JP6692830B2 - 抗癌組成物及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、抗癌組成物及びその使用に関し、特に、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）又はソラフェニブ（sorafenib）とのその組合せでの治療による生物活性に関する。
グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ（Glycine N-methyl transferase，GNMT）は、複数の活性を有し、そのうちの一つは、肝細胞癌の腫瘍抑制遺伝子（tumor suppressor gene）である。アフラトキシン(aflatoxin)、ポリ芳香族炭化水素(polyaromatic hydrocarbons)などの発癌物質に暴露されると、前記酵素は、これらの発癌物質によって誘導されるDNA付加物形成(DNA adduct formation)及び細胞毒性を低下させることによって保護効果を示すことができる。いくつかの研究は、グリシン-N-メチルトランスフェラーゼが肝臓解毒経路(hepatic detoxification pathways)の開始に参与することを推定している。研究によると、肝細胞癌患者の80％以上は、組織における前記酵素の発現量が減少し、肝硬変患者に発展するリスクが増加する。雄性又は雌性マウスにかかわらず、グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトすることにより、肝細胞癌率の自然発生が増加する。ヒトグリシン-N-メチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入したマウスは、肝臓におけるGNMTが過剰発現し、アフラトキシンB1誘導肝腫瘍形成（aflatoxin B1-induced liver tumorigenesis）を防止する。DebRoy, S. らは、2013、PloS one、第8巻、e70062に、類似の現象を示し、即ち、グリシン-N-メチルトランスフェラーゼが過剰発現すると、癌細胞の増殖を阻害することができる。
長年にわたり、天然物（natural products）は、薬物の研究開発にとって重要な資源と考えられる。1990年までに、薬物のほぼ80％が天然物又は天然物の類似体に由来すると推定される。漢方薬は、天然物の独特の源であり、人々が長い間使用されるいくつかの薬物である。
本発明は、従来の技術の欠点を鑑みて、出願人は慎重な試験研究を通じて忍耐の精神を持ち、最終的に従来の技術の欠点を克服するために、本願の発明を発明した。以下は、本発明の簡単な説明である。
本発明は、二つの部分に分けることができ、一つは薬物スクリーニングプラットフォームを確立し、及びこのプラットフォームが肝臓疾患に対する潜在的な薬物を見つけ出すことを証明する。もう一つはこのプラットフォームで二つの潜在的な薬物を見つけ、且つその薬物の一つは、マウスモデルで検証される。これらの二つの薬物は、すべて肝臓保護機能を有し、且つ脂肪肝、肝線維症/肝硬変、肝臓癌などの肝疾患の予防及び治療に適用することができる。
従来技術の欠点を克服するために、本発明は、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシドの活性、又はソラフェニブと組み合わせる医薬品及び/又は食品の使用を実験によって探究する。
本発明の目的は、医薬品及び/又は食品の使用の多様化のために、多重の投与法を提供する。
本発明によれば、適切な実施形態において、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）は、芍薬（Paeonia lactiflora Pall.）又は五倍子（Galla Chinesis）から抽出することができる。
本発明は、特定の実施形態により説明した。本発明を読んだ後に当業者に明らかとなる改良や変更は、本願の精神及び範囲内にあるとみなされる。前述の開示を逸脱しない範囲で、いくつかの修正、変更及び置換が可能であり、いくつかの場合において、本発明の一部の特徴は、他の特徴に対応する使用しないときに使用されることが理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲と一致する方法で広く解釈されることが適当である。
世界的に、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）は普遍的な悪性腫瘍であり、3番目に死亡率の高く、よく知られた癌である。毎年新たに診断される症例の数は約500万人を超えている。診断が容易ではなく、治療プログラムが不良であり、且つ再発率が高いため、発生率は死亡率にほぼ等しい。現在、商品名Nexavarを有するソラフェニブ（Sorafenib）のみが肝細胞癌の治療のために2007年に食品医薬品局（FDA）の承認を受けた。その薬物の副作用は軽度であるが、ソラフェニブを服用している患者は、薬物耐性がある傾向がある。肝細胞癌の治療の限界を考えると、患者の生存を拡大するために、予防薬、新しい治療薬又は薬剤組合せプログラムの戦略を研究開発する必要がある。
GNMT発現指向細胞ベースの薬物スクリーニングプラットフォームの確立（Establishment of a GNMT expression oriented cell-based drug screening platform）。
グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ（Glycine N-methyl- transferase，GNMT）のプロモーター領域をクローニングした後、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase，LUC）レポーター遺伝子をレンチウイルスベクターpLKO.1（lentiviral vector-pLKO.1）にクローニングした。ヒト胎児由来腎臓細胞株HEK293T（ATCC CRL-11268）を、VSV-Gエンベロープ発現のプラスミドpMD.G（plasmid-pMD.G）、図1に示すようにpLV-GNMTpLuc、及びパッケージングプラスミドpCMV-ΔR8.91（plasmid-pCMV-ΔR8.91）で同時形質移入し、レンチウイルスを含む上清を収穫した。 Huh7細胞をこのウイルスに感染させ、ピューロマイシン含有培地で選択した。得られたコロニーの一つを採取し、増幅し、Huh7-GNMTプロモーター-ルシフェラーゼ（Huh7-GNMT promoter- Luciferase、H7GPL）と同定した。
相対ルシフェラーゼ活性（relative luciferase activity，RLA）は、「ルシフェラーゼの活性/蛍光検出染料（AlamaBlue）の蛍光の強度」によって計算した。グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ（GNMT）プロモーター誘導の倍数変化（fold changes）は、「薬物の相対ルシフェラーゼ活性/溶媒対照の相対ルシフェラーゼ活性」によって計算した。
確立された安定細胞系Huh7-GNMTプロモーター-ルシフェラーゼ細胞において、グリシン-N-メチルトランスフェラーゼのプロモーター（human glycine N-methyltransferase promoter）を活性化し、薬物スクリーニングプラットフォームとする。図２に示すように、前記細胞は、ルシフェラーゼ活性アッセイレによってポーター遺伝子の断片を有することを確認した。Chen、M.H. らは、2011、PloS one、第6（11）巻、e2718に、食品医薬品局（Food and Drug Administration、FDA）によって承認された26種類の薬物が肝臓癌の遺伝子発現特性を逆転させることが確認されることを示す。Huh-7-GNMTプロモーター-ルシフェラーゼ（H7GPL）細胞を培養し、上記26種類の薬物及び溶媒対照群を用いたところ、23％の上記薬物がルシフェラーゼ活性を増加させた。
表1に示すように、前記２６種類の薬物から、シクロピロキサミン（ciclopirox）、クロロキノリン（Clioquinol）、アピゲニン（apigenin）、ルテオリン（luteolin）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）、トリコスタチンA（trichostatin A，TSA）などが選択される。この６種類の薬物は、GNMTプロモーターの活性を改善することができる。この結果は、前記プラットフォームが肝細胞癌治療薬物の識別に使用できることを示している。
スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）は、グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ（GNMT）誘導活性を有するヒストン脱アセチル化酵素(histone deacetylase)阻害剤である。Huh7-GNMTプロモーター-ルシフェラーゼ細胞をスベロイルアニリドヒドロキサム酸によって試験し、ハイスループットスクリーニングプラットフォーム(high-throughput screening platform)の資格を評価した。図３に示すように、Huh7-GNMTプロモーター-ルシフェラーゼ細胞を、0.1μM、1.0μM、10μMの異なる濃度のスベロイルアニリドヒドロキサム酸及びジメチルスルホキシド（DMSO）の溶媒対照群で培養した。結果は、最小のウェル間差異（inter-well variation）を示した。薬物スクリーニングプラットフォームの資格を評価するために、薬物スクリーニングのためのプラットフォームの品質を決定するために、シグナル/バックグラウンド（Signal/Background，S/B）、シグナル/ノイズ（Signal/Noise，S/N）及びZ'因子（Z’factor）などの統計パラメーターを計算した。
