KR20170123320A - 망막의 퇴행을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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벤자민 파울러
카메시와리 암바티
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유니버시티 오브 켄터키 리서치 파운데이션
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Abstract

본 발명은 세포와 관련된 Alu RNA에 의한 인플라마솜(inflammasome) 활성화를 억제하고, 세포의 ATP-유도 투과성을 감소시키고, 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소종의 양을 감소시키고, 그리고 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소종의 양을 감소시키기 위한, 망막 손상 및/또는 망막 퇴행/망막 변성을 치료하는데 유용한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 RPE 새포를 보호하고 및/또는 연령-관련 건식 황반변성(AMD) 및 습윤 AMD를 비롯한 망막 손상 및/또는 변성과 관련된 병적상태, 알츠하이머 병, 다양한 형태의 관절염, 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐질환, 염증성 장질환 및 뒤시엔느(Duchenne) 근육디스트로피의 치료 및 예방적 치료에 사용하기 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

망막의 퇴행을 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2015년 10월 27일 출원된 미국 임시 특허출원 제 62/247,099 호; 2015년 10월 26일 출원된 동 제 62/246,455 호; 2015년 2월 26일 출원된 동 제 62/121,379 호의 우선권을 주장하며, 이들 출원의 전체 기술 내용은 본 명세서에 포함된다.
본 발명은, 세포와 관련된 Alu RNA에 의한 인플라마솜(inflammasome) 활성화를 억제하고, 세포의 ATP-유도 투과성을 감소시키고, 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소종의 양을 감소시키고, 그리고 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소종(oxygen species)의 양을 감소시키기 위한, 망막 손상 및/또는 망막 퇴행/망막 변성을 치료하는데 유용한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NRTI)를 포함하는 화합물 및 조성물에 관한 것이다.
세계적으로 수백만 명의 사람들이 실명을 하고 공인된 치료법이 없는 연령-관련 황반변성(AMD)의 진행된 형태인 지도모양위축(geographic atrophy)은 망막 색소상피(retinal pigmented epithelium, RPE) 세포의 사멸로부터 발생한다. 예를 들면, 마이크로RNA(miRNA) 생합성에 관여하는 효소인 DICER의 발현은 지도모양위축으로 인간 눈의 RPE에서 감소되며, Dicer 1의 조건 절제는 생쥐에서 RPE 퇴행을 유도한다. 놀랍게도, miRNA 생합성이나 기능을 담당하는 7가지 기타 효소를 제거하면 그러한 병리(pathology)가 유발되지 않는다. 그 대신, DICER1의 녹다운(knockdown)은 인간 RPE 세포에서 Alu 반복 RNA 및 생쥐의 RPE에서 B1 및 B2 (Alu 유사 요소) 반복 RNAs의 축적을 유도한다. Alu RNA는 인간의 눈의 RPE에서 지도모양위축으로 급격히 증가하며, 이 병리학적 RNA의 도입은 인간 RPE 세포 및 생쥐의 RPE 변성의 사멸을 유도한다.
선진국에서 암과 마찬가지로 유행하는 연령-관련 황반변성(AMD)은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이다. 많은 공인된 치료법이 존재하는 AMD의 신생 혈관 형태와는 대조적으로, 훨씬 더 일반적인 위축성 형태의 AMD는 제대로 이해되지 않았고 효과적인 임상이 이루어지지 않은 채 남아 있다. 망막 색소상피의 심한 위축은 심한 시력 상실을 가져오며 지도모양위축이라고 불리운다.
따라서, 망막 퇴행/망막 변성, 특히 RPE 퇴행을 치료하는 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 특허청구범위에서 상세히 설명된다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 적용되는 예시적인 실시형태를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참고로 하여 더 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 d4T가 증가하거나 증가하지 않은 대조용 PBS 또는 Alu RNA 처리된 생쥐의 안저(ocular fundus) 사진을 맨 윗열에 표시하고(왼쪽에서 오른쪽으로), 그리고 Alu RNA 투여시 파열되지만 최고의 투여량 d4T에서 건강한 RPE 형태/세포간 접합부로 복원되는 세포간 접합부(ZO-1)에 대해 적색으로 염색된 RPE 플랫 마운트(flat mount)를 나타낸다.
도 2는 표시된 시간 동안 Alu RNA (pAluA)에 대한 강제 발현 플라스미드로 처리된 인간(HeLa) 세포가 MTS 증식 분석에 의해 모니터링된 바와 같이, 널(null) 플라스미드(pUC19)와 비교하여 생존율이 크게 감소하고, 그리고 d4T 동시투여가 Alu 과발현에 의해 유발된 세포 사멸을 방지한다는 것을 나타낸 막대 그래프이다.
도 3은 Alu-특이적 프로브를 이용한 노던 블로팅(Nothern blotting)의 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 제시된 바와 같이, DICER1(Dcr as) (레인 3 (좌측으로부터 3 번째 레인))을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 일차 인간 RPE 세포는 대조용 안티센스 올리고뉴클레오티드(Ctr as) (레인 1 (가장 왼쪽))와 비교하여 핵 구획에서 Alu RNA 수준이 증가하고, d4T (레인 2 및 4)의 동시투여는 Alu RNA 수준을 감소시키지 못한다. u6 (하단 행)은 핵분획에 대한 부하 대조군(loading control)으로서 표시된다.
도 4는 Alu-특이적 프로브를 사용한 노던 블로팅 결과의 또 다른 예를 제공한다. 도 4에 제시된 바와 같이, d4T의 동시투여는, Alu-특이적 프로브를 사용하여 노던 블로팅에 의해 검출된 바와 같이, d4T의 유무에 관계없이 Alu RNA로 형질 감염된 인간 RPE 세포의 핵분획에서 형질 감염후 1, 4 또는 24 시간에 Alu RNA 수준을 변화시키지 않는다. u6 (하단 행)은 도 4의 핵분획에 대한 부하 대조군으로서 표시된다.
도 5는, Alu RNA가 Alu 투여 24 시간 후 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 성숙을 일으키고, 이는 d4T로의 동시처리에 의해 차단(100㎛; 최우측 레인)된다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯의 결과를 제공한다. 하단 행은 빈쿨린(vinculin) 부하 대조군이다.
도 6은, Alu RNA가 3TC (20-100 uM, 최우측 레인)와의 동시처리로 차단되는 Alu 투여 24 시간 후(상부, 중간 레인, 하부 밴드)에 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 성숙을 일으킨다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯의 결과이고, 여기서 최하위 밴드는 부하 대조군, 빈쿨린이다.
도 7은, Alu RNA가 아지도티미딘 (AZT), 코디세핀(cordycepin) 및 아바카비르(abacavir, ABC) (50-100 uM, 왼쪽에서 3-8 레인)로의 동시처리에 의해 차단되고, Alu 투여 24 시간후 (상부, 중간 레인, 하부 밴드)에 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 성숙을 일으킨다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 부하 대조군 비쿨린은 하단에 표시된다.
도 8은, 전형적인 인플라마솜 활성제인 LPS/ATP로 처리된 일차 인간 RPE 세포가 증가된 카스파제-1 활성화 및 세포 표면 수용체 어댑터 단백질 MyD88를 통한 인플라마솜 시그널링의 마커인 IRAK4의 포스포릴화를 나타내는 겔을 제공한다. 또한, 도 8에 도시된 바와 같이, d4T (25/100 uM)는 LPS/ATP에 의해 유도된 카스파제-1 활성화 및 IRAK4 포스포릴화를 차단한다. 빈쿨린은 도 8의 겔에서 부하 대조군으로서 사용되었다. 또한, 도시된 바와 같이, LPS 및 ATP는 NLRP3 인플라마솜을 조합하여서만 활성화시킨다.
도 9는, d4T, 3TC 및 코디세핀 (100 uM에서), 모든 디-데옥시 뉴클레오시드 역전사효소 억제제가 LPS/ATP에 의해 유도된 IL-18 성숙(바닥) 및 카스파제-1 활성화(활성 p20 밴드, 상부)를 억제하는 것으로 나타난 웨스턴 블로팅의 결과를 제공한다. 도 9를 얻기 위해서, 생쥐 골수-유래 대식세포의 (i) 무처리, (ii) LPS 처리 또는 (iii) LPS/ATP 처리 후 세포 배양 상등액을 수집하고, 카스파제-1 및 IL-18 항체로 웨스턴 블로팅 프로빙을 실시하였다.
도 10은, d4T (100, 250 uM)가 나이제리신(nigericin)에 의해 유도된 IL-1β 성숙 (상단, 18 및 22 kDa 형태) 및 카스파제-1 활성화 (활성 p20 밴드, 하부)를 억제한다는 것을 나타낸 웨스턴 블롯의 결과를 제공한다. 도 10을 얻기 위해서, 생쥐 골수-유래 대식세포의 (i) 무처리, (ii) LPS 처리 또는 (iii) LPS/ATP 처리 후 세포 배양 상등액을 수집하고, 카스파제-1 및 IL-1 베타 항체로 웨스턴 블로팅 프로빙을 실시하였다.
도 11은, d4T가 요드산 모노나트륨 (MSU)에 의해 유도된 PMA-분화된 THP-1 단핵세포(monocytes)로부터의 IL-1 베타 분비를 억제하지 않음을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 도 11은, 인간 THP-1 단핵세포가 PMA를 갖는 대식세포로 분화된 후에 형성되었으며, 도 11에 나타낸 바와 같이, 공지된 인플라마솜 활성제인 MSU로 처리하면 비처리 세포에 비해 IL-1 베타 분비가 증가하는 반면, d4T를 투여 범위 (25-1,000 uM)에서의 동시투여는 IL-1베타 분비에 크게 영향을 미치지 않았다.
도 12는 d4T 및 기타 뉴클레오시드 역전사효소 억제제가 MSU에 의해 유도된 PMA-분화된 THP-1 단핵세포로부터의 IL-1 베타 분비를 억제하지 않는다는 것을 나타내는 막대 그래프이다. 인간 THP-1 단핵세포는 PMA를 갖는 대식세포로 분화되었다. 이들을 MSU로 처리하면, 도 12에 나타낸 바와 같이, 비처리 세포에 비해 IL-1 베타 분비를 증가시키는 반면, d4T, 3TC 또는 코디세핀 (모두는 디-데옥시 뉴클레오티드 유사체임)을 투여량 범위(25-1,000 uM)에서 동시투여하면 IL-1베타 분비에 크게 영향을 미치지 않았다.
도 13은 d4T가 Alu RNA에 의해 유도된 NLRP3 프라이밍(priming)을 감소시키는 것을 제공하는 그래프이다. 실제로, 도 13에 나타낸 바와 같이, Alu RNA 형질 감염(transfection)은 모의 시약(형질 감염 시약 단독)에 비해 "프라이밍"(Y-축)으로 일컬어지는 16 시간에서 일차 인간 RPE 세포에서 NLRP3 mRNA 수준을 증가시킨다. 이 효과는 d4T (100 uM)의 동시투여에 의해 둔화되고 18SNA 대조군으로 표준화된다.
도 14는, Alu RNA 형질 감염이 모의 시약(형질 감염 시약 단독)과 비교하여 "프라이밍" (Y-축)으로 지칭되는 이벤트인 24 시간에서 일차 인간 RPE 세포에서 IL-1베타 mRNA 수준을 증가시킨다는 것을 그래프 형태로 도시한다. 이 효과는 d4T (100 uM)의 동시투여에 의해 둔화되고 18S RNA 대조군으로 표준화된다.
도 15는, d4T가 Alu 발현에 의해 야기된 미토콘드리아 ROS를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 실제로, 도 15는 Alu (pAluA)의 강제 발현이 MitoSox 분석에 의해 검출된 바와 같이, 증가된 미토콘드리아 반응성 산소종 (mtROS)을 유발한다는 것을 입증한다. 도 15를 얻기 위해서, 일차 인간 RPE 세포는 d4T를 갖거나 갖지 않는 Alu 발현 플라스미드 또는 대조용 플라스미드 (pUC19)와 함께 배양되었다. 15 시간 후 세포를 mtROS (적색) 및 세포 수, 핵 (청색; Hoechst DNA 염색)으로 동시 염색하였다. pAluA 그룹의 세포는 pUC19 대조군과 비교하여 더 큰 mtROS 염색 (적색)을 나타내었고, 이는 pAluA+ d4T 처리된 세포에서 감소된 효과이었다.
도 16은, d4T가 Alu RNA에 의해 유도된 ATP 방출을 억제하지 않음을 보여주는 그래프를 제공한다. 또한, 도 16에 나타낸 시간 동안 Alu RNA로 처리된 일차 인간 RPE 세포는 ATP를 방출한다. 세포 배양 상등액은 모의 시약 또는 Alu RNA 처리된 세포로부터 d4T 유무에 관계없이 수집되었고, ATP는 ATP-의존성 루시퍼라제 분석을 이용하여 검출되었다. 주목할 만한 것은, d4T는 ATP 방출에 영향을 미치지 않았다.
도 17은, d4T가 Yo-Pro1 (P2X7 수용체 분석)에 대한 ATP-유도된 세포-투과성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 실제로, d4T는 96 웰 마이크로플레이트 판독기에서 영역 스캔 형광측정에 의해 결정된, ATP에 의해 유도된 Yo-Pro 침투를 투여량- 의존적으로 감소시켰다. 도 17은 상대적 형광 단위 (RFU, y-축)로 형광 측정의 결과를 제공한다.
도 18은, d4T가 Alu RNA 형질 감염 후 증가하는 세포외 칼륨 수준을 감소시키는 것을 그래프 형식으로 도시한다. 실제로, 세포 배양 칼륨 수준은 6 시간 동안 Alu RNA로 처리된 일차 인간 RPE 세포에서 증가하며, 이는 d4T 동시투여에 의해 감소된 효과이다. 칼륨 수준은 칼륨-의존성 피루베이트 키나제 분석을 사용하여 분광 광도계로 세포 배양 상등액에서 결정되었다.
