JP6691922B2 - 網膜退化を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願
この出願は、2015年10月27日に出願された米国仮出願第62/247,099号；2015年10月26日に出願された米国仮出願第62/246,455号；および2015年2月26日に出願された米国仮出願第62/121,379号に対する優先権および遡及の特典を主張し、それらの出願の全ての開示は、本明細書中にその参照として組み込まれる。

技術分野
本開示は、網膜損傷および／または網膜退化(retinal degradation)／網膜変性(retinal degeneration)を治療するため、細胞に関連したAlu RNAによるインフラマソーム(inflammasome)活性化を阻害するため、細胞のATP-誘導透過性を減少するため、および細胞中のミトコンドリア反応性酸素種の量を減少するために有益な化合物、組成物および方法に関する。本開示は、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（NRTI）を含む化合物および組成物に関する。

背景
全世界の何百万もの人々に失明を引き起こし、それに対する承認された治療がない、地図状萎縮である加齢黄斑変性の進行形は、網膜色素上皮（RPE）細胞の死に起因する。例えば、マイクロRNA（miRNA）生物発生に関与する酵素のDICERの発現は、地図状萎縮を有するヒトの目のRPEで減少し、Dicer1の条件除去はマウスでRPE変性を誘導する。驚くべきことに、miRNAの生物発生または機能に関与する7つの他の酵素の除去は、そのような病理を誘導しない。その代わりに、DICER1のノックダウンはヒトRPE細胞においてAluリピート(repeat)RNAならびにマウスのRPEにおいてB1およびB2（Alu-様エレメント）リピートRNAの蓄積をもたらす。Alu RNAは地図状萎縮を有するヒトの目のRPEで著しく増加しており、この病理学的RNAの出現がマウスにおいてヒトRPE細胞の死およびRPE変性を誘導する。

工業国での癌と同じほど広まっている加齢黄斑変性（AMD）は、世界的に失明の主な原因である。多くの承認された治療が存在するAMDの血管新生型と対照的に、AMDのはるかに一般的な萎縮型は、ほとんど理解されておらず、有効な臨床的介入がないままである。網膜色素上皮の極度の萎縮は、重度の視力低下をもたらし、地図状萎縮と称される。

それゆえ、網膜退化／網膜変性、具体的にはRPE退化を治療するための組成物および方法に対する要求がある。

本発明の新規な特徴は、添付された特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴と利点のより良い理解は、本発明の本質が用いられている実施態様を記載している、以下の詳細な説明および添付の図を参照することによって得られるであろう。

図１は、コントロールのPBSまたはd4Tの増加する量を用いるかもしくは用いないAlu RNA処理（左〜右）を受けたマウスの眼底写真を上段列に示し；そして、Alu RNA投与で分断されるが、d4Tの一番高用量で正常なRPE形態／細胞間結合に回復する細胞間結合（ZO-1）が赤色で染色されたRPE平面プレパラートを示す。

図２は、MTS増殖アッセイによりモニターされたとき、Alu RNAの強制発現プラスミド（pAluA）で表示された時間処理されたヒト（HeLa）細胞が、ヌル（null）プラスミド（pUC19）と比較して大きく減少した生存率を示し、そしてd4Tの併用がAlu過剰発現によって誘導される細胞死を防いだことを示す棒グラフを提供する。

図３は、Alu-特異的プローブを用いたノーザンブロット法の結果を示す。図３で提示されるように、DICER1を標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Dcr as）で処理された一次ヒトRPE細胞（レーン3（左から3番目のレーン））は、コントロールのアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ctr as）（レーン1（一番左））と比較して核分画で増加したAlu RNAレベルを示し、d4Tの併用（レーン2および4）はAlu RNAレベルを減少しない。u6（下段列）は、核画分に対する負荷コントロールとして示される。

図４は、Alu-特異的プローブを用いたノーザンブロット法の結果の別の例を提供する。図４で提示されるように、d4Tの併用は、Alu-特異的プローブを用いたノーザンブロット法で検出されたように、Alu RNAでトランスフェクトされた、d4Tを有するか有しないヒトRPE細胞の核画分中のAlu RNAレベルをトランスフェクション後1、4または24時間で変えない。u6（下段列）は、図４における核画分に対する負荷コントロールとして示される。

図５は、Alu RNAがAlu投与後24時間で一次ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-1（Caspase-1）成熟（maturation）を引き起こし（上段、中央レーン、より下のバンド）、それはd4Tとの共処理（100μM；一番右のレーン）でブロックされることを示すウエスタンブロットの結果を提供する。下段列はビンキュリン負荷コントロールである。

図６は、Alu RNAがAlu投与後24時間で一次ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-1成熟を引き起こし（上段、中央レーン、より下のバンド）、それは3TCとの共処理（20〜100μM；一番右のレーン）でブロックされ、ここで一番下のバンドは負荷コントロールのビンキュリンであることを示すウエスタンブロットである。

図７は、Alu RNAがAlu投与後24時間で一次ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-1成熟（maturation）を引き起こし（上段、中央レーン、より下のバンド）、それはアジドチミジン（AZT）、コルジセピンおよびアバカビル（ABC）との共処理（50〜100μM；左からレーン3〜8）でブロックされることを示すウエスタンブロットである。負荷コントロールのビンキュリンは一番下に示される。

図８は、古典的なインフラマソーム活性化剤のLPS/ATPで処理された一次ヒトRPE細胞が、増加したCasp-1活性化、および細胞表面のレセプターアダプタータンパク質MyD88によるインフラマソームシグナル伝達のマーカーでもある、IRAK4の増加したリン酸化を示すことを示しているゲルを提供する。さらに、図８に示されるように、d4T（25/100μM）は、LPS/ATPにより誘導されたCasp-1活性およびIRAK4リン酸化をブロックする。ビンキュリンが図８のゲルにおける負荷コントロールとして用いられた。さらに、図に示されるように、LPSおよびATPは共同してのみNLRP3インフラマソームを活性化する。

図９は、ウエスタンブロット法の結果を提供する、ここで、d4T、3TCおよびコルジセピン（100μM）（全てジ-デオキシヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）が、LPS/ATPによって誘導されたカスパーゼ-1活性化（活性なp20バンド、上段）およびIL-18成熟（下段）を阻害することが示される。図９を生じるために、マウスの骨髄由来マクロファージの(i)無処理、(ii)LPS処理または(iii)LPS/ATP処理後に細胞培養上清が集められ、カスパーゼ-1およびIL-18に対する抗体でプローブするウエスタンブロット法にかけられた。

図１０は、d4T（100、250μM）が、ニゲリシンで誘導されたIL-1ベータ成熟（上段、18および22kDa体）およびカスパーゼ-1活性化（活性なp20バンド、下段）を阻害することを示すウエスタンブロットの結果を提供する。図１０を生じるために、マウスの骨髄由来マクロファージの(i)無処理、(ii)LPS処理または(iii)LPS／ニゲリシン処理後に細胞培養上清が集められ、IL-1ベータおよびカスパーゼ-1に対する抗体でプローブするウエスタンブロット法にかけられた。

図１１は、d4Tが尿酸一ナトリウム（MSU）によって誘導されるPMA-分化型THP-1単球からのIL-1ベータの分泌を阻害しないことを明らかにする棒グラフを示す。図１１は、ヒトTHP-1単球がPMAでマクロファージに分化された後に作成され、図１１に示されるようにMSU（既知のインフラマソーム活性化剤）での処理は、非処理細胞と比較してIL-1ベータの分泌を増加したのに対して、用量（25〜1000μM）の範囲でのd4T併用はIL-1ベータの分泌に有意に影響を及ぼさなかった。

図１２は、d4Tおよびその他のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が、MSUにより誘導されるPMA-分化型THP-1単球からのIL-1ベータの分泌を阻害しないことを示す棒グラフである。ヒトTHP-1単球はPMAでマクロファージに分化された。図１２に示されるように、MSUでのそれらの処理は、非処理細胞と比較してIL-1ベータの分泌を増加したのに対して、用量（25〜1000μM）の範囲でのd4T、3TCまたはコルジセピン（全てジ-デオキシヌクレオチド類似体である）の併用はIL-1ベータの分泌に有意に影響を及ぼさなかった。

図１３は、d4TがAlu RNAによって誘導されたNLRP3プライミング（priming）を減少することを示すグラフである。実際に、図１３に示されるように、Alu RNAトランスフェクションは、mock（トランスフェクション試薬のみ）と比較して16時間で一次ヒトRPE細胞でのNLRP3 mRNAレベル、「プライミング」と称される事象を増加する（Y-軸）。この効果は、d4T（100μM）の併用によって鈍り、18S RNAコントロールまで正常化される。

図１４は、Alu RNAトランスフェクションは、mock（トランスフェクション試薬のみ）と比較して24時間で一次ヒトRPE細胞でのIL-1ベータ mRNAレベル、「プライミング」と称される事象を増加する（Y-軸）ことを示す。この効果は、d4T（100μM）の併用によって鈍り、18S RNAコントロールまで正常化される。

図１５は、d4TがAlu発現によって引き起こされるミトコンドリアROSを減少することを示す。実際に、図１５は、MitoSoxアッセイにより検出されるように、Aluの強制発現（pAluA）が増加したミトコンドリア反応性酸素種（mtROS）を引き起こすことを示す。図１５を生じるために、一次ヒトRPE細胞はd4Tとまたはd4TなしにAlu発現プラスミドまたはコントロールプラスミド（pUC19）とインキュベートされた。15時間後、細胞はmtROS（赤色）および細胞カウント、核（青色、Hoechst DNA染色）のために共染色された。pAluA群の細胞は、pUC19コントロールと比較して、pAluA＋d4T処理細胞で減少する効果である、より多いmtROS染色（赤色）を示した。

図１６は、d4TがAlu RNAにより誘導されるATP放出を阻害しないことを示すグラフを提供する。さらに、Alu RNAで処理された一次ヒトRPE細胞は、図１６に示される時間、ATPを放出する。d4Tとまたはd4Tなしで処理されたmockまたはAlu RNA細胞から細胞培養上清が集められ、ATP-依存性ルシフェラーゼアッセイを用いてATPを検出した。特に、d4TはATP放出に影響を及ぼさなかった。

図１７は、d4TがYo-Pro1に対するATP-誘導細胞透過性を減少することを示す（P2X7レセプターアッセイ）。実際に、d4Tは用量依存的に、96ウェル マイクロプレート リーダー中でのエリア-スキャン蛍光測定によって決定されたATPによって誘導されるYo-Pro侵入を減少した。図１７は、相対蛍光単位での蛍光測定（RFU、y-軸）の結果を提供する。

図１８は、グラフの形式で、d4Tが、Alu RNAトランスフェクション後に増加する細胞外のカリウムレベルを減少することを示す。実際に、細胞培養のカリウムレベルはAlu RNAで6時間処理された一次ヒトRPE細胞で増加し、その効果はd4T併用により減少する。カリウムレベルは、細胞培養上清中で、カリウム-依存性ピルビン酸キナーゼアッセイを用い、分光光度法で測定された。

図１９は、d4Tが、Yo-Pro1に対するbzATP-誘導細胞透過性をブロックすることを示す（P2X7レセプターアッセイ）。図１９を作成するため、d4Tは、ヒトP2X7レセプターを安定に発現しているHEK293細胞がP2X7-選択的アゴニストのbzATPで刺激されたときに、YO-PRO-1ヨウ素侵入をブロックした。細胞は、bzATP/YO-PROの添加前にd4Tで30分間プレ-インキュベートされ、485/515nmで蛍光（相対蛍光単位で）がt=30分で測定された。

図２０は、メトキシ-d4T (me-d4T; IUPAC名: 1-[(2R,5S)-5-(メトキシメチル)-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-5-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン、本明細書で「カムブジン(Kamuvudine) 1」とも呼ばれる)の化学構造を提供する。さらに具体的に言うと、図２０に示されるように、d4Tのリボース5’ヒドロキシ基のメトキシ基での単一置換（円で囲まれた）は、d4Tリン酸化を防ぐためにデザインされた。

図２１は、Alu RNA±me-d4Tでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。

図２２は、me-d4Tはしないが、未修飾d4TがHela細胞でのGFP-発現レンチウイルスの複製をブロックしている細胞を示す。

図２３は、リアルタイム定量PCRでの測定による一次マウスRPE細胞において、me-d4Tはしないが、未修飾d4Tが、mtDNAレベル（染色体DNAエクソン-イントロン連結配列に標準化された(normalized)）を減少することを示すグラフを提供する。n=4, *p < 0.05（スチューデントt-検定による）。

図２４は、閉鎖小帯-1（ZO-1；赤色）に対して染色された平面プレパラートを提供する、下段列。変性は青色の楔形により示される。n=4の代表画像（B,C,E）が示される。スケールバー、(C): 200 μm; (E): 20 μm。

図２５は、me-d4T合成の概略図を提供する。

図２６は、me-d4T（ピーク#6）最終生成物のHPLCクロマトグラムである、純度>97%。

図２７は、me-d4T最終生成物の1H NMRスペクトロスコピーである、ここで、ケミカルシフトはme-d4Tの構造に一致する。

図２８は、me-d4T最終生成物の液体クロマトグラフィー／質量分析の結果を提供する、m/z比はme-d4Tの構造と一致する。

図２９は、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形を提供する。3TC（2’3’ ジデオキシシチジン）の化学構造が示され、ここで、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形（O-メチル基）が円で囲まれている。

図３０は、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形を提供する。AZT（3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン）の化学構造が示され、ここで、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形（O-メチル基）が円で囲まれている。

図３１は、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形を提供する。ABC（シクロプロピルアミノプリニルシクロペンテン）の化学構造が示され、ここで、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形（O-メチル基）が円で囲まれている。

図３２は、d4Tの細胞透過変形体（IC-d4T）を示し、ここで、「n」グループは11に等しい。誘導体は3TC、AZT、ABCの細胞透過変形体を含み、ここで、種々の態様において、核酸塩基グループ（円で囲まれた）は、3TC、AZT、ABC、もしくはd4T、3TC、AZT、ABC（図２９〜３１）のメトキシ-変形体、またはそれらの誘導体で置換され得る。

図３３は、本開示による例示的NRTIの構造を提示する。

図３４は、Alu RNA±d4Tでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）およびIRAK4リン酸化のウエスタンブロットである。

図３５は、Alu RNA±NRTIs（3TC、AZT、ABC）でトランスフェクトされたヒトRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化のウエスタンブロットである。

図３６は、眼底写真：上段列；閉鎖小帯-1（ZO-1；赤色）に対して染色された平面プレパラート、下段列を含む。スケールバー、50μm。

図３７は、眼底写真：上段列；閉鎖小帯-1（ZO-1；赤色）に対して染色された平面プレパラート、下段列を提供する。スケールバー、50μm。

図３８は、NRTIsがLPS/ATP-誘導インフラマソーム活性化をブロックすることを示す。具体的には、図３８はd4Tがカスパーゼ-1をブロックしたことを示唆するゲルを示す。

図３９も、NRTIsがLPS/ATP-誘導インフラマソーム活性化をブロックすることを示しており、具体的には、d4TがIL-1ベータをブロックしたことを示唆するゲルを示す。

図４０は、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）による測定により、Raji TK^- 細胞では起こらないが、Raji TK⁺細胞が、AZTをAZT-トリホスフェート（AZT-TP）にリン酸化することを示すクロマトグラムを提示する。

図４１は、細胞溶解物のウエスタンブロットによる測定により、AZTが、Raji TK^- およびTK⁺ 細胞の両方で、LPS/ATPによるIL-1ベータ活性化をブロックすることを示す。

図４２は、d4Tが一次ヒトRPE細胞（n=4）からのAlu-誘導ATP放出をブロックしないことを示す棒グラフである。

図４３は、ヒトP2X7レセプターを安定的に発現するHEK293細胞におけるbzATP（100μM）によって誘導されるP2X7-媒介YO-PRO-1色素取り込み（蛍光）が、d4TおよびA438079（両薬剤に対して64μM）により阻害されたことのグラフを提供する。蛍光の値は、bzATP処理なしでの細胞から差し引かれた基準値である。 * bzATP対d4T; # bzATP対A438079, p < 0.05 （Student-Newman Keuls ポスト-ホック検定(n = 12)による）。

図４４は、Alu RNA±d4Tでトランスフェクトされた一次マウスRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）およびIRAK4リン酸化のウエスタンブロットである。

図４５は、ビオチン-UTP-ラベル化Alu RNA-トランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞のノーザンブロットである。

図４６は、AZT-トリホスフェート（AZT-TP）のLC-MS/MSスペクトルを提供する。

図４７は、AZU-トリホスフェート（AZU-TP）のLC-MS/MSスペクトルを提供する。

図４８は、指定されたピークの同一性を確認するためのMSスペクトル（差し込み図）を伴う、AZT-TPでスパイクされた(spiked)Raji TK^- 細胞のクロマトグラフ分離を示す。

図４９は、指定されたピークの同一性を確認するためのMSスペクトル（差し込み図）を伴う、AZU-TPでスパイクされたRaji TK^- 細胞のクロマトグラフ分離を示す。

図５０は、AZT-TP基準の検量線（黒丸）である。図に示されるように、AZTで処理されたRaji TK⁺ 試料はAZT-TPを生じた（白三角）のに対して、AZT-TPはAZTで処理されたRaji TK^- 細胞で検出されなかった。

図５１は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞における、カチオン フラックス(flux)でなくP2X7孔機能(pore function)をブロックするショートペプチド（Panx1¹⁰）（対スクランブルペプチド：Scr Panx1¹⁰）でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。

図５２は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞における、孔機能でなくP2X7カチオン フラックスをブロックするカルミダゾリウム（図３２が用いられたIC-およびEC-d4Tの化学構造を提供する）でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。

図５３は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞における、細胞透過性（IC）、細胞-不透過性（EC）または未修飾（no tag）d4Tでのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。