伝統的な漢方薬の薬物ライブラリーをスクリーニングする（Screening a traditional Chinese medicine drug library）。
国立中国薬品研究所（National research institute of Chinese medicine, NRICM）の伝統的な漢方薬の薬物ライブラリー(traditional Chinese medicine drug library)は、中国薬草から抽出された324種類の純粋な化合物と480種類の粗抽出物を含む。上記のプラットフォームは、伝統的な漢方薬の薬物ライブラリーをスクリーニングするために使用される。最初のスクリーニングでは、[（個々のルシフェラーゼ活性-すべてのサンプルの平均のルシフェラーゼ活性）]/すべてのサンプルの標準偏差のZスコアが1.5より大きい場合、その化合物がグリシン-N-メチルトランスフェラーゼのレポーター活性（GNMT reporter activity）を増加させることができることを示した。図４に示すように、13種類の純粋化合物と13種類の漢方薬抽出物が合計26種類のサンプル（ヒット）のZ値は1.5より大きく、グリシン-N-メチルトランスフェラーゼのルシフェラーゼ活性を増加させる能力を有する。
芍薬抽出物の生物活性画分の抗HCC効果（The anti-HCC effect of Paeonia lactiflora Pall.extract derived bioactive fraction）。
市販の芍薬薬用材料から抽出物を調製し、芍薬の活性部分を確認する。調製したメタノール抽出物のグリシン-N-メチルトランスフェラーゼのプロモーター活性（GNMT promoter activity）は、図６に示すように用量依存的なパターンを示す。芍薬（Paeonia lactiflora Pall.）のメタノール抽出物の活性は、バイオアッセイ誘導分画(bioassay guided fractionation)法によって同定した。芍薬のメタノール抽出物を酢酸エチルで分配した（partitioned）後、ジクロロメタン(Dichloromethane)及びメタノールの勾配溶媒を移動相として有機層をシリカゲル（silica gel）に入れ、中圧液体クロマトグラフィー（Medium Pressure Liquid chromatography，MPLC）分離を進め、8つの異なる画分（F1-F8）を生成した。図８に示すように、GNMTプロモーター活性を試験した後、F3画分では最大のGNMTプロモーター活性を増強する可能性が示される。F3画分は、デキストランゲルLH20（Sephadex LH-20）カラムを用いた透過クロマトグラフィー(permeation chromatography)によりさらに純化する。図９に示すように、F3-6画分は、レポーターアッセイ（reporter assay）によって試験した後、４倍を超える可能性を有する。また、図1０に示すように、前記画分は、誘導ルシフェラーゼ活性（induced luciferase activity）を有する。図１１に示すように、内生のGNMTの発現について、F3-6画分は、Huh7細胞のmRNA及びタンパク質活性をアップレギュレートする。図１２に示すように、F3-6画分は、肝細胞癌に対する有効性について、Huh7細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示す。
図１３に示すように、異種移植アッセイ（xenograft assay）について、F3-6画分は、溶媒対照群と比較して腫瘍発生率（tumor incidence rate）を著しく低下させる。Huh7細胞を接種した２０日後、対照群の非肥満性糖尿病/重症複合免疫不全症（NOD-SCID）マウスは腫瘍を増殖し始め、且つ8週間以内に80％（8/10）のマウスが腫瘍を増殖した。対照的に、Huh7細胞を接種した３０日後、25mpk（mg/kg）のF3-6画分で治療したマウスは腫瘍を増殖し始め、且つ腫瘍の発生率は33％（3/9）に低下した。実験期間中に300mpk（mg/kg）のF3-6画分で治療したマウスは、腫瘍が発見されていない。図１４に示すように、溶媒対照群と比較して、25mpk（mg/kg）のF3-6画分で治療した群の腫瘍の平均サイズは顕著に減少する。
F3-6画分の活性成分であるPGG化合物は、生体外及び生体内の両方において肝臓癌細胞の増殖を阻害する（PGG, the active component in F3-6, inhibits liver cancer cells growth both in vitro and in vivo）。
図１５に示すように、F3-6画分を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）でさらに純化し、活性成分1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside 、PGG、純度> 98％）が同定される。図１６に示すように、F3-6画分から分離されて純化された化合物は、シグマ（Sigma）社から購入した化合物と比較すると、２種類の1,2,3,4,6-ペンタロイルグルコピラノシド （PGGs）は、似ているGNMT誘導する効果を有する。1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド化合物は、構造的にはグルコース基と没食子酸基とから構成されているが、図１６に示すように、グルコース基及び没食子酸基のいずれかがGNMTプロモーター活性に影響を及ぼさなく、GNMTプロモーター活性を誘導することもできない。
さらに、GNMT免疫ブロット（immunoblot）及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応試験は、PGGがGNMT mRNAの発現を誘導することを確認した。図１７に示すように、PGGはHuh7細胞におけるGNMTタンパク質の発現を時間依存的に誘導し、最大の治療効果は投与後48時間で得られた。台湾中山科学技術研究所のヒト肝癌細胞株のHuh7、Hep3B (ATCC-No 8064)、HepG2 (ATCC HB-8065)、SK-HEP-1 (ATCC HTB-52)及びMahlavu悪性肝臓癌細胞株の細胞増殖効果を分析した。
細胞生存率は、蛍光検出染料alamarBlue（登録商標）によって分析される。図１８に示すように、PGGは異なる肝癌細胞の増殖に対して用量依存性を示し、Huh7細胞株の50%抑制濃度（IC50）は0.03mg/mL、Hep3B細胞株の50%抑制濃度は0.07mg/mL、SK-HEP-1、Mahlavu及びHep G2細胞株の50%抑制濃度は0.10mg/mLである。Huh7細胞に対するPGGの治療効果を探究し、7日間の治療の後にコロニー形成能力（colony formation capacity）を分析する。図１９に示すように、PGGは用量依存的にHuh7細胞コロニーの形成を減少させ、0.05mg/ml以上のPGGは、95％のHuh7細胞コロニーの形成を阻害する。生体内のPGGの抗腫瘍効果を試験するために、Huh7細胞をヌードマウスの皮下に接種する。ヌードマウスの腫瘍が十分に増殖して明確に同定された場合、マウスを無作為に２群に分け、それぞれをPGG及び溶媒で10日間処理した。図２０に示すように、300 mg/kg PGG治療群は、溶媒対照群と比較して腫瘍増殖を著しく阻害することが観察された。図２１に示すように、免疫ブロットを用いて腫瘍試料を分析し、PGG治療群はGNMT誘導作用を示した。
PGG処理によりHuh7細胞におけるアポトーシスが誘導される（PGG treatment induces apoptosis in Huh7 cells）。
フローサイトメトリーアッセイ(flow cytometry assay)を用いてPGGの影響を受けた肝癌細胞の周期を分析し、肝癌細胞増殖を抑制するPGGのメカニズムを評価した。Huh7細胞をPGGで24時間治療した後、図２２に示すように、sub-G1周期のアポトーシス細胞の数は、著しく増加している。図２３に示すように、PGGで治療したHuh7細胞をアポトーシスマーカーであるアネキシンV（Annexin V）で染色し、PGGがアポトーシスを著しく誘導し得ることを示した。
図２４に示すように、上記の結果と一致して、１２時間のPGG処理後にHuh7細胞においてカスパーゼ（caspase）3/7活性の5倍の増加が観察された。免疫ブロットは、PGG処理が用量依存的に切断されたカスパーゼ３の含量を増加させることをさらに確認した。以上により、Huh7細胞をPGGで治療すると、細胞のアポトーシスを誘導することができる。
PGGはHuh7細胞を感作し、ソラフェニブの治療効果を与える（PGG sensitizes Huh7 cells to sorafenib treatment）。