도 19는, d4T가 Yo-Pro1에 대한 bzATP-유도된 세포 투과성을 차단한다는 것을 나타낸다(P2X7 수용체 분석). 도 19를 준비하기 위해서, d4T는 P2X7-선택 작용제 bzATP로 자극된 인간 P2X7 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 YO-PRO-1 요오드화물 유입을 차단하였다. bzATP/YO-PRO를 첨가하기 전 30분 동안 d4T로 세포를 미리 배양하고, t = 30분에 485/515 nm에서 형광 (상대적 형광 단위로)을 측정하였다.
도 20은, 메톡시-d4T [me-d4T; IUPAC 명: 1-[(2R,5S)-5-(메톡시메틸)-2,5-디히드로푸란-2-일]-5-메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온, 본 명세서에서는 "카무부딘 1"이라고 함]의 화학적 구조를 제공한다. 보다 구체적으로, 도 20에 나타낸 바와 같이, d4T 포스포릴화를 방지하기 위해 d4T의 리보스 5'-히드록시기를 메톡시기 (원으로 표시)로 단일 치환하도록 설계하였다.
도 21은 Alu RNA± me-d4T로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다.
도 22는, 변형되지 않은 d4T (me-d4T가 아닌)가 HeLa 세포에서 GFP-발현 렌티바이러스의 복제를 차단하는 세포를 나타낸다.
도 23은, 변형되지 않은 d4T (me-d4T가 아닌)가 실시간 정량적 PCR에 의해 결정된 바와 같은 일차 생쥐 RPE 세포에서 mtDNA 수준 (염색체 DNA 엑손-인트론 접합 서열로 표준화 됨)을 감소시킨다는 것을 나타내는 그래프를 제공한다. n = 4, 스투덴트 t-시험에 의해 *p < 0.05.
도 24는 폐쇄띠(zonula occludens) (ZO-1; 적색)에 대해 염색된 플랫 마운트를 하단 행에 제공한다. 변성은 청색 화살표로 강조되었다. n = 4 (B, C, E)의 대표적인 이미지가 표시되었다. 스케일 바(C): 200 ㎛; (E): 20 ㎛.
도 25는 me-d4T 합성의 개략적인 반응식을 제공한다.
도 26은 me-d4T (피크 # 6) 최종 생성물, 순도 > 97%의 HPLC 크로마토그램이다.
도 27은, 화학적 이동이 me-d4T의 구조와 일치하는, me-d4T 최종 생성물의 1H NMR 분광 그래프이다.
도 28은 me-d4T의 구조와 일치하는 m-d4T 최종 생성물의 액체 크로마토그래피/질량 분석 결과를 제공한다.
도 29는 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변종을 제공한다. 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변이(O-메틸기)가 원으로 표시되어있는 3TC (2'3'-디데옥시티딘)은 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변종을 제공한다.
도 30은 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변이 (O-메틸기)가 원으로 표시된 AZT (3'-아지도-2',3'-디데옥시티미딘)의 화학 구조가 도시되어 있다.
도 31은 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변종을 제공한다. 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변이(O-메틸기)가 원으로 표시되어있는 ABC (시클로프로필아미노 푸리닐시클로펜텐)의 화학 구조가 도시되어 있다.
도 32는 d4T (IC-d4T)의 세포 투과성 변종을 나타내며, 여기서 "n"은 11이다. 유도체는 3TC, AZT, ABC의 세포 투과성 변종을 포함하며, 여기서 핵산 염기 기 (원으로 표시)는 다양한 실시형태에서 d4T의 3TC, AZT, ABC 또는 메톡시 변종, 그의 3TC, AZT, ABC(도 29-31) 또는 그의 유도체로 치환될 수 있다.
도 33은 본 발명에 따른 예시적인 NRTI의 구조를 제공한다.
도 34는 Alu RNA ± d4T로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위) 및 IRAK4 포스포릴화의 웨스턴 블롯이다.
도 35는 Alu RNA ± NRTI (3TC, AZT, ABC)로 형질 감염된 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화의 웨스턴 블롯이다.
도 36은 안저 사진을 포함하는 데, 상단 열은 폐쇄띠-1 (ZO-1; 적색)로 염색된 플랫 마운트이고, 하단 열은 스케일 바, 50 ㎛이다.
도 37은 안저 사진을 제공하는 데, 상단 열은 폐쇄띠-1 (ZO-1; 적색)로 염색된 플랫 마운트이고, 하단 열은 스케일 바, 50 ㎛이다.
도 38은 NRTIs가 LPS/ATP-유도된 인플라마솜 활성화를 차단함을 예시한다. 특히, 도 38은 d4T가 카스파제-1을 차단함을 보여주는 겔을 나타낸다.
도 39는 또한 NRTIs가 LPS/ATP-유도된 인플라마솜 활성화를 차단하는 것을 예시하는 데, 특히 d4T가 IL-1베타를 차단하는 것을 나타내는 겔을 나타낸다.
도 40은 Raji TK- 세포가 아닌 Raji TK+ 세포가 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)에 의해 AZT를 AZT-트리포스페이트 (AZT-TP)로 포스포릴화한다는 것을 보여주는 크로마토그램이다.
도 41은 AZT가 세포 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이, Raji TK- 및 TK+ 세포 모두에서 LPS/ATP에 의해 IL-1 베타 활성화를 차단한다는 것을 나타낸다.
도 42는 d4T가 일차 인간 RPE 세포 (n = 4)로부터의 Alu-유도된 ATP 방출을 차단하지 않는다는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 43은, 인간 P2X7 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 bzATP (100 μM)에 의해 유도된 P2X7-매개 YO-PRO-1 염료흡수(형광)가 d4T 및 A438079 (양쪽 약물 모두 64 μM)에 의해 억제되었음을 나타내는 그래프를 제공한다. 형광 값은 bzATP 처리가 없는 세포로부터 뺀 기준선이다. * bzATP 대 d4T; # bzATP 대 A438079, Student-Newman Keuls post-hoc 시험(n=12)에 의해 p < 0.05.
도 44는 Alu RNA±d4T로 형질 감염된 일차 생쥐 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위) 및 IRAK4 포스포릴화의 웨스턴 블롯이다.
도 45는 비오틴-UTP-표지된 Alu RNA-형질 감염된 일차 인간 RPE 세포의 노던 블롯이다.
도 46은 AZT-트리포스페이트 (AZT-TP)의 LC-MS/MS 스펙트럼을 제공한다.
도 47은 AZU-트리포스페이트 (AZT-TP)의 LC-MS/MS 스펙트럼을 제공한다.
도 48은 지정된 피크의 동일성을 확인하기 위해 AZT-TP와 스파이크된 Raji TK- 세포에 MS 스펙트럼 (삽입)을 이용한 크로마토그래피 분리를 도시한다.
도 49는 지정된 피크의 동일성을 확인하기 위해 AZU-TP와 스파이크된 Raji TK- 세포에 MS 스펙트럼 (삽입)을 이용한 크로마토그래피 분리를 도시한다.
도 50은 AZT-TP 표준물 (검정색 원)의 표준 곡선이다. 도시된 바와 같이, AZT로 처리된 Raji TK+ 샘플은, AZT로 처리된 Raji TK- 세포에서 검출되지 않음에 따라 AZT-TP (흰색 삼각형)를 생성하였다.
도 51은 짧은 펩티드(Panx110)를 갖는 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯으로, 이는 P2X7 기공 기능을 차단하나 양이온 플럭스 (대 스크램블된 펩티드: Scr Panx110)는 차단하지 못한다.
도 52는 칼미다졸륨(도 32는 사용된 IC- 및 EC-d4T의 화학적 구조를 제공함)을 갖는 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서의 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이고, 이는 P2X7 양이온 플럭스를 차단하지만, 공극기능은 차단하지 못한다.
도 53은 세포 투과성(IC), 세포-불투성(EC), 또는 변성되지 않은 (태그 없음) d4T를 갖는 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다.
도 54는 d4T가 일차 인간 RPE 세포에서 pAlu-유도된 미토콘드리아 ROS 생성을 방지한다는 것을 나타낸다. 도 54에서, 미토콘드리아 반응성 산소종(ROS)은 MitoSox (적색) 및 Hoechst (청색)를 갖는 세포핵으로 가시화되었다.
도 55는 철(Ⅲ) 암모늄 구연산염의 존재하에 일차 인간 RPE 세포에서의 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다. TM-3TC (구조 8) (25 μM)의 첨가에 의해 철-유도된 카스파제-1 활성화를 차단하였다. 하단: 부하 대조군 투불린이다.
도 56은 철(Ⅲ) 암모늄 구연산염의 존재하에 일차 인간 RPE 세포에서의 카스파제-1 활성화 (p10 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다. d4T-엔 (구조 3) (25 μM)의 첨가에 의해 철-유도된 카스파제-1 활성화를 차단했다. 하단: 대조용 투불린이다.
도 57은 철(Ⅲ) 암모늄 구연산염의 존재하에 일차 인간 RPE 세포에서의 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다. 2me-d4T (구조 4) (25μM)의 첨가에 의해 철-유도된 카스파제-1 활성화를 차단했다. 하단: 대조용 투불린이다.
도 58은 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화(p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다. d4T-엔(구조 3) 및 TM-3TC(구조 8) (25 및 100 μM)의 첨가에 의해 Alu-유도된 카스파제-1 활성화를 차단하였다. 하단: 대조용 투불린이다.
도 59는 모든 약물에 대해 50 ㎛의 농도에서 NRTIs 또는 유도체 (부형체 처리(DMSO)에 비하여, "Tx 없음")로 처리된 일차 인간 RPE 세포에서의 mtDNA의 상대적인 양의 그래프이다. DNA는 약물에 노출된 세포 배양액에서 4일 후에 수집되었다. mtDNA에 대해 정량적인 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 게놈 DNA 서열로 표준화되었다. 포스포릴화되지 않은 d4T의 변형된 버전 (예를 들면, me-d4T, 도 20), 2 me-d4T (구조 4))은 모(parent) NRTI (d4T)와 비교하여 mtDNA 결핍을 나타내지 않는다. TM-3TC는 구조 8이다. N = 3-4/그룹, 오차 막대(error bar)는 S.E.M이다.
도 60은 모든 약물에 대해 50 ㎛의 농도에서 NRTIs 또는 유도체(부형체 처리(DMSO)에 대해 "NoTx"로 처리됨)로 처리된 일차 인간 RPE 세포에서의 mtDNA의 상대적인 양의 그래프이다. DNA는 약물에 노출된 세포 배양액에서 4일 후에 수집되었다. mtDNA에 대해 정량적인 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 게놈 DNA 서열로 표준화되었다. 포스포릴화되지 않은 AZT의 변형된 버전 (me-AZT (구조 1), N-Me-AZ-AZT (구조 10)는 모 화합물 (AZT)에 비해 mtDNA 결핍을 나타내지 않는다. N = 3-4/그룹이고, 오차 막대는 S.E.M이다.
도 61은 상단 열에 망막하의 대조용 빈-벡터 플라스미드(pNull); 또는 복강내 변형된 NRTIs (me-AZT (구조 1), N-me-me-AZT (구조 10) 또는 2 me-d4T (구조 4)로 매일 2회 처리된 Alu RNA-발현 플라스미드(pAlu) 또는 대조용 부형체를 투여 당 25 mg/kg의 투여량으로 투여한 생쥐의 안저 사진을 나타내고, 그리고 하단 열에는 Alu RNA 발현시 파괴(disrupted)되지만, 변형된 NRTI 처리로 건강한 RPE 형태/세포간 접합부로 복원되는 적색의 세포간 접합부 (ZO-1)로 염색된 RPE 플랫 마운트를 나타낸다. 스케일 바 20 ㎛.
도 62는 화학식 I (반응식 1의 구조 C), 화학식 IV (구조 B), 화학식 VIII (구조 E), 화학식 X (구조 D) 및 메톡시-d4T (구조 A; 또한 도 20)의 합성의 개략적인 반응식을 제공한다.
도 63은 변형된 NRTIs가 렌티바이러스 복제를 차단하지 않는다는 것(렌티바이러스 GFP 발현을 차단한 NRTIs와 달리)을 보여주는 렌티바이러스 형질도입 분석의 그래프이다. GFP-발현 렌티바이러스는 NRTIs(AZT, 3TC, d4T), 변형된 NRTIs (me-AZT, 구조 1; 2me-AZT, 구조 10; TM-3TC, 구조 8; me-d4T, 도 20; 2me-d4T, 구조 4) 또는 대조용(부형체)의 존재하에 20의 다중 감염에서 2.5x103 HeLa 세포에 첨가하였다. 모든 약물은 10 μM의 농도로 첨가되었다. 렌티바이러스 첨가 72 시간 후에 GFP 발현을 위해 세포를 영상화하였다. 시야당 GFP-양성 세포가 기록되었다. n = 4-11, 오차 막대 S.E.M. NRTIs는 역전사효소를 차단하는 것으로 알려져 있는 렌티바이러스의 역전사는 GFP 발현에 필수적이고, 변형된 NRTIs는 역전사효소를 차단해서는 안되며, NRTIs는 역전사효소를 차단하는 것으로 알려져 있다.