図５４は、d4Tが、一次ヒトRPE細胞におけるpAlu-誘導ミトコンドリアROS発生を阻害することを示す。図５４において、ミトコンドリア反応性酸素種（ROS）はMitoSox（赤色）および細胞核はHoechst（青色）で可視化された。

図５５は、クエン酸鉄(III)アンモニウムの存在下での一次ヒトRPE細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。TM-3TC(構造8)(25μM)の添加は鉄-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。下段：負荷コントロールチューブリン。

図５６は、クエン酸鉄(III)アンモニウムの存在下での一次ヒトRPE細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p10サブユニット）のウエスタンブロットである。d4T-ene(構造3)(25μM)の添加は鉄-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。下段：負荷コントロールチューブリン。

図５７は、クエン酸鉄(III)アンモニウムの存在下での一次ヒトRPE細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。2me-d4T(構造4)(25μM)の添加は鉄-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。下段：負荷コントロールチューブリン。

図５８は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。d4T-ene(構造3)およびTM-3TC(構造8)(25および100μM)の添加はAlu-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。下段：負荷コントロールチューブリン。

図５９は、全ての薬剤に対して50μmの濃度で、NRTIsまたは誘導体で処理された一次ヒトRPE細胞におけるmtDNAの相対量（ビヒクル処理(DMSO)、「No Tx」と比べて）のグラフである。薬物への曝露での細胞培養中での4日後、DNAを集めた。mtDNAに対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応が行われ、ゲノムDNA配列に標準化された(normalized)。リン酸化されない修飾型のd4T（例えば、me-d4T(図20)、2 me-d4T(構造4)）は親のNRTI（d4T）と比較してmtDNA枯渇を示さなかった。TM-3TCは構造8である。N=3〜4／群、エラーバーはS.E.M.である。

図６０は、全ての薬剤に対して50μmの濃度で、NRTIsまたは誘導体で処理された一次ヒトRPE細胞におけるmtDNAの相対量（ビヒクル処理(DMSO)、「No Tx」と比べて）のグラフである。薬物への曝露での細胞培養中での4日後、DNAを集めた。mtDNAに対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応が行われ、ゲノムDNA配列に標準化された。リン酸化されない修飾型のAZT（me-AZT(構造1)、N-Me-Me-AZT(構造10)）は親の化合物(AZT)と比較してmtDNA枯渇を示さなかった。N=3〜4／群、エラーバーはS.E.M.である。

図６１は、網膜下のコントロール空-ベクター プラスミド（pNull）またはAlu RNA-発現プラスミド（pAlu）を受け、1日2回、腹腔内の修飾NRTIs（me-AZT(構造1)、N-me-me-AZT(構造10)または2 me-d4T(構造4)；25 mg/kg/投与）またはコントロール ビヒクルで処理されたマウスの眼底写真の上段列およびAlu RNA発現で妨害されるが、修飾NRTI処理で正常なRPE形態／細胞間結合に回復される細胞間結合（ZO-1）に対して赤色で染色された下段列RPE平面プレパラートを示す。

図６２は、式I（スキーム1における構造C）、式IV（構造B）、式VIII（構造E）、式X（構造D）およびメトキシ-d4T（構造A；図20にも）の合成の概略図を提供する。

図６３は、修飾NRTIsがレンチウイルス複製をブロックしないこと（レンチウイルスGFP発現をブロックしたNRTIsと対照的）を示すレンチウイルス形質導入アッセイのグラフである。NRTIs（AZT、3TC、d4T）、修飾NRTIs（me-AZT、構造1；2me-AZT、構造10；TM-3TC、構造8；me-d4T、図20；2me-d4T、構造4）またはコントロール（ビヒクル）の存在下、GFP-発現レンチウイルスが20の感染の多重度で2.5×10³ HeLa細胞に加えられた。全ての薬剤は10μMの濃度で加えられた。レンチウイルスの添加後72時間、細胞が撮像された。視野当たりのGFP-陽性細胞が記録された。n=4〜11、エラーバー S.E.M.。レンチウイルスの逆転写はGFP発現のために必須であり、修飾NRTIsは逆転写酵素をブロックしないのに対して、NRTIsは逆転写酵素をブロックすることが知られている。

図６４は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それは3TCへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図６５は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それは3Me-3TCへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図６６は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それは3Et-3TCへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図６７は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それはAZTへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図６８は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それは2Me-AZTへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図６９は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それは2Et-AZTへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図７０は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それはd4Tへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図７１は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それはO-Me N-Et d4Tへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図７２は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それはMe-d4Tへの応答においてカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図７３は、iGluc細胞ルミネッセンスアッセイの結果を示す棒グラフであり、それは2Et-d4Tへの応答において用量依存的にカスパーゼ-1活性化の阻害を示す。

図７４は、Alu-RNA-誘導カスパーゼ-1活性化が2Et-d4T (25μM)、2Me-AZT (25μM)、O-Me N-Et d4T (25μM)、d4T-ene (25〜100μM)およびTM-3TC (25〜100μM)により減少することを示す一連のウエスタンブロットを含む。

図７５は、鉄-誘導カスパーゼ-1活性がTM-3TC (25μM)、d4T-ene (25μM)、2Me-d4T (25μM)、Me-AZT (25〜100μM)および2Me-AZT (25μM)により減少することを示す一連のウエスタンブロットを含む。N=3〜4。

図７６は、補体-誘導カスパーゼ-1活性化が3TC (25μM)により減少することを示すウエスタンブロットを含む。

図７７は、パラコート-誘導カスパーゼ-1活性化が3TC (25μM)により減少することを示すウエスタンブロットを含む。

図７８は、アミロイド ベータ-誘導カスパーゼ-1活性化が3TC (10〜25μM)により減少することを示すウエスタンブロットを含む。

図７９は、「ウエットAMD」のモデルで脈絡膜血管新生が3TC (0.55 nmol)、ABC (0.64 nmol)またはAZT (0.55 nmol)により減少することを示すデータを含む。

図８０は、「ウエットAMD」のモデルで脈絡膜血管新生（CNV）がMe-d4T、O-Me-N-Et-d4T、2Et-AZTまたは3Et-3TC (0.14 nmol)により減少することを示すデータを含む。

図８１は、既存のCNV病変を有する初代(first)マウスの左目（上２列）および右目（下２列）の眼底写真を含み、第1および第3列はCNV病変からの時間依存の色素漏出を示し、第2列は3TCの125 ngの単回硝子体内投与後の時間依存の色素漏出を示し、第4列は3-Me-3TCの62.5 ngの単回硝子体内投与後の時間依存の色素漏出を示す。

図８２は、既存のCNV病変を有する2代(second)マウスの左目（上２列）および右目（下２列）の眼底写真を含み、第1および第3列はCNV病変からの時間依存の色素漏出を示し、第2列は3TCの125 ngの単回硝子体内投与後の時間依存の色素漏出を示し、第4列は3-Me-3TCの62.5 ngの単回硝子体内投与後の時間依存の色素漏出を示す。

図８３は、「ドライAMD」のモデルでAlu RNA-誘導RPE変性が3Me-3TCおよびO-Me N-Et d4Tによってブロックされることを示すデータを含む。

図８４は、「ドライAMD」のモデルでpAlu-誘導RPE変性が3Me-3TCによってブロックされることを示すデータを含む。

図８５は、「ドライAMD」のモデルでpAlu-誘導RPE変性が3Et-3TCによってブロックされることを示すデータを含む。

図８６は、「ドライAMD」のモデルでpAlu-誘導RPE変性が2Et-d4Tまたは2Et-AZTによってブロックされることを示すデータを含む。

図８７は、「ドライAMD」のモデルでポリIC-誘導RPE変性がMe-d4Tまたは2-Me-d4Tによってブロックされることを示すデータを含む。

図８８は、「ドライAMD」のモデルでアミロイド ベータ-誘導RPE変性が3TCまたはK-2（2Me-d4T）によってブロックされることを示すデータを含む。

図８９は、「ドライAMD」のモデルで鉄-誘導RPE変性がd4T、K-1（Me-d4T）またはK-2（2Me-d4T）によってブロックされることを示すデータを含む。

図９０は、d4T、AZTまた3TCが網膜変性を引き起こし得ることを示すデータを含む。

図９１は、カムブジン類(Kamuvudines)が網膜に対して毒性がないことを示すデータを含む。

図９２は、カムブジン類が網膜に対して毒性がないことを示すさらなるデータを含む。

図９３は、NRTIs（d4T、3TCまたはAZT）がミトコンドリアDNA（mtDNA）を減少するのに対して、修飾NRTIs（Me-d4T、2Me-d4T、TM-3TC、Me-AZTまたは2Me-AZT）はmtDNAを減少しないことを示すデータを含む。

図９４は、NRTIs（d4T、AZTまたは3TC）はL1レトロ転位を阻害するが、修飾NRTIs（Me-d4T、2Me-d4T、Me-AZT、2Me-AZT、3Me-3TC、2Et-d4T、2Et-AZTまたは3Et-3TC）はL1レトロ転位を阻害しないことを示すデータを含む。

実施態様の詳細な説明
ここで開示の主題は、この説明を通して具体的であるが非限定の例によって説明される。それらの例は、本発明に関する開発および実験の過程中の種々の時点で集められたデータを代表するデータの編集を含み得る。それぞれの例は、本開示の説明のために提供され、それらへの限定ではない。実際、本開示の範囲から逸脱することなしに本開示の教示に種々の修正および変化がなされ得ることは当業者に明らかであろう。例えば、1つの態様の部分として説明または記載された特徴は、なおさらなる態様を生むために別の態様で用いられ得る。

本開示の個々の特徴または限定に対する全ての言及は、他に特定されていないか、またはその言及がなされている文脈でそれとは反対のことが明確に暗示されていなければ、対応する複数の特徴または限定を含むであろうし、逆もまた同様である。

本明細書で用いられる方法または工程の段階の全ての組合せは、他に特定されていないか、またはその言及される組合せがなされている文脈でそれとは反対のことが明確に暗示されていなければ、いかなる順序でも行われ得る。

本明細書で用いられる用語は、当業者に十分に理解されると信じるが、ここで開示の主題の説明を容易にするため、若干の定義が記載される。

他に定義されていなければ、本明細書で用いられる技術的および科学的用語の全ては、本発明が属する技術の熟練者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。

URLまたは他のそのような識別子もしくはアドレスに対する言及がなされる場合、そのような識別子は変化し得るし、インターネット上の特定の情報は現れたり消えたりし得るが、等価な情報はインターネットを検索することにより見い出され得ることが理解される。

本明細書で用いられるとき、あらゆる保護基および化合物に対する略語は、他に表示がなければ、それらの一般的使用、広く認められている略語または生化学命名法におけるIUPC-IUB Commission（Biochem. (1972) 11(9):1726-1732参照)と一致する。

長年の特許法の慣行に従って、「a」、「an」および「the」の用語は、本願において用いられるとき、特許請求の範囲を含めて、「１またはそれより多い」を指す。よって、例えば、「細胞(a cell)」と言及することは、多数のそのような細胞を含むなどである。

他に表示されていなければ、本明細書および特許請求の範囲で用いられる成分量、反応条件のような特性およびその他諸々を表す全ての数値は、全ての事例において、「約」の用語により修飾されていると理解されたい。したがって、そうでないと表示されていなければ、この明細書および特許請求の範囲において規定された数値パラメータは、ここで開示の主題によって得ようとする所望の特性に依存して変動し得る近似値である。

本明細書で用いられるとき、「約」という用語は、値または質量、重量、時間、容量、濃度もしくはパーセンテージについて言及するとき、特定量からの、ある実施態様においては±20%、ある実施態様においては±10%、ある実施態様においては±5%、ある実施態様においては±1%、ある実施態様においては±0.5%、ある実施態様においては±0.1%の変化を包含することを意味する。なぜなら、そのような変化は開示された方法を行うのに適切であるからである。

本明細書で用いられるとき、範囲は、ある特定値に「約」を付した値からおよび/または別の特定値に「約」を付した値までとして表すことができる。また、本明細書で開示される多くの値が存在し、各値はその値自体に加えて、当該特定値に「約」を付した値としても本明細書で開示されていると理解されたい。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」もまた開示されている。また、２つの特定単位間の各単位も開示されていると理解されたい。例えば、10および15が開示されている場合、11、12、13および14もまた開示されている。

本明細書で用いられるとき、「任意の」または「任意に」の用語は、それに続いて記載される事象または状況が起こるか、起こらないことを意味し、該記載は、該事象または状況が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。例えば、任意に可変の部分は、その部分が変わるか変わらないことを意味する。

「生理学的に機能する誘導体」の用語は、本開示の化合物の医薬的に許容なあらゆる誘導体を意味する。例えば、式(I)の化合物または式(II)の化合物のアミドまたはエステルは、対象、具体的には哺乳動物への投与において、その活性代謝物である本開示の化合物を直接的または間接的のいずれかで供給することができる。

「治療」または「治療する」の用語は、病状または障害（例えば、網膜退化）を、治療する、改善する、安定させるか、または予防する意図での、対象の医学的管理を意味する。この用語は、積極的治療、すなわち病状の改善に特に向けられた治療を含み、また、原因治療、すなわち関連病状の原因の排除に向けられた治療も含む。さらに、この用語は、緩和治療、すなわち病状の治癒よりもむしろ症状の緩和のために設計された治療；予防的治療、すなわち関連病状の症状または障害の進行を最小限にする、あるいは、部分的または完全に阻害することに向けられた治療、ならびに補助的治療、すなわち関連疾患、病状、または障害の改善に向けられた別の特定の治療を補完するために利用される治療を含む。

本化合物を投与することに関して、「投与する」の用語は、対象への化合物および／またはその医薬組成物を提供するあらゆる方法を意味する。そのような方法は、当業者に公知であり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、鼻腔内投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、ならびに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、硝子体内の持続的薬物送達デバイスによるものを含む硝子体内投与、前房内（前房へ）投与、脈絡膜上注射、網膜下投与、結膜下注射、テノン嚢下投与、球周囲投与、経強膜薬物送達、局所点眼薬による投与等のような注入可能ものを含む非経口投与を含むが、これらに限定されない。投与は、継続的または間欠的であり得る。種々の観点において、製剤は、治療的に投与され得る；すなわち、既存の疾患または病状を治療するために投与される（例えば、OP化合物への曝露）。さらに種々の観点において、製剤は、予防的に投与され得る；すなわち、疾患または病状を予防するために投与される。

「有効量」の用語は、所望の結果を達成するか、または望ましくない状態に効果を及ぼすのに十分な量を意味する。例えば、「治療的な有効量」とは、所望の治療結果を得るか、または望ましくない症状において効果を及ぼすのに十分であるが、有害な副作用を引き起こすのには一般的に不十分である量を意味する。任意の特定の患者に対する具体的な治療的有効量レベルは、治療される障害およびその障害の重篤度；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般健康、性別、および食事；投与の時間；投与経路；使用される特定の化合物の排出速度；治療の期間；使用される特定の化合物と組み合わせるか、または同時に使用される薬物を含む種々の要因、ならびに医療技術における公知の要因等に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を漸増することは、当該分野の十分な技術の範囲内である。必要なら、効果的な１日量は、投与のために複数回投与量に分けることができる。それゆえに、単回の投与組成物は、そのような量、または、１日量を成すその分割量(submultiples)を含むことができる。該投与量は、あらゆる禁忌の事象において、個々の医師により調整され得る。投与量は変わり得るし、１日または数日間、１日当たり１回以上の用量投与において投与され得る。ガイダンスは、医薬品の所定のクラスに対する適切な投与量に関する説明書に見出され得る。さらに種々の観点において、製剤は、「予防的有効量」、すなわち、疾患または病状を予防するのに有効な量において投与され得る。

「対象(subject)」または「それを必要とする対象」の用語は、特定の疾患、病状、障害等に関連した症状を任意に示す、投与の対象を意味する。本明細書に開示される方法の対象は、ヒトまたは非ヒト（例えば、霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモット、げっ歯類および非哺乳類）であり得る。「対象」の用語は、特定の年齢または性を意味しない。したがって、雄性であろうと雌性であろうと、大人および新生の対象、ならびに胎児が対象とされることが意図される。「対象」の用語は、ヒトおよび獣医の対象を含む。

当業者により認識されるように、「抑制」、「抑制する」、「抑制剤」、「阻害」、「阻害する」または「阻害剤」の用語は、全ての場合において、血管新生の完全な除去を意味しない。むしろ、当業者は、「抑制する」または「阻害する」の用語は血管新生における縮小または減少を意味することを理解するでああろう。そのような縮小または減少はコントロールに対して決定され得る。ある態様において、コントロールに対する縮小または減少が、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100% 減少であり得る。

ある実施態様において、ここに開示される主題は、網膜損傷および／または網膜変性を治療するための方法を含む。実際、本開示のある方法は、網膜損傷および／または退化を治療するための組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。

ある態様において、本組成物はヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）を含む。さらに、ある態様において、本組成物は、ヌクレオシドおよび／またはNRTI化合物ならびに医薬的に許容な担体を含む医薬組成物である。

本明細書で議論されるように、本開示のある例示方法において、投与される組成物は、ヌクレオシドおよび／またはNRTIを含む組成物である。したがって、例示組成物は、次のものに限定されないが、スタブジン（d4T）、ラミブジン（3TC）、コルジセピン、アジドチミジン（AZT）、アバカビル（ABC）それらの化学的誘導体（例えば、リン酸化を排除するメトキシ誘導体）等を含む化合物から構成される。他の可能な化合物は、例えば、Herediaらによる米国特許第6,514,979号に記載の化合物を含む。当業者はまた、本開示の組成物および方法に用いることができる、本明細書に記載のさらなるヌクレオシドおよび／またはNRTIsを認識するであろう。