現在、ソラフェニブ（sorafenib）は依然として肝臓癌の治療に最も好ましい薬剤であるが、その副作用に基づく重大な問題があり、限られた臨床効果をもたらす。ソラフェニブの構造は図２５に示されており、その化学名は4-[4-[[4-クロロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]カルバモイルアミノ]フェノキシ]-N-メチル-ピリジン-2-カルボキシ-アミド（4-[4-[[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl] carbamoylamino] phenoxy] -N-methyl-pyridine-2-carbox-amide）。
上記のように、GNMTは、肝細胞癌を抑制する活性を有する。PGGがGNMTの誘導剤になるかどうかを評価する必要がある。PGGの過剰発現が、ソラフェニブに対する肝癌細胞の治療効果を十分に感作するかどうかを確認するために、PGGによる治療を行った。異なる濃度のソラフェニブにより、緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein、GFP）を有するHuh7-GFP及びHuh7-GNMT細胞を処理した後、細胞生存率を分析する。ソラフェニブは、Huh7-GFP及びHuh7-GNMT細胞の増殖を用量依存的に阻害するが、ソラフェニブによる治療は、GNMTを過剰発現するHuh7-GNMT細胞が、Huh7-GFP細胞よりも感受性が高まる。図２６に示すように、2.5μMのソラフェニブで治療した後、Huh7-GNMT細胞の生存率は、Huh7-GFP細胞よりも著しく低下する。
ソラフェニブの治療に対するGNMTの生体内の添加の影響を評価するために、Huh7-GNMT及びHuh7-GFP細胞を、胸腺を欠く雌性非肥満性糖尿病/重症複合免疫不全症（NOD-SCID）マウスに皮下注射した。マウスを無作為に群分けし、ソラフェニブ又は生理食塩水で治療した。Huh7-GFP細胞と比較して、GNMT過剰発現は腫瘍増殖を減少させることができる。マウスを10mg/kgの経口投与のソラフェニブ又は生理食塩水で週３日に処理した後、ソラフェニブは腫瘍増殖の著しい阻害を示したことが観察された。図２７に示すように、他のすべてのグループと比較して、Huh7-GNMT細胞を移植し、腫瘍を治療するためにソラフェニブを投与すると、腫瘍サイズの減少は有意な統計的有意性を示す。これらの結果に基づいて、肝癌に対するPGGとソラフェニブの併用療法（combination therapy）の有効性について検討する。
ソラフェニブとPGGの併用療法を評価するために、Huh7細胞を用いて細胞毒性試験を行った。図２８に示すように、PGGを７２時間投与すると、ソラフェニブの有効性が高まり、ソラフェニブの高用量は依然としてHuh7細胞の生存率に影響を及ぼす。NOD-SCIDマウスでは、Huh7細胞の異種移植を皮下で行った。25、300 mg/kgのF3-6画分又は低用量10 mg/kgのソラフェニブ単独にかかわらず、マウスの腫瘍サイズは対照群と比較して減少している。図２９に示すように、ソラフェニブと25 mg/kgのF3-6画分又は25 mg/kgのPGGとの併用療法を、任意の単一の薬剤と比較して、腫瘍増殖を減少させる。また、図３０に示すように、対照群と比較して、F3-6画分及びPGGを投与した異種移植腫瘍マウスは、GNMT mRNAを増加することが観察された。
PGGは、c-Mycの抑制を介してGNMTプロモーター活性を増強する（(PGG enhances GNMT promoter activity via suppression of c-Myc）。
マイクロアレイ解析(microarray analysis)を用いて、PGGがGNMT発現に影響を与えるメカニズムを評価する。Huh7細胞をPGGで6時間及び48時間処理した後、経路濃縮分析(pathway enrichment analysis)を用いて、前記選択された時間に169遺伝子が著しく変化したことが見出された。これらの結果は、形質転換増殖因子-β（transforming growth factor-β、TGF-β）シグナル伝達経路、がんの経路、上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、ErbB）シグナル伝達経路、細胞周期及び急性骨髄性白血病経路（acute myeloid leukemia）などの経路に影響を与えることを示す。表２に示すように、関与する経路は全てc-Myc遺伝子を有する。図３１に示すように、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction、qRT-PCR、Q-PCR）は、PGGがc-Mycの発現に影響を及ぼすことが確認される。図３２及び図３３に示すように、Huh7及びHep G2細胞の免疫ブロット分析は、PGGがc-Myc遺伝子発現を用量及び時間依存的に阻害することを示す。図３４及び図３５に示すように、異種移植腫瘍マウスにおけるPGG又はF3-6画分の処理は、生体外の結果と一致し、c-Mycの発現を減少させる。
PGGはc-Mycを下方制御する(downregulate)ことによってGNMTに影響を与えるので、短いヘアピンRNA(short hairpin RNA、shRNA)を用いてc-Myc遺伝子をノックアウトし、PGG処理のような効果が存在する可能性を推測している。GNMTプロモーターレポータープラスミド（promoter reporter plasmid）、チミジンキナーゼ（thymidine kinase、TK）プロモーター駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（renilla luciferase plasmid）、shMycプラスミド又はshLacZプラスミドを用いてHuh7細胞を72時間同時形質移入し(co-transfected)、GNMTプロモーター活性を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ(dual luciferase reporter assays)によって試験する。図３６に示すように、shRNAがc-Mycを発現しないように調節することが見出され、shLacZ対照群と比較してGNMTプロモーター活性がほぼ5倍増加している。Huh7-shMyc及びHuh7-shLacZ安定細胞を調製してc-Myc遺伝子をノックアウトし、GNMT mRNAの発現を測定する。図３７に示すように、Huh7-shMyc細胞における内生のGNMT mRNAの含量は、対照群Huh7-shLacZ細胞より著しく高いことが見出される。GNMTプロモーターレポーター遺伝子及びTKレニラレポーターを介してGNMTプロモーター活性を試験し、Huh7細胞が異所的に(ectopically) c-Mycを過剰発現(overexpress)できるかどうかを評価し、c-MycのGNMTプロモーターへの影響を検証する。
図３８に示すように、c-Mycの過剰発現は、GNMT遺伝子プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性及び内在性GNMTタンパク質の発現を著しく阻害することが観察される。この結果は、c-Myc調節がGNMT発現を減少させるが、c-Myc阻害はPGG治療効果に類似していることを示す。
c-Myc遺伝子をノックアウトしてからPGGを投与し、GNMTプロモーター活性が損傷しているかどうかを評価し、c-Myc発現の阻害は、PGGがGNMTプロモーターを誘導することを影響することが確認される。図３９に示すように、PGGによって誘導されたGNMTプロモーターの効果は、c-Mycをノックアウトされた細胞に著しく減少している。上記のように、c-Mycのダウンレギュレーションが、Huh7細胞におけるPGG誘導性GNMTプロモーターの発現において主要な役割を果たすことを示唆している。
PGGの抗HCC効果は、c-Myc抑制と関連している（The anti-HCC effect of PGG is associated with c-Myc suppression）。
PGGが肝癌細胞の増殖をどのように阻害するメカニズムについて、PGGはGNMT発現を誘導することによって肝癌細胞に影響を及ぼすと推測される。GNMTをノックアウトすると、PGGの治療効果を助けることが予測される。GNMT shRNAを安定に発現するHuh7細胞について評価する。結果は図４０に示すように、PGGによる細胞毒性に対し、GNMTのノックアウトによっても、著しい改善が見られない。c-Mycは既知の発癌遺伝子（oncogene）であるので、c-Mycの下方制御の機能がPGGの抗肝癌発生に影響を与えるかどうかを試験する。
c-Mycの異所性発現は、PGG誘発細胞毒性を低下させ、肝癌細胞に影響を及ぼすか？図４１に示されるように、c-Myc過剰発現はPGGの影響を防止することができなく、Huh7細胞は依然として細胞毒性を示す。さらに、図４２に示すように、c-Mycの異所性発現は、PGG誘導性のc-Myc mRNA阻害を減少させるが、PGG誘発Huh7細胞によって生成されるc-Mycタンパク質の消費を防止することができなく、PGGは、c-Mycタンパク質の安定性を低下させることができることを示す。図４３に示すように、シクロヘキシミド（cycloheximide 、CHX）を用いてシクロヘキシミドチェイスアッセイ(cycloheximide chase assay)を行う。 PGG処理の後、c-Mycの分解動力学(degradation kinetics)をタンパク質半減期アッセイによって決定し、PGGがc-Mycタンパク質の半減期を有意に低下させることができることを示す。