도 64는 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, 3TC에 반응하여 용량 의존적 방식으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 65는 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, 3Me-3TC에 반응하여 투여량 의존적 방식으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 66은 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, 3Et-3TC에 반응하여 투여량-의존적으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 67은 iGluc 세포 발광분석의 결과를 보여주는 막대 그래프로서, AZT에 반응하여 투여량 의존적 방식으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 68은 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, 2Me-AZT에 반응하여 투여량-의존적으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 69는 2Et-AZT에 반응하여 투여량 의존적 방식으로 카스파제-1 활성화의 억제를 나타내는 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 70은 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, d4T에 반응하여 투여량-의존적으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 71은 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, O-MeN-Et d4T에 반응하여 투여량-의존적으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 72는 iGluc 세포 발광분석의 결과를 나타내는 막대 그래프로서, Me-d4T에 반응하여 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 73은 iGluc 세포 발광분석 결과를 보여주는 막대 그래프로서, 2Et-d4T에 반응하여 투여량-의존적으로 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 74는 Alu-RNA-유도된 카스파제-1 활성화가 2Et-d4T (25 μM), 2Me-AZT (25 μM), O-MeN-Et d4T (25 μM), d4T-엔 (25-100 μM) 및 TM-3TC (25-100 μM)에 의해 감소된다는 것을 나타내는 일련의 웨스턴 블롯이다.
도 75는 철-유도된 카스파제-1 활성화가 TM-3TC (25 μM), d4T-엔 (25 μM), 2Me-d4T (25 μM), Me-AZT (25-100 μM) 및 2Me-AZT (25 μM)에 의해 감소되는 것을 보여주는 일련의 웨스턴 블롯을 포함한다. N = 3-4.
도 76은 보체(Complement)-유도된 카스파제-1 활성화가 3TC (25 μM)에 의해 감소됨을 보여주는 웨스턴 블롯을 포함한다.
도 77은 파라콰트(Paraquat)-유도된 카스파제-1 활성화가 3TC (25 μM)에 의해 감소됨을 보여주는 웨스턴 블롯을 포함한다.
도 78은 아밀로이드 베타-유도된 카스파제-1 활성화가 3TC (10-25 μM)에 의해 감소됨을 보여주는 웨스턴 블롯을 포함한다.
도 79는 "습윤 AMD" 모델에서 맥락막 혈관신생이 3TC (0.55 nmol), ABC (0.64 nmol) 또는 AZT (0.55 nmol)에 의해 감소된다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 80은 "습윤 AMD"의 모델에서 맥락막 혈관신생 (CNV)이 Me-d4T, O-Me-N-Et-d4T, 2Et-AZT 또는 3Et-3TC (0.14 nmol)에 의해 감소된다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 81은 기존의 CNV 병변을 갖는 제1 생쥐의 좌측 눈(상단 2개 열) 및 우측 눈 (하단 2개 열)의 안저 사진을 포함하며, 첫 번째 및 세 번째 열은 CNV 병변으로부터 시간-의존 염료 누출을 보여 주며, 두 번째 열은 125 ng의 3TC의 단일 유리체내투여 후 시간-의존성 염료 누출을 나타내며, 네 번째 열은 62.5 ng의 3-Me-3TC의 단일 유리체 투여 후 시간-의존성 염료 누출을 나타낸다.
도 82는 기존의 CNV 병변을 갖는 제2 생쥐의 좌측 눈(상단 2개 열) 및 우측 눈 (하단 2개 열)의 안저 사진을 포함하며, 첫 번째 및 세 번째 열은 CNV 병변으로부터 시간-의존 염료 누출을 보여 주며, 두 번째 열은 125 ng의 3TC의 단일 유리체내 투여 후 시간-의존성 염료 누출을 나타내며, 네 번째 열은 62.5 ng의 3-Me-3TC의 단일 유리체 투여 후 시간-의존성 염료 누출을 나타낸다.
도 83은, "건식 AMD"의 모델에서의 Alu RNA-유도된 RPE 변성이 3Me-3TC 및 O-MeN-Et d4T에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 84는, "건식 AMD"의 모델에서의 pAlu-유도된 RPE 변성이 3Me-3TC에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 85는, "건식 AMD"의 모델에서 pAlu-유도된 RPE 변성이 3Et-3TC에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 86은, 건조한 "AMD"모델에서의 pAlu-유도된 RPE 변성이 2Et-d4T 또는 2Et-AZT에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 87은, "건식 AMD"의 모델에서의 폴리IC-유도된 RPE 변성이 Me-d4T 또는 2-Me-d4T에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 88은, "건식 AMD"의 모델에서 아밀로이드 베타-유도된 RPE 변성이 3TC 또는 K-2 (2Me-d4T)에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 89는, "건식 AMD"의 모델에서 철-유도된 RPE 변성이 d4T, K-1 (Me-d4T) 또는 K-2 (2Me-d4T)에 의해 차단된다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 90은 d4T, AZT 또는 3TC가 망막변성을 일으킬 수 있음을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 91은 카무부딘이 망막에 유독하지 않음을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 92는 카무부딘이 망막에 유독하지 않음을 나타내는 추가 데이터를 포함한다.
도 93은 NRTIs (d4T, 3TC 또는 AZT)가 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 감소시키는 반면, 변형된 NRTIs (Me-d4T, 2Me-d4T, TM-3TC, Me-AZT 또는 2Me-AZT)는 mtDNA를 감소시키지 않는다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
도 94는 NRTIs (d4T, 3TC 또는 AZT)가 L1 레트로전이(retrotransposition)를 억제하지만, 변형된 NRTIs (Me-d4T, 2Me-d4T, Me-AZT, 2Me-AZT, 3Me-3TC, 2Et-d4T, 2Et-AZT, 또는 3Et-3TC)는 L1 레트로전이를 억제하지 않는다는 것을 보여주는 데이터를 포함한다.
본 명세서에 발명 대상은 상세한 설명을 통해 특정적으로 예시하지만 비제한적인 실시예로 예시된다. 실시예들은 본 발명과 관련된 개발 및 실험 과정에서 여러 시간에 수집된 데이터를 대표하는 데이터의 편집을 포함할 수 있다. 각 실시예는 본 발명의 설명을 위해 제공되며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 사실상, 본 발명의 설명은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 설명에 대해 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들면, 일 실시형태의 일부로서 예시되거나 기술된 특징은 또 다른 실시형태와 함께 이용되어 더 추가적인 실시형태를 형성할 수 있다.
본 명세서에 기술된 특유의 특성들 또는 제한들에 대한 모든 참고사항들은, 달리 언급되지 않거나 또는 언급된 문맥에 의해 정반대로 명백하게 암시되지 않는 한, 상응하는 복수의 특성(들) 또는 제한(들)을 포함해야하며, 그 역으로도 마찬가지이다.
본 명세서에서 사용되는 방법 또는 공정의 모든 조합은 달리 명시되지 않거나 또는 언급된 조합이 만들어지는 문맥에 의해 반대로 명확하게 암시되지 않는 한 어떠한 순서로도 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어는 당업자에게 잘 알려져 있는 것으로 믿어지지만, 본 명세서에 개시된 발명 대상의 설명을 용이하게 하기 위해 특정한 정의를 하였다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
URL 또는 다른 식별자 또는 어드레스가 참조되는 경우, 그러한 식별자가 변할 수 있고 인터넷상의 특정 정보가 오고 갈 수 있지만 인터넷을 검색함으로써 동등한 정보가 발견될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이에 대한 참고 자료로서 그러한 정보를 입수할 수 있고 대중에게 보급될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 임의의 보호기 및 화합물에 대한 약어는, 달리 명시하지 않는 한, 그들의 공통적인 용어, 인정된 약어 또는 IUPAC-IUB 생화학 명칭 위원회 (Biochem. (1972) 11 (9): 1726-1732)에 따른 것이다.
오래 지속된 특허법 협약에 따라, 용어 "a", "an" 및 "the"는 청구항을 포함하여 본 명세서에서 사용되는 경우 "하나 이상"을 의미한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 셀"에 대한 의미는 복수의 셀 등을 포함한다.
달리 지시가 없는 한, 본 명세서 및 특허청구의 범위에 기재된 성분의 양, 반응 조건 등과 같은 성질을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구 범위에 기재된 수치 파라미터는 현재 개시된 발명 대상에 의해 획득하고자 모색되는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 질량, 중량, 시간, 부피, 농도 또는 백분율 값이나 양을 언급할 때 "약"이라는 용어는 일부 실시형태에서 특정량으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 및 ±0.1%의 변화를 포함하는 의미이며, 이는 이러한 다양함이 기술된 방법을 실시하기에 적합하기 때문이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 숫자 범위는 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 특정 값까지 표현될 수 있다. 본 명세서에는 수많은 값이 있는데, 각각의 값은 또한 값 그 자체 이외에 특정 값에 대해 "약"으로 기재된다. 예를 들면, 값 "10"이 기재되어 있는 경우 "약 10"이라는 의미도 있다. 또한, 2 개의 특정 단위들 사이의 각 단위가 기재됨을 이해할 수 있다. 예를 들면 10과 15가 기재되어 있다면 11, 12, 13, 14도 또한 기재된 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "임의적" 또는 "임의적으로"라는 용어는 후에 기술되는 사항 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는다는 것을 의미하며, 상기 설명은 상기 사항 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들면, 임의적으로 변형된 부분은 그 부분이 변형되거나 또는 변형되지 않은 것을 의미한다.
"생리학적 기능성 유도체"라는 용어는 본 발명에 따른 화합물의 약학적으로 허용 가능한 어떠한 유도체도 의미한다. 예를 들면, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 아미드 또는 에스테르는, 투여대상, 특히 포유동물에 투여시, 본 발명의 활성 대사물의 화합물을 직간접적으로 제공할 수 있다.
"치료"또는 "치료하는"이란 용어는 병적상태 또는 장애 (예를 들면, 망막 퇴행)를 치료, 완화, 안정화 또는 예방하려는 의도로 환자의 의학적 관리를 의미한다. 이 용어는 능동적 치료 즉, 상태 개선을 위해 특별히 지시된 치료를 포함하며, 인과적 치료, 즉 관련된 상태의 원인을 제거하기 위한 치료를 포함한다. 또한, 이 용어는 완화 치료, 즉 상태의 치료보다는 증상의 경감을 위해 설계된 치료; 예방적 치료, 즉 관련 상태의 증상 또는 장애의 진행을 최소화 또는 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위한 치료; 및 보조치료, 즉 관련된 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 목표로 하는 또 다른 특정 치료를 보충하기 위해 이용되는 치료를 포함한다.
화합물 투여와 관련하여, "투여"라는 용어는 투여대상에게 조성물 및/또는 그의 약제학적 조성물을 제공하는 어떠한 방법도 포함하는 의미이다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 경구투여, 경피투여, 흡입투여, 비강투여, 국소투여, 질내투여, 안과투여, 구강내 투여, 뇌내 투여, 직장 투여 및 피하투여 등의 주사 가능한 것을 포함하는 비경구 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피하투여, 유리체내 지속 약물 전달장치를 통한 유리체내 투여, 전방내(전방 내부로)투여, 맥락막 주사, 망막하 투여, 결막하 주사, 서브-테논(sub-Tenon's) 투여, 과피투여, 경공 막 약물 전달, 국소 점안제를 통한 투여 등이 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 투여는 지속적이거나 간헐적으로 이루어질 수 있다. 다양한 양태에서, 제제는 치료학적으로, 즉 기존 질환 또는 상태 (예: OP 화합물에 대한 노출)를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 추가적으로 다양한 양태에서, 제제는 예방적으로, 즉 질병 또는 상태의 예방을 위해 투여될 수 있다.
"유효량"이란 용어는 목적하는 결과를 달성하거나 바람직하지 않은 상태에 영향을 미치기에 충분한 양을 의미한다. 예를 들면, "치료학적 유효량"은 원하는 치료 결과를 얻거나 원하지 않는 증상에 영향을 미치기에 충분하지만 일반적으로 불리한 부작용을 야기하기에 충분하지 않은 양을 의미한다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료학적 유효량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 조성; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이요법; 투여시간; 투여경로; 사용된 특정 화합물의 배설 속도; 치료기간; 사용된 특정 화합물과 병용되거나 동시에 사용되는 약물을 포함한 다양한 요소 및 의학 분야에서 잘 알려진 요소에 좌우될 것이다. 예를 들면, 원하는 치료 효과를 달성하고, 또 원하는 효과가 달성될 때까지 점차적으로 투여량을 증가시키는데 필요한 수준보다 낮은 수준으로 화합물의 투여량을 시작하는 것은 당해 분야의 기술 범위 내에 있다. 원하는 경우, 효과적인 1일 투여량은 투여 목적에 따라 여러 횟수로 나눌 수 있다. 결과적으로, 단일 투여 조성물은 1일 투여량을 구성하는 양 또는 그 약수(submultiples)를 함유할 수 있다. 투여량은 약물사용 금지시 의사가 개별적으로 조정할 수 있다. 투여량은 다양할 수 있으며, 1일 또는 수일 동안 매일 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 의약품의 주어진 부류에 적절한 투여량에 대한 지침은 문헌에서 알 수 있다. 추가의 다양한 양태에서, 제제는 "예방적 유효량", 즉 질환 또는 상태의 예방에 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
"환자" 또는 "필요로 하는 환자"란 용어는 특정 질병, 상태, 장애 등과 관련된 증상을 임의적으로 나타내는 투여 대상을 의미한다. 본 명세서에 기재된 방법의 환자는 인간 또는 비인간 동물(예를 들면, 영장류, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 소, 고양이, 기니아피그, 설치류 및 비포유 동물)일 수 있다. "환자"라는 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서 성인 및 신생아 환자뿐만 아니라 태아도 남성이든 여성이든 모두를 포함하는 의미이다. "환자"란 용어는 사람 및 동물을 포함하는 의미이다.