ある態様において、本開示の方法は、Alu RNAによる1以上の生理学的プロセスの活性化を阻害することを含む。本明細書に開示されるように、Alu RNA（ヒト細胞ならびにB1およびB2におけるAluリピートRNA、Alu様エレメント リピートRNAsを含む）増加は、興味のある特定の病状に関連した細胞に関連する。例えば、Alu RNA増加は、地図状萎縮を有する眼の網膜色素上皮（RPE）細胞に関連する。Alu RNAのこの増加は、RPE細胞の死を誘導する。本明細書に開示の方法および組成物は、RPE退化を治療することができ、その結果、そのような細胞死に関連する状態を治療することができる。

ある態様において、本開示の方法は、少なくとも1つのインフラマソームの活性化を阻害することを含む。ある態様において、少なくとも1つのインフラマソームは、NLRP3インフラマソーム、1L-1ベータインフラマソームおよびそれらの組合せから選択される。ある態様において、細胞の1つ以上のインフラマソームを阻害することは、細胞および／または対象に阻害剤（組成物）を投与することを含む、ここで、細胞は対象の細胞である。阻害剤を含む組成物に対して、本明細書に記載の阻害剤は、例えば、ポリペプチド阻害剤（オリゴヌクレオチド阻害剤を含む）、低分子阻害剤、および／またはsiRNA阻害剤であり得る。

さらに、本組成物を投与するある例示方法は、LPS/ATPによる炎症、LPS/ATPによるインフラマソーム活性化、Alu RNAによるインフラマソーム活性化、および／またはニゲリシン誘導インフラマソーム活性化を阻害することができる。例示方法は、特にAlu RNA発現、P2X7レセプターによる侵入をブロックおよび／またはATP誘導細胞透過性の減少により引き起こされる、網膜退化および／またはミトコンドリア反応性酸素種によるその他の網膜損傷も治療することができる。

ある態様において、本開示の方法は、細胞中の特定の作用を阻害することにより網膜損傷を治療することを含む。ある態様において、細胞はRPE細胞、網膜視細胞または脈絡膜細胞から選択される。ある態様において、細胞はRPE細胞である。ある態様において、細胞は対象の細胞である。ある態様において、細胞は、興味ある病状を有するか、または有することが疑われるか、または有する危険性がある対象の細胞である。ある態様において、細胞は、加齢黄斑変性を有するか、または有することが疑われるか、または有する危険性がある対象の細胞である。ある態様において、細胞は地図状萎縮を有するか、または有することが疑われるか、または有する危険性がある対象の細胞である。ある態様において、細胞が理的萎縮を有するか、または有することが疑われるか、または有する危険性がある対象の細胞であり、かつその細胞がRPE細胞である。ある態様において、加齢黄斑変性を有する対象は、本明細書に開示される方法および組成物を用いて治療され得る。

したがって、ポリペプチドが阻害されることに関連して本明細書で用いられるとき、「細胞の」は細胞の内側（細胞膜の内側）、細胞上（細胞膜の中、細胞膜上、そうでなければ細胞上に存在、）または細胞の外側にあるポリペプチドを意味するが、ポリペプチドが細胞の外側にある場合、それは、当業者がそのポリペプチドを細胞に関連すると認識するような細胞外環境にある。例えば、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-8、NFκB、またはインフラマソームのポリペプチド（例えば、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-1)は、細胞に中に存在し得る。別の例として、NLRP3は細胞中または細胞上に存在し得る。

本明細書に記載されているように、ここに開示の主題は、医薬的に許容な担体と共に本明細書に開示の化合物を含む医薬組成物をさらに含む。

「医薬的に許容な担体」の用語は、無菌水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョン、ならびに使用直前の無菌の注射液または分散液への再構成のための無菌粉末を意味する。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散の際に必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持され得る。これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジュバントも含有し得る。微生物の作用の予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等のような種々の抗菌剤および抗真菌剤の包含により確保され得る。糖類、塩化ナトリウム等のような等張剤を含むことも望ましい。注入可能な医薬剤形の持続的吸収は、吸収を遅延する、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような薬剤の包含により引き起こされ得る。注入可能なデポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコライド、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（無水物）のような生分解性のポリマー中で薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。ポリマーに対する薬物の割合および利用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。デポー型注入可能な製剤はまた、体内組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより製造される。注入可能な製剤は、例えば、細菌保持濾過器を通しての濾過により、または滅菌水または使用直前の他の注入可能な無菌媒体に溶解されるか、または分散され得る無菌固体組成物の形態中に、滅菌剤を組み込むことにより滅菌され得る。適した不活性担体は、乳糖のような糖類を含むことができる。

適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および対象とする受容者の体液と等張の製剤を与える溶質を含み得る水性および非水性の無菌注射液；および懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。

本組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとることができ、それは懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化(formulatory)剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質なしの無菌水での構成のための粉末の形態であり得る。

本製剤は、単位用量または多用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供され、それは使用の直前に無菌液体担体の添加のみを必要とする冷凍または凍結乾燥（凍結乾燥された(lyophilized)）状態で保存され得る。

経口投与のため、本組成物は、例えば、結合剤（例えば、前もってゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような医薬的に許容な賦形剤を用いる慣用の技術によって製造される錠剤またはカプセルの形態をとり得る。錠剤は当該技術で公知の方法によりコーティングされ得る。

経口投与用液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとり得るか、それらは、使用前に水または他の適切なビヒクルでの構成のための乾燥物質として提供され得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水溶性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存剤（メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような医薬的に許容な添加剤を用いる慣用技術によって製造され得る。本製剤は、必要に応じて、緩衝塩、着香剤、着色剤および甘味剤も含み得る。経口投与用製剤は、活性化合物の制御された放出を与えるために適当に製剤化され得る。口腔投与のため、本組成物は慣用の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。

本組成物は、点眼剤として製剤化され得る。例えば、その医薬的に許容な担体は、生理食塩水または点眼剤を製剤化するために用いられるその他の物質、任意にその他の剤を一緒に含み得る。したがって、点眼製剤は、対象の眼への直接的な局所投与を可能にする。

本組成物はまた、埋め込みまたは注入用の製剤として製剤化されうる。したがって、例えば、本化合物は、適当なポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば、許容な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化され得る。本化合物はまた、直腸組成物、クリームもしくはローション、または経皮パッチに製剤化され得る。

ここに開示の主題は、本明細書に記載の化合物または医薬組成物を含み得るキットをさらに含み、それは本化合物または組成物の投与のために役立つデバイスと一緒に梱包される。当業者により認識されるように、適当な投与補助デバイスは、選択される化合物または組成物の製剤および／または求められる投与部位に依存するであろう。例えば、化合物または組成物の製剤が、対象における注射に適するなら、そのデバイスはシリンジであり得る。別の例として、求められる投与部位が細胞培地であるなら、そのデバイスは滅菌ピペットであり得る。

さらに、本開示のNRTIsは、過去数十年間のヒトの使用で集められた多大な薬物動態および安全性データを有する、種々の、幅広く用いられる小分子の安価なクラスである；それゆえ、NRTIsは再度目的を持たす薬物に十分である。そのため、本開示は、主要な満たされていない医療ニーズに対処することにより、1以上のNRTIsの使用に対して新規かつ広範囲に適用可能な基盤を提供する。

前で簡単に記載されたように、加齢黄斑変性は、全世界で数千万のヒトを襲う疾患であり、AMDに対する有効な治療法はない(AmbatiおよびFowler, 2012)。同様に、移植片対宿主病は、成功の組織移植を妨げる主要な妨害物である(Ferraraら, 2009)；そして非感染性の肝炎は、主に線維症および発癌に向かわせる、薬物誘導肝臓損傷および脂肪肝炎への主要な一因である(KubesおよびMehal, 2012)。したがって、本開示のある方法および／または化合物は、ある態様において、本開示で提供される少なくとも1つのNRTIを含む化合物を投与することにより、加齢黄斑変性、移植片対宿主病、および／または非感染性の肝炎を治療することが意図される。

NRTIsによるインフラマソーム阻害は特定のNRTIのリン酸化なしに達成され得るので、本明細書で提供されるme-d4Tまたはその他のリン酸化無能力ヌクレオシド類似体の使用はNRTI-トリホスフェート媒介ポリメラーゼ阻害に関連する治療的制限毒性を回避するであろう(Lewisら, 2003)。したがって、ある態様において、本開示は、me-d4Tまたはその他のリン酸化無能力ヌクレオシド類似体をそれを必要とする対象に投与することにより網膜疾患を治療するための方法を指向する。

さらに、ある態様において、本開示は、それを必要とする対象に化合物または組成物の有効量を投与することを含む、網膜損傷を治療するための方法を提供する、ここで、組成物は本明細書に開示の化合物またはそれらの組合せを含む。

ある態様において、ここに開示の主題は、それを必要とする対象に化合物または組成物の有効量を投与する工程を少なくとも含む、RPE細胞、網膜視細胞、脈絡膜細胞、またはそれらの組合せを保護するための方法を提供する、ここで、組成物は本明細書に開示の化合物またはそれらの組合せを含む。

ある態様において、ここに開示の主題は、それを必要とする対象に化合物または組成物の有効量を投与することを含む、網膜損傷および／または退化に関連する病状のための方法を提供する、ここで、組成物は本明細書に開示の化合物またはそれらの組合せを含む。

ある態様において、ここに開示の主題は、それを必要とする対象に化合物または組成物の有効量を投与することを含む、加齢黄斑変性（AMD）を治療するための方法を提供する、ここで、組成物は本明細書に開示の化合物またはそれらの組合せを含む。ある態様において、ANDはウエットAMDである。ある態様において、ANDはドライAMDである。

本明細書に記載されているように、本発明者らは、HIVおよびHBVの治療に対してFDAで承認されているヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が、ドライおよびウエット加齢黄斑変性（AMD）のマウスモデルで有効であることを驚くべきことに発見したことを経験している(Fowlerら, Science 2014)。しかしながら、本発明者らにより試験されたNRTIsのいくつか（すなわち、d4T、AZT）は、患者に望ましくない副作用を引き起こし、それは、ミトコンドリア枯渇をもたらすDNAポリメラーゼ-ガンマへの的外れの効果のために起こると考えられる。もしNRTIsがAMDのような慢性疾患を治療するために用いることができるのなら、NRTIsでの長期のポリメラーゼ阻害はそれらの臨床移動を妨げる。

本発明者らは、d4Tの新規なメトキシ-修飾型をデザインした(Fowlerら, Science 2014)。しかしながら、me-d4Tの合成は骨が折れた（10工程を超える）。さらに、AZTおよび3TCのような他のNRTIsもまた、これらの薬物の修飾型がドライおよびウエットAMDのマウスモデルでも有効であるかどうかは知られていないけれども、それらのマウスモデルをブロックした(Fowlerら, Science 2014; Mizutaniら, IOVS 2015, 印刷中)。したがって、ここに開示の主題は、以前に公知の化合物の欠点を有しない、本明細書に開示される用途に対して有用な独創的な化合物を含む。

ある態様において、ここに開示の主題は、次の構造：
を有する化合物またはその医薬的に許容な塩を提供する、

ここで、
R₁は、共有結合、H、アルキル、置換アルキル、分枝アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノから選択され；ある態様において、R₁はエチル、ブチル、プロピル、2-メチルプロピルおよびt-ブチルから選択され；そしてある態様において、R₁は共有結合、Hおよび-CH₃から選択され；
R₂は、H、アルキル、置換アルキル、分枝アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノから選択され；ある態様において、R₂はエチル、ブチル、プロピル、2-メチルプロピルおよびt-ブチルから選択され；ある態様において、R₂は-N(R₃)₂（ここで、R₃はそれぞれ独立して、アルキル、置換アルキル、分枝アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノから選択され、そして、ある態様において、R₃はそれぞれ独立して、H、CH₃、エチル、ブチル、t-ブチル、イソブチル、プロピル、2-メチルプロピル、イソプロピル、ペンチルおよびヘキシルから選択される）であり；
R₄は、H、アルキル、置換アルキル、分枝アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノから選択され；そして、ある態様において、R₄は-CH₃およびエチルから選択され；

R₅はC、CHおよびSから選択され；
R₆は、H、アルキル、置換アルキル、分枝アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノから選択され；ある態様において、R₆はエチル、ブチル、プロピル、2-メチルプロピルおよびt-ブチルから選択され；ある態様において、R₆は-N=N⁺=NHおよびN₃から選択され；そして
R₇は、H、アルキル、置換アルキル、分枝アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノであり；ある態様において、R₇はエチル、ブチル、プロピル、2-メチルプロピルおよびt-ブチルから選択され；そして、ある態様において、R₇は-CH₂-O-CH₃、-CH₃、=CH₂、-CH₂-NH₂および-CH₂-N=N⁺=NHから選択され；そして、ある態様において、R₇は、-CH₂-O-R₈（ここで、R₈はアルキル、置換アルキル、アルキレン、アシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアシルアミノから選択され、そして、ある態様において、R₈は-CH₃、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルから選択される）である。

本明細書で用いられる、「アルキル」の用語は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、メチルプロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニルおよびアレニル基を含む、C1-20までの線状（すなわち「直鎖」）、分枝状、または環状、飽和もしくは少なくとも一部およびある場合には完全に不飽和の（すなわち、アルケニルおよびアルキニル）炭化水素鎖を意味する。「分枝状」は、メチル、エチルまたはプロピルのような低級アルキル基が線状アルキル鎖に結びついたアルキル基を意味する。「低級アルキル」は、1〜約8個の炭素原子（すなわち、C1-8アルキル）、例えば、1、2、3、4、5、6、7または8個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。「高級アルキル」は、約10〜約20個の炭素原子、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。ある態様において、「アルキル」は、特にC1-8直鎖アルキルを意味する。その他の態様において、「アルキル」は、特にC1-8分枝鎖アルキルを意味する。

アルキル基は、同一または異なることができる1以上のアルキル基置換基で任意に置換され得る（「置換アルキル」）。「アルキル基置換基」の用語は、次のものに限定されないが、アルキル、置換アルキル、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシ、アリールオキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシ、アラルキルチオ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、オキソおよびシクロアルキルを含む。アルキル鎖の間に1以上の酸素、硫黄または置換または無置換の窒素原子が任意に挿入され得る、ここで、窒素置換基は、水素、低級アルキル（本明細書で「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）またはアリールである。

したがって、本明細書で用いられるとき、「置換アルキル」の用語は、アルキル基の1以上の原子またな官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェートおよびメルカプトを含む別の原子または官能基と置き換わった、本明細書で定義されるアルキル基を含む。

さらに、本明細書で用いられるとき、アルキルおよび／または「置換アルキル」の用語は、「アリル」または「アリル基」を含む。「アリル基」または「アリル」の用語は、基CH2HC=CH2および置換により形成されるその誘導体を意味する。したがって、アルキルおよび／または置換アルキルの用語は、アリル基、例えば、次のものに限定されないが、アリル、メチルアリル、ジメチルアリル等を含む。「アリル位」または「アリル部位」の用語はアリル基の飽和炭素原子を意味する。したがって、アリル部位にくっついたヒドロキシ基またはその他の置換基のような基は、「アリリック(allylic)」と呼ばれ得る。

「アルキレン」は、1〜約20個の炭素原子、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の炭素原子を有する、線状または分枝状の2価の脂肪族炭化水素基を意味する。アルキレン基は、線状、分枝状または環状であり得る。アルキレン基はまた、任意に不飽和および／または1以上の「アルキル基置換基」で置換され得る。アルキレン基の間に1以上の酸素、硫黄または置換または無置換の窒素原子（本明細書で「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）が任意に挿入され得る、ここで、窒素置換基は、前記のアルキルである。典型的なアルキレン基は、メチレン (-CH2-)；エチレン (-CH2-CH2-)；プロピレン (-(CH2)3-)；シクロへキシレン (-C6H10-)；-CH=CH-CH=CH-；-CH=CH-CH2-；-(CH2)q-N(R)-(CH2)r-（ここで、qおよびrはそれぞれ独立して、0〜約20の整数、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20であり、Rは、水素または低級アルキルである）；メチレンジオキシ (-O-CH2-O-)；およびエチレンジオキシ (-O-(CH2)2-O-)を含む。アルキレン基は、約2〜約3個の炭素原子を有することができ、さらに6〜20個の炭素を有することができる。

本明細書で用いられるとき、「アシル」の用語は、カルボキシ基のOHが別の置換基で置き換えられた有機酸基（すなわち、Rが本明細書で定義されるアルキルまたはアリール基である、RCO-で表されるような）を意味する。それゆえ、具体的に、「アシル」の用語は、アセチルフランおよびフェナシル基のようなアリールアシル基を含む。アシル基の具体的な例はアセチルおよびベンゾイルを含む。

「アルコキシ」または「アルコキシアルキル」は、アルキル-O-基を意味する、ここでアルキルは前記の通りである。本明細書で用いられる「アルコキシ」の用語は、C1-20までの線状、分枝状、または環状、飽和もしくは不飽和のオキソ-炭化水素鎖を意味し、例えば、それはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、t-ブトキおよびペントキシを含む。

「アシルオキシ」は、アシルが前記の通りである、アシル-O-基を意味する。

「アシルアミノ」は、アシルが前記の通りである、アシル-NH-基を意味する。

「アミノ」の用語は、-NH2基を意味する。

環式の環構造中の結合を表す破線は、その結合が環中に存在するか存在しないかのどちらかであり得ることを示す。すなわち、環式の環構造中の結合を表す破線は、環構造が飽和の環構造、部分的に飽和の環構造および不飽和環構造からなる群から選択されることを示す。

さらに、ある態様において、本開示は、以下に開示される1以上の化合物、それらの化合物を含む医薬組成物、それらの化合物の合成および／または使用を指向する。

ある態様において、ここに開示される化合物は、式I〜XIVのいずれか1つの構造またはその医薬的に許容な塩を有する。

Me-AZT：1-[(5R)-2-(メトキシメチル)-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-1-イル)オキソラン-3-イル]トリアザ-1,2-ジエン-2-イウム (本明細書でカムブジン 5とも呼ばれる)