図４３に示すように、PGGは、タンパク質分解を促進することによってc-Mycタンパク質の発現レベルを下方制御する。PGGは、c-Mycタンパク質の安定性を干渉するため、PGG誘発細胞毒性において、ノックアウトシステムの使用はc-Mycの役割を十分に果たす。図４４に示すように、PGGは、Huh7-shLacZ細胞と比較してHuh7-shMyc細胞の生存率をわずかに低下させるだけであった。c-Mycのノックアウトは、PGGキル細胞の誘導効果に影響を与え、c-Mycの下方制御がPGGの影響を受けるHuh7細胞の増殖活性の主因であることを示す。
タンパク質分解経路（proteolytic pathway）とPGG誘発c-Myc分解との間の関連性を評価するために、PGG調節c-Mycの分解を様々なタンパク質分解阻害剤で評価した。図４５に示すように、塩化アンモニウム（NH4Cl）及びN-[（ベンジルオキシ）カルボニル]-L-ロイシル-N-[（1S）-1-ホルミル-3-メチル-ブチル] -L-ロイシンアミド（Z-LEU-LEU-LEU-CHO、MG132）などのプロテアーゼ阻害剤は、PGG誘発に起因するc-Myc分解を防止できない。クロロキン二リン酸（chloroquine diphosphate）、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid 、EDTA）、N-ベンジルオキシカルボニル-L-ロイシル-L-ノルロイシナル（N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-norleucinal、calpeptin）及びアポトーシス阻害剤N-ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（メチルオキシ）フルオロメチルケトン（N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (Ome)fluoromethyl ketone，Z-VAD-FMK）は、PGG誘導性のc-Mycタンパク質発現の抑制効果を妨げることができる。
これらの結果は、PGGが、Huh7細胞におけるプロテアソーム非依存性メカニズム（proteasome independent mechanism）を介してc-Mycの分解を誘導することを示す。PGG誘発性c-Myc阻害が腫瘍細胞において広く存在するかどうかを確認するために、免疫ブロット分析が用いられ、図４６に示すように、ヒト前立腺癌（prostate cancer）PC-3（ATCC CRL-1435）及びヒト前骨髄球性白血病（promyelocytic leukemia）細胞株HL-60（ATCC CCL-240）などの細胞株を含む他のヒト腫瘍で行われたPGGによる治療は、 c-Myc発現の減少を示す。
「治療」、「治療中]という用語は、患者に現在存在する疾患又はその疾患に関連する任意の症状を緩減、改善、軽減又は排除し、及びその疾患又はその症状を予防する方法を指す。用語「治療有効量（therapeutically effective amount）」は、医学的症状又は生物体の状態の悪化を改善又は予防するには十分な用量である。有効量はまた、投与された化合物の用量が診断用量のため十分であることを示す。本明細書中に他に記載されていない限り、「活性化合物」及び「薬学的に活性な化合物」は交換可能に使用され、製薬学的、薬理学的又は治療的効果を有する物質を指す。
「賦形剤（excipients）」（「薬学的に許容される担体又は賦形剤」、「生物学的に利用可能な担体又は賦形剤」とも呼ばれる）という用語は、溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤又は抗真菌剤、保存又は遅延吸収剤などの任意の剤形の調製用の従来の適当な化合物。通常、このような担体又は賦形剤自体は、疾患を治療するための活性を持たなく、そして、この技術で開示された誘導体は、様々な薬学的に許容される担体または賦形剤と共に剤形に処方され、動物又はヒトの投与は、有害反応、アレルギー又は他の不適切な反応を引き起こさない。この技術分野で開示された誘導体は、種々の薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に製剤化され、動物又はヒトに投与することは有害反応、アレルギー又はその他の不適切な反応を引き起こさない。従って、この技術に開示される誘導体は、薬学的に許容される担体又は賦形剤とともに、臨床及びヒトにおける使用に適している。
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味料、香味剤、医薬グレードの染料又は顔料、及び粘度剤の少なくとも一つを含むが、これらに限定されない。
「薬学的組成物（pharmaceutical composition）」という用語は、固体又は液体組成物であり、その形態、濃度及び純度は、患者（例えば、ヒト又は動物の患者）への投与に適しており、投与の後、所望の生理学的変化を誘発することができる。薬学的組成物は、典型的には、滅菌及び/又は非発熱性（non-pyrogenic）のものである。
適切な実施形態では、併用療法（combination therapies）は、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside、PGG)を含む錠剤、カプセルなどの単回経口組成物の投与によって患者に適用してもよく、或いは、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）を含む食べ物を食べてもよく、次いで、ソラフェニブ(sorafenib)化合物を含む異なる剤形又は同じ剤形を投与する。併用療法は、順次に投与する方法又は短時間の間隔に投与する方法であり得る。これらの併用療法は、患者の状態及び年齢に従って、様々な剤形を選択することができる。例えば、舌下又は経口錠剤の経口剤形、直腸投与剤、経鼻投与剤、乾燥粉末又は噴霧吸入剤、さらに、膣内投与、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内注射、局所（topical）投与など、ハンドクリーム、ミスト（mist）、溶液（solution）、ローション（lotion）、ゲル（gel）、クリーム（クリーム）、軟膏、ペースト（paste）、油薬（unguent）、乳剤（emulsion）及び懸濁剤、また、経口又は注射投与をさらに含み得る。短時間の間隔の投与は、通常、前後３時間内に行われる。
他に定義されない限り、本明細書に列挙される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解される意味に属する。
材料及び方法（Materials and methods）
細胞培養及び試薬（Cell culture and Reagents）
ヒト肝臓癌細胞株Huh7、Hep G2、Hep 3B、SK-HEP-1、Mahlavu及びヒト胎児由来腎臓細胞株HEK-293Tは、10％の熱失活したウシ胎児血清胎児血清(heat-inactivated fetal bovine serum)（HyClone、Logan、UT、USA）、100U/mLのペニシリン（penicillin）、100μg/mLのストレプトマイシン（streptomycin）、0.1mM/Lの非必須アミノ酸（nonessential amino acids ）及び2mM/LのL-グルタミン（L-glutamine ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium、DMEM）（Gibco BRL、Grand Island、NY）で5％CO2の加湿インキュベーター内で培養した。ヒト前立腺癌細胞株PC-3及びヒト前骨髄球性白血病細胞株HL-60をGibco BRLのRPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培地で培養する。レンチウイルス(lentiviral)系統によって確立された安定細胞Huh7-GFP、Huh7-GNMT、Huh7-shGNMT、Huh7-shLacZ、Huh7-shMycは、1μg/ mLのピューロマイシン(puromycin)を補充した培地（DMEM）中で培養する。
化合物3-メチルアデニン(3-methyladenine、3-MA)、N-[（ベンジルオキシ）カルボニル]-L-ロイシル-N-[（1S）-1-ホルミル-3-メチル-ブチル] -L-ロイシンアミド（Z-LEU-LEU-LEU-CHO、MG132）、クロロキン二リン酸(chloroquine diphosphate)、N-（トランス-エポキシスクシニル）-L-ロイシン-4-グアニジノブチルアミド((1S,2S)-2-(((S)-1-((4-Guanidinobutyl)amino)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)carbamoyl)cyclopropanecarboxylic acid，E-64)、シクロヘキシミド(cycloheximide、CHX)、ペプスタチン(N-isovaleryl-L-valyl-L-valyl-3-hydroxy-6-methyl-g-aminoheptanoyl- L-alanyl-3-hydroxyl-6-methyl-g-aminoheptanoic acid、pepstatin A)及びヨウ化プロピジウム(propidium iodide)は、シグマ アルドリッチ社（St Louis、MO、USA）から購入した。N-ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（メトキシ）フルオロメチルケトン(N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(Ome)fluoromethyl ketone、Z-VAD-FMK) は、Selleckchem.comから購入した。N-ベンジルオキシカルボニル-L-ロイシル-L-ノルルイシン（N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-norleucinal、calpeptin）は、メルクミリポア社(Billerica, MA,. USA)から購入した。