당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, "억제", "억제하는", "억제제", "저지", "저지하는" 또는 "저지제"라는 용어는 모든 경우에 혈관신생의 완전한 제거를 지칭하지 않는다. 오히려, 숙련된 당업자는 "억제" 또는 "저지"가 혈관신생의 감소 또는 감소를 의미한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 감소는 대조군과 관련하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군과 관련한 감소는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 감소일 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 현재 기재된 발명의 대상은 망막 손상 및/또는 망막변성을 치료하는 방법을 포함한다. 실제로, 본 발명의 일부 방법은 망막 손상 및/또는 퇴행을 치료하기 위한 유효량의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NRTI)를 포함한다. 또한, 일부 실시형태에서, 조성물은 뉴클레오시드 및/또는 NRTI 화합물뿐만 아니라 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 명세서의 일부 예시적인 방법에서, 투여된 조성물은 뉴클레오시드 및/또는 NRTI를 포함하는 조성물이다. 따라서, 예시적인 조성물은 스타부딘(d4T), 라미부딘(3TC), 코디세핀, 아지도티미딘(AZT), 아바카비르(ABC), 이들의 화학적 유도체 (예를 들면, 포스포릴화를 방지하는 메톡시-유도체) 등으로 이루어지는 데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기타 가능한 화합물은 예를 들면 헤레디아(Heredia) 등에게 허여된 미국 특허 제 6,514,979 호에 기재된 것들을 포함한다. 당해 기술 분야의 숙련가는 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는, 상기 특허 명세서에 기재된 추가의 뉴클레오시드 및/또는 NRTIs를 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 Alu RNA에 의한 하나 이상의 생리학적 과정의 활성화를 억제하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, Alu RNA (인간 세포에서의 Alu 반복 RNA 및 B1 및 B2, Alu-유사 원소 반복 RNA를 포함) 증가는 특정 관심 증상과 관련된 세포와 관계가 있다. 예를 들면, Alu RNA 증가는 지도모양위축을 가진 눈의 망막 색소상피 세포(RPE)와 관련이 있다. 이러한 Alu RNA의 증가는 RPE 세포의 사멸을 유발한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 RPE 퇴행을 치료할 수 있고, 그에 따라 상기 세포 사멸과 관련된 증상을 치료할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 인플라마솜의 활성화를 억제하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 인플라마솜은 NLRP3 인플라마솜, 1L-1베타 인플라마솜 및 이들의 조합물 중에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포 중 하나 이상의 인플라마솜을 억제하는 단계는 억제제 (조성물)를 세포 및/또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는데, 여기서 세포는 환자의 세포이다. 억제제를 포함하는 조성물의 경우, 본 명에서에 기재된 바와 같은 억제제는, 예를 들면 폴리펩티드 억제제 (올리고뉴클레오티드 억제제 포함), 소분자 억제제 및/또는 siRNA 억제제일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물(들)을 투여하기 위한 일부 예시적인 방법은 LPS/ATP에 의한 염증, LPS/ATP에 의한 인플라마솜 활성화, Alu RNA에 의한 인플라마솜 활성화 및/또는 나이제리신-유도된 인플라마솜 활성화를 억제할 수 있다. 예시적인 방법은 또한 Alu RNA 발현에 의해 야기되는 미토콘드리아 반응성 산소종을 감소시킴으로써, P2X7 수용체를 통한 침입을 차단함으로써 및/또는 ATP-유도된 세포 투과성을 감소시킴으로써 망막 퇴화 및/또는 기타 망막 손상을 치료할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포에서 특정 작용을 억제함으로써 망막 손상을 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서 세포는 RPE 세포, 망막 광수용체 세포 또는 맥락막 세포로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 RPE 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 환자의 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 관심대상의 증상을 갖는 것으로 의심되거나 또는 위험을 갖는 환자의 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 연령-관련 황반변성을 갖고 있을 것으로 의심되거나 또는 위험이 있는 환자의 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 지도모양위축이 있을 것으로 의심되거나, 위험이 있는 환자의 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 지도모양위축이 있을 것으로 의심되거나 또는 위험이 있는 환자의 세포이고, 세포는 RPE 세포이다. 일부 실시형태에서, 연령-관련 황반변성을 갖는 환자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있다.
따라서, 억제되는 폴리펩티드와 관련하여 본 발명에서 사용되는 "세포 중" 이란, 폴리펩티드가 세포 외부에 존재하는 한, 세포 내부 (세포막 내부), 세포 상 (세포막 상, 아니면 세포 상에 제시된 세포막 내), 또는 세포의 외부에 존재하는 폴리펩티드를 의미하며, 당업자는 폴리펩티드가 세포와 관련되어 있음을 인식할 수 있는 세포외 환경에 있다. 예를 들면, VDAC1, VDAC2, 카스파제-8, NFκB, 또는 인플라마솜 (예를 들면, NLRP3, PYCARD, 카스파제-1)의 폴리펩티드가 세포 내에 존재할 수 있다. 다른 예를 들면, NLRP3는 세포내 또는 세포 상에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 특허 대상은 본 명세서에 기재된 화합물을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 의약 조성물을 추가로 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 사용 직전에 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한, 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액뿐만 아니라 멸균 분말을 의미한다. 적절한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면 활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등 다양한 항박테리아제 및 항진균제를 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 또한 당, 염화 나트륨 등과 같은 등장 화제(isotonic agents)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 의약 형태의 지속된 흡수는 흡수를 지연시키는 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴과 같은 제제의 포함에 의해 이루어질 수 있다. 주사 가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜라이드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 생분해성 중합체에서 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 만들어진다. 중합체에 대한 약물의 비율 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 데포 주사 가능한 제형은 또한 신체 조직과 양립할 수 있는 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획함으로써 제조된다. 주사 가능한 제형은, 예를 들면 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 직전에 멸균 수 또는 기타 멸균 주사 가능한 매체 중에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 살균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다. 적합한 불활성 담체는 락토오스와 같은 당을 포함할 수 있다.
적합한 제형은 항산화제, 완충액, 세균 제제, 살균성 항생제 및 제제를 의도된 수용체의 체액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.
상기 조성물은 유성 또는 수성 부형체 중의 현탁액, 용액 또는 유제와 같은 형태를 가질 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 부형체, 예를 들면, 무균 발열원이 없는 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
제형은 단위-투여량 또는 다중-투여 용기, 예를 들면 밀폐된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균된 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 냉동 또는 동결 건조 상태로 저장할 수 있다.
경구투여를 위해서, 조성물은 예를 들면 결합제 (예를 들면, 예비 젤라틴 화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스)와 같은 약학적으로 허용 가능한 부형제; 충전제 (예: 락토오스, 미세결정질 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예: 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들면, 소듐라우릴 설페이트)를 갖는 통상적인 기술에 의해 제조된 정제 또는 캅셀제의 형태를 가질 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법으로 코팅될 수 있다.
경구투여를 위한 액체 제제는, 예를 들면 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 가질 수 있거나, 사용하기 전에 물 또는 다른 적합한 부형체로 구성하기 위한 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들면 현탁제 (예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방); 유화제 (예: 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 부형체 (예: 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸알코올 또는 분획된 식물성 오일); 및 보존제 (예: 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 함께 종래 기술에 의해 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 완충제 염, 향료, 착색제 및 감미제를 적절하게 함유할 수 있다. 경구투여용 제제는 활성 화합물의 제어된 방출을 제공하도록 적절하게 제제화될 수 있다. 협측(buccal) 투여를 위해서, 조성물은 종래의 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 가질 수 있다.
상기 조성물은 점안제로서 제제화될 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 담체는 염수 용액 또는 임의로 다른 약제와 함께 점안제를 제제화하는데 사용되는 기타 물질을 포함할 수 있다. 따라서, 점안제 제제는 환자의 눈에 직접 국소 투여될 수 있다.
상기 조성물은 또한 이식 또는 주사용 제제로서 제형화될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 적절한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용 가능한 오일 중의 에멀젼) 또는 이온교환 수지로, 또는 난용성 유도체 (예를 들면, 난용성 염으로서)로 제제화될 수 있다. 상기 화합물은 또한 직장 조성물, 크림 또는 로션 또는 경피 패치로 제제화될 수 있다.
현재 개시된 특허 대상은 화합물 또는 조성물의 투여에 유용한 기구와 함께 포장된, 본 명세서에 기재된 화합물 또는 약학 조성물을 포함할 수 있는 키트를 추가로 포함한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 적절한 투여 보조기구는 선택된 화합물 및 조성물 및/또는 목적하는 투여 부위의 제제에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 화합물 또는 조성물의 제형이 환자의 주사에 적절하다면, 상기 기구는 주사기일 수 있다. 또 다른 예로서, 원하는 투여 부위가 세포 배양 배지인 경우, 기구는 멸균 피펫일 수 있다.
또한, 본 발명의 NRTIs는 널리 사용되는 다양하고 저렴한 종류의 저분자로서, 지난 수십년 동안 인간의 사용에 대해 광범위한 약동학 및 안전성 데이터가 수집되었고, 따라서 NRTIs는 약물 재사용에 익숙하다. 이와 같이, 본 발명은 충족되지 않은 주요 의료 요구를 만족함으로써 하나 이상의 NRTIs을 사용하기 위한 신규하고 광범위하게 적용 가능한 기초를 제공한다.
상기에서 간략히 설명한 바와 같이, 연령-관련 황반변성은 전 세계적으로 수천만 명의 사람들에게 영향을 미치는 질환이며, AMD에 대한 효과적인 치료법은 없다(Ambati and Fowler, 2012). 마찬가지로, 이식편대 숙주질환(graft-versus-host disease)은 성공적인 조직 이식을 방해하는 주요 장애물이고(Ferrara et al., 2009); 무균 간 염증은 섬유증과 발암의 주요 결정 인자인 약물-유도 간 손상과 지방 간염에 주요한 원인이 된다 (Kubes and Mehal, 2012). 따라서, 본 발명의 일부 방법 및/또는 화합물은, 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 일부 실시형태에서 적어도 하나의 NRTI를 포함하는 화합물을 투여함으로써 연령-관련 황반변성, 이식편대 숙주질환 및/또는 무균 간 염증을 치료하기 위한 것이다.
NRTIs에 의한 인플라마솜 억제는 특정 NRTI의 포스포릴화 없이 달성될 수 있으므로, 본 발명에서 제공되는 바와 같이, me-d4T 또는 다른 포스포릴화-무력 뉴클레오시드 유사체를 사용하면 NRTI-트리포스페이트-매개 중합효소 억제와 관련된 치료-제한 독성을 피해야한다(Lewis et al., 2003). 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 me-d4T 또는 또 다른 포스포릴화-무력 뉴클레오시드 유사체를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 망막 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 화합물, 및 이 화합물 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 망막 손상을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 발명의 대상은 본 명세서에 기재된 화합물, 및 이 화합물 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 적어도 포함하는, RPE 세포, 망막 광수용체 세포, 맥락막 세포 또는 이들의 조합을 보호하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 발명 대상은 본 명세서에 기재된 화합물, 및 이 화합물 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 적어도 포함하는, 망막 손상 및/또는 분해와 관련된 증상에 대한 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 발명의 대상은 본 명세서에 기재된 화합물, 및 이 화합물 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 적어도 포함하는, 연령-관련 황반변성 (AMD)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, AMD는 습윤 AMD이다. 일부 실시형태에서, AMD는 건식 AMD이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 HIV 및 HBV의 치료를 위해 FDA-승인된 뉴클레오시드 역전사효소 억제제가 놀랍게도 건식 및 습윤 연령-관련 황반변성 생쥐 모델에서 효과적이라는 것을 알아냈다(Fowler et al. Science 2014). 그러나, 본 발명자들에 의해 시험된 NRTIs의 일부(즉, d4T, AZT)는 미토콘드리아 결핍을 유도하는 DNA 중합효소-감마에 대한 오프-표적(off-target) 효과로 인해 발생하는 것으로 생각되는, 환자에게 바람직하지 않은 부작용을 일으킨다. NRTIs가 AMD와 같은 만성질환을 치료하는 데 사용될 경우, NRTIs를 사용한 장기적인 중합효소 억제는 임상적 변환(translation)을 방해할 수 있다.
본 발명자는 d4T의 새로운 메톡시-변형된 버전을 고안하였다 (Fowler et al. Science 2014). 그러나 me-d4T의 합성은 어려웠다(10 단계 이상). 더우기, AZT 나 3TC와 같은 다른 NRTIs은, 이들 약물의 변형 형태가 이들 모델에 효과적일지라도, 건식 및 습윤 AMD 생쥐 모델을 차단했다 (Fowler et al. Science 2014; Mizutani et al., IOVS 2015, 언론에서). 따라서, 본 발명의 대상은 이미 공지된 화합물의 결점 없이 본 명세서에 기재된 적응증에 유용한 독특한 화합물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 발명 대상은 특정 실시형태에서 하기 화학식의 구조를 갖는 화합물 및 약학적으로 허용되는 이들의 염을 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 공유결합, H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R1은 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R1은 공유결합, H 및 -CH3로부터 선택되고;
R2는 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R2는 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R2는 -N(R3)2이고, 여기서 각 R3은 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되며, 그리고 일부 실시형태에서, 각 R3는 H, CH3, 에틸, 부틸, t-부틸, 이소부틸, 프로필, 2-메틸프로필, 이소프로필, 펜틸 및 헥실로부터 선택되고;
R4는 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R4는 -CH3 및 에틸로부터 선택되고;
R5는 C, CH 및 S로부터 선택되고;
R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R6은 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R6은 -N=N+=NH 및 N3으로부터 선택되고; 그리고
R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노이고; 일부 실시형태에서, R7은 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R7은 -CH2-O-CH3, -CH3, = CH2, -CH2-NH2 및 -CH2-N=N+=NH로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, R7은 -CH2-O-R8이고, 여기서 R8은 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고, 일부 실시형태에서, R8은 -CH3, 에틸, 프로필, 2-메틸프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸, 및 헥실로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 C1-20의 선형 (즉, "직쇄"), 분지된 또는 시클릭, 포화 또는 부분적으로 포화되고, 일부 경우 완전히 불포화된 (즉, 알케닐 및 알키닐) 탄화수소 사슬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 옥테닐, 부타디에닐, 프로피닐, 메틸프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐 및 알레닐기이다. "분지된"이란 메틸, 에틸 또는 프로필과 같은 저급 알킬기가 선형 알킬 사슬에 부착된 알킬기를 의미한다. "저급 알킬"이란 1 내지 약 8개의 탄소 원자 (즉, C1-8 알킬), 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 의미한다. "고급 알킬"이란 약 10 내지 약 20개의 탄소 원자, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 의미한다. 특정 실시형태에서, "알킬"은 특히 C1-8 직쇄 알킬을 의미한다. 다른 실시형태에서, "알킬"은 특히 C1-8 분지쇄 알킬을 의미한다.
