JP6721242B2 - 生体試料保存容器 - Google Patents
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Description
〔1〕生体試料を収容する容器本体と、容器外部から容器内部へ液体を注入する注入部材、及び容器内部から容器外部へ液体を排出する排出部材とを有する生体試料保存容器であって、注入部材と排出部材が、注入部材と排出部材との間に液体の流れが生じるような位置であって、この液体の流れが容器本体に収容される生体試料に接触するような位置に、設置されていることを特徴とする生体試料保存容器。
(1)〔1〕乃至〔4〕のいずれかに記載の生体試料保存容器の容器本体に、生体試料を収容する工程、
(2)平衡液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、排出部材から排出する工程、
(3)ガラス化液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程、
(4)生体試料保存容器を冷却し、生体試料を凍結する工程。
(1)凍結した生体試料が容器本体に収容されている〔1〕乃至〔4〕のいずれかに記載の生体試料保存容器を、加温する工程
(2)融解液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程、
(3)希釈液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程、
(4)洗浄液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程。
〔1〕生体試料保存容器
本発明の生体試料保存容器は、生体試料を収容する容器本体と、容器外部から容器内部へ液体を注入する注入部材、及び容器内部から容器外部へ液体を排出する排出部材とを有するものであって、注入部材と排出部材が、注入部材と排出部材との間に液体の流れが生じるような位置であって、この液体の流れが容器本体に収容される生体試料に接触するような位置に、設置されていることを特徴とするものである。
本発明の生体試料の凍結方法は、以下に説明する工程(1)〜(4)を含むことを特徴とするものである。工程(1)、工程(2)、工程(3)、工程(4)は、この順序で行う。工程(2)及び工程(3)は、複数回行ってもよい。
本発明の凍結生体試料の融解方法は、以下に説明する工程(1)〜(4)を含むことを含むことを特徴とするものである。工程(1)、工程(2)、工程(3)、工程(4)は、この順序で行う。工程(2)、工程(3)、及び工程(4)は、複数回行ってもよい。
細胞やスフェロイドのような生体試料をゲルに包埋し、ガラス化凍結する方法は、以前から知られていた。しかし、このような方法において凍結対象となるゲルは非常に小さなものであり、上記の板状のゲルのような大きなゲルをガラス化凍結する方法は知られていなかった。従って、このような板状のゲルを、上記の生体試料保存容器に収容せずに、ガラス化凍結する方法、及びそれを融解する方法は、新規な方法であり、本発明はこのような方法も含む。具体的には、上記の板状のゲルを平衡液及びガラス化液に順次浸漬した後、ガラス化凍結する方法、及びガラス化凍結した板状のゲルを加温し、融解液、希釈液、及び洗浄液に順次浸漬する方法も、本発明に含まれる。
(1)細胞シートの作製
日本白色種ウサギ膝軟骨由来初代培養細胞(コスモバイオ社)を、温度応答性培養皿(アップセル、CellSeed社)に播種し、増殖培地(20%FBS含有DMEM/F12培地)中で、37℃、5%CO2下で培養した。細胞がコンフルエンスに達したときに、増殖培地を分化培地(10%FBS及び100μM L-アスコルビン酸含有RMI1640培地)に交換し、更に培養を継続した。
ポリエチレン製のジッパー付袋(110×85mm、膜厚0.063-0.064mm)に、2本のチューブ(テフロン製、内径1.7mm)を、一端が袋の外に突き出るように挿入した。挿入したチューブは、袋の長辺に沿うようにヒートシールによって固定した。チューブの袋内に挿入されている部分には、内径0.6〜0.8mmの小孔を、5〜10mm間隔で設けた。この細胞シート保存用袋の外観を図3に示す。
上記の保存用袋のジッパーを開け、そこから上記の細胞シートを保存用袋の内部に入れた。細胞シートは、2枚のナイロンメッシュ(50×50mm、糸径95μm、目開き140μm)に挟み、これらによって保護された状態で収容した。
(1)ガラス化凍結及び融解後の細胞シートの評価
細胞シートの評価を、以下の回収率及び細胞生存率の二つの観点で行った。
回収率:ガラス化凍結後の細胞シートの形状(破損の有無)を確認し、破損がなく回収できたシートの割合を算出した。
細胞生存率:コラゲナーゼtype II処理により細胞を分散させ、細胞の生存性をトリパンブルー染色により判定した。
また、比較対象として、ガラス化凍結及び融解処理を行わない細胞シート(非ガラス化区)を用いた。
平衡液、ガラス化液、融解液、希釈液、洗浄液を、この順に保存容器に注入し、灌流又は洗浄後の平衡液、ガラス化液、洗浄液をそれぞれ回収した。注入前の液体を原液、回収後の液体を回収液とし、それぞれの原液及び回収液の浸透圧を測定し、液の交換が正常に行われているかどうかを調べた。結果を下表に示す。
なお、原液及び回収液の浸透圧は凝固点降下浸透圧計(Osmomat030)を用い、必要に応じてMQで希釈することにより測定した。
2:開口部
3:注入管
4:排出管
5:注入口
6:排出口
7:小孔
Claims (4)
- 生体試料を収容する容器本体と、容器外部から容器内部へ液体を注入する注入部材、及び容器内部から容器外部へ液体を排出する排出部材とを有する生体試料保存容器であって、
1)注入部材及び排出部材が管であり、これらの管の一部は容器本体内部に位置し、当該部分には、複数の小孔が設けられていること、
2)容器本体は、開閉可能な開口部を有する長方形型の袋状の容器であること、
3)注入部材及び排出部材は、一端が容器本体の外に突き出るように開口部から挿入されており、他の一端が容器本体の開口部とは逆の端部付近に位置すること、及び
4)注入部材及び排出部材は、容器本体の周縁部であって、長方形型の容器本体の対辺に沿ってそれぞれ設置されていることを特徴とする生体試料保存容器。 - 生体試料が、細胞シートであることを特徴とする請求項1に記載の生体試料保存容器。
- 以下の工程(1)〜(4)を含むことを特徴とする生体試料の凍結方法であって、生体試料が細胞シートであることを特徴とする生体試料の凍結方法、
(1)請求項1に記載の生体試料保存容器の容器本体に、生体試料を収容する工程、
(2)平衡液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、排出部材から排出する工程、
(3)ガラス化液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程、
(4)生体試料保存容器を冷却し、生体試料を凍結する工程。 - 以下の工程(1)〜(4)を含むことを特徴とする凍結生体試料の融解方法であって、生体試料が細胞シートであることを特徴とする凍結生体試料の融解方法、
(1)凍結した生体試料が容器本体に収容されている請求項1に記載の生体試料保存容器を、加温する工程
(2)融解液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程、
(3)希釈液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程、
(4)洗浄液を、注入部材から容器本体へ注入し、生体試料と接触させた後、容器内部の液体を排出部材から排出する工程。
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JP2017122369A JP6721242B2 (ja) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 生体試料保存容器 |
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JP2017122369A JP6721242B2 (ja) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 生体試料保存容器 |
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