プラスミド及び形質移入(Plasmids and transfections)
レンチウイルス(lentivirus)によって生成したプラスミドpCMV-ΔR8.91、pMD.G及びpLKO.1、並びにc-Myc、GNMTの短いヘアピンRNA(short hairpin RNA、shRNA) 及びLacZ遺伝子にコードされるβ-ガラクトシダーゼは、台湾中央研究院(Academia Sinica)の国立RNAiコア施設(National RNAi Core Facility)から得られる。グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ（Glycine N-methyl-transferase 、GNMT）プロモーター領域-1812〜+14は、既知の方法でクローニングし、次いでホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase 、LUC）レポーター遺伝子をレンチウイルスベクターpLKO.1（lentiviral vector-pLKO.1）に挿入し、GNMTプロモータールシフェラーゼプラスミド（GNMT promoter-luciferase plasmid）を構成する。pcDNA-c-Mycプラスミドは、中国医薬大学の廖世平博士によって提供された。トランスフェクション(transfection)のために、細胞を70％〜90％コンフルエンスに移植し、形質移入試薬（TurboFect Reagent、Fermentas、Hanover、MD）及びリポフェクタミン3000（Lipofectamine 3000、Life Technologies、Mulgrave、Australia）を用いてプラスミドDNAをトランスフェクトし、トランスフェクションは、操作説明書に従って実施し、プラスミドDNAがトランスフェクトされたことを示す。
ハイスループットスクリーニングのためのGNMT遺伝子発現指向プラットフォームの確立(Establishment of GNMT gene expression-oriented platform for high-throughput screening)
プラスミド-pLKO.1は国立RNAiコア施設(National RNAi Core Facility)から購入した。 pLKO.1のClaI及びEcoRI部位内に位置するU6プロモーター断片(promoter fragment)をClaI-BamHI-EcoRI（CBE）リンカーで置換する。 CBEリンカー(CBE linker)は、二つのオリゴヌクレオチド：5'-CGATATCGGATCCGTCGACG-3'(SEQ ID NO. 1)及び5'-AATTCGTCGACGGATCCGATAT-3'(SEQ ID NO. 2)をアニーリングする(annealing)ことによって生成する。得られた二本鎖DNA断片は、ClaIの5'オーバーハング(overhang)末端、続いてEcoRV部位、BamHI部位、SalI部位及びEcoRIの5'突出末端を含んでいる。 CBEリンカーをClaI及びEcoRIでダイジェストしたpLKO.1のClaI及びEcoRI部位に連結して、pLV-CBEプラスミドを作製する。合成ポリ（A）シグナル要素（pGL3プロモーターベクター（プロメガ社、Madison、WI、USA）から）、GNMTプロモーター、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子及びシミアン空胞化ウイルス40（SV40）後期ポリ（A）シグナル要素を含む〜4キロベース（kb）断片は、SspI及びSalIで-1812/+ 14 GNMTプロモーター-ルシフェラーゼプラスミド(GNMT promoter-luciferase plasmid)をダイジェストすることによって生成する。得られた断片は、EcoRV及びSalIで消化したpLV-CBEプラスミドに連結する。 得られたGNMTプロモーターを含むpLV-GNMTpLucプラスミドは、レンチウイルスの生産に使用する。要するに、HEK293T細胞株(ATCC No. CRL-11268)を、パッケージングプラスミド-pCMV-ΔR8.91(plasmid-pCMV-ΔR8.91)、VSV-Gエンベロープ発現プラスミド-pMD.G(plasmid-pMD.G)及びpLV-GNMTpLucで、TurboFect（商標） Reagent（Fermentas、Hanover、MD）を用いて同時トランスフェクトした。レンチウイルスを含む上清は、ウェブサイト（HTTP://rnai.genmed.sinica.edu.tw/）に公表されたプロトコールに従って得られる。
Huh7細胞をレンチウイルスに感染させ、ピューロマイシン(puromycin)含有培地で選択した。 得られたコロニーの一つを採取し、増幅し、Huh7-GNMTプロモーター-ルシフェラーゼ(Huh7-GNMT promoter-Luciferase、H7GPL)と同定した。H7GPLの細胞溶解物をプロメガ社（Promega Corporation）のルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assay System）を用いたルシフェラーゼ活性測定に使用し、薬物スクリーニングプラットフォームのスクリーニングの評価基準とする。
Zhang、J.H.ら、1999、Journal of biomolecular screening、第4版、67-73頁でのZ'パラメーター式によると、シグナル/バックグラウンド（Signal/Background，S/B）、シグナル/ノイズ（Signal/Noise，S/N）及びZ'因子（Z’factor）などの統計パラメーター(Statistical parameters)を比較し、スクリーニングプラットフォームの資格を評価基準とする。
薬物スクリーニング(Drug screening)
国立中国薬品研究所（National research institute of Chinese medicine, NRICM）の伝統的な中医学薬物ライブラリー(traditional Chinese medicine library)は、324種類の純粋な化合物と480種類の粗抽出物を含む。324種類の純粋な化合物を20mg/mLの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解しており、480種類の粗抽出物を200mg/mLの濃度でDMSOに溶解しており、H7GPL細胞を96ウェルプレートに接種する。0.2mg/mLの濃度を有する324種類の純粋な化合物及び2mg/mLの濃度を有する480種類の粗抽出物のそれぞれは、24時間インキュベートし、一次スクリーニングを行う。次いでプロメガ社のルシフェラーゼアッセイシステム(Luciferase Assay System)を用いて細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定する。各プレートにおいて、6つのウェルを最終濃度1％のDMSOで処理して対照群とする。すべての試験データをZ値に変換し、各ウェル中のレポーター遺伝子の活性を得る。
次いで、Z値≧1.5の一次スクリーニングのサンプル（hit）を選択し、二次スクリーニングを上記と同じプラットフォームで行う。H7GPL細胞は、上記の二重のプレート中で前記サンプルで20時間処理し、次いでAbD serotecのalamarBlue（登録商標）試薬（Oxford、UK）を加え、さらに4時間インキュベートする。細胞毒性は、レポーター遺伝子を評価するための実験操作説明書に従って測定する。GNMTプロモーター活性を1.5倍以上に誘導した薬物は、二次スクリーニングのグリシン-N-メチルトランスフェラーゼのルシフェラーゼ活性を増加させる能力を有する薬物と見做す。
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction、qRT-PCR、Q-PCR )