알킬기는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 알킬 치환기로 임의적으로 치환될 수 있다 ("치환된 알킬"). "알킬기 치환체"라는 용어는 알킬, 치환된 알킬, 할로, 아릴아미노, 아실, 히드록실, 아릴옥실, 알콕실, 알킬티오, 아릴티오, 아르알킬옥실, 아르알킬티오, 카르복실, 알콕시카르보닐, 옥소 및 시클로알킬을 포함하는 의미이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 산소, 황 또는 치환되거나 비치환된 질소 원자가 알킬 사슬에 임의적으로 삽입될 수 있으며, 여기서 질소 치환체는 수소, 저급 알킬 (이하, "알킬아미노알킬"이라 함), 또는 아릴이다.
따라서, 본 명세서에서 사용된 용어 "치환된 알킬"은, 본 명세서에서 정의한바와 같이, 알킬기의 하나 이상의 원자 또는 관능기가 다른 원자 또는 관능기로 치환된 알킬기를 의미하며, 예를 들면, 알킬, 치환된 알킬, 할로겐, 아릴, 치환된 아릴, 알콕실, 히드록실, 니트로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 황산염 및 메르캅토가 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 알킬 및/또는 "치환된 알킬"은 "알릴" 또는 "알릴기"를 포함하는 의미이다. "알릴기" 또는 "알릴"이란 용어는 CH2HC=CH2 기 및 치환에 의해 형성된 그의 유도체를 의미한다. 따라서, 알킬 및/또는 치환된 알킬이라는 용어는 알릴기, 예를 들면 알릴, 메틸알릴, 디-메틸알릴 등과 같은 알릴기이지만, 이들에 한정되지 않는다. 용어 "알릴 위치"또는 "알릴 부위"는 알릴기의 포화된 탄소 원자를 나타낸다. 따라서, 알릴 부위에 결합된 히드록시기 또는 다른 치환기와 같은 기는 "알릴"을 의미할 수 있다.
"알킬렌"은 1 내지 약 20개의 탄소 원자, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄, 분지쇄의 2가 지방족 탄화수소기를 의미한다. 알킬렌기는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭일 수 있다. 알킬렌기는 또한 임의로 불포화이거나 및/또는 하나 이상의 "알킬 치환기"로 치환될 수 있다. 알킬렌기에는 하나 이상의 산소, 황 또는 치환되거나 치환되지 않은 질소 원자가 임의로 삽입될 수 있으며 (본 명세서에서 "알킬아미노알킬"로 지칭됨), 여기서 질소 치환기는 전술한 바와 같은 알킬이다. 알킬렌기의 예로는 메틸렌(-CH2-); 에틸렌(-CH2-CH2-); 프로필렌(-(CH2)3-); 시클로헥실렌 (-C6H10-); -CH=CH-CH=CH-; -CH=CH-CH2-; -(CH2)q-N(R)-(CH2)r- (여기서, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 약 20의 정수, 예를 들면 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고, R은 수소 또는 저급 알킬임); 메틸렌디옥실 (-O-CH2-O-); 및 에틸렌디옥실 (-O-(CH2)2-O-)가 있다. 알킬렌기는 약 2 내지 약 3 개의 탄소 원자를 가질 수 있고, 또한 6 내지 20개의 탄소를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아실"은 카르복시기의 OH가 또 다른 치환체, (즉, RCO-로 나타내지고, 여기서, R은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 알킬 또는 아릴기임)에 의해 치환된 유기산 기를 의미한다. 이와 같이, "아실"이란 용어는 구체적으로 아세틸푸란 및 펜아실기와 같은 아릴아실기를 의미한다. 아실기의 구체적인 예는 아세틸 및 벤조일이다.
"알콕실"또는 "알콕시알킬"은 알킬이 전술한 바와 같은 알킬-O-기를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "알콕실"은 C1-20의 선형, 분지된, 또는 시클릭, 포화 또는 불포화 옥소-탄화수소 사슬을 의미하며, 예를 들면 메톡실, 에톡실, 프로폭실, 이소프로폭실, 부톡실 및 t-부톡실 및 펜톡실을 포함한다.
"아실옥실"은 아실-O-기(여기서, 아실은 상기 기재된 바와 같음)를 의미한다.
"아실아미노"는 아실-NH-기(여기서 아실은 상기 기재된 바와 같음)를 의미한다.
"아미노"는 -NH2기를 의미한다.
환형 고리 구조에서 결합을 나타내는 점선은 결합이 고리 내에 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. 즉, 환형 고리 구조에서 결합을 나타내는 점선은 고리 구조가 포화 고리 구조, 부분 포화 고리 구조 및 불포화 고리 구조로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 나타낸다.
또한, 일부 실시형태에서, 본 발명은 하기 화합물, 하기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 하기 화합물 1 이상의 합성, 및/또는 그들의 용도에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 하기 화학식 (I) 내지 (XIV) 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염이다.
(I)
Figure pct00002
Me-AZT: 1-[(5R)-2-(메톡시메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥소란-3-일]트리아자-1,2-디엔-2-이움 (본 명세서에서 '카무부딘 5'라고도 함)
(II)
Figure pct00003
데옥시-메틸-d4T: 5-메틸-1-[2R,5R)-5-메틸-2,5-디히드로푸란-2-일]-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온
(III)
Figure pct00004
메틸렌 d4T: 5-메틸-1-[(2R)-5-메틸리덴-2,5-디히드로푸란-2-일]-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온
(IV)
Figure pct00005
2Me-d4T: 1-[(2R)-5-(메톡시메틸)-2,5-디히드로푸란-2-일]-3,5-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온 (본 명세서에서, "카무부딘 2"라고도 함)
(V)
Figure pct00006
데옥시-아미노-d4T: 1-[(2R)-5-(아미노메틸)-2,5-디히드로푸란-2-일]-5-메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온
(VI)
Figure pct00007
Me-3TC: 4-아미노-1-[(2R,5S)-2-(메톡시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일]-1,2-디히드로피리미딘-2-온
(VII)
Figure pct00008
디아미노-Me-3TC: 1-[(2R,5S)-2-(메톡시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일]-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온
(VIII)
Figure pct00009
3Me-3TC: 4-(디메틸아미노)-1-[(2R,5S)-2-(메톡시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일]-1,2-디히드로피리미딘-2-온 (본 명세서에서, '카무부딘 6' 및 'TM-3TC'라고도 함)
(IX)
Figure pct00010
아지도-d4T: 1-{[(2S,5R)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)-2,5-디히드로푸란-2-일]메틸} 트리아자-1,2-디엔-2-이움
(X)
Figure pct00011
2Me-AZT: 1-[(2R,4S,5S)-4-아지도-5-(메톡시메틸)옥소란-2-일]-3,5-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온 (본 명세서에서, '카무부딘 4'라고도 함)
(XI)
Figure pct00012
O-MeN-Etd4T: 3-에틸-1-[(2R,5S)-5-(메톡시메틸)-2,5-디히드로푸란-2-일]-5-메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온 (본 명세서에서, '카무부딘 3'이라고도 함)
(XII)
Figure pct00013
2Et-AZT: 1-[(2R,4S,5S)-4-아지도-5-(에톡시메틸)옥소란-2-일]-3-에틸-5-메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온 (본 명세서에서, '카무부딘 8'이라고도 함)
(XIII)
Figure pct00014
2Et-d4T: 1-[(2R,5S)-5-(에톡시메틸)-2,5-디히드로푸란-2-일]-3-에틸-5-메틸-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-2,4-디온 (본 명세서에서, '카무부딘 7'이라고도 함)
(XIV)
Figure pct00015
3Et-3TC: 4-(디에틸아미노)-1-[2-(에톡시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일]-1,2-디히드로피리미딘-2-온 (본 명세서에서, '카무부딘 9'라고도 함)
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식의 화합물 중 어느 하나 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 갖는다:
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
또는
Figure pct00020
.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식의 화합물 중 어느 하나 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 갖는다:
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
또는
Figure pct00026
.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식의 화합물 중 어느 하나 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 갖는다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
또는
Figure pct00038
.
또한, 본 발명은 약물 및/또는 약제와 같은 약제학적 조성물, 특히 포유동물에서 망막 손상 및/또는 망막 변성을 치료하기 위한 조성물의 제조에 있어서, 본 명세서에 개시된 화합물 또는 그의 임의의 조합물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물, 임의의 염, 특히 임의의 약학적으로 허용되는 염, 임의의 용매 및/또는 임의의 생리학적 유도체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 다음과 같은 질병을 억제한다:
이식편대 숙주질환, 만성 통증, 증식성 유리체 망막병증, 녹내장, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 양극성 장애, 주요 우울 장애, 신장 섬유증, 신장증, 폐 섬유증, 헌팅턴 병, 골다공증, 만성 림프성 백혈병, 불안 장애, 폐결핵, 갱년기 여성 및 골절 환자에서의 골다공증, 전신성 홍반성 루푸스, 원반 모양 홍반성 루푸스, 만성 염증성 및 신경병성 통증, 상 염색체 우성 다낭 신질환, 척수 손상, 알츠하이머병, 신경병성 통증, 고혈압, 정맥류, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 통풍, 자가 면역성 간염, 이식편 혈관 손상, 죽상 동맥 경화증, 혈전증, 대사증후군, 타액선 염증, 외상성 뇌손상, 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌졸중, 파킨슨병, 흑색종, 신경 모세포종, 전립선암, 유방암, 피부암 및 갑상선암, 관상 조기 위암, 신경내분비 암, 유점액 결장암, 대장암; 고급 유성판 세포종, 신장세포 암종, 미분화 난소암종, 유두내 낭종성 유방암, 그램음성 패혈증, 감염성 녹농균, 비브리오 콜레라, 레지오넬라 종, 프란시셀라 종, 및 리슈만편모충 종, 클라미디아 종, 극저온증; 각막염, 여드름, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장증후군, 인슐린 저항성, 비만, 용혈성 요독 증후군, 폴리오마 바이러스 감염, 면역복합체 신장질환, 급성 관상손상, 루푸스 신염, 가족성 차가운자가 염증 증후군, 머클-웰스 증후군 및 신생아 기형 다계통 염증성 질환, 만성 영아신경학적 피부 및 관절의 자가염증성 질환, 신장허혈-재관류 손상, 사구체 신염, 저온 글로빈혈증, 전신혈관염, IgA 신병증, 말라리아, 헬민스 기생충, 패혈증성 쇼크, 알레르기성 천식, 건초열, 만성 폐색성 폐질환, 약물유발 폐염증, 접촉성 피부염, 나병, 부르콜데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia) 감염, 호흡기 동기화 바이러스 감염, 건선, 경피증, 반응성 관절염, 낭포성 섬유증, 매독, 쇼그렌 증후군, 염증성 관절질환, 비알콜성 지방간 질환, 심장수술(수술근처/수술후 염증), 급성 및 만성 장기이식거부, 급성 및 만성골수이식 거부, 종양 혈관신생, 근위축성 측삭 경화증, 자폐증 스펙트럼 장애(예를 들면, 자폐증의 마우스 모델에 나타난 바와 같이 P2X7의 카무부딘 차단을 통해), 및/또는 이들의 임의의 조합.
또한, 일부 실시형태에서, 본 발명은 사슬 종결과 무관한 비표준 NRTI 기능이 P2X7-의존성 실명, 이식편대 숙주질환 및/또는 무균 염증을 예방한다는 것을 제공한다. 따라서, 본 발명은 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 NRTI 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 P2X7-의존성 실명, 이식편대 숙주질환 및/또는 염증을 방지하는 방법에 관한 것이다.
또한, 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 (i) 세포와 관련된 Alu RNA에 의한 인플라마솜 활성화; (ii) LPS/ATP에 의한 염증, (iii) LPS/ATP에 의한 인플라마솜 활성화, (iv) 나이제리신-유도된 인플라마솜 활성화 및/또는 이들의 조합을 억제한다. 그리고 일부 실시형태에서, 상기 인플라마솜은 NLRP3 인플라마솜 및/또는 1L-1베타 인플라마솜으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명에 따른 방법의 일부 실시형태는 (i) 세포와 관련된 P2X7 수용체를 통한 도입을 차단하는 단계; (ii) Alu RNA 발현에 의해 야기된 미토콘드리아 반응성 산소종을 감소시키는 단계; 및/또는 (iii) 세포의 ATP-유도 세포 투과성을 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 고려되는 세포는 예를 들면 RPE 세포, 망막 광수용체 세포, 맥락막 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또한, NRTIs는 HIV에 대한 주된 치료제이며, 레트로바이러스 복제를 차단한다. 생명 주기 동안 역전사효소 (reverse transcriptase, RT)를 필요로 하는 내인성 역전사인 Alu RNA는 NLRP3 인플라마솜을 활성화시켜 지도모양위축에서 망막 색소상피의 세포 사멸을 일으킨다. 이는 수백만 명의 눈을 멀게 하는 연령-관련 황반변성의 치료 불가능한 형태이다. 또한, 본 발명자들은 NRTIs가 NLRP3 인플라마솜의 신규한 억제제라는 것을 알아냈다. 그리고, 놀랍게도, 이 효과는 역전사효소 억제와 무관하다.