デオキシ-メチル-d4T：5-メチル-1-[2R,5R)-5-メチル-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン

メチレン d4T：5-メチル-1-[2R)-5-メチリデン-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン

2Me-d4T：1-[(2R)-5-(メトキシメチル)-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-3,5-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン (本明細書で「カムブジン 2」とも呼ばれる)

デオキシ-アミノ-d4T：1-[(2R)-5-(アミノメチル)-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-5-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン

Me-3TC：4-アミノ-1-[(2R,5S)-2-(メトキシメチル)-1,3-オキサチオラン-5-イル]-1,2-ジヒドロピリミジン-2-オン

デアミノ-Me-3TC：1-[(2R,5S)-2-(メトキシメチル)-1,3-オキサチオラン-5-イル]-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン

3Me-3TC：4-(ジメチルアミノ)-1-[(2R,5S)-2-(メトキシメチル)-1,3-オキサチオラン-5-イル]-1,2-ジヒドロピリミジン-2-オン (本明細書でカムブジン 6およびTM-3TCとも呼ばれる)

アジド-d4T：1-｛[(2S,5R)-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-1-イル)-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]メチル｝トリアゾ-1,2-ジエン-2-イウム

2Me-AZT：1-[(2R,4S,5S)-4-アジド-5-(メトキシメチル)オキソラン-2-イル]-3,5-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン (本明細書でカムブジン4とも呼ばれる)

O-Me N-Et d4T：3-エチル-1-[(2R,5S)-5-(メトキシメチル)-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-5-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン (本明細書でカムブジン3とも呼ばれる)

2Et-AZT：1-[(2R,4S,5S)-4-アジド-5-(エトキシメチル)オキソラン-2-イル]-3-エチル-5-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン (本明細書でカムブジン8とも呼ばれる)

2Et-d4T：1-[(2R,5S)-5-(エトキシメチル)-2,5-ジヒドロフラン-2-イル]-3-エチル-5-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-2,4-ジオン (本明細書でカムブジン7とも呼ばれる)

3Et-3TC：4-(ジエチルアミノ)-1-[2-(エトキシメチル)-1,3-オキサチオラン-5-イル]-1,2-ジヒドロピリミジン-2-オン (本明細書でカムブジン 9とも呼ばれる)

ある態様において、ここに開示の化合物は、次の化合物のいずれか1つの構造、またはその医薬的に許容な塩を有する：

ある態様において、ここに開示の化合物は、次の化合物のいずれか1つの構造、またはその医薬的に許容な塩を有する：

ある態様において、ここに開示の化合物は、次の化合物のいずれか1つの構造、またはその医薬的に許容な塩を有する：

さらに、本開示は、薬物および／または医薬のような医薬組成物、特に哺乳動物の網膜損傷および／または網膜変性の治療のための組成物の調製または製造における、本明細書に開示の化合物またはそれらの組合せのいずれかの使用を提供する。ある態様において、本開示は、医薬的に許容な担体と共に、本明細書に開示の化合物、それらの塩いずれか、具体的にそれらの医薬的に許容な塩のいずれか、それらの溶媒和物のいずれか、および／またはそれらの生理学的誘導体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。

ある態様において、本開示の方法および組成物は、移植片対宿主病、慢性疼痛、増殖性硝子体網膜症、緑内障、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、双極性障害、大鬱病性障害、腎線維症、腎炎、肺線維症、ハンチントン病、骨粗鬆症、慢性リンパ球性白血病、不安障害、肺結核、更年期後の女性および骨折患者における骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス、円板状エリトマトーデス、慢性炎症性および神経因性疼痛、常染色体優性多発性嚢胞腎、脊髄損傷、アルツハイマー病、神経因性疼痛、高血圧症、静脈瘤、I型糖尿病、II型糖尿病、痛風、自己免疫性肝炎、移植血管損傷(graft vascular injury)、アテローム性動脈硬化症、血栓症、メタボリック症候群、唾液腺炎、外傷性脳損傷、虚血性心疾患、虚血性脳卒中、パーキンソン病、黒色腫、神経芽細胞腫、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、甲状腺癌、管状早期胃癌(tubular early gastric cancer)、神経内分泌癌、類粘液大腸癌、大腸癌；高悪性度尿路上皮癌、腎臓明細胞癌、未分化卵巣癌、乳頭嚢胞内乳癌、グラム陰性菌敗血症、感染性の緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、コレラ菌(Vibrio cholera)、レジオネラ(Legionella) spp.、フランシセラ(Francisella) spp.およびリーシュマニア(Leishmania) spp. クラミジア(Chlamydia) spp.、クリオピリン関連周期熱症候群(cryopyrinopathies)；角膜炎、尋常性座瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、インスリン耐性、肥満、溶血性尿毒症症候群、ポリオーマウイルス感染症、免疫複合体型腎疾患、急性尿細管損傷、ループス腎炎、家族性慣例自己炎症症候群、マックル-ウェルズ症候群および新生児期発症多臓器系炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節自己炎症性疾患、腎虚血-再灌流傷害、糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、全身性血管炎、IgA腎症、マラリア、蠕虫感染症、敗血性ショック、アレルギー性喘息、枯草熱、慢性閉塞性肺疾患、薬剤誘発性肺炎症、接触性皮膚炎、ハンセン病、バークホルデリア セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)感染症、呼吸器合胞体ウイルス感染症、乾癬、強皮症、反応性関節炎、嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群、炎症性関節疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、心臓手術（術中／術後の炎症）、急性および慢性臓器移植拒絶反応、急性および慢性骨髄移植拒絶反応、腫瘍の血管新生、筋萎縮性側索硬化症、自閉症スペクトラム障害（例えば、自閉症のマウスモデルで見られるように、P2X7のカムブジン阻止により）、および／またはそられのあらゆる組合せを阻害する。

さらに、ある態様において、本開示は、連鎖停止に非依存の非標準的なNRTI機能が、P2X7-依存性失明、移植片対宿主病および／または無菌性炎症を防ぐことを提供する。したがって、ある態様において、本開示は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の少なくとも1つのNRTIの有効量を投与することによって、対象におけるP2X7-依存性失明、移植片対宿主病および／または炎症を防ぐ方法を指向する。

さらに、ある態様において、本開示の方法および組成物は、(i)細胞に関連するAlu RNAによるインフラマソーム活性化；(ii)LPS/ATPによる炎症、(iii)LPS/ATPによるインフラマソーム活性化、(iv)ニゲリシン-誘導インフラマソーム活性化、および／またはそれらの組合せを阻害する。そして、ある態様において、インフラマソームは、NLRP3インフラマソームおよび1L-1ベータ インフラマソームからなる群から選択される。さらに、本開示の方法のある態様は、例えば、(i)細胞に関連するP2X7受容体による侵入をブロックする；(ii)Alu RNA発現に起因するミトコンドリア反応性酸素種を減少する；(iii)細胞のATP-誘導細胞透過性を減少する工程を含み得る。そして、本開示で意図される細胞は、例えば、RPE細胞、網膜視細胞、脈絡膜細胞、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。

さらに、NRTIsはHIVに対する中核治療であり、それらはレトロウイルス複製をブロックする。そのライフサイクルのために逆転写酵素（RT）も必要である内在性レトロエレメントのAlu RNAは、NLRP3インフラマソームを活性化し、何百万人のヒトを盲目にする加齢黄斑変性の治療不可能な形態である、地図状萎縮における網膜色素上皮の細胞死を引き起こす。さらに、本開示の発明者らは、1つのクラスとしてのNRTIsがNLRP3インフラマソームの新規な阻害剤であることを見出した。そそして、驚くべきことに、この効果は逆転写酵素阻害と無関係である。

ここに開示の主題の1以上の態様の詳細がこの明細書に記載される。この明細書に記載の態様への変更およびその他の態様は、この明細書で提供された情報の研究後、当業者に明らかになるであろう。この明細書で提供された情報、および特にここに記載の実施態様の具体的詳細は、主に理解の明確性のために提供されており、不必要な限定がそれらから理解されるべきでない。不一致がある場合、定義を含むこの明細書の仕様が支配するであろう。

さらに、ここに開示の主題は、次の具体的であるが非限定的な実施例によって説明される。次の実施例は、本発明に関する開発および実験の過程中の種々の時点で集められたデータを代表するデータの編集を含み得る。

実施例 1
本開示の発明者らは、NRTIs d4T、AZT、ABCおよび3TCが、5’-メトキシ-d4Tと同様に、Alu RNAによるカスパーゼ1活性化をブロックし、それは逆転写酵素を阻害しないことを見出した。さらに、本発明者らは、AZTがチミジンキナーゼ欠損細胞でリン酸化されないが、LPS/ATP-誘導インターロイキン-1ベータの分泌をまだブロックすること；NRTIsがP2X7-依存性YOPRO-1色素摂取ならびに地図状萎縮、移植片対宿主病および無菌性肝炎症のマウスモデルをブロックすること；そしてNRTIsが、標準逆転写酵素阻害非依存性のNLRP3インフラマソームの新規な阻害剤であることを見出した。したがって、NRTIsは種々のP2X7-推進(driven)疾患に再度目的を持たす薬物に十分である。

NRTIsは1974年に抗ウイルス化合物であることが初めて発見され(Ostertagら, 1974)、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）を治療するために広く使用されている。NRTIsの作用の標準的なメカニズムは、ウイルスRNA鋳型からのDNA合成の連鎖停止により、それにより逆転写酵素依存性ウイルスのウイルスライフサイクルを妨害することである。

加齢黄斑変性（AMD）は、世界中の高齢者の失明の主要な原因である(Ambatiら, 2003; AmbatiおよびFowler, 2012)。より多く見られ治療不可能なAMDのドライ型において、非コードAlu RNAsの過多が網膜色素上皮の細胞死を誘導することにより失明を引き起こす(Dridiら, 2012; Kanekoら, 2011; Taralloら, 2012)。Alu配列は、HIVのように、ライフサイクルのために逆転写酵素に依存する、非コード レトロトランスポゾンである(BatzerおよびDeininger, 2002; Dewannieuxら, 2003)。

Alu RNAは、カスパーゼ1およびNLRP3インフラマソームの活性化によりRPE細胞死を仲介する(Taralloら, 2012)。本開示は、HIVの治療にFDAが承認しているスタブジン (d4T; 2’3’ ジデオキシチミジン; Zerit, Bristol-Myers Squibb)のような逆転写酵素阻害剤が、Alu RNAレベルを減少せず（図４５）、その活性な20 kDa形へのカスパーゼ1開裂(Hentzeら, 2003; Yaminら, 1996)を、一次ヒトRPE細胞（図３４）および一次マウスRPE細胞（図４４）で阻害することを提供する。さらに、本開示は、d4Tもまた、Alu-誘導RPE細胞死を仲介するMyD88アダプターの下流キナーゼ(Taralloら, 2012)のIRAK4のリン酸化をヒトおよびマウスRPE細胞（図３４および４４）でブロックすることを示す。本開示の発明者らはまた、抗HIV剤のアジドチミジン(AZT; 3’-アジド-2’,3’-ジデオキシチミジン; Retrovir, ViiV Healthcare)、ラミブジン(3TC; 2’3’ ジデオキシシチジン; Zeffix, GlaxoSmithKline)およびアバカビル(ABC; ジ-デオキシグアノシン類似体; Ziagen, ViiV Healthcare)を含むその他のNRTIsもまた、Alu RNAにより誘導されるカスパーゼ1をブロックすることも見い出した（図３５）。

さらに、本開示は、d4TおよびAZTがドライAMDのAlu RNA-誘導マウスモデル(Kanekoら, 2011; Taralloら, 2012)でRPE変性を防止することを提供する。さらに、d4Tの連日経口投与を受けているマウスは、AZTの腹腔内投与でのように（図３７）、Alu RNA発現プラスミドの網膜下注入後のRPE変性をブロックする（図３６）ことが見出されている。

逆転写酵素の阻害が、d4Tによるインフラマソームブロックに必要であるかどうかを試験するため、d4Tの5’ O-メチル-修飾型 (5’-OCH3-d4T; me-d4T)が合成された（図２０；図２５；図３６；図２７；図２８）。したがって、ある態様において、本開示は、本明細書で提供されるd4Tの5’ O-メチル-修飾型を合成するための方法を指向する。

ヌクレオシド類似体のトリリン酸型のみ逆転写酵素を阻害する；5’位でのメチル修飾はリン酸化を防止し、したがってヌクレオシド トリホスフェートの形成を防止する(Nykanenら, 2001)。したがって、d4Tと同様に、me-d4TもまたヒトRPE細胞においてカスパーゼ1をブロックする（図２１）。

本発明者らは、me-d4Tは逆転写酵素を阻害せず、非修飾d4Tと対照的に、me-d4Tはレンチウイルス複製をブロックしないこと（図２２）を確かめた。また、ジ-デオキシヌクレオシド類似体のトリホスフェート代謝物は、ミトコンドリアDNAの枯渇を引き起こした；そしてme-d4Tはリン酸化されないという考えと一致し、d4Tは、me-d4Tでは起きないが、mtDNAレベルを減少することを見出した（図２３）。Me-d4TもマウスでAlu-誘導RPE変性を阻害する（図２４）。これらのデータは、d4Tがカスパーゼ1活性化および逆転写酵素阻害と無関係のRPE変性をブロックできることを示している。

さらに、本発明者らはまた、NRTIsが、逆転写酵素によるシグナル伝達であることが知られていない(Mariathasanら, 2004; Mariathasanら, 2006; Martinonら, 2002)、LPS/ATPによりインフラマソーム活性化をブロックするかどうかも試験した。ウエスタンブロットで検出されるように、D4Tは一次マウス骨髄由来マクロファージでLPS/ATP-誘導カスパーゼ1成熟を阻害することが見出された（図３８）。

カスパーゼ1はLPS/ATP刺激でインターロイキン1ベータ（IL-1ベータ）を直接加工する(process)；d4Tはまた、これらの細胞で成熟したIL-1ベータの分泌をブロックする（図３９）。RT阻害無しにLPS/ATP-誘導インフラマソーム活性化が阻害され得るかどうかを測定するために、本発明者らは、チミジンキナーゼ-欠乏(Raji/TK^-)および-発現(Raji/TK⁺)細胞を使用した(Balzariniら, 1989)。本発明者らは、AZT添加後、TK^-では起こらなかったが、TK⁺細胞はAZT-トリホスフェート（AZT-TP）を生成し、AZT代謝はRT阻害に必要であった（図４０；図４６、図４７、図４８、図４９、図５０）。AZTはTK^- 細胞でリン酸化されなかったのにもかかわらず、AZTはLPS/ATP-誘導インターロイキン1ベータの成熟をなお阻害し（図４１）、AZTは逆転写酵素阻害によるインターロイキン1ベータ成熟を阻害しないことを示した。

Alu RNA(Kerurら, 2013)およびLPS/ATP(Quら, 2011)は、ATPレセプターP2X7によりインフラマソームを活性化する。それゆえ、本発明者らは、d4TはP2X7またはP2X7-依存経路をブロックするとの仮説を立てた。最初にd4TがATPレベルを調節することによりP2X7の上流に作用するかどうかを決定するための試験が行われた；しかしながら、d4TはAlu RNAにより誘導される細胞培地へのATPの放出をブロックしない（図４２）。

次に、d4TがP2X7機能に直接拮抗するかどうかを決定するための試験が行われた：ATP結合で、細胞-表面P2X7が、インフラマソーム活性化を仲介する非選択的カチオンチャンネルを形成する(KahlenbergおよびDubyak, 2004; Petrilliら, 2007)。しかしながら、d4Tは、マウスまたはラットのどちらかのP2X7レセプターを発現するHEK293細胞のパッチクランプ分析でモニターされたとき、P2X7カチオンチャンネル機能を有意に調節しなかった(Humphreysら, 2000)。

最後に、P2X7活性化は、〜1000 Daまでの分子に対して透過性の大きな孔の形成と関連する(Adinolfiら, 2005; Cheewatrakoolpongら, 2005; Surprenantら, 1996)。D4T、ならびにAZTおよび3TCも、ヒトP2X7-過剰発現HEK293安定細胞株において、選択的P2X7アゴニストのbzATPの添加後の蛍光色素YO-PRO1(M.W. Da)のP2X7-依存性取り込みを阻害した（図４３）。

NRTIsが、色素取り込みに関与するメカニズムによりAlu-誘導P2X7-仲介インフラマソーム活性化をブロックするとの考えと一致して、Alu RNA-誘導カスパーゼ1活性化は、P2X7-仲介色素取り込みおよびLPS/ATP-誘導インフラマソーム活性化をブロックするが、カチオン フラックスをブロックしない、小さいペプチドにより阻害された(PelegrinおよびSurprenant, 2006)(図５１)。一方、Alu-誘導カスパーゼ1活性化は、P2X7-仲介カチオン フラックスを選択的にブロックするが、色素取り込みはブロックしないカルミダゾリウムによって阻害されなかった（図５２）。

さらに、P2X7の細胞内C末端は、P2X7-関連色素取り込みを支配し、細胞透過性でない(Agarwalら, 2011)d4Tの型はAlu RNAによるカスパーゼ1活性化をブロックしない（図５３、図３２）。P2X7にまたはP2X7の下流であるが、ミトコンドリア機能障害の上流での拮抗作用と一致して、d4Tは、LPS/ATP刺激で産生されるミトコンドリアROS（mtROS）産生をブロックし(Adinolfiら, 2005; Cruzら, 2007; Garcia-Marcosら, 2005; Nakahiraら, 2011)、Alu過剰発現(Taralloら, 2012)がMitoSOxアッセイにより測定された（図５４）。最後に、d4Tは、結晶性尿酸一ナトリウムで処理されたPMA-プライムド(primed) THP-1細胞において、P2X7-依存性インターロイキン1-ベータ分泌を防止しない（図１１）(Martinonら, 2006; Riteauら, 2012)。