シグマ アルドリッチ社のTri Reagent（登録商標）を用いて細胞を溶解し、ホモジナイズして全RNA(Total RNA)を調製し、インビトロジェン社（Carlsbad、CA、USA）の逆転写酵素試薬(Super Script II Reverse Transcriptase Kit)を用いてcDNAに逆転写する。ロシュ・ダイアグノスティックス社（Basel、Switzerland）の蛍光標識試薬(LightCycler（登録商標） First Start DNA Master SYBR Green I reagent)を用いて、アプライドバイオシステムズ社（Foster City、CA）の蛍光定量装置(ABI StepOne Plus System)でPCRの色を表させ、PCR定量をう。mRNAレベルは、標準としてTATAボックス結合タンパク質（TATA-box binding protein、TBP）のmRNAレベルを用いて正規化する。以下のプライマーを使用した：GNMT順方向プライマーACTGGATGACTCTGGACAA(SEQ ID NO. 3)及び逆方向プライマーACTGAGGATGTGGTCGT(SEQ ID NO. 4)、TBP順方向プライマーTGCACAGGAGCCAAGAGTGAA(SEQ ID NO. 5)及び逆方向プライマーCACATCACAGCTCCCCACCA(SEQ ID NO. 6)、c-Myc順方向プライマーTTCGGTTGTTGCTGATCTGTCT(SEQ ID NO. 7)及び逆方向プライマーCCCTCCACTCGGAAGGACTAT(SEQ ID NO. 8)。
免疫ブロッティング（Immunoblotting）
RIPA溶解緩衝液(RIPA lysis buffer)を用いて細胞又は異種移植腫瘍(xenograft tumors)を得る。RIPA溶解緩衝液は、50 mMのトリメチロールアミノメタン(2-Amino-2-hydroxyl- methyl-propane-1,3-diol、Tris（pH 7.5）)、150mMの塩化ナトリウム、1%のTriton X 100、0.5％のデオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholate)及び0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）からなり、その中にプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を添加する。ホスファターゼ阻害剤は、1mMのフェニルメタン-スルホニルフルオライド（Phenylmethane-sulfonyl fluoride、PMSF）、10μg/mlのロイペプチン、50μg/mlのトシル-L-リシル-クロロメタン塩酸塩(Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride、TLCK)、50 μg/mlのトシルフェニル-アラニンクロロメチルケトン(tosylphenyl-alanine chloromethyl ketone、TPCK)、1 μg/mlのアプロチニン(Aprotinin)、1mMのフッ化ナトリウム、5mMのピロリン酸ナトリウム（sodium pyrophosphate、NaPPi）及び10mMのオルトバナジウム酸ナトリウム(Na3VO4)からなる。タンパク質を既知の方法を用いて切断し、定量し、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis、SDS-PAGE）のゲル上で分離し、イムノブロッティング実験を行う。使用された抗体は、抗GNMTモノクローナル抗体14-1(YMAC Bio Tech、台湾)、抗システインプロテアーゼ3（9H19L2、Thermo scientific）、抗c-Myc（ウサギモノクローナル抗体D84C12、Ｃell signaling Technonogy社及び抗体46-0603、インビトロジェン社）及び抗β-アクチン（AC-15、シグマ アルドリッチ社）。
細胞生存率及びコロニー形成アッセイ(Cell viability and colony formation assay)
細胞毒性に対する試験薬物の効果は、操作説明書に従って、AbD serotecの蛍光検出染料であるAlamarBlue（登録商標）アッセイ及びプロメガ社のMultiTox-Fluor多重細胞毒性アッセイ(MultiTox-Fluor multiplex cytotoxicity assay)によって評価する。Huh 7細胞は、6ウェルプレートに接種する（1×104細胞/ウェル）。一晩のインキュベーションの後、細胞を特定濃度の薬物で7日間処理する。生存細胞をクリスタルバイオレットで染色し、コロニーの数を定量したOpenCFUコロニー計数ソフトウェア(OpenCFU colony counting software)で分析する。
GNMT増強剤化合物の抽出、単離及び同定(Extraction, isolation and identification of GNMT enhancer Compounds)
150グラムの市販白い芍薬根の薬(Radix Paeoniae Alba)は、台北(Taipei, Taiwan)にある漢方薬ストアから購入した。これは白い芍薬(Paeonia lactiflora Pall.)であると同定される。スキーム1（Scheme 1）に示すように、0.6リットルの50％水性メタノールで二回（88〜90℃）それぞれ1時間還流抽出する(reflux extracted)。上清を濾紙で濾過し、濾液と合わせて、0.7Lの酢酸エチルで3回分配する。酢酸エチル分配層は、減圧して溶媒を除去した後、粗抽出物24.9グラムを得り、メルク社（Merck）の40-63ミクロンのシリカゲル（ドイツ）を充填した300×30ミリメートルカラムの中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）に入れた、ジクロロメタン（Dichloromethane）及びメタノールを移動相溶媒として分離する。移動相の勾配条件は、100％ジクロロメタン〜60％ジクロロメタン/40％メタノールの直線勾配で1時間で溶出し、次に40％メタノール〜100％メタノールの直線勾配で20分間溶出し、最後に、100％メタノールで20分間溶出し、流速は18 ml/分である。
集めた画分溶出液（eluents）は、溶媒を減圧で別々に除去した後、メルク社のシリカゲル60 F254（ドイツ）吸着した薄層上に置く。酢酸エチル、メタノール及び0.1％酢酸（15：2：0.5）の混合溶媒を移動相として、薄層クロマトグラフィーにより測定する。結果は、波長254nmで、バニリン/硫酸試薬を噴霧することによって評価する。得られた8つの異なる画分（F1〜F8）は、GNMTプロモーター活性を試験した後、最も活性的なF3画分を発見する。F3画分から溶媒を除去した後、デキストランゲルLH20（Sephadex LH-20）カラムに入れ、メタノールを移動相として溶出し、溶出液を別々に減圧で溶媒を除去した後、GNMTプロモーター活性の試験により、生物活性F3-6の画分を得る。
F3-6画分は、RP-18カラム（Cosmosil、250×10mm、5μm;ナカライ、日本）を使用し、フォトダイオードアレイ検出器と連結したアジレント1100 (Agilent 1100)の高性能液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography、HPLC）システムによってさらに純化する。二つの移動相は、それぞれ0.1％酢酸を含有する水及びアセトニトリルであり、直線勾配溶出条件は、5％のアセトニトリル溶液から20分間に100％のアセトニトリルまで、3ml/分の流速で、波長203 nmでモニターする。サンプル濃度は、440mg/mLであり、注入量は、10-50μLである。波長211、231及び278nmのUV値を有する褐色の無定形粉末が得られる。前記粉末をメタノールで希釈し、質量分析のためにエレクトロスプレー質量分析（MATLCQ ESI-MS）に直接注入する。質量分析は、それぞれ963.02[M+Na]+及び939.03[M-H]-のm/z値を示す。重水素化メタノール（CD3OD）溶媒でVNMRS 600核磁気共鳴分光計（Varian、Palo Alto、CA）を用いて、得られた記録を文献スペクトルデータと比較する。前記淡褐色の無定形粉末は、図１５に示すように、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside，PGG）化合物である。PGGは、細胞ベースのアッセイのためにリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解している。
フローサイトメトリーアッセイ(flow cytometry assay)
増殖した細胞を氷冷した75％のエタノールで一晩固定し、1mg/mlのリボヌクレアーゼ(RNase A)を添加し、10μg/mlのヨウ化ロピジウム（propidium iodide）で37℃で３０分間染色する。そして、分析のためにBD バイオサイエンス社のAccura C6（BD Biosciences、San Jose）フローサイトメトリーに入れる。eBioscience社（eBioscience、San Diego、USA）の実験マニュアルに従って、細胞をアネキシンV-APCannexin V -APC Apoptosis Detection Kitで染色する。
カスパーゼ3/7活性アッセイ(Caspase 3/7 activity assay)
Huh7細胞を96ウェルプレートに入れ、溶媒又はPGGで12時間インキュベートする。システインプロテアーゼ-3及びシステインプロテアーゼ-7（Caspase 3/7）活性の測定は、プロメガ社のBulletin-Apo-ONE（登録商標） Homogeneous Caspase-3/7の実験マニュアルに従って行う。
マイクロアレイ解析(Microarray analysis)