본 발명 대상의 1 이상의 실시형태에 대한 상세한 설명이 본 명세서에 기재된다. 본 명세서에 기재된 실시형태 및 기타 실시형태는 본 명세서에 기재된 정보를 연구한 후 당업자는 변형할 수 있을 것이다. 본 명세서에서 제공된 정보, 특히 예시적인 실시형태에 기술된 구체적인 설명은 주로 이해의 명확성을 위해 제공되며 이로부터 불필요한 제한이 없을 것이다. 모순되는 경우가 있는 경우, 본 명세서에서의 정의가 조정할 것이다.
본 발명의 대상은 다음에 구체적인 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 다음의 실시예는 본 발명과 관련된 개발 및 실험 과정에서 여러 시간에 걸쳐 수집된 데이터를 대표하는 데이터의 편집을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1
본 발명자들은 NRTIs d4T, AZT, ABC 및 3TC가 역전사효소를 억제하지 않는 5'-메톡시-d4T와 마찬가지로 Alu RNA에 의한 카스파제-1 활성화를 차단한다는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은 AZT가 티미딘 키나제-결핍 세포에서 포스포릴화되지는 않지만 LPS/ATP-유도된 인터루킨-1 베타 분비를 여전히 차단한다는 것; NRTIs가 P2X7-의존성 YOPRO-1 염색 흡수 및 지도모양위축, 이식편대 숙주질환 및 무균 간 염증의 생쥐 모델을 차단한다는 것; 그리고 NRTIs가 표준 역전사효소 억제와 독립적인 NLRP3 인플라마솜의 신규한 억제제라는 것을 알아냈다. 따라서, NRTIs는 다양한 P2X7에 의해 유발된 질병에서 약물 재사용에 익숙하다.
NRTIs는 1974년에 항바이러스 화합물인 것으로 처음 발견되었고 (Ostertag et al., 1974), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 치료하기 위해 널리 사용된다. NRTIs의 정식 작용 메카니즘은 바이러스 RNA 주형으로부터 DNA 합성의 사슬 종결을 통해 이루어지며, 이로써 역전사효소-의존성 바이러스의 바이러스 수명주기를 억제한다.
연령-관련 황반변성(AMD)은 전세계 노인에 있어서 실명의 주요 원인이다 (Ambati et al., 2003; Ambati and Fowler, 2012). AMD의 보편적이고 치료가 불가능한 건조한 형태의 경우, 코딩되지 않는 Alu RNAs의 과잉 분비는 망막 색소상피의 세포 사멸을 유도하여 실명을 유발한다(Dridi et al., 2012; Kaneko et al., 2011; Tarallo et al., 2012). Alu 서열은 HIV와 마찬가지로 역전사효소를 생명주기에 의존하는 비코딩 역전이 효소이다(Batzer and Deininger, 2002; Dewannieux et al., 2003).
Alu RNA는 카스파제-1 및 NLRP3 인플라마솜의 활성화를 통해 RPE 세포 사멸을 매개한다(Tarallo et al., 2012). 본 발명은 HIV의 치료를 위해 FDA 승인된 스타부딘 (d4T: 2'3'-디데옥시티미딘; Zerit, Bristol-Myers Squibb)과 같은 역전사효소 억제제가 주로 인간(도 34) 및 생쥐 RPE 세포 (도 44)에서 Alu RNA 수준(도 45)을 감소시키지 않으면서 그의 활성 20 kDa 형태로 카스파제-1 절단을 방지한다는 것을 제공한다. 또한, 본 발명은 d4T가 인간 및 생쥐 RPE 세포(도 34 및 도 44)에서 Alu-유도된 RPE 세포 사멸 (Tarallo et al., 2012)을 매개하는 MyD88 아답터의 키나제 하류인 IRAK4의 포스포릴화를 차단한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 항 HIV 제제인 아지도티미딘 (AZT; 3'-아지도-2',3'-디데옥시티미딘: Retrovir, ViiV Healthcare), 라미부딘 (3TC; 2'3'-디데옥시시티딘; Zeffix, GlaxoSmithKline) 및 아바카비르(ABC; 디-데옥시구아노신 유사체; Ziagen, ViiV Healthcare)를 포함하는 기타 NRTIs가 또한 Alu RNA(도 35)에 의해 카스파제-1 절단을 차단한다는 사실을 알아냈다.
또한, 본 발명은 d4T 및 AZT가 건식 AMD의 Alu RNA-유도 생쥐 모델에서 RPE 변성을 방지한다는 것을 제공한다(Kaneko et al., 2011; Tarallo et al., 2012). 또한, Alu RNA를 발현하는 플라스미드의 망막하 유리체내 후 AZT의 복강내 투여 (도 37)로서 d4T의 매일 경구투여를 받는 생쥐가 RPE 변성을 차단한다는 것이 밝혀졌다(도 36).
역전사효소 억제가 d4T에 의한 인플라마솜 차단에 필요한지 여부를 시험하기 위해서, d4T (5'-OCH3-d4T; me-d4T)의 5'O-메틸-변성 버전을 합성하였다(도 20, 도 25, 도 36, 도 27, 도 28). 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에서 제공된 바와 같은 d4T의 5'O-메틸-변형된 버전을 합성하는 방법에 관한 것이다.
뉴클레오시드 유사체의 트리포스페이트 버전 만이 역전사효소를 억제하고; 5'위치의 메틸 변형은 포스포릴화를 방지하므로 뉴클레오시드 트리포스페이트의 형성을 방지한다(Nykanen et al., 2001). 따라서, d4T와 마찬가지로, me-d4T도 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화를 차단한다(도 21).
본 발명자들은 me-d4T가 역전사효소를 억제하지 않으며, 변형되지 않은 d4T와는 대조적으로, me-d4T가 렌티바이러스 복제를 차단하지 않음을 확인하였다 (도 22). 또한, 디-데옥시뉴클레오시드 유사체의 트리포스페이트 대사산물은 미토콘드리아 DNA의 결핍을 초래하였고; me-d4T가 포스포릴화되지 않는다는 생각과 일치하여, d4T가 mtDNA 수준을 감소시키지만 me-d4T는 감소시키지 않는 것으로 밝혀졌다(도 23). Me-d4T는 또한 생쥐에서 Alu-유도된 RPE 변성을 방지한다(도 24). 이러한 데이터는 d4T가 역전사효소 억제와 무관하게 카스파제-1 활성화 및 RPE 변성을 차단할 수 있다는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 NRTIs가 역전사효소를 통해 신호하는 것으로 알려지지 않은 LPS/ATP에 의한 인플라마솜 활성화를 차단하였는지 여부를 시험하였다 (Mariathasan et al., 2004; Mariathasan et al., 2006; Martinon et al., 2002). 웨스턴 블롯에 의해 검출되는 바와 같이, d4T가 일차 생쥐 골수-유래된 대식세포에서 LPS/ATP-유도된 카스파제-1 성숙을 억제한다는 것을 알아냈다(도 38).
카스파제-1은 LPS/ATP 자극시 인터루킨 1 베타 (IL-1베타)를 직접 처리하고; d4T는 또한 이들 세포에서 성숙한 IL-1 베타의 분비를 차단한다(도 39). LPS/ATP-유도된 인플라마솜 활성화가 RT 억제없이 억제될 수 있는지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 티미딘 키나제-결핍 (Raji/TK-) 및 -발현 (Raji/TK+) 세포를 이용하였다 (Balzarini et al., 1989). 본 발명자들은 TK- 세포가 아닌 AZT, TK+를 첨가한 후에 RT 억제에 필요한 AZT 대사산물인 AZT-트리포스페이트 (AZT-TP)를 생성시켰다(도 40, 도 46, 도 47, 도 48, 도 49, 도 50). 비록 AZT가 TK- 세포에서 포스포릴화되지는 않았지만, AZT는 여전히 LPS/ATP-유도 인터루킨-1 베타 성숙을 억제하였으며 (도 41), 이는 AZT가 역전사효소 억제를 통해 인터루킨-1 베타 성숙을 억제하지 않았음을 나타낸다.
Alu RNA (Kerur et al., 2013) 및 LPS/ATP (Qu et al., 2011)는 ATP 수용체 P2X7을 통해 인플라마솜을 활성화시킨다. 따라서, 본 발명자들은 d4T가 P2X7 또는 일부 P2X7-의존성 경로를 차단한다고 가정하였다. 먼저, d4T가 ATP 수준을 조절함으로써 P2X7의 상류에서 작용하는지 여부를 결정하기 위한 시험을 수행하였다. 그러나, d4T는 Alu RNA에 의해 유도된 세포 배양 배지로의 ATP 방출을 차단하지 않는다(도 42).
그 다음, d4T가 P2X7 기능에 직접적으로 길항하는지 여부를 결정하기 위해 시험을 수행하였다: ATP 결합시 세포-표면 P2X7은 인플라마솜 활성화를 매개하는 비선택적 양이온 채널을 형성한다 (Kahlenberg and Dubyak, 2004; Petrilli et al., 2007). 그러나, d4T는 생쥐 또는 랫트 P2X7 수용체를 발현하는 HEK293 세포의 패치 클램프 분석 (Humphreys 등, 2000)에 의해 모니터링된 P2X7 양이온 채널 기능을 크게 조절하지 않았다.
마지막으로, P2X7 활성화는 약 1,000 Da 이하의 분자에 대해 투과성이 있는 큰 기공의 형성과 관련이 있다(Adinolfi et al., 2005; Cheewatrakoolpong et al., 2005; Surprenant et al., 1996). d4T, 및 또한 AZT 및 3TC가 선택적 P2X7 작용제 bzATP를 첨가한 후, 인간 P2X7-과발현 HEK293 안정 세포주(도 43)에서 형광 염료 YO-PRO1 (M.W.Da)의 P2X7-의존성 흡수를 억제한다는 것이 밝혀졌다.
NRTIs가 염료 흡수를 포함하는 메카니즘을 통해 Alu-유도된 P2X7-매개된 인플라마솜 활성화를 차단한다는 아이디어와 일치하여, Alu RNA-유도된 카스파제-1 활성화는 P2X7-매개된 염료 흡수 및 LPS/ATP-유도된 인플라마솜을 차단하지만 양이온 플럭스는 차단하지 않는 작은 펩티드에 의해 억제되었다(Pelegrin and Surprenant, 2006) (도 51). 반면, Alu-유도된 카스파제-1의 활성화는 P2X7-매개된 양이온 플럭스를 선택적으로 차단하지만 염료 흡수는 차단하지 않는 카미다졸륨에 의해 억제되지 않았다 (도 52).
또한, P2X7의 세포내 C-말단은 P2X7-관련 염료 흡수를 지배하고, 세포 투과성이 아닌 d4T의 버전 (Agarwal et al., 2011)은 Alu RNA에 의한 카스파제-1 활성화를 차단하지 않는다(도 53, 도 32). P2X7에서 또는 그 하류, 그러나 미토콘드리아 장애의 상류에서는 길항 작용과 일치하여, d4T는 LPS/ATP 자극에 의해 생성되는 미토콘드리아 ROS (mtROS) 생성을 차단하고(Adinolfi et al., 2005; Cruz et al., 2007; Garcia-Marcos et al., 2005; Nakahira et al., 2011), 그리고 Alu 과발현 (Tarallo et al., 2012)은 MitoSOx 분석법으로 측정되었다 (도 54). 마지막으로, d4T는 결정성 모노나트륨 요산염(도 11)으로 치료한 PMA-초회 자극된 THP-1 세포에서 P2X7 비의존성 인터루킨 1-베타 분비를 방지하지 못한다 (Martinon et al., 2006; Riteau et al., 2012).
지도모양위축(GA)의 Alu-유발된 모델 이상으로 NRTIs의 잠재적인 치료적 관련성을 조사하기 위해서, NRTIs가 일반적인 인플라마솜 억제제로서 작용한다면, 이들은 P2X7에 의해 유발되는 다른 동물 모델의 질환에서 광범위하게 유용할 수 있다는 가설을 세웠다. NLRP3 인플라마솜- 및 P2X7-유도된 이식편대 숙주질환 모델 (Jankovic et al., 2010; Wilhelm et al., 2010)에서, 동종이종 골수 및 T 세포를 수용하는 생쥐를 d4T로 처리한 결과, 생리 식염수로 처리한 대조용에 비해 생존율이 개선되었다(30-70% 대 0%). 또한 NLRP3- 및 P2X7-유도 무균 염증 모델 (McDonald et al., 2010)에서, d4T는 중성구 이동을 간 손상의 초점으로 감소시켰다.
흥미롭게도, P2X7 의존적 기공 기능만이 표현형에 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌다 (Sorge et al., 2012). 그러나, 현재 이온 채널 활성화가 아닌 하류 P2X7 신호 전달을 선택적으로 목표로 하는 FDA 승인 약물은 없다. 그러므로 NRTIs는 임상적으로나 실험적으로나 P2X7 기능의 선택적 표적화에 가치가 있다.