地図状萎縮（GA）のAlu-誘導モデルを凌駕するNRTIsの潜在的治療妥当性を探索するため、NRTIsが包括的なインフラマソーム阻害剤として機能するなら、それらはP2X7によっても推進される疾患の他の動物モデルで広く有益かもしれないとの仮説が立てられた。NLRP3 インフラマソーム-およびP2X7-推進移植片体宿主病のモデル(Jankovicら, 2013; Wilhelmら, 2010)において、同種骨髄およびT細胞を受けたマウスのd4Tでの処理は、生理食塩水処理のコントロールと比べて改善された生存を示した（30〜70％対0％）。さらに、無菌性炎症のNLRP3-およびP2X7-推進モデル(McDonaldら, 2010)において、d4Tは肝損傷の病巣への好中球遊走を減少した。

興味深いことに、P2X7-依存性孔機能だけが表現型(phenotype)に影響を与えることが示された(Sorgeら, 2012)。しかしながら、現在のところ、イオンチャンネル活性化でなく、下流P2X7シグナル伝達を選択的に標的とするFDA承認の医薬は何もない。それゆえ、NRTIsは、P2X7機能を選択的に標的とすることで、臨床的および実験的の両方で価値を有し得る。

最近、HIV複製を調節することのP2X7の役割が提唱されており(Hazletonら, 2012)、HIV患者は血漿のIL-18レベルを増加しており(Ahmadら, 2002; Iannelloら, 2010)、それはNRTI含有の高活性な抗レトロウイルス療法での治療後に減少する(Stylianouら, 2003)。特に、HIV-1感染患者のNRTI治療による血漿のIL-18レベルの減少は、ウイルス複製の阻害が起こる前にNRTIsがIL-18レベルを低下させることを示す、ウイルス負荷またはCD4+ T-細胞数に有意に関連しなかった(Davidら, 2000)。IL-18成熟は、一般的にP2X7活性化も要求する、活性カスパーゼ1による前(pro)-IL18開裂を必要とする。したがって、本開示の方法および実験は、NRTIsが逆転写酵素阻害と無関係のHIV-誘導サイトカイン発現を調節することができるとの考えと一致する。

ある態様において、d4Tは、野生型マウスにおいて、Alu RNAにより誘導されるRPE変性を防止する。図１に示されるように、加齢黄斑変性のマウスモデルにおいて、マウスへのAlu RNAの網膜下投与はRPE変性を引き起こす。実際に示されるように、野生型マウスの硝子体液への共送達された(co-delivered)d4Tは、送達後1週間で用量依存的にAlu RNA-誘導RPE細胞死を防止する。図１の上段列は、d4Tの増量を用いるかまたは用いない、コントロールPBSまたはAlu RNA処理を受けたマウスの眼底写真を提供する（左〜右）。矢印はRPE細胞死の脱色領域を示し、それはd4Tの一番高用量で解消する。図１の下段列は、Alu RNA投与で分断されるがd4Tの一番高用量で正常なRPE形態／細胞間結合に回復する、細胞間結合（ZO-1）が赤色で染色されたRPE平面プレパラートを示す。

一方、ある態様において、d4Tは、インビトロで、Alu RNA発現プラスミドにより誘導される細胞毒性を予防する。図２は、MTS増殖アッセイによりモニターされたとき、Alu RNAの強制発現プラスミド（pAluA）で表示された時間処理されたヒト（HeLa）細胞が、ヌル（null）プラスミド（pUC19）と比較して大きく減少した生存率を示し、そしてd4Tの併用がAlu過剰発現によって誘導される細胞死を防いだことを示す。

ある典型的な態様において、d4TはAlu RNAレベルの減少による細胞毒性を救済しない。図３に提示されるように、Alu-特異的プローブを用いたノーザンブロット法によりモニターされるとき、DICER1を標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Dcr as）で処理された一次ヒトRPE細胞（レーン3（左から3番目のレーン））は、コントロールのアンチセンス・オリゴヌクレオシド（Ctr as）（レーン1（一番左））と比較して核分画の増加したAlu RNAレベルを示す。一方、d4Tの併用（レーン2および4）はAlu RNAレベルを減少しない。図３は核画分に対する負荷コントロールとしてu6（下段列）を示す。

さらに、ある態様において、d4TはAlu RNAレベルを減少しない。例えば、一次ヒトRPE細胞は、d4Tを有するか有しないでAlu RNAでトランスフェクトされ得る（図４）。そして、図４に提示されるように、d4Tの併用は、Alu-特異的プローブを用いたノーザンブロットで検出されたように、核画分中のAlu RNAレベルをトランスフェクション後1、4または24時間で変えない。u6（下段列）は、図4における核画分に対する負荷コントロールとして示される。

本開示は、ある態様において、d4TはAlu RNAによるインフラマソーム活性化を阻害することをさらに提供する。実際に、Alu RNAはNLRP3インフラマソーム活性化を引き起こし、それは酵素カスパーゼ1のプロセッシングを特徴とし、図５は、Alu RNAがAlu投与後24時間で一次ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-1成熟を引き起こし（上段、レーン2、下のバンド）、それはd4Tとの共処理（100μM；レーン3）でブロックされることを示すウエスタンブロットを提供する。

ある態様において、3TCはAlu RNAによるインフラマソーム活性化を阻害する。実際に、Alu RNAはNLRP3インフラマソーム活性化を引き起こし、それは酵素カスパーゼ1のプロセッシングを特徴とする。図６は、Alu RNAがAlu投与後24時間で一次ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-1成熟を引き起こし（上段、レーン2、下のバンド）、それは3TCとの共処理（20〜100μM；一番右のレーン）でブロックされることを示すウエスタンブロットである。下段に負荷コントロールのビンキュリンが示される。

次に、図７は、Alu RNAによるインフラマソーム活性化のAZT、コルジセピンおよびアバカビルの阻害の証拠を提供する。実際に、Alu RNAはNLRP3インフラマソーム活性化を引き起こし、それは酵素カスパーゼ1のプロセッシングを特徴とする。図７は、Alu RNAがAlu投与後24時間で一次ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-1成熟を引き起こし（上段、レーン2、下のバンド）、それはアジドチミジン（AZT）、コルジセピンおよびアバカビル（ABC）との共処理（50〜100μM；レーン3〜8）でブロックされることを示すウエスタンブロットである。再度、負荷コントロールのビンキュリンが下段に示される。

ある態様において、本開示は、d4TがLPS/ATPによるインフラマソーム活性化を阻害することを提供する。したがって、図８は、古典的なインフラマソーム活性化剤のLPS/ATPで処理された一次ヒトRPE細胞が、増加したCasp-1活性化、および細胞表面のレセプターアダプタータンパク質MyD88によるインフラマソームシグナル伝達のマーカーでもある、IRAK4の増加したリン酸化を示すことを明らかにするゲルを提供する。さらに、図８に示されるように、d4T（25/100μM）は、LPS/ATPにより誘導されたCasp-1活性およびIRAK4リン酸化をブロックする。図８の負荷コントロールはビンキュリンである。さらに、図に示されるように、LPSおよびATPは組合せだけでNLRP3インフラマソームを活性化する。したがって、一方または他方だけでの処理はこの実験のコントロールとして役に立つ。

本開示はさらに、典型的な態様において、d4Tおよびその他のNRTIsがLPS/ATPによるインフラマソーム活性化を減じることを提供する。図９に提示されるように、
全てジ-デオキシヌクレオシド逆転写酵素阻害剤である、d4T、3TCおよびコルジセピン（100μMで）は、LPS/ATPによって誘導されたカスパーゼ-1活性化（活性なp20バンド、上段）およびIL-18成熟（下段）を阻害する。図９を生じるために、マウスの骨髄由来マクロファージの(i)無処理、(ii)LPS処理または(iii)LPS/ATP処理後に細胞培養上清が集められ、カスパーゼ-1およびIL-18に対する抗体でプローブするウエスタンブロット法にかけられた。

本開示のある態様において、d4Tはニゲリシン-誘導インフラマソーム活性化を阻害する。図１０によれば、d4T（100、250μM）は、ニゲリシンで誘導されたIL-1ベータ成熟（上段、18および22kDa体）およびカスパーゼ-1活性化（活性なp20バンド、下段）を阻害する。マウスの骨髄由来マクロファージの(i)無処理、(ii)LPS処理または(iii)LPS／ニゲリシン処理後に細胞培養上清が集められ、IL-1ベータおよびカスパーゼ-1に対する抗体でプローブするウエスタンブロット法にかけられた。図１０はこれらの取り組みの結果を示す。

さらに、ある態様において、d4tはMSUによって誘導されるPMA-分化THP-1単球からのIL-1ベータの分泌を阻害しない。ヒトTHP-1単球はPMAでマクロファージに分化される。図１１に示されるように、既知のインフラマソーム活性化剤の尿酸一ナトリウム（MSU）での処理は、非処理細胞と比較してIL-1ベータの分泌を増加したのに対して、用量（25〜1000μM）の範囲でのd4T併用はIL-1ベータの分泌に有意に影響を及ぼさなかった。さらに、d4Tは、ELISAでの測定（n=3〜4）により、MSU-誘導IL-1ベータの分泌をブロックしない。

ある態様において、d4Tおよびその他のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、MSUにより誘導されるPMA-分化THP-1単球からのIL-1ベータの分泌を阻害しない。このことを説明するために、ヒトTHP-1単球がPMAでマクロファージに分化された。MSUでの処理は、非処理細胞と比較してIL-1ベータの分泌を増加した。一方、図１２に示されるように、用量（25〜1000μM）の範囲でのd4T、3TCまたはコルジセピン（全てジ-デオキシヌクレオチド類似体である）の併用は、IL-1ベータの分泌に有意に影響を及ぼさなかった。

次に、ある態様において、d4TはAlu RNAによって誘導されるNLRP3プライミング（priming）を減少する。実際に、図１３の棒グラフで提供されるように、Alu RNAトランスフェクションは、mock（トランスフェクション試薬のみ）と比較して16時間で一次ヒトRPE細胞でのNLRP3 mRNAレベル、「プライミング」と称される事象を増加する（Y-軸）。この効果は、d4T（100μM）の併用によって鈍り、18S RNAコントロールまで正常化される。

さらに、本開示の典型的な態様において、D4TはAlu RNAにより誘導されるIL-1ベータ プライミングを減少する。図１４は、Alu RNAトランスフェクションが、mock（トランスフェクション試薬のみ）と比較して24時間で一次ヒトRPE細胞でのIL-1ベータ mRNAレベル、「プライミング」と称される事象を増加する（Y-軸）ことを示している。この効果は、d4T（100μM）の併用によって鈍り、18S RNAコントロールまで正常化される。

一方、ある態様において、d4TはAlu発現によって引き起こされるミトコンドリアROSを減少する。図１５は、MitoSoxアッセイにより検出されるように、Aluの強制発現（pAluA）が、増加したミトコンドリア反応性酸素種（mtROS）を引き起こすことを示している。図１５を生じるために、一次ヒトRPE細胞はd4Tとまたはd4TなしにAlu発現プラスミドまたはコントロールプラスミド（pUC19）とインキュベートされた。15時間後、細胞はmtROS（赤色）および細胞カウント、核（青色、Hoechst DNA染色）のために共染色された。pAluA群の細胞は、pUC19コントロールと比較して、pAluA＋d4T処理細胞で減少している効果である、より多いmtROS染色（赤色）を示した。

そして、さらなる態様において、d4TはAlu RNAにより誘導されるATP放出を阻害しない。（図１６）示された時間Alu RNAで処理された一次ヒトRPE細胞はATPを放出する。図１６を提供するため、d4Tとまたはd4TなしでmockまたはAlu RNA処理細胞から細胞培養上清が集められた。ATP-依存性ルシフェラーゼアッセイを用いてATPを検出した。そして、特に、d4TはATP放出に影響を及ぼさなかった。

ある態様において、図１７に示されるように、d4TはYo-Pro1に対するATP-誘導細胞透過性を減少する（P2X7レセプターアッセイ）。図１７を作成するために、PMAによりマクロファージに分化されたTHP-1細胞は、P2X7レセプター活性に対するアッセイにおいて、大量の蛍光染料のYo-Pro 1侵入を許した。d4Tは、96ウェル マイクロプレート リーダー中でのエリア-スキャン蛍光測定による測定で、ATPにより誘導されるYo-Pro侵入を用量依存的に減少することが観察された。実際に、図１７は、相対蛍光単位での蛍光測定（RFU、y-軸）の結果を示す。

さらに、d4Tが、Alu RNAトランスフェクション後に増加する細胞外のカリウムレベルを減少することが示されている。（図１８）実際に、細胞培養のカリウムレベルは6時間Alu RNAで処理した一次ヒトRPE細胞で増加し、その効果はd4T併用により減少する。図１８のために、カリウムレベルは、細胞培養上清中で、カリウム-依存性ピルビン酸キナーゼアッセイを用い、分光光度法で測定された。

次に、ある態様において、図１９に示されるように、d4Tは、Yo-Pro1に対するbzATP-誘導細胞透過性をブロックする（P2X7レセプターアッセイ）。d4Tは、ヒトP2X7レセプターを安定に発現しているHEK293細胞がP2X7-選択的アゴニストのbzATPで刺激されたときのYO-PRO-1ヨウ素侵入をブロックした。細胞は、bzATP/YO-PROの添加前にd4Tで30分間プレ-インキュベートされ、485/515nmで蛍光がt=30分で測定された。

さらに、d4Tは、逆転写酵素阻害と無関係である、Alu-誘導RPE変性およびカスパーゼ-1活性化をブロックする。

ある態様において、本開示は、図２０で与えられる構造を有する化合物を指向する。図２０は、メトキシ-d4T (me-d4T)およびd4Tの化学構造を含む。図２０に示されるように、リボース5’ヒドロキシ基のメトキシ基での単一置換（円で囲まれた）は、本開示の発明者らにより、d4Tリン酸化を防ぐためにデザインされた。したがって、ある態様において、本開示は、リボース5’ヒドロキシ基のメトキシ基での単一置換含む化合物を指向する。そして、ある態様において、本開示は、d4tリン酸化のような、リン酸化を防ぐためにリボース5’ヒドロキシ基の場所にメトキシ基を有する化合物を提供する。

さらに、本開示は図２１〜図２３における追加の実験の結果を提供する。実際に、図２１は、Alu RNA±me-d4Tでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである；図２２は、me-d4Tはしないが、未修飾d4TがHela細胞でのGFP-発現レンチウイルスの複製をブロックしている細胞を示す；そして、図２３は、リアルタイム定量PCRでの測定による一次マウスRPE細胞において、me-d4Tはしないが、未修飾d4Tが、mtDNAレベル（染色体DNAエクソン-イントロン連結配列に標準化された）を減少することを示すグラフを提供する。n=4, *p < 0.05（スチューデントt-検定による）。

ある態様において、Me-d4t（腹腔内注射）は、マウスでのAlu-誘導RPE変性を防止することが示された。図２４の上段列、閉鎖小帯-1（ZO-1；赤色）に対して染色された平面プレパラートを提供する、下段列。図２４において、変性は青色の楔形により示される。n=4の代表画像が示される。

一方、図２５は、me-d4T合成の概略図を提供し、図２６は、me-d4T（ピーク#6）最終生成物のHPLCクロマトグラムである、純度>97%。そして、図２７は、me-d4T最終生成物の1H NMRスペクトロスコピーであり、ここで、ケミカルシフトはその構造に一致し、そして、図２８は、me-d4T最終生成物の液体クロマトグラフィー／質量分析の結果を提供し、m/z比はその構造と一致する。

図２９、図３０および図３１は、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形体を提示する。具体的には、図２９は3TC（2’3’ ジデオキシシチジン）の化学構造を示し；図３０はAZT（3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン）の化学構造を提供し；そして、図３１はABC（シクロプロピルアミノプリニルシクロペンテン）の化学構造を示す。図２９〜３１のそれぞれにおいて、ヌクレオシド類似体のメトキシ変形（O-メチル基）が円で囲まれている。さらに、図３２は、d4Tの細胞透過変形体（IC-d4T）を示し、ここで、「n」グループは11に等しい。誘導体は3TC、AZT、ABCの細胞透過変形体を含み、ここで、種々の態様において、核酸塩基グループ（円で囲まれた）は、3TC、AZT、ABC、もしくはd4T、3TC、AZT、ABC（図２９〜３１）のメトキシ-変形体、またはそれらの誘導体で置換され得る。

一方、図３３は、本開示による例示的なNRTIの化学構造を提供する。

ある態様において、本開示は、NRTIsがAlu-誘導RPE変性および／またはカスパーゼ-1活性化をブロックすることを提供する。例えば、図３４は、Alu RNA±d4Tでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）およびIRAK4リン酸化のウエスタンブロットを示す。図３５は、Alu RNA±NRTIs（3TC、AZT、ABC）でトランスフェクトされたヒトRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化のウエスタンブロットである。図３６は、pAluがRPE変性を引き起こし、それはd4Tの経口投与で防止されることを示しており、そして、図３７は、pAluがRPE変性を引き起こし、それはAZTの腹腔内投与で防止されることを示している。図３６および図３７は、眼底写真：上段列；閉鎖小帯-1（ZO-1；赤色）に対する染色された平面プレパラート、下段列を含む。変性は青色の楔形により示される。スケールバー、50μm。