アレイハイブリダイゼーション(Array hybridization)は、アフィメトリクス社（Affymetrix、USA）の遺伝子チップ発現解析ハンドブックに従って実施する。Affymetrix Exprssion Console（商標）のソフトウェアを使用し、生データを標準化する。t検定統計量(t-test statistic)を用いて治療群及び対照群を測定する。有意に変化したプローブセット(Significant changed probe sets) のq値は<0.005であり、平均差(mean-diff)のq値は> 1.5である。差次的に発現する遺伝子(differentially expressed genes)プローブセットは、DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery; http://david.abcc.ncifcrf.gov/)のDAVIDバイオインフォマティクスオンラインツール(DAVID Bioinformatics online tools)を用いて、アノテーション(annotation)及び経路濃縮分析(pathway enrichment analysis)を行う。
生体内の腫瘍モデル(In vivo tumor models)
すべての動物実験は、高雄医科大学の施設動物実験及び使用委員会によって審査され承認され、関連ガイドラインに従って実施される。腫瘍発生率アッセイ(tumor incidence assay)のために、5〜6週齢の雌性非肥満性糖尿病/重症複合免疫不全症（NOD-SCID）マウスに、Huh7細胞（1×106）を右脇腹に皮下注射する。移植5日後、マウスを無作為に3群に分け、F3-6（25mg/kg（mpk）i.p注射、300mpk経口投与）及び生理食塩水を週3回53日間処理する（図13及び図14参照）。
さらに、GNMT及びソラフェニブの併用効果(combinatory effect)を評価するために、胸腺を欠く雌性非肥満性糖尿病/重症複合免疫不全症（NOD-SCID）マウスに、2×106のHuh7-GFP細胞又はHuh7-GNMT細胞を皮下注射する。マウスの腫瘍が著しく増殖した状態で検出された場合、同じ異種移植を示し、マウスを無作為に二つの群に分け、10mg/kg LC(LC Laboratories)のソラフェニブ又は生理食塩水を週に3回投与する（図27参照）。
PGGの生体内の抗腫瘍効果を試験するために、2×106のHuh7細胞を上記のようにBalb/cヌードマウスに皮下移植した。マウスは有意な腫瘍増殖状態が検出された時、マウスをランダムにグループ分けし、PGG及び生理食塩水で1日1回10日間治療し、図２０に示すように、生体内の抗腫瘍効果を毎日試験する。
薬物の併用効果を評価するために、胸腺を欠く雌性非肥満性糖尿病/重症複合免疫不全症（NOD-SCID）マウスに、2×106のHuh7細胞を移植する。マウスの腫瘍が著しく増殖した状態で検出された場合、マウスを無作為にに6群に分け、生理食塩水、25 mg/kgのF3-6画分、300 mg/kgのF3-6画分、10 mg/kgのソラフェニブ、25 mg/kgのF3-6画分＋10 mg/kgのソラフェニブ及び300 mg/kgのF3-6画分＋10 mg/kgのソラフェニブで治療した。マウスに、25 mg/kg及び300 mg/kgのF3-6画分又は25 mg/kgのPGGを週３回、及び10 mg/kgのソラフェニブを週２回投与する（図２９参照）。
腫瘍の成長は、バーニアキャリパー測定(Vernier calliper measurement)を使用して、腫瘍の長さ（L）及び幅（W）を毎日又は週に3回測定する。 腫瘍体積（Tumor volume、TV）は、式体積=（L×W2）/2を用いて計算する。 F3-6画分は、リン酸緩衝食塩水（Phosphate buffered saline、PBS）に溶解しており、PGGは、リン酸緩衝食塩水又は0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩(carboxymethyl cellulose sodium salt)に溶解しており、ソラフェニブは、ポリオキシエチレンヒマシ油(Polyoxyethylene castor oil，Cremophor EL（登録商標）)/エタノール溶液に溶解している。
統計分析(Statistical analysis)
実験結果は平均値±平均値の標準誤差(Mean ± SEM)として表される。不対のサンプルと対のサンプルとの間の統計的差異は、非依存性Student’s t-testによって分析される。複数の治療群を対照群と比較すると、一元配置分散分析(one way ANOVA)又は二方向反復測定分散分析(two way repeated measures ANOVA)が適用される。分散分析(Analysis of variance，ANOVA)が統計的差異を示す場合、Dunnett's test又はStudent-Newman-Keuls test検定が適用され、p <0.05が統計的に有意であることを示す。データ及びグラフィック解析については、SigmaPlotソフトウェア（バージョンversion 8.0、Chicago、IL、USA）及びSigmaStat（バージョンversion 2.03、Chicago、IL、USA）がIBMコンピュータ上で実行される。
以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 本発明に用いられる医薬品及び生体材料は市販されており、以下のものはあくまでも例である。
実施例１ 白い芍薬の活性画分の調製
150グラムの市販の白い芍薬根の薬(Radix Paeoniae Alba)は、台北にある漢方薬ストアから購入する。これは白い芍薬(Paeonia lactiflora Pall.)であると同定される。スキーム1（Scheme 1）に示すように、0.6リットルの50％水性メタノールで二回（88〜90℃）それぞれ1時間還流抽出する。上清を濾紙で濾過し、濾液と合わせて、0.7Lの酢酸エチルで3回分配する。酢酸エチル分配層は、減圧して溶媒を除去した後、メルク社の40-63ミクロンのシリカゲル（ドイツ）を充填した300×30ミリメートルカラムの中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）に入れ、ジクロロメタン（Dichloromethane）及びメタノールを移動相溶媒として分離する。移動相の勾配条件は、100％ジクロロメタン〜60％ジクロロメタン/40％メタノールの直線勾配で1時間で溶出し、次に40％メタノール〜100％メタノールの直線勾配で20分間溶出し、最後に、100％メタノールで20分間溶出し、流速は18 ml/分である。
集めた画分溶出液（eluent）は、溶媒を減圧で別々に除去した後、メルク社のシリカゲル60 F254（ドイツ）吸着した薄層上に置いた。酢酸エチル、メタノール及び0.1％酢酸（15：2：0.5）の混合溶媒を移動相として、薄層クロマトグラフィーにより測定する。結果は、波長254nmで、バニリン/硫酸(vanillin/ sulfuric acid)試薬を噴霧することによって分析する。得られた8つの異なる画分（F1〜F8）は、GNMTプロモーター活性を試験した後、最も活性的なF3画分を発見する。F3画分から溶媒を除去した後、デキストランゲルLH20（Sephadex LH-20）カラムに入れ、メタノールを移動相として溶出し、溶出液を別々に減圧下で溶媒を除去した後、GNMTプロモーター活性の試験に、生物活性F3-6の画分を得る。
実施例２ 1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）化合物の調製
F3-6画分は、RP-18カラム（Cosmosil、250×10mm、5μm、ナカライ、日本）を使用し、フォトダイオードアレイ検出器(Photodiode Array Detector)と連結したアジレント1100 (Agilent 1100)の高性能液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography、HPLC）システムによって室温でさらに純化する。二つの移動相は、それぞれ0.1％の酢酸を含有する水及びアセトニトリルであり、直線勾配溶出条件は、5％のアセトニトリル溶液から20分間に、100％のアセトニトリルまで、3ml/分の流速で、波長203 nmでモニターし、波長211、231及び278nmのUV値を有する褐色の無定形粉末が得られる。質量分析は、それぞれ963.02[M+Na]+及び939.03[M-H]-のm/z値を示す。重水素化メタノール（CD3OD）溶媒でVNMRS 600核磁気共鳴分光計（Varian、Palo Alto、CA）を用いて、得られた記録を文献スペクトルデータと比較する。前記淡褐色の無定形粉末は、図１５に示すように、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside，PGG）化合物である。PGGは、細胞ベースのアッセイのためにリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解している。
実施例３ 五倍子画分の調製
１０５グラムの五倍子(Galla Chinesis)は、漢方薬ストアから購入する。スキーム1（Scheme 1）に示すように、0.6リットルの50％メタノールで二回それぞれ1時間還流抽出する。上清を濾紙で濾過し、濾液と合わせて、減圧で溶媒を除去して乾燥させ、粗抽出物90.6グラムを得り、450グラムのメルク社の40-63ミクロンのシリカゲルを充填したカラムの中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）に入れる。ジクロロメタン：メタノール= 90：10で溶出し、画分E1を得り、酢酸エチル：メタノール：0.1％酢酸= 15：2：0.5の溶出液は画分E2、100％メタノールの溶出液は画分E3。