HIV 복제를 조절하는데 있어서 P2X7에 대한 역할이 최근에 제안되었고 (Hazleton et al., 2012), HIV 환자는, NRTI를 함유한 고도로 활성인 항레트로 바이러스 요법으로 치료 후 감소하는 혈장 IL-18 수준(Ahmad et al., 2002; Iannello et al., 2010)이 증가하였다(Stylianou et al., 2003). 특히, HIV-1 감염 환자의 NRTI 치료에 의한 혈장 IL-18 농도의 감소는 바이러스 부하 또는 CD4+ T 세포 수와 크게 관련이 없었는데 (David et al., 2000), 이는 NRTIs가 바이러스 복제가 억제되기 전에 IL-18 수준을 저해할 수 있다는 것을 나타낸다. IL-18 숙성은, 통상적으로 P2X7 활성화를 필요로 하는 활성 카스파제-1에 의한 pro-IL18 절단을 요한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 실험은 NRTIs가 역전사효소 억제와 무관하게 HIV-유발 사이토카인 발현을 조절할 수 있다는 아이디어와 일치한다.
일부 실시형태에서, d4T는 야생형 생쥐에서 Alu RNA에 의해 유도된 RPE 변성을 방지한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 생쥐에 대한 망막하의 Alu RNA 투여는 연령-관련 황반변성의 생쥐 모델에서 RPE 변성을 일으킨다. 실제로, 도시된 바와 같이, 야생형 생쥐의 유리체액에 동시 전달된 d4T는 전달 1 주일 후에 Alu RNA-유도된 RPE 세포 사멸을 투여량-의존적으로 방지한다. 도 1의 상단 행은 증가된 양의 d4T (왼쪽에서 오른쪽)가 있거나 없는 대조 PBS 또는 Alu RNA 치료를 받는 생쥐의 안저 사진을 제공한다. 화살표는 RPE 세포 사멸의 탈색된 영역을 나타내며, 이는 최고 투여량의 d4T에서 분해된다. 도 1의 하단 행은 Alu RNA 투여시 분열되지만 d4T의 최고 투여량에서 건강한 RPE 형태/세포간 접합으로 복원된 적색의 세포간 접합부 (ZO-1)에 대해 염색된 RPE 플랫 마운트를 나타낸다.
한편, 특정 실시형태에서, d4T는 시험관내에서 Alu RNA를 발현하는 플라스미드에 의해 유도된 세포 독성으로부터 보호한다. 도 2는 표시된 시간 동안 Alu RNA (pAluA)에 대한 강제 발현 플라스미드로 처리된 인간 (HeLa) 세포가 MTS 증식 분석에 의해 모니터링된 바와 같이 널(null) 플라스미드 (pUC19)와 비교하여 생존력이 크게 감소하였고, 그리고 d4T 동시투여는 Alu 과발현에 의해 유발된 세포 사멸을 방지하였다는 것을 나타낸다.
일부 예시적인 실시형태에서, d4T는 Alu RNA 수준의 감소를 통해 세포 독성을 제거하지 않는다. 도 3에 제시된 바와 같이, DICER1 (Dcr as) (레인 3, 좌측으로부터 3 번째 레인)을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 일차 인간 RPE 세포는 Alu 특이적 프로브를 사용하여 노던 블로팅으로 모니터링한 대조용 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Ctr as)(레인 1, 가장 왼쪽)와 비교하여 핵 구획에서 증가된 Alu RNA 수준을 나타낸다. 한편, d4T (레인 2 및 4)의 동시투여는 Alu RNA 수준을 감소시키지 못한다. 도 3은 핵분획에 대한 부하 대조군으로서 u6 (하단 열)을 나타낸다.
또한, 일부 실시형태에서, d4T는 Alu RNA 수준을 감소시키지 않는다. 예를 들면, 일차 인간 RPE 세포는 d4T 유무에 관계없이 Alu RNA로 형질 감염될 수 있다(도 4), 도 4에 제시된 바와 같이, d4T의 동시투여는 Alu-특이적 프로브를 사용하여 노던 블로팅에 의해 검출되는 핵분획의 형질 감염후 1, 4 또는 24 시간에서 Alu RNA 수준을 변화시키지 않는다. U6 (하단 행)은 도 4의 핵분획에 대한 부하 대조군으로서 도시되어 있다.
본 발명은 또한 일부 실시형태에서 d4T가 Alu RNA에 의한 인플라마솜 활성화를 억제한다는 것을 제공한다. 실제로, Alu RNA는 효소 카스파제-1의 처리에 의해 표시되는 NLRP3 인플라마솜 활성화를 유도하고, 도 5는 Alu RNA가 dT4에 의한 동시처리에 의해 차단되는 d4T (100 uM; 레인 3), Alu 투여 24 시간 후 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 성숙을 일으키는 것을 보여주는 웨스턴 블롯을 제공한다(상단, 레인 2, 하부 밴드). 도 5의 하단 행은 빈쿨린 부하 대조군이다.
특정 실시형태에서, 3TC는 Alu RNA에 의한 인플라마솜 활성화를 억제한다. 실제로, Alu RNA는 효소 카스파제-1의 처리에 의해 표시되는 NLRP3 인플라마솜 활성화를 일으킨다. 도 6은 Alu RNA가 Alu 투여 24 시간 후 일차 인간 RPE 세포에서 3TC (20-100 uM; 레인 3)와의 동시처리로 차단되는 카스파제-1 성숙을 일으키는 것을 나타내는 웨스턴 블롯이다 (상단 레인 2, 하부 밴드). 하단에는 부하 대조군인 빈쿨린이 표시되어 있다.
그 다음, 도 7은 Alu RNA에 의한 인플라마솜 활성화의 AZT, 코디세핀 및 아바카비르 억제의 증거를 제공한다. 실제로, Alu RNA는 효소 카스파제-1의 처리에 의해 표시되는 NLRP3 인플라마솜 활성화를 일으킨다. 도 Alu RNA가 Alu 투여 24 시간 후, 아지도티미딘 (AZT), 코디세핀, 및 아바카비르(ABC)와의 동시처리로 차단되는 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 성숙을 일으키는 것(상단, 레인 2, 하부 밴드)을 나타내는 웨스턴 블롯이다(50-100 uM, 레인 3-8). 다시, 부하 대조군 빈쿨린은 하단에 표시되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 d4T가 LPS/ATP에 의한 인플라마솜 활성화를 억제한다는 것을 제공한다. 이와 같이, 도 8은 전형적인 인플라마솜 활성화제인 LPS/ATP로 처리된 일차 인간 RPE 세포가 카스페제-1 활성화를 증가시키고, 세포 표면 수용체 아답터 단백질인 MyD88를 통한 인플라마솜 신호 전달의 표지자인 IRAK4의 포스포릴화를 나타낸다는 것을 보여주는 겔을 제공한다. 또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, d4T (25/100 uM)는 LPS/ATP에 의해 유도된 카스파제-1 활성화 및 IRAK4 포스포릴화를 차단한다. 도 8에서 부하 대조군은 빈쿨린이다. 더욱이, 도시된 바와 같이, LPS 및 ATP는 조합으로만 NLRP3 인플라마솜을 활성화시킴으로써 하나 또는 다른 하나의 단독 처리는 이러한 실험을 위한 대조군으로서 유용하다.
본 발명은 또한, 예시적인 실시형태에서, d4T 및 다른 NRTIs가 LPS/ATP에 의한 인플라마솜 활성화를 감소시킨다는 것을 추가로 제공한다. 도 9에 제시된 바와 같이, d4T, 3TC 및 코디세핀 (100 uM에서), 모든 디-데옥시 뉴클레오시드 역전사효소 억제제는 LPS/ATP에 의해 유도된 카스파제-1 활성화 (활성 p20 밴드, 상부) 및 IL-18 성숙(하부)을 억제한다. 도 9를 얻기 위해서, 생쥐 골수-유래된 대식세포의 (i) 무 처리후, (ii) LPS 처리후 또는 (iii) LPS/ATP 처리 후에 세포 배양 상등액을 수집하고, 카스파제-1 및 IL-18의 항체로 웨스턴 블로팅 프로빙을 실시하였다.
본 발명의 일부 실시형태에서, d4T는 나이제리신-유도 인플라마솜 활성화를 억제한다. 도 10에서, d4T (100, 250 uM)는 나이제리신에 의해 유도된 IL-1 베타 성숙(상단, 18 및 22 kDa 형태) 및 카스파제-1 활성화 (활성 p20 밴드, 하부)를 억제한다. 생쥐 골수-유래 대식세포의 (i) 무처리후, (ii) LPS 처리후, 또는 (iii) LPS/나이제리신 처리후, IL-1 베타 및 카스파제-1에 대한 항체로 웨스턴 블로팅 프로빙을 실시하였다.
또한, 일부 실시형태에서, d4T는 MSU에 의해 유도된 PMA-분화된 THP-1 단핵세포로부터의 IL-1 베타 분비를 억제하지 않는다. 인간 THP-1 단핵세포를 PMA에 의해 대식세포로 분화시켰다. 도 11에 도시된 바와 같이, 투여량 (25-1,000 uM)에서 d4T 동시투여가 IL-1 베타 분비에 크게 영향을 미치지 않음에 따라, 공지된 인플라마솜 활성제인 모노나트륨 요산염(MSU)으로 처리한 결과 무처리 세포에 비해 IL-1 베타 분비를 증가시켰다. 또한, d4T는 ELISA (n = 3-4)에 의해 결정된 바와 같이 MSU-유도된 IL-1 베타 분비를 차단하지 않는다.
특정 실시형태에서, d4T 및 기타 뉴클레오시드 역전사효소 억제제는 MSU에 의해 유도된 PMA-분화된 THP-1 단핵세포로부터의 IL-1 베타 분비를 억제하지 않는다. 이것을 입증하기 위해, 인간 THP-1 단핵세포를 PMA에 의해 대식세포로 분화시켰다. MSU 처리는 비처리 세포에 비해 IL-1 베타 분비를 증가시켰다(도 12). 한편, 도 12에 나타낸 바와 같이, 다양한 투여량 (25-1,000 uM)에서 d4T, 3TC 또는 코디세핀 (모두 디-데옥시 뉴클레오티드 유사체)의 동시투여는 IL-1베타 분비에 크게 영향을 미치지 않았다.
그 다음, 일부 실시형태에서, d4T는 Alu RNA에 의해 유도된 NLRP3 프라이밍을 감소시킨다. 실제로, 도 13의 막대 그래프에서 제공된 바와 같이, Alu RNA 형질 감염은 모의 시약(형질 감염 시약 단독)과 비교하여 "프라이밍"(Y-축)으로 일컬어지는 16 시간에서 일차 인간 RPE 세포에서 NLRP3 mRNA 수준을 증가시킨다. 이 효과는 d4T (100 uM)의 동시투여에 의해 둔화되고 18S RNA 대조군으로 표준화된다.
또한, 본 발명의 예시적인 실시형태에서, d4T는 Alu RNA에 의해 유도된 IL-1베타 프라이밍을 감소시킨다. 도 14는 Alu RNA 형질 감염이 모의 시약(형질 감염 시약 단독)와 비교하여 "프라이밍 (priming)"(Y-축)으로 지칭되는 24 시간에서 일차 인간 RPE 세포에서 IL-1베타 mRNA 수준을 증가시킨다는 것을 예시한다. 이 효과는 d4T (100 uM)의 동시투여에 의해 둔화되고 18S RNA 대조군으로 표준화된다.
한편, 일부 실시형태에서, d4T는 Alu 발현에 의해 야기된 미토콘드리아 ROS를 감소시킨다. 도 15는 Alu (pAluA)의 강제 발현이 MitoSox 분석에 의해 검출된 증가된 미토콘드리아 반응성 산소종 (mtROS)을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 15를 얻기 위해, 일차 인간 RPE 세포는 d4T를 갖거나 갖지 않는 Alu 발현 플라스미드 또는 대조용 플라스미드 (pUC19)와 함께 배양되었다. 15 시간 후에 세포를 mtROS (적색) 및 세포 수, 핵(청색, Hoechst DNA 염색)으로 동시염색하였다. pAluA 그룹의 세포는 pUC19 대조군과 비교하여 더 큰 mtROS 염색(적색)을 나타냈는데, 이는 pAluA+ d4T 처리된 세포에서 감소된 효과이다.
그리고 추가의 실시형태에서, d4T는 Alu RNA에 의해 유도된 ATP 방출을 억제하지 않는다(도 16). 수 시간 동안 Alu RNA로 처리된 일차 인간 RPE 세포는 ATP를 방출하였다. 도 16을 얻기 위해서, d4T를 갖거나 갖지 않은 모의 시약 또는 Alu RNA 처리된 세포로부터 세포 배양 상등액을 수집하였다. ATP는 ATP-의존성 루시퍼라제 분석을 이용하여 검출되었다. 그리고, 특히 d4T는 ATP 방출에 영향을 미치지 않았다.
특정 실시형태에서, d4T는 도 17에 나타낸 바와 같이, ATP-유도된 세포 투과성을 Yo-Pro1 (P2X7 수용체 분석)로 감소시킨다. 도 17을 얻기 위해서, PMA에 의해 대식세포로 분화된 THP-1 세포는 P2X7 수용체 활성에 대한 분석에서 큰 형광 염료 Yo-Pro 1의 유입을 허용했다. d4T는 96 웰 마이크로 플레이트 판독기에서 영역 스캔 형광 측정에 의해 결정된, ATP에 의해 유도된 Yo-Pro 유입을 투여량-의존적으로 감소시키는 것으로 관찰되었다. 실제로, 도 17은 상대 형광 단위 (RFU, y-축)로 형광 측정의 결과를 제공한다.