図３８〜４１は、NRTIsがLPS/ATP-誘導インフラマソーム活性化をブロックすることを示している。図３８および３９は、細胞培地および細胞溶解物のウエスタンブロットで測定されるように、LPS/ATP処理一次マウス骨髄-誘導マクロファージでのカスパーゼ-1（図３８）およびIL-1ベータ（図３９）をブロックしたことを示している。さらに、図４０は、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）で測定されるように、Raji TK^- 細胞では起こらないが、Raji TK⁺細胞が、AZTをAZT-トリホスフェート（AZT-TP）にリン酸化することを示すクロマトグラムを提示する。そして、図４１は、細胞溶解物のウエスタンブロットで測定されるように、AZTが、Raji TK^- およびTK⁺ 細胞の両方で、LPS/ATPによるIL-1ベータ活性化をブロックすることを示している。n=3〜4の代表的画像が図３８〜４１のそれぞれで提供される。

ある態様において、本開示は、図４２〜４３に示されるように、NRTIsがP2X7孔機能ならびに移植片拒絶および無菌性肝炎症のP2X7-推進モデルの両方を選択的にブロックすることを提供する。図４２は、d4Tが一次ヒトRPE細胞（n=4）からのAlu-誘導ATP放出をブロックしないことを示す棒グラフである。一方、図４３は、NRTIsがP2X7孔機能ならびに移植片拒絶および無菌性肝炎症のP2X7-推進モデルを選択的にブロックすることを示すグラフ図であり、それは時間（分）経過の蛍光（bzATPの％）のグラフを提供する。

そして、ある典型的な態様において、本開示は、d4TがAlu RNAレベルを減少することなしにカスパーゼ-1をブロックすることを提供する。したがって、図４４は、Alu RNA±d4Tでトランスフェクトされた一次マウスRPE細胞でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）およびIRAK4リン酸化のウエスタンブロットを提供する。そして、図４５は、ビオチン-UTP-ラベル化Alu RNA-トランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞のノーザンブロットを提供する。特に、図４５において、d4TはAlu RNAレベルを減少しなかった（u6 RNAに正常化される）。

次に、図４６〜４７は、AZT-トリホスフェート（AZT-TP、標的化合物；図４６）およびAZU-トリホスフェート（AZU-TP、内部標準；図４７）のLC-MS/MSスペクトルを提供する。そして、図４８〜４９は、指定されたピークの同一性を確認するためのMSスペクトル（差し込み図）を伴う、AZT-TP（図４８）およびAZU-TP（図４９）でスパイクされたRaji TK^- 細胞のクロマトグラフ分離を示す。

図５０は、AZT-TP基準の検量線（黒丸）である。AZTで処理されたRaji TK⁺ 試料はAZT-TPを生じた（白三角）のに対して、AZT-TPはAZTで処理されたRaji TK^- 細胞で検出されなかった。図５０は2つの実験を代表する。

図５１〜５４は、ある典型的な態様において、P2X7-依存性孔機能は、Alu-誘導カスパーゼ-1活性化を仲介することを示している。実際に、図５１は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞における、カチオン フラックス(flux)でなくP2X7孔機能をブロックするショートペプチド（Panx1¹⁰）（対スクランブルペプチド：Scr Panx1¹⁰）でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである；図５２は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞における、孔機能でなくP2X7カチオン フラックスをブロックするカルミダゾリウム（図３２が用いられたIC-およびEC-d4Tの化学構造を提供する）でのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである；そして、図５３は、Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞における、細胞透過性（IC）、細胞-不透過性（EC）または未修飾（no tag）d4Tでのカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）のウエスタンブロットである。さらに、図５４は、d4Tが、一次ヒトRPE細胞におけるpAlu-誘導ミトコンドリアROSを阻害することを示す。図５４において、ミトコンドリア反応性酸素種（ROS）はMitoSox（赤色）および細胞核はHoechst（青色）で可視化された。

クエン酸鉄(III)アンモニウムの存在下での一次ヒト網膜色素上皮（RPE）細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）が研究された。図５５に示されるウエスタンブロットに反映されるように、TM-3TC(構造8)(25μM)の添加は鉄-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。図５７に示されるウエスタンブロットに反映されるように、2me-d4T(構造4)(25μM)の添加は鉄-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。

クエン酸鉄(III)アンモニウムの存在下での一次ヒトRPE細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p10サブユニット）が研究された。図５６に示されるウエスタンブロットに反映されるように、d4T-ene(構造3)(25μM)の添加は鉄-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。

Alu RNAでトランスフェクトされた一次ヒトRPE細胞におけるカスパーゼ-1活性化（p20サブユニット）。図５８に示されるウエスタンブロットに反映されるように、d4T-ene(構造3)およびTM-3TC(構造8)(25および100μM)の添加はAlu-誘導カスパーゼ-1活性化をブロックした。

NRTIsまたは誘導体（それぞれ50 μm）で処理された一次ヒトRPE細胞におけるmtDNAの相対量が、コントロールとしてビヒクル処理(DMSO)（「No Tx」）を用いて研究された。薬物への曝露での細胞培養中での4日後、DNAが集められた。mtDNAに対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応が行われ、ゲノムDNA配列に標準化された。図５９に反映されるように、リン酸化されない修飾型のd4T（例えば、me-d4T(図20)、2 me-d4T(構造4)）は親のNRTI（d4T）と比較してmtDNA枯渇を示さなかった。図６０に反映されるように、リン酸化されない修飾型のAZT（me-AZT(構造1)、N-Me-Me-AZT(構造10)）は親の化合物(AZT)と比較してmtDNA枯渇を示さなかった。

NRTIsまたは誘導体での処理を研究するために、マウスの研究が行われた。網膜下のコントロール空-ベクター プラスミド（pNull）またはAlu RNA-発現プラスミドを受けたマウスが、1日2回、腹腔内の修飾NRTIs（me-AZT(構造1)、N-me-me-AZT(構造10)または2 me-d4T(構造4)；25 mg/kg/投与）またはコントロール ビヒクルで処理された。図６１の上段列は、マウスの眼底写真を示す。図６１の下段列は、Alu RNA発現で妨害されるが、修飾NRTI処理で正常なRPE形態／細胞間結合に回復される細胞間結合（ZO-1）に対して赤色で染色されたRPE平面プレパラートを示す。

式I（スキーム1における構造C）、式IV（構造B）、式VIII（構造E）、式X（構造D）およびメトキシ-d4T（構造A；図20にも）の合成の概略図が図６２に示される。一般的な合成手順は次の通りである：乾燥THF(5 mL)中のヌクレオチド(1.5 mmole)の懸濁液に、NaH(15 mmole)を加え、その混合物を窒素下、室温で10分間撹拌した。その混合物に、ヨウ化メチル(15 mmole)を一度に加え、1〜3時間撹拌した。反応完了のために、反応をTLCでチェックし、メタノールの滴下で反応をクエンチした。その混合物を酢酸で中和し、蒸発させた。残渣をジクロロメタンに懸濁させ、NaHSO3水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。生成物を、シリカゲルとジクロロメタン中の2％メタノールを用いるフラッシュ カラムクロマトグラフィーで精製した。誘導体の構造をLCMSおよび1H-NMRスペクトロスコピーで確認した。

構造 A) 収量 200mg (56%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 11.31 (s, 1H, NH), 7.50 (d, 1H, 6-H), 6.82 (dd, 1H, I'-H), 6.42 (dd, 1H, 3'-H), 5.91 (dd, 1H, 2'-H), 4.88 (s, 1H, 4'-H), 3.56 (m, 2H, 5'-H), 3.28 (s, 3H, OCH3), 1.75 (s, 3H, CH3).

構造 B) 67mg (18.7 %). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 7.56(s, 1H, 6-H), 6.88 (dt, 1H, 1'-H), 6.43 (dd, 1H, 3'-H), 5.90 (d, 1H, 2'-H), 4.89 (s, 1H, 4'-H), 3.56 (m, 2H, 5'-H), 3.27 (s, 3H, OCH3), 3.18 (s, 3H, NCH3), 1.8 (s, 3H, CH3).

構造 C) 1g-スケールの収量は0.4g 固体(36 %)であった。1H NMR(500 MHz, DMSO) 11.31 (s, 1H, NH), 7.56 (d, 1H, 6-H), 6.88 (dt, 1H, 1’-H), 6.43 (dd, 2H, 3’-H), 5.91 (m, 2H, 2’-H), 4.89(s, 1H, 4’H), 6.43 (dd, 1H, 3'-H), 5.91 (d, 2H, 2'-H), 4.89 (s, 1H, 4'-H), 3.55(t, 2H, 5'-H), 3.27 (s, 3H, OCH3), 3.18 (s, 3H, NCH3), 1.8 (d, 3H, CH3).

構造 D) 油状物 (0.5g, 46 %). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 7.56 (d, 1H, 6-H), 6.88 (dt, 1H, 1’-H), 6.43 (dd, 2H, 3’-H), 5.91 (m, 2H, 2’-H), 4.89(s, 1H, 4’H), 6.43 (dd, 1H, 3'-H), 5.91 (d, 2H, 2'-H), 4.89 (s, 1H, 4'-H), 3.55(t, 2H, 5'-H), 3.27 (s, 3H, OCH3), 3.18 (s, 3H, NCH3), 1.8 (d, 3H, CH3).

構造 E) 反応は1時間で完了した。収量0.224g(55 %). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 7.81 (d, 1H, H6), 6.23 (t, 1H, H4’), 6.09 (d. 1H, H5), 5.31 (t, 1H, H2’), 3.70 (m, 2H, H6’), 3.43 (dd, 1H, H5’b), 3.34 (s, 3H, OCH3), 3.08 (dd, 1H, H5’a), 3.04 (s, 6H, N(CH3)2).

実施例 2
この実施例で、「カムブジン類」とも呼ばれる、特異なNRTIsの構造を研究する。これらのカムブジン類の合成のための手順は、本明細書に記載されている。これらのカムブジン類に対するNMRおよび質量分析のデータならびにカムブジン類の生物活性に関するデータも提供される。

5’-O-アルキル置換およびジ-アルキル置換カムブジン類の合成
乾燥THF(5 mL)中のヌクレオチド(1.5 m-mole)の懸濁液にNaH(4.5 m-mole)を加え、その混合物を窒素下、室温で10分間撹拌した。その混合物にヨウ化アルキル(4.5 m-mole)を一度に加え、1〜3時間撹拌した。反応完了のために、反応をTLCでチェックし、メタノールの滴下で反応をクエンチした。その混合物を酢酸で中和し、蒸発させた。残渣をジクロロメタンに懸濁させ、NaHSO₃水溶液で洗浄し、MgSO₄で乾燥し、溶媒を蒸発させた。生成物を、溶媒として酢酸エチル／ヘキサンを用いて、シリカゲルを用いるフラッシュ カラムクロマトグラフィーで精製した。誘導体の構造をLCMSおよび¹H-NMRスペクトロスコピーで確認した。

不斉ジ-置換カムブジン類の合成

A) N-置換ヌクレオシドの合成。ジクロロメタン(5 mL)中のヌクレオチド(1.5 m-mole)の懸濁液に、NaH(1.5 m-mole)を加え、その混合物を窒素下、室温で10分間撹拌した。その混合物にヨウ化アルキル(1.5 m-mole)を一度に加え、1〜3時間撹拌した。反応完了のために、反応をTLCでチェックした。抽出物を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥。溶媒を蒸発させ、N-置換生成物をフラッシュ クロマトグラフィーで精製。

B) ジクロロメタン(5 mL)中のN-置換ヌクレオチド(1.5 m-mole)の懸濁液に、NaH (1.5 m-mole)を加え、その混合物を窒素下、室温で10分間撹拌した。その混合物にヨウ化アルキル(1.5 m-mole)を一度に加え、1〜3時間撹拌した。反応完了のために、反応をTLCでチェックした。抽出物を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥。溶媒を蒸発させ、ジ-置換生成物をフラッシュ クロマトグラフィーで精製。

カムブジン類に対するNMRおよび質量分析

1. a) O-Me-d4T
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 7.26 (q, J = 1.3 Hz, 1H), 6.85 (dt, J = 3.6, 1.7 Hz, 1H), 6.44 (dt, J = 6.0, 1.6 Hz, 1H), 6.05 (dt, J = 6.1, 1.8 Hz, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.41 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.17 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.75 (d, J = 1.3 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]⁺ マス計算値 C₁₁H₁₄N₂O₄Na⁺= 261.23, 実測値 =261.2.

1. b) 2-Me-d4T
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.56 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 6.89 (ddd, J = 3.4, 1.9, 1.4 Hz, 1H), 6.44 (dt, J = 6.0, 1.8 Hz, 1H), 5.91 (ddd, J = 6.0, 2.5, 1.4 Hz, 1H), 4.96 - 4.83 (m, 1H), 3.60 - 3.52 (m, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 2.08 (s, 2H), 1.81 (d, J = 1.2 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]⁺ マス計算値 C₁₂H₁₆N₂O₄Na⁺= 275.28, 実測値 275.2.

1. c) 2-Et-d4T
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.50 (t, J = 1.3 Hz, 1H), 6.89 (dq, J = 3.4, 1.5 Hz, 1H), 6.44 (dt, J = 5.9, 1.6 Hz, 1H), 5.93 (ddt, J = 6.0, 2.5, 1.4 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 3.93 - 3.78 (m, 2H), 3.59 (td, J = 3.1, 1.3 Hz, 2H), 3.45 (qt, J = 7.0, 1.5 Hz, 3H), 1.80 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.10 (tdd, J = 7.0, 5.2, 1.3 Hz, 6H). MS (ESI): [M+Na]⁺ マス計算値 C₁₄H₂₀N₂O₄Na⁺=303.3, 実測値 303.2.

1. d) N-Et d4T
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.69 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 6.89 (dt, J = 3.4, 1.7 Hz, 1H), 6.41 (dt, J = 6.0, 1.8 Hz, 1H), 5.92 (ddd, J = 6.0, 2.4, 1.4 Hz, 1H), 5.01 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.84 - 4.75 (m, 1H), 3.85 (qd, J = 7.1, 1.8 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 5.3, 3.4 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.09 (t, J = 7.0 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]⁺ マス計算値 C₁₂H₁₆N₂O₄Na⁺=275.28, 実測値 275.2.

1. e) O-Me N-Et d4T
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.55 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 6.90(dt, J = 3.3, 1.7 Hz, 1H), 6.45 (dt, J = 6.0, 1.7 Hz, 1H), 5.93 (ddd, J = 6.1, 2.3, 1.4 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 3.91 - 3.81 (m,2H), 3.56 (dd, J = 3.1, 1.5 Hz, 2H), 3.28 (s, 3H), 1.81 (d, J = 1.2Hz, 3H), 1.10 (t, J = 7.0 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]⁺ マス計算値 C₁₃H₁₈N₂O₄Na⁺289.31, 実測値 289.2.

2. a) O-MeAZT
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.30 (s, 1H), 7.50 (q, J = 1.1 Hz, 1H), 6.82 (dt, J = 3.3, 1.6 Hz, 1H), 6.41 (dt, J =6.1, 1.7 Hz, 1H), 5.91 (ddd, J = 6.2, 2.5, 1.3 Hz, 1H), 4.93- 4.77 (m, 1H), 3.55 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 3.28 (s, 3H), 1.75(d, J = 1.3 Hz, 3H). MS (ESI): [M+H]⁺, C₁₁H₁₅N₅O₄ ⁺, 計算値 282.26, 実測値 282.2.

2. b) 2-Me-AZT
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.63 (q, J = 1.2 Hz, 1H, H6), 6.15 (t, J =6.4 Hz, 1H, H1’), 4.43 (dt, J = 7.3, 5.4 Hz, 1H, H3’), 3.97 (dt, J = 5.1, 4.1 Hz,1H, H4’), 3.67 - 3.50 (m, 2H, H5’), 3.35 (s, 3H, OCH₃), 3.17 (s, 3H, NCH₃), 2.46 - 2.27 (m, 2H, H2’), 1.85 (d, J = 1.2 Hz, 3H, CH₃).
MS (ESI): [M+H]⁺ C₁₂H₁₈N₅O₄ ⁺, 計算値 = 296.29, 実測値 296.2.

2. c) 2-Et-AZT
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.62 (t, J = 1.2 Hz, 1H, H6),6.16 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H1’), 4.43 (q, J = 5.8 Hz, 1H, H3’), 3.96 (q, J =4.4 Hz, 1H, H4’), 3.83 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.68 - 3.55 (m, 2H, H5’),3.55 - 3.44 (m, 2H), 2.37 (dp, J = 20.5, 7.0 Hz, 2H, H2’), 1.84 (d, J= 1.2 Hz, 3H, CH₃), 1.15 (td, J = 7.0, 1.1 Hz, 3H), 1.08 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
MS (ESI): [M+H]⁺ 計算値 C₁₄H₂₂N₅O₄ ⁺= 324.35, 実測値 324.2.