集めた画分溶出液（eluent）は、溶媒を減圧で別々に除去した後、メルク社のシリカゲル60 F254（ドイツ）吸着した薄層上に置いた。酢酸エチル、メタノール及び0.1％の酢酸（15：2：0.5）の混合溶媒を移動相として、薄層クロマトグラフィーにより測定する。結果は、波長254nm及び360 nmで、バニリン/硫酸(vanillin/sulfuric acid)試薬を噴霧することによって評価する。最も活性的なE2画分をさらに純化する。E2画分から溶媒を除去した後、デキストランゲルLH20（Sephadex LH-20）カラムに入れ、メタノールを移動相として溶出し、溶出液を別々に減圧で溶媒を除去した後、PGGを含むE2-6の画分を得る。
実施例４ 五倍子画分におけるPGG化合物の分析
E2-6画分は、Thermo Syncronis 社のC18カラム（100 × 2.1 mm、1.7 μm）を使用し、フォトダイオードアレイ検出器と連結したWatersの超高性能液体クロマトグラフィー(UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC)システムによって35℃で分析する。移動相は、それぞれアセトニトリル溶液及び0.1％のリン酸緩衝液であり、勾配条件は、２％のアセトニトリル溶液で１分間溶出し、その後、2〜10％のアセトニトリル溶液直線勾配（linear gradient）で1〜2分間溶出し、１０％のアセトニトリル溶液で２分間溶出し、その後、１０〜２５％のアセトニトリル溶液直線勾配で４〜１０分間溶出し、２５〜５０％のアセトニトリル溶液直線勾配（linear gradient）で１０〜１４分間溶出する。各試料の注入の前に、1分間に100％のアセトニトリル溶液に浄化し、5分間の平衡期にある。 溶媒の流速を0.4ml/分及び1μLの注入量に維持しながら、ピークを波長203nmでモニターする。
本発明は革新的な発明である。本発明はグリシン-N-メチルトランスフェラーゼのプロモーター化合物の活性を同定するためにヒトグリシン-N-メチルトランスフェラーゼのプロモーターによって駆動されるレポーターアッセイプラットフォーム(promoter driven reporter assay platform)を確立する。天然の1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside，PGG）は潜在的候補化合物であることが見出されている。さらに、実験によって、生体外で1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシドと商品名Nexavarを有するソラフェニブの併用療法は、ソラフェニブがHuh7細胞に対する殺傷の増殖効果をもたらし、生体内で腫瘍増殖の遅延を引き起こすことをを証明した。さらに、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシドは、c-Myc遺伝子の発現を阻害するだけでなく、c-Mycタンパク質の分解も誘導する。1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシドは、明らかに新規のc-Myc阻害剤及び肝細胞癌の優れた薬物である。深い産業価値を持っているので、法律に従って出願を提出する。以上の説明によると、当業者であれば本考案の技術思想を逸脱しない範囲で、多様な変更及び修正が可能であることが分かる。従って、本考案の技術的な範囲は、明細書の詳細な説明に記載された内容に限らず、実用新案登録請求の範囲によって定めなければならない。
Claims (5)
- 癌を治療する組成物を調製するための組成物の使用であって、前記組成物が、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside，PGG）化合物を含み、
前記癌を治療する組成物が、ソラフェニブ（sorafenib）と結合し、多重の投与法（multi-administered method）を用いて被験者に投与し、
前記1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）が、芍薬（Paeonia lactiflora Pall.）又は五倍子（Galla Chinesis）からメタノールで抽出し、中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）法及びデキストランゲルLH-20カラム法により分離し、
前記1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）が、芍薬（Paeonia lactiflora Pall.）から抽出する場合、条件は以下の通りであり、
中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）が、ジクロロメタン（Dichloromethane）及びメタノールを移動相溶媒として分離し、移動相の条件が、100％ジクロロメタンから60％ジクロロメタン/40％メタノールまでの直線勾配で1時間溶出し、次に40％メタノールから100％メタノールまでの直線勾配で20分間溶出し、最後に、100％メタノールで20分間溶出し、流速は18 ml/分、デキストランゲルLH-20（Sephadex LH-20）カラムが、メタノールを移動相溶媒として溶出し、
前記1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）が、五倍子（Galla Chinesis）から抽出する場合、条件は以下の通りであり、
中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）が、ジクロロメタン：メタノール= 90：10で溶出し、画分E1を得、酢酸エチル：メタノール：0.1％酢酸= 15：2：0.5で溶出し、画分E2を得、100％メタノールで溶出し、画分E3を得、デキストランゲルLH-20（Sephadex LH-20）カラムが、メタノールを移動相溶媒として溶出する、前記組成物の使用。 - 前記癌を治療する組成物が、食品又は医薬品であり、肝臓の障害、前立腺癌及びヒト前骨髄球性白血病の治療又は保健の少なくとも一つに用いられる、請求項１に記載の組成物の使用。
- グリシン-N-メチルトランスフェラーゼ（GNMT）の促進及びc-Mycタンパク質の阻害に用いられる、請求項１に記載の組成物の使用。
- 生物体の癌を阻害する化合物を調製するための化合物の使用であって、
前記化合物が、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl -Beta-D-glucopyranoside，PGG）を含み、
前記1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）が、芍薬（Paeonia lactiflora Pall.）又は五倍子（Galla Chinesis）からメタノールで抽出し、中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）法及びデキストランゲルLH-20カラム法により分離し、
前記1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）が、芍薬（Paeonia lactiflora Pall.）から抽出する場合、条件は以下の通りであり、
中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）が、ジクロロメタン（Dichloromethane）及びメタノールを移動相溶媒として分離し、移動相の条件が、100％ジクロロメタンから60％ジクロロメタン/40％メタノールまでの直線勾配で1時間溶出し、次に40％メタノールから100％メタノールまでの直線勾配で20分間溶出し、最後に、100％メタノールで20分間溶出し、流速は18 ml/分、デキストランゲルLH-20（Sephadex LH-20）カラムが、メタノールを移動相溶媒として溶出し、
前記1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-ベータ-D-グルコピラノシド（PGG）が、五倍子（Galla Chinesis）から抽出する場合、条件は以下の通りであり、
中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）が、ジクロロメタン：メタノール= 90：10で溶出し、画分E1を得、酢酸エチル：メタノール：0.1％酢酸= 15：2：0.5で溶出し、画分E2を得、100％メタノールで溶出し、画分E3を得、デキストランゲルLH-20（Sephadex LH-20）カラムが、メタノールを移動相溶媒として溶出し、
前記生物体の癌を阻害する化合物が、生物体内のc-Mycタンパク質の安定性を妨げ、
前記化合物が、ソラフェニブ（sorafenib）と結合し、多重の投与法（multi-administered method）を用いて被験者に投与する、前記化合物の使用。 - 前記生物体の癌を阻害する化合物が、肝疾患、白血病又は前立腺の癌疾患の阻害に用いられる、請求項４に記載の化合物の使用。
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