또한, d4T는 Alu RNA 형질 감염 후에 증가하는 세포외 칼륨 수준을 감소시키는 것으로 나타났다(도 18). 실제로, 세포 배양 칼륨 수준은 6 시간 동안 Alu RNA로 처리된 일차 인간 RPE 세포에서 증가하며, 이는 d4T 동시투여에 의해 감소되는 효과를 나타낸다. 도 18에서, 칼륨 수준은 칼륨-의존성 피루베이트 키나제 분석을 분광 광도법으로 이용하여 세포 배양 상등액에서 결정되었다.
그 다음, 일부 실시형태에서, d4T는 도 19에 나타낸 바와 같이, Yo-Pro1에 대한 bzATP-유도된 세포 투과성 (P2X7 수용체 분석)을 차단한다. d4T는 P2X7-선택 작용제인 bzATP로 자극된 인간 P2X7 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 YO-PRO-1 요오드화물 유입을 차단하였다. bzATP/YO-PRO를 첨가하기 전에 세포를 d4T로 30분간 예비 배양한 다음, t = 30분에서 485/515 nm에서 형광을 측정하였다.
또한, d4T는 역전사효소 억제와 무관하게 Alu-유도된 RPE 변성 및 카스파제-1 활성화를 차단한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 도 20에 제공된 구조(들)를 갖는 화합물에 관한 것이다. 도 20은 메톡시-d4T (me-d4T) 및 d4T의 화학 구조를 포함한다. 도 20에 도시된 바와 같이, 리보스 5'히드록시기를 메톡시기(원으로 표시)로 단일 치환하는 것은 d4T 포스포릴화를 방지하기 위해 본 발명자에 의해 설계되었다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 리보스 5'히드록시기를 메톡시기로 단일 치환하는 것을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 그리고, 일부 실시형태에서, 본 발명은 d4T 포스포릴화와 같은 포스포릴화를 방지하기 위해 리보스 5'히드록시기 대신에 메톡시기를 포함하는 화합물을 제공한다.
본 발명은 도 21 내지 도 23에서 추가적인 실험결과를 제공한다. 사실상, 도 21은 Alu RNA±me-d4T로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이고; 도 22는 HeLa 세포에서 GFP-발현 렌티바이러스의 복제를 차단하는, 변형되지 않은 d4T (me-d4T는 아님)를 나타낸 세포를 나타내고; 그리고 도 23은 실시간 정량적 PCR에 의해 결정된 바와 같이, 변형되지 않은 d4T(me-d4T는 아님)가 일차 생쥐 RPE 세포에서 mtDNA 수준 (염색체 DNA 엑손-인트론 접합 서열로 표준화 됨)을 감소시키는 것을 나타내는 그래프를 제공한다. n = 4, 스투던트 t-시험에 의한 *p < 0.05.
일부 실시형태에서, Me-d4T (복강내 주사)는 생쥐에서 Alu-유도된 RPE 퇴행을 방지하는 것으로 나타났다. 도 24(상단 행)는 폐쇄띠(zonula occludens)-1 (ZO-1; 적색)(하단 행)에 대해 염색된 플랫 마운트를 제공한다. 퇴행성은 도 24에서 청색 화살표로 강조되어 있다. n = 4의 대표적인 이미지가 나타나 있다.
한편, 도 25는 me-d4T 합성의 개요를 제공하고, 도 26은 me-d4T (피크 # 6) 최종 생성물(순도 > 97%)의 HPLC 크로마토그램이다. 도 27은 화학적 이동이 구조와 일치하는 me-d4T 최종 생성물의 1H NMR 분광 그래프이고, 그리고 도 28은 구조와 일치하는 m/z 비를 갖는 m-d4T 최종 생성물의 액체 크로마토그래피/질량 분광법의 결과를 제공한다.
도 29, 도 30 및 도 31은 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변종을 제공한다. 구체적으로, 도 29는 3TC (2'3'디데옥시시티딘)의 화학 구조를 나타내고, 도 30은 AZT (3'-아지도-2',3'-디데옥시티미딘)의 화학 구조를 제공하고; 그리고 도 31은 ABC (시클로프로필아미노푸리닐 시클로펜텐)의 화학 구조를 나타낸다. 도 29 내지 도 31의 각각에서, 뉴클레오시드 유사체의 메톡시 변이 (O-메틸기)는 원으로 표시되어있다. 또한, 도 32는 "n"이 11인 d4T (IC-d4T)의 세포 투과성 변종을 나타낸다. 유도체는 다양한 실시형태에서 핵염기 그룹(원으로 표시)이 3TC, AZT, ABC에 의해서 대체될 수 있는 3TC, AZT, ABC의 세포 투과성 변종, 또는 3TC, AZT, ABC 또는 d4T, 3TC, AZT, ABC (도 29-31)의 메톡시-변종 또는 이의 유도체를 포함한다.
한편, 도 33은 본 발명에 따른 예시적인 NRTI의 화학 구조를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 NRTIs가 Alu-유도된 RPE 변성 및/또는 카스파제-1 활성화를 차단한다는 것을 제공한다. 예를 들면, 도 34는 Alu RNA±d4T로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위) 및 IRAK4 포스포릴화의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 35는 Alu RNA±NRTIs (3TC, AZT, ABC)로 형질 감염된 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화의 웨스턴 블롯이다. 도 36은 pAlu가 dPT의 경구투여에 의해 방지되는 RPE 퇴행을 일으킨다는 것을 나타내고, 그리고 도 37은 pAlu가 AZT의 복강내 투여에 의해 방지되는 RPE 변성을 일으킨다는 것을 나타낸다. 도 36 및 도 37은 안저 사진(상단 행); 폐쇄띠-1 (ZO-1; 적색)에 대해 염색된 플랫 마운트(하단행)을 포함한다. 퇴행은 파란색 화살표로 표시되어 있다. 스케일 바, 50 ㎛.
도 38 내지 도41은 NRTIs가 LPS/ATP-유도된 인플라마솜 활성화를 차단한다는 것을 예증한다. 도 38 및 39는, d4T가 세포 배양 배지 및 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이, LPS/ATP 처리된 일차 생쥐 골수-유래된 대식세포에서 카스파제-1 (도 38) 및 IL-1베타 (도 39) 활성화를 차단하였음을 나타낸다. 또한, 도 40은 Raji TK- 세포가 아닌 Raji TK+ 세포가 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)에 의해 결정된 바와 같이, AZT를 AZT-트리포스페이트(AZT-TP)로 포스포릴화 한다는 것을 보여주는 크로마토그램을 제시한다. 그리고 도 41은 AZT가 세포 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이 Raji TK- 및 TK+ 세포 모두에서 LPS/ATP에 의한 IL-1 베타 활성화를 차단한다는 것을 나타낸다. n = 3-4 실험의 대표적인 이미지는 도 38 내지 도 41에 각각 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 NRTIs가 도 42 및 43에 나타낸 바와 같이 P2X7 기공 기능 및 P2X7-유도 모델의 이식편 거부 및 무균 간 염증을 선택적으로 차단한다는 것을 제공한다. 도 42는 d4T가 일차 인간 RPE 세포(n = 4)로부터의 Alu-유도된 ATP 방출을 차단하지 않는다는 것을 나타내는 막대 그래프이다. 한편, 도 43은 NRTIs가 P2X7 기공 기능 및 P2X7에 의해 유도된 이식편 거부 및 무균 간 염증 모델을 선택적으로 차단하여 시간(분)에 대한 형광(bzATP%) 그래프를 제공한다는 것을 보여주는 그래프이다.
특정 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 d4T가 Alu RNA 수준을 감소시키지 않으면서 카스파제-1 활성화를 차단한다는 것을 제공한다. 따라서, 도 44는 Alu RNA±d4T로 형질 감염된 일차 생쥐 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위) 및 IRAK4 포스포릴화의 웨스턴 블롯을 제공한다. 그리고 도 45는 바이오틴-UTP-라벨링된 Alu RNA-형질 감염된 일차 인간 RPE 세포의 노던 블롯을 제공한다. 특히, 도 45에서, d4T는 Alu RNA 수준을 감소시키지 않았다(u6 RNA로 표준화됨).
그 다음, 도 46 및 도 47은 AZT-트리포스페이트 (AZT-TP, 표적 화합물; 도 46) 및 AZU-트리포스페이트 (AZU-TP, 내부 표준; 도 47)의 LC-MS/MS 스펙트럼을 제공한다. 또한, 도 48 및 도 49는 지정된 피크의 동일성을 확인하기 위해 AZT-TP (도 48) 및 AZU-TP(도 49)로 스파이크된 Raji TK- 세포의 크로마토그래피 분리를 MS 스펙트럼(삽입)으로 나타낸다.
도 50은 AZT-TP 표준 (검정색 원)의 표준 곡선이다. AZT로 처리된 Raji TK+ 샘플은 AZT-TP (흰색 삼각형)를 생성한 반면, AZT-TP는 AZT로 처리된 Raji TK- 세포에서 검출할 수 없었다. 도 50은 두 가지 실험을 대표한다.
도 51 내지 도 54는 일부 예시적인 실시형태에서 P2X7-의존성 기공 기능이 Alu-유도된 카스파제-1 활성화를 매개한다는 것을 나타낸다. 실제로, 도 51은 짧은 펩티드(Panx110)와 함께 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯으로서, 이는 P2X7 기공 기능을 차단하지만 양이온 플럭스(스크램블된 펩티드: Scr Panx110)는 차단하지 않는다. 도 52는 P2X7 양이온 플럭스를 차단하지만 기공 기능은 차단하지 않는 칼미다졸륨(도 32는 IC- 및 EC-d4T의 화학적 구조를 제공함)과 함께 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다. 도 53은 세포 투과성(IC), 세포-불투성(EC) 또는 변형되지 않은(태그 없음) d4T와 함께 Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)의 웨스턴 블롯이다. 또한, 도 54는 d4T가 일차 인간 RPE 세포에서 pAlu-유도된 미토콘드리아 ROS 생성을 방지한다는 것을 나타낸다. 도 54에서, 미토콘드리아 반응성 산소종 (ROS)은 MitoSox (적색)으로 시각화하고, 그리고 세포핵은 Hoechst (청색)으로 시각화하였다.
철(III) 암모늄 구연산염의 존재하에 일차 인간 망막 색소상피 세포 (RPE 세포)에서의 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)를 연구하였다. TM-3TC (구조 8) (25 μM)의 첨가는, 도 55에 도시된 웨스턴 블롯에 반영된 바와 같이, 철-유도 카스파제-1 활성화를 차단하였다. 2me-d4T (구조 4) (25μM)의 첨가는, 도 57에 도시된 웨스턴 블롯에 반영된 바와 같이, 철-유도된 카스파제-1 활성화를 차단하였다.
철(III) 암모늄 구연산염의 존재하에 일차 인간 RPE 세포에서의 카스파제-1 활성화 (p10 하위 단위)를 연구하였다. d4T-엔 (구조 3) (25 μM)의 첨가는, 도 56에 도시된 웨스턴 블롯에 반영된 바와 같이, 철-유도 카스파제-1 활성화를 차단하였다.
Alu RNA로 형질 감염된 일차 인간 RPE 세포에서의 카스파제-1 활성화 (p20 하위 단위)를 연구하였다. 도 58에 도시된 웨스턴 블롯에 반영된 바와 같이, d4T-엔(구조 3) 및 TM-3TC(구조 8)(25 및 100μM)의 첨가는 Alu-유도된 카스파제-1 활성화를 차단하였다.
NRTIs 또는 유도체 (각각 50 ㎛)로 처리한 일차 인간 RPE 세포에서의 mtDNA의 상대적인 양은 대조군으로서 부형체 처리(DMSO)("No Tx")를 이용하여 연구되었다. DNA를 약물에 노출된 세포 배양액에서 4일 후에 수집하였다. mtDNA에 대해 정량적 중합효소 연쇄반응을 수행하고 게놈 DNA 서열로 표준화하였다. 도 59에 반영된 바와 같이, 포스포릴화되지 않은 d4T의 변형된 버전(예를 들면, me-d4T (도 20), 2 me-d4T (구조 4))은 모 NRTI (d4T)와 비교하여 mtDNA 결핍을 나타내지 않는다. TM-3TC는 구조 8이다. 도 60에 반영된 바와 같이, 포스포릴화되지 않은 AZT (구조 1), N-Me-Me-AZT(구조 10)의 변형된 버전은 모 화합물(AZT)과 비교하여 mtDNA 결핍을 나타내지 않는다.
생쥐 연구는 NRTIs 또는 유도체로 처리하기 위해 수행되었다. 망막하 대조용 빈 벡터 플라스미드 (pNull) 또는 Alu RNA 발현 플라스미드 (pAlu)를 투여받은 생쥐를 매일 2회 복강내 변형된 NRTIs (me-AZT (구조 1), N-me-me-AZT (구조 10), 또는 2 me-d4T (구조 4), 25 ㎎/㎏/투여) 또는 대조용 부형체로 처리하였다. 도 61의 상단 행은 생쥐의 안저 사진을 표시한다. 도 61의 하단 행은 Alu RNA 발현시 분열되지만 변형된 NRTI 치료법을 이용하여 건강한 RPE 형태/세포간 접합부로 복원되는 적색의 세포간 접합부 (ZO-1)로 염색된 RPE 플랫 마운트를 표시한다.
화학식 I (반응식 1의 구조 C), 화학식 IV (구조 B), 화학식 VIII (구조 E), 화학식 X (구조 D) 및 메톡시-d4T (구조 A; 또한 도 20)의 개략도는 또한 도 62에 도시되어 있다. 일반적인 합성 과정은 다음과 같다: 건조 THF (5 mL) 중의 뉴클레오티드 (1.5 mmole)의 현탁액에 NaH (15 mmole)를 첨가하고, 그 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 메틸요오드화물 (15 mmole)을 상기 혼합물에 한 번에 첨가하고 1-3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 여부를 TLC로