3. a) 3-Me-3TC
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.82 (d, J=7.8 Hz,1H), 6.23 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.31(t, J = 4.7 Hz, 1H), 3.77 - 3.65 (m, 2H), 3.44 (dd, J = 11.7,5.5 Hz, 1H), 3.34 (s, 3H), 3.09 (dd, J = 11.7, 4.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H).
MS (ESI): [M+H]⁺, C₁₁H₁₈N₃O₃S⁺計算値 272.34, 実測値 272.2

3. b) 3-Et-3TC
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 - 7.77 (m, 1H), 6.22 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.29 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.60 - 3.48 (m,4H, CH₂), 3.32 (s, 2H), 3.10 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 1.18 - 1.01(m, 9H, CH₃).MS (ESI): [M+H]⁺, C₁₄H₂₄N₃O₃S⁺計算値 314.41, 実測値 314.4

NRTIsおよびカムブジン類の特徴付け
ある態様において、カムブジン類（修飾NRTIs）は、元のNRTIs（d4T、3TC、AZT）と比較して、より望ましい薬物らしい特徴を有する。例えば、以下の表1を参照して、カムブジン類は、NRTIsと比較して、より大きなLogP値（0より大きく1に近い）および水中でのより低い溶解度を有する。あるタイプの化合物放出の間、例えば、眼球内持続放出薬物送達システムにおいて、カムブジン類のより大きなLogP値およびより低い溶解度は、元のNRTIsと比較して、硝子体液および網膜内でのより長い滞留時間（すなわち、より長い半減期）を提供する。

細胞におけるNRTIsおよびカムブジン類の効力

図６４〜７３、および７４〜７８を参照して、本明細書に開示の化合物はカスパーゼ-1活性化を阻害する。カスパーゼ-1は、インフラマソーム複合体の中核を成す酵素であり、AMDにおけるRPE細胞死の重要な危険応答シグナルおよびメディエーターである。図６４〜７３は、カムブジン類が、マウスJ774 iGluc細胞におけるiGlucルミネッセンスアッセイで測定されるように、用量依存的にカスパーゼ-1を阻害することを示している。重要なことには、用量応答曲線に関して、個々の化合物間でいくらかの差が存在したことであり、それは（特有のR基を有する）各化合物を個々に試験する必要があることを強調する。さらに、カムブジン類は、カムブジン類のクラス内で化合物活性に差があることも示唆する、カスパーゼ-1活性化の可変で不完全な阻害を示した。

図６４〜７３に示されるデータを得るために、iGLucアッセイが行われた(Bartok ら, iGLuc: a luciferase-based inflammasome and protease activity reporter. Nature Methods 2013; 10(2):147-54から改変された)。簡単に言えば、96ウェルプレート中、ウェル当り100,000iGLuc細胞が一晩平板培養された。翌朝、媒体をプレートから吸引し、薬物（NRTIsまたは修飾NRTIs）を有する血清フリーのDMEMの75 μLと30分間置き換えた。薬物曝露の30分後、5 mMの最終濃度のために20 mM ATP(25 μL)を加える。それぞれのウェルから50 μLの媒体を集め、それぞれの試料にセレンテラジン 4.4 μMの50 μLを加え、直ちにルミネッセンスを読み取る。

図６４は、3TCがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。3TC（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図６５は、3Me-3TCがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。3Me-3TC（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図６６は、3Et-3TCがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。3Et-3TC（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図６７は、AZTがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。AZT（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図６８は、2Me-AZTがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。2Me-AZT（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図６９は、2Et-AZTがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。2Et-AZT（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図７０は、d4Tがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。d4T（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図７１は、O-Me N-Et d4Tがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。O-Me N-Et d4T（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図７２は、Me-d4Tがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。Me-d4T（100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図７３は、2Et-d4Tがカスパーゼ-1活性化を阻害することを示す。ATP（5 mM）がカスパーゼ-1活性化を誘導し、それをマウスJ774 iGluc細胞におけるカスパーゼ-1によるルシフェラーゼ開裂のルミネッセンスをモニターすることにより測定する。2Et-d4T（1 nM〜100 μM）への曝露は、用量依存的にカスパーゼ-1開裂を減少する。N=3。

図７０〜７３に示されるように、d4Tと比較して、インフラマソーム活性化においてカムブジン類（修飾NRTIs）によるより大きな減少があった。具体的には、d4Tは約35％までインフラマソーム活性化を減じたのに対して、O-Me, N-Et-d4Tは約55％までインフラマソーム活性化を減じ、Me-d4Tは約70％までインフラマソーム活性化を減じ、そして、2Et-d4Tは約45％までインフラマソーム活性化を減じた。理論により拘束されることを望まず、カムブジン類のそれぞれは、親のNRTI（すなわち、d4T）と比較して、インフラマソーム活性化においてより大きな減少を与えるので、カムブジン類もまた網膜変性の増大したブロックを与えると思われる。

図７４は、ウエスタンブロット法によりモニターされたように、カムブジン類が一次ヒトRPE細胞におけるAlu RNAにより誘導されるカスパーゼ-1活性化をブロックすることを示す。一次ヒトRPE細胞における、ウエスタンブロット法によりモニターされる、Alu RNA誘導カスパーゼ-1活性化は2Et-d4T (25μM)、2Me-AZT (25μM)、O-Me N-Et d4T (25μM)、d4T-ene (25〜100μM)およびTM-3TC (25〜100μM)により減少する。N=3〜4。

Alu RNAは、ドライAMDを有する患者において蓄積し、RPEの死を引き起こす毒性の内在性レトロエレメントである。図７５は、カムブジン類がクエン酸鉄(Fe3⁺)アンモニウム（FAC）に曝らされた一次ヒト細胞におけるカスパーゼ-1活性化をブロックすることを示す。FACはAlu RNA中間体によりカスパーゼ-1を活性化し、NLRP3-依存性RPE変性を誘導する(Gelfandら, Cell Reports 2015)。ウエスタンブロット法でモニターされた、一次ヒトRPE細胞におけるクエン酸鉄(III)アンモニウム(100 μM)-誘導カスパーゼ-1活性は、TM-3TC (25μM)、d4T-ene (25μM)、2Me-d4T (25μM)、Me-AZT (25〜100μM)および2Me-AZT (25μM)により減少する。N=3〜4。

図７６〜７８は、一次ヒトRPE細胞において、NRTI 3TCがAMD-関連ストレッサー（補体タンパク質C3a、ROS-発生剤のパラコートおよびアミロイドβ）により誘導されるカスパーゼ-1活性化をブロックすることを示す。図７６は、ヒトRPE細胞において、MRTIsが補体-誘導カスパーゼ-1活性化を減少することを示す。ウエスタンブロット法によりモニターされた、一次ヒトRPE細胞におけるLPSプライミング後のヒトC3a(100 nM)-誘導カスパーゼ-1活性化は3TC (25μM)により減少する。N=3〜4。図７７は、ヒトRPE細胞におけるパラコート-誘導カスパーゼ-1活性化をNRTIsが減少することを示す。ウエスタンブロット法によりモニターされた、一次ヒトRPE細胞におけるパラコート(250μM)-誘導カスパーゼ-1活性化は、3TC (25μM)により減少する。N=3〜4。図７８は、ヒトRPE細胞におけるアミロイドβ-誘導カスパーゼ-1活性化をNRTIsが減少することを示す。ウエスタンブロット法によりモニターされた、一次ヒトRPE細胞におけるオリゴマー Aβ1-40ペプチド(0.5μM)-誘導カスパーゼ-1活性化は、3TC (10〜25μM)により減少する。N=3〜4。

マウスにおけるNRTIsおよびカムブジン類の効力

ドライおよびウエットAMDのマウスモデルにおけるカムブジン類の効力が本明細書に示される。図７９〜８７を参照して、本明細書の開示の化合物は、「ウエットAMD」のモデルにおいて、脈絡膜血管新生（CNV）を減少し、「ドライAMD」のモデルにおいて、RPE変性をブロックする。

図７９および８０は、脈絡膜血管新生（CNV；ウエットAMD）のレーザー-誘導モデルにおいてNRTIsおよびカムブジン類が有効であることを示す。図７９は、本明細書に開示の化合物が、「ウエットAMD」のモデルにおいて脈絡膜血管新生を減少することを示す。野生型マウスにおいて、レーザー損傷後の3TC (0.55 nmol)、ABC (0.64 nmol)またはAZT (0.55 nmol)の硝子体内投与は、レーザー損傷-誘導CNV容積を減じた。PBSまたはDMSOの注入がビヒクル コントロールであった。N=16。図８０は、本明細書に開示の化合物が、「ウエットAMD」のモデルにおいて脈絡膜血管新生（CNV）を減少することを示す。野生型マウスにおいて、レーザー損傷後のMe-d4T、O-Me-N-Et-d4T、2Et-AZTまたは3Et-3TC (0.14 nmol)の硝子体内投与は、7日目で脈絡膜血管新生（CNV）容積を減じた。DMSOの注入がビヒクル コントロールであった。N=16。NRTIs（図７９）と比較して、修飾NRTIs（図８０）は、CNVを抑制することにおいてより強力（より少ない用量を要求）であり、かつより効果的（達成される抑制のより大きな度合い）である。

理論により拘束されることを望まず、NRTIsおよびカムブジン類の両方は、P2X7-依存性で抗血管新生効果を与え、それはCNVを減じると思われる。具体的に、NRTIsまたはカムブジン類の硝子体内注射は、PBSまたはDMSOと比較して、それぞれ野生型マウスにおけるレーザー-誘導CNVを抑制したのに対して、NRTIsの硝子体内注射は、P2rx7^-/-マウスにおけるレーザー-誘導CNVを抑制しなかった。さらに、NRTIsの硝子体内注射はNlrp3^-/-マウスにおけるレーザー-誘導CNVを抑制した、このことは、抗血管新生効果がNlrp3-非依存性であることを示している。NRTIsおよびカムブジン類のP2X7阻害および／血管-阻害効果はまた、次のものに限定されないが、腫瘍増殖をブロックすることおよび／または移植片対宿主病を治療することを含む、その他の疾患の治療において有効であると思われる。

図８１および８２は、元のNRTIsと比較して、カムブジン類が既存の血管新生疾患の治療において、増大した有効性と効力を有することを示す。JR5558マウスは、自然発症の脈絡膜血管新生（CNV）を生じ、ウエット／血管新生の加齢黄斑変性（AMD）の動物モデルである。CNV病変の活性は、この疾患を有するヒトで行われるように、病変からの色素漏出の度合いを評価する、蛍光眼底血管造影法を用いてモニターすることができる。図８１および８２は、2つのJR5558マウス（N=8）からの代表画像である。図８１および８２の第1および第3列は、それぞれ、初代および2代JR5558マウスの左目（第1列）および右目（第3列）における既住のCNV病変からの時間依存の色素漏出を示す。図８１および８２の第2列は3TCの125 ngの単回硝子体内投与後の左目の時間依存の色素漏出を示し、第4列は3-Me-3TCの62.5 ngの単回硝子体内投与後の右目の時間依存の色素漏出を示す。列2および4に見られるように、3TCおよび3-Me-3TCの両方は、投与後3日で既住のCNV病変の活性を抑制する（すなわち、それらの色素漏出を減少する）。さらに、元のNRTI（3TC）と比較して、カムブジン（すなわち、3-Me-3TC）は、より低用量（すなわち、より強力）でCNV病変漏出においてより大きな減少（より効果的）を与える。

ドライAMDのモデルにおける図８３〜８６において、眼底写真およびRPEのZO-1平面プレパラート染色によるモニターにより、カムブジン類がドライAMDのモデルにおいてAlu-誘導RPE変性をブロックすることが示される。

図８３は、本明細書に開示の化合物が、「ドライAMD」のモデルにおいてAlu RNA-誘導RPE変性をブロックすることを示す。野生型マウスにおいて、Alu RNA（0.3μg）の網膜下注射はRPE変性（カラーの眼底写真で白黄色部分(上段列)および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導する。眼底写真（上段；変色の白色領域のより小さい領域）およびZO-1免疫染色されたRPE平面プレパラート（下段；より六角形でモザイク状の様相）に見られるように、3Me-3TC（25mg、Alu RNA注射後6日間の1日2回）の腹腔内投与はRPE変性を防ぐ。下段のパネルは、O-Me N-Et d4T（25mg、Alu RNA注射後6日間の1日2回）の腹腔内投与は、野生型マウスにおけるAlu RNA-誘導RPE変性を防ぐことを実証する眼底写真を示す。6実験の代表的な画像。

図８４は、本明細書に開示の3Me-3TCが、「ドライAMD」のモデルにおいてpAlu-誘導RPE変性をブロックすることを示す。野生型マウスにおいて、Aluコード化プラスミド（pAlu）の網膜下注射はRPE変性（カラーの眼底写真(上段列)で白黄色部分および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導する。3Me-3TC（25mg、pAlu注射後6日間の1日2回）の腹腔内投与は、眼底写真（上段）およびZO-1免疫染色されたRPE平面プレパラート（下段）に見られるようにRPE変性を防ぐ。6実験の代表的な画像。

図８５は、3Et-3TCが、「ドライAMD」のモデルにおいてpAlu-誘導RPE変性をブロックすることを示す。野生型マウスにおいて、Aluコード化プラスミド（pAlu）の網膜下注射はRPE変性（カラーの眼底写真(上段列)で白黄色部分および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導する。3Et-3TC（25mg、pAlu注射後6日間の1日2回）の腹腔内投与は、眼底写真（上段）およびZO-1免疫染色されたRPE平面プレパラート（下段）に見られるようにRPE変性を防ぐ。6実験の代表的な画像。

図８６は、本明細書に開示の化合物が、「ドライAMD」のモデルにおいてpAlu-誘導RPE変性をブロックすることを示す。野生型マウスにおいて、Aluコード化プラスミド（pAlu）の網膜下注射はRPE変性（カラーの眼底写真(上段列)で白黄色部分および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導する。2Et-d4Tまたは2Et-AZT（25mg、pAlu注射後6日間の1日2回）の腹腔内投与は、眼底写真に見られるようにRPE変性を防ぐ。6実験の代表的な画像。

図８７〜８９において、カムブジン類は、ポリI:C、アミロイドβ、鉄の眼球内注射後のRPE変性をブロックすることに効果的であることが示される。

図８７は、「ドライAMD」のモデルで、本明細書に開示の化合物がポリIC-誘導RPE変性をブロックすることを示す。野生型マウスの網膜下腔へのポリIC（0.2μg）の投与は、RPE変性（カラーの眼底写真(上段列)で白黄色部分および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導する。Me-d4Tまたは2-Me-d4T(0.14 mmol)の硝子体内投与（ポリIC注射後）は、この変性をブロックする（ポリIC後7日に測定）。上段列は、代表的な眼底写真を示す。下段列は、代表的なZO-1免疫染色されたRPE平面プレパラートを示す。N=4〜6。

図８８は、「ドライAMD」のモデルで、本明細書に開示の化合物がアミロイドβ-誘導RPE変性をブロックすることを示す。RPE変性（カラーの眼底写真(上段列)で白黄色部分および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導するために、オリゴマー アミロイドβ1-40ペプチド(0.83μM)をマウスの網膜下腔に注射した。1〜6日目の3TCまたはK-2（2Me-d4T）の腹腔内投与（25 mg/kg）は、7日目にRPE変性の進展をブロックした。上段列はカラーの眼底写真を示す。下段列はZO-1染色RPE平面プレパラートを示す。

図８９は、「ドライAMD」のモデルで、本明細書に開示の化合物が鉄-誘導RPE変性をブロックすることを示す。RPE変性（カラーの眼底写真(上段列)で白黄色部分および六角形配列の崩壊（下段列））を誘導するために、クエン酸鉄(III)アンモニウム(3 nM)をマウスの網膜下腔に注射した。1〜6日目のd4T、K-1（Me-d4T）またはK-2（2Me-d4t）の腹腔内投与（25 mg/kg）は、ビヒクル処理と比較して、7日目にRPE変性の進展をブロックした。上段列はカラーの眼底写真を示す。下段列はZO-1染色RPE平面プレパラートを示す。

マウスおよび細胞におけるNRTIs対カムブジン類の安全性／毒性

本化合物の安全性および毒性も研究された。図９０は、NRTIsが硝子体内注射後の網膜に毒性であることを示す。驚くべきことにかつ予測されず、NRTIsに単一R置換を追加すると、この毒性が取り除かれる：図９１は、カムブジン類の同じ用量の硝子体内注射は毒性がなく、それは、それらが眼内投与に対してNRTIsより安全であることを示している。さらに、図９２は、カムブジン類が、それらの硝子体投与が網膜の解剖学的破壊を誘導しないという点において安全であることを示している。

図９０は、既知のNRTIsが網膜毒性を引き起こし得ることを示している。マウスでのd4T、AZTまたは3TC（0.56 nmol）の硝子体内注射は、網膜変性の領域（赤色楔形）網膜毒性を誘導した。代表的なカラーの眼底写真像が示される（N=8）。これらのデータは、NRTIsが眼内投与後に有害な作用を有し得ることを示している。

図９１は、本明細書に開示の化合物が網膜に対して毒性がないことを示している。マウスにおけるカムブジン1〜9（2.8 nmol）の硝子体内注射は、網膜毒性を誘導しなかった。代表的なカラーの眼底写真像が示される（N=8）。これらのデータは、NRTIsと異なり、カムブジン類は眼内投与に対してより安全であるを示している。

図９２も、本明細書に開示の化合物が網膜に対して毒性がないことを示している。マウスにおけるカムブジン1〜5（2.8 nmol）の硝子体内注射は、網膜のいかなる解剖学的破壊（H&E染色-上段列）または網膜の種々の層（ILM：内境界膜；OLM：外境界膜；IPL：内網状層；INL：内顆粒層；ONL：外顆粒層；IS：内節；OS：外節）の厚さの変化を誘導しなかった。N=8。これらのデータは、NRTIsと異なり、カムブジン類が非常に高い濃度での眼内投与であってもより安全であることを示している。

最後に、図９３および９４は、カムブジン類がNRTIsの「的外れの」ポリメラーゼ阻害を欠いていることを示している。すなわち、NRTIsにおけるR基の置換は、ポリメラーゼ阻害に対するそれらの活性を完全に変えた。

図９３は、カムブジン類にはないが、NRTIsが培養下の一次ヒトRPE細胞においてミトコンドリアDNAコピー数をブロックしたことを示している。NRTIsは、DNAポリメラーゼ ガンマに対する内因性のヌクレオチドと競争することによりミトコンドリア（mt）DNAを枯渇させる；mtDNA枯渇は、NRTI使用に関連する多くの副作用に大きく関与すると考えられる。それぞれの修飾された化合物を個々に試験することの必要性を示す、mtDNAレベルの救済においてカムブジン類間でいくらかの差があった。グラフは、全ての薬物に対して50μMの濃度で、NRTIs（d4T、3TCまたはAZT）または修飾NRTIs（Me-d4T、2Me-d4T、TN-3TC、Me-AZTまたは2Me-AZT）で処理された一次ヒトRPE細胞におけるビヒクル処理（DMSO、別名「No Tx」）に対するmtDNAの相対量を示す。薬物への曝露を伴う細胞培養の4日後にDNAが集められた。定量的ポリメラーゼ連鎖反応がmtDNAに対して行われ、ゲノムDNA配列に標準化された(normalized)。D4T、3TCおよびAZTはmtDNA枯渇を示す。D4TおよびAZTの修飾型はmtDNA枯渇を示さなかった。N=3〜4／群、エラーバーはS.E.M.である。これらのデータはNRTIsがミトコンドリア毒性を引き起こし得るのに対して、ほとんどの修飾NRTIsはミトコンドリア毒性を引き起こさないことを示している。ミトコンドリア毒性は、NRTIsを服用する患者に観察される乳酸アシドーシスを伴う筋障害、末梢神経障害および肝脂肪症の原因とされており、修飾NRTIsはミトコンドリア毒性を引き起こさないので、修飾NRTIsは元のNRTIsより安全である（すなわち、ミトコンドリア毒性を減少または排除する）ことが予測される。

図９４は、EGFPレポーターがヒトLINE-1レトロトランスポゾンの達成できた(successful)逆転写および組込みのみに発現される、L1レトロ転位アッセイの結果を示す。カムブジン類はしないが、NRTIsがL1レトロ転位をブロックした、そしてそのことは、それらがRNA-依存性DNAポリメラーゼ活性をブロックしないことを示す。これらの発見は、新規な治療法として、ヌクレオシド類似体の合理的な再設計および改良に対して道を開く。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）細胞培養L1レトロ転位アッセイはHela細胞で行われた。ビヒクル（RPS）の存在下、またはNRTIs（d4T、AZTまたは3TC）もしくはメトキシ-NRTIs（Me-d4T、2Me-d4T、Me-AZT、2Me-AZT、3Me-3TC、2Et-d4T、2Et-AZTまたは3Et-3TC）の存在下、EGFPレポーターで標識された活性L1配列を発現するプラスミドで細胞がトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞がピューロマイシン中で選択された。トランスフェクト後7日目に、レトロ転位を受けた（EGFP-陽性）細胞がフローサイトメトリーによりアッセイされた。レトロ転位を無効にするL1-ORF1において2点変異を有するプラスミドJM111のバックグラウンド蛍光に基づいて細胞が開閉された(gated)。データは1にセットされたRPSで標準化される。これらのデータは、NRTIsが内因性L1活性を妨げるのに対して、修飾NRTIsは、細胞の中のこの天然のL1活性を妨げないであろうことを示している。3Et-3TCは天然のL1活性にいくらかの残留妨害を有するようであるのに対して、その他のカムブジン類（修飾NRTIs）はL1活性には影響がない。

本明細書で言及される全ての出版物、特許および特許出願は、次のリストに記述されている参考文献を含み、個々の出版物、特許または特許出願が参照として組み込まれることが具体的かつ個別に示されるように、同じ範囲で参照として本明細書に組み込まれる。

参考文献
1. International Patent Application No. PCT/US11/38753.
2. International Patent Application No. PCT/US12/46928.
3. U.S. Provisional Patent Application Serial No. 61/586,427.
4. U.S. Provisional Patent Application Serial No. 61/780,105.
5. Adinolfi, E., Callegari, M.G., Ferrari, D., Bolognesi, C., Minelli, M., Wieckowski, M.R., Pinton, P., Rizzuto, R., and Di Virgilio, F. (2005). Basal activation of the P2X7 ATP receptor elevates mitochondrial calcium and potential, increases cellular ATP levels, and promotes serum-independent growth. Mol Biol Cell 16, 3260-3272.

6. Agarwal, H.K., Loethan, K., Mandal, D., Doncel, G.F., and Parang, K. (2011). Synthesis and biological evaluation of fatty acyl ester derivatives of 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine. Bioorg Med Chem Lett 21, 1917-1921.
7. Ahmad, R., Sindhu, S.T., Toma, E., Morisset, R., and Ahmad, A. (2002). Elevated levels of circulating interleukin-18 in human immunodeficiency virus-infected individuals: role of peripheral blood mononuclear cells and implications for AIDS pathogenesis. J Virol 76, 12448-12456.
8. Ambati, J., Ambati, B.K., Yoo, S.H., Ianchulev, S., and Adamis, A.P. (2003). Age-related macular degeneration: etiology, pathogenesis, and therapeutic strategies. Surv Ophthalmol 48, 257-293.
9. Ambati, J., and Fowler, B.J. (2012). Mechanisms of age-related macular degeneration. Neuron 75, 26-39.
10.Balzarini, J., Herdewijn, P., and De Clercq, E. (1989). Differential patterns of intracellular metabolism of 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine and 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine, two potent anti-human immunodeficiency virus compounds. J Biol Chem 264, 6127-6133.

11.Batzer, M.A., and Deininger, P.L. (2002). Alu repeats and human genomic diversity. Nat Rev Genet 3, 370-379.
12.Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J.C., and Greenfeder, S. (2005). Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochem Biophys Res Commun 332, 17-27.
13.Cruz, C.M., Rinna, A., Forman, H.J., Ventura, A.L., Persechini, P.M., and Ojcius, D.M. (2007). ATP activates a reactive oxygen species-dependent oxidative stress response and secretion of proinflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem 282, 2871-2879.
14.David, D., Chevrier, D., Treilhou, M.P., Joussemet, M., Dupont, B., Theze, J., and Guesdon, J.L. (2000). IL-18 underexpression reduces IL-2 levels during HIV infection: a critical step towards the faulty cell-mediated immunity? Aids 14, 2212-2214.
15.Dewannieux, M., Esnault, C., and Heidmann, T. (2003). LINE-mediated retrotransposition of marked Alu sequences. Nat Genet 35, 41-48.

16.Dridi, S., Hirano, Y., Tarallo, V., Kim, Y., Fowler, B.J., Ambati, B.K., Bogdanovich, S., Chiodo, V.A., Hauswirth, W.W., Kugel, J.F., et al. (2012). ERK1/2 activation is a therapeutic target in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 13781-13786.
17.Ferrara, J.L., Levine, J.E., Reddy, P., and Holler, E. (2009). Graft-versus-host disease. Lancet 373, 1550-1561.
18.Garcia-Marcos, M., Fontanils, U., Aguirre, A., Pochet, S., Dehaye, J.P., and Marino, A. (2005). Role of sodium in mitochondrial membrane depolarization induced by P2X7 receptor activation in submandibular glands. FEBS Lett 579, 5407-5413.
19.Hazleton, J.E., Berman, J.W., and Eugenin, E.A. (2012). Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. J Immunol 188, 4488-4495.
20.Hentze, H., Lin, X.Y., Choi, M.S., and Porter, A.G. (2003). Critical role for cathepsin B in mediating caspase-1-dependent interleukin-18 maturation and caspase-1-independent necrosis triggered by the microbial toxin nigericin. Cell Death Differ 10, 956-968.

21.Humphreys, B.D., Rice, J., Kertesy, S.B., and Dubyak, G.R. (2000). Stress-activated protein kinase/JNK activation and apoptotic induction by the macrophage P2X7 nucleotide receptor. J Biol Chem 275, 26792-26798.
22.Iannello, A., Boulassel, M.R., Samarani, S., Tremblay, C., Toma, E., Routy, J.P., and Ahmad, A. (2010). HIV-1 causes an imbalance in the production of interleukin-18 and its natural antagonist in HIV-infected individuals: implications for enhanced viral replication. J Infect Dis 201, 608-617.
23.Jankovic, D., Ganesan, J., Bscheider, M., Stickel, N., Weber, F.C., Guarda, G., Follo, M., Pfeifer, D., Tardivel, A., Ludigs, K., et al. (2013). The Nlrp3 inflammasome regulates acute graft-versus-host disease. J Exp Med 210, 1899-1910.
24.Kahlenberg, J.M., and Dubyak, G.R. (2004). Mechanisms of caspase-1 activation by P2X7 receptor-mediated K+ release. Am J Physiol Cell Physiol 286, C1100-1108.
25.Kaneko, H., Dridi, S., Tarallo, V., Gelfand, B.D., Fowler, B.J., Cho, W.G., Kleinman, M.E., Ponicsan, S.L., Hauswirth, W.W., Chiodo, V.A., et al. (2011). DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature 471, 325-330.

26.Kerur, N., Hirano, Y., Tarallo, V., Fowler, B.J., Bastos-Carvalho, A., Yasuma, T., Yasuma, R., Kim, Y., Hinton, D.R., Kirschning, C.J., et al. (2013). TLR-Independent and P2X7-Dependent Signaling Mediate Alu RNA-Induced NLRP3 Inflammasome Activation in Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci 54, 7395-7401.
27.Kubes, P., and Mehal, W.Z. (2012). Sterile inflammation in the liver. Gastroenterology 143, 1158-1172.
28.Lewis, W., Day, B.J., and Copeland, W.C. (2003). Mitochondrial toxicity of NRTI antiviral drugs: an integrated cellular perspective. Nat Rev Drug Discov 2, 812-822.
29.Mariathasan, S., Newton, K., Monack, D.M., Vucic, D., French, D.M., Lee, W.P., Roose-Girma, M., Erickson, S., and Dixit, V.M. (2004). Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature 430, 213-218.
30.Mariathasan, S., Weiss, D.S., Newton, K., McBride, J., O'Rourke, K., Roose-Girma, M., Lee, W.P., Weinrauch, Y., Monack, D.M., and Dixit, V.M. (2006). Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature 440, 228-232.

31.Martinon, F., Burns, K., and Tschopp, J. (2002). The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell 10, 417-426.
32.Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A., and Tschopp, J. (2006). Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome. Nature 440, 237-241.
33.McDonald, B., Pittman, K., Menezes, G.B., Hirota, S.A., Slaba, I., Waterhouse, C.C., Beck, P.L., Muruve, D.A., and Kubes, P. (2010). Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science 330, 362-366.
34.Nakahira, K., Haspel, J.A., Rathinam, V.A., Lee, S.J., Dolinay, T., Lam, H.C., Englert, J.A., Rabinovitch, M., Cernadas, M., Kim, H.P., et al. (2011). Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome. Nat Immunol 12, 222-230.
35.Nykanen, A., Haley, B., and Zamore, P.D. (2001). ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321.

36.Ostertag, W., Roesler, G., Krieg, C.J., Kind, J., Cole, T., Crozier, T., Gaedicke, G., Steinheider, G., Kluge, N., and Dube, S. (1974). Induction of endogenous virus and of thymidine kinase by bromodeoxyuridine in cell cultures transformed by Friend virus. Proc Natl Acad Sci U S A 71, 4980-4985.
37.Pelegrin, P., and Surprenant, A. (2006). Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J 25, 5071-5082.
38.Petrilli, V., Papin, S., Dostert, C., Mayor, A., Martinon, F., and Tschopp, J. (2007). Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death Differ 14, 1583-1589.
39.Qu, Y., Misaghi, S., Newton, K., Gilmour, L.L., Louie, S., Cupp, J.E., Dubyak, G.R., Hackos, D., and Dixit, V.M. (2011). Pannexin-1 is required for ATP release during apoptosis but not for inflammasome activation. J Immunol 186, 6553-6561.
40.Riteau, N., Baron, L., Villeret, B., Guillou, N., Savigny, F., Ryffel, B., Rassendren, F., Le Bert, M., Gombault, A., and Couillin, I. (2012). ATP release and purinergic signaling: a common pathway for particle-mediated inflammasome activation. Cell Death Dis 3, e403.

41.Sorge, R.E., Trang, T., Dorfman, R., Smith, S.B., Beggs, S., Ritchie, J., Austin, J.S., Zaykin, D.V., Vander Meulen, H., Costigan, M., et al. (2012). Genetically determined P2X7 receptor pore formation regulates variability in chronic pain sensitivity. Nat Med 18, 595-599.
42.Stylianou, E., Bjerkeli, V., Yndestad, A., Heggelund, L., Waehre, T., Damas, J.K., Aukrust, P., and Froland, S.S. (2003). Raised serum levels of interleukin-18 is associated with disease progression and may contribute to virological treatment failure in HIV-1-infected patients. Clin Exp Immunol 132, 462-466.
43.Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R.A., and Buell, G. (1996). The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science 272, 735-738.
44.Tarallo, V., Hirano, Y., Gelfand, B.D., Dridi, S., Kerur, N., Kim, Y., Cho, W.G., Kaneko, H., Fowler, B.J., Bogdanovich, S., et al. (2012). DICER1 Loss and Alu RNA Induce Age-Related Macular Degeneration via the NLRP3 Inflammasome and MyD88. Cell 149, 847-859.
45.Wilhelm, K., Ganesan, J., Muller, T., Durr, C., Grimm, M., Beilhack, A., Krempl, C.D., Sorichter, S., Gerlach, U.V., Juttner, E., et al. (2010). Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nat Med 16, 1434-1438.

46.Yamin, T.T., Ayala, J.M., and Miller, D.K. (1996). Activation of the native 45-kDa precursor form of interleukin-1-converting enzyme. J Biol Chem 271, 13273-13282.
47.Fowler, et al. (2014) Nucleoside reverse transcriptase inhibitors possess intrinsic anti-inflammatory activity. Science 346: 6212, 1000-1003.

本開示の教示または以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、さらなる態様または実施が可能であることを当業者は認識するであろう。この詳細な説明、および特に本明細書に開示される例示の態様および実施の具体的な詳細は、理解を明確にするために主に示されるもので、不必要な限定がそれらか理解されるべきでない、変更に対して、この開示を読めば当業者に明らかになるであろうし、主張される本発明の精神または範囲から逸脱することなくなされ得る。

Claims (14)

1. 次の：
   からなる群から選択される構造を有する化合物、またはその医薬的に許容な塩。
2. 次の：
   からなる群から選択される構造を有する請求項1に記載の化合物、またはその医薬的に許
   容な塩。
3. 前記化合物が、次の構造：
   を有する請求項2に記載の化合物、またはその医薬的に許容な塩。
4. 請求項1に記載の化合物および医薬的に許容な担体を含む医薬組成物。
5. 前記化合物が、次の構造：
   を有する請求項4に記載の医薬組成物。
6. ドライ加齢黄斑変性（AMD）およびウエットAMDを含む網膜損傷および／または退化、リュウマチ性関節炎および反応性関節炎を含む種々の形態の関節炎、真性糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、移植片対宿主病、慢性疼痛、増殖性硝子体網膜症、緑内障、多発性硬化症、双極性障害、大鬱病性障害、腎線維症、腎炎、肺線維症、ハンチントン病、骨粗鬆症、慢性リンパ球性白血病、不安障害、肺結核、更年期後の女性および骨折患者における骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス、円板状エリトマトーデス、慢性炎症性および神経因性疼痛、常染色体優性多発性嚢胞腎、脊髄損傷、アルツハイマー病、神経因性疼痛、高血圧症、静脈瘤、I型糖尿病、II型糖尿病、痛風、自己免疫性肝炎、移植血管損傷、アテローム性動脈硬化症、血栓症、メタボリック症候群、唾液腺炎、外傷性脳損傷、虚血性心疾患、虚血性脳卒中、パーキンソン病、黒色腫、神経芽細胞腫、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、甲状腺癌、管状早期胃癌、神経内分泌癌、類粘液大腸癌、大腸癌；高悪性度尿路上皮癌、腎臓明細胞癌、未分化卵巣癌、乳頭嚢胞内乳癌、グラム陰性菌敗血症、感染性の緑膿菌、コレラ菌、レジオネラ spp.、フランシセラ spp.およびリーシュマニアspp. クラミジア spp.、クリオピリン関連周期熱症候群；角膜炎、尋常性座瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、インスリン耐性、肥満、溶血性尿毒症症候群、ポリオーマウイルス感染症、免疫複合体型腎疾患、急性尿細管損傷、ループス腎炎、家族性慣例自己炎症症候群、マックル-ウェルズ症候群および新生児期発症多臓器系炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節自己炎症性疾患、腎虚血-再灌流傷害、糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、全身性血管炎、IgA腎症、マラリア、蠕虫感染症、敗血性ショック、アレルギー性喘息、枯草熱、薬剤誘発性肺炎症、接触性皮膚炎、ハンセン病、バークホルデリア セノセパシア感染症、呼吸器合胞体ウイルス感染症、乾癬、強皮症、嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群、炎症性関節疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、心臓手術（術中／術後の炎症）、急性および慢性臓器移植拒絶反応、急性および慢性骨髄移植拒絶反応、腫瘍の血管新生、筋萎縮性側索硬化症、および自閉症スペクトラム障害に関連する症状の治療するときに使用のための、請求項1に記載の化合物または請求項4に記載の組成物。
7. 網膜損傷を治療するときに使用のための、請求項1もしく6に記載の化合物または請求項4もしくは6に記載の組成物。
8. 細胞に関連するAlu RNAによるインフラマソーム活性化を阻害するときに使用のための、請求項1もしく6に記載の化合物または請求項4もしくは6に記載の組成物。
9. 前記インフラマソームが、NLRP3インフラマソーム、IL-1ベータ インフラマソームおよびそれらの組合せから選択される、請求項8に記載の使用のための化合物または組成物。
10. ATP-誘導の細胞透過性を減少するときに使用のための、請求項1もしくは6に記載の化合物または請求項4もしくは6に記載の組成物。
11. 細胞におけるミトコンドリア反応性酸素種の量を減少するときに使用のための、請求項1もしく6に記載の化合物または請求項4もしくは6に記載の組成物。
12. 前記細胞が、網膜色素上皮細胞、網膜視細胞、脈絡膜細胞およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項8〜11のいずれか1つに記載の使用のための化合物または組成物。
13. 前記症状がドライAMDまたはウエットAMDである、請求項12に記載の化合物または組成物。
14. 前記化合物が、次の構造：
    を有する請求項13に記載の化合物または組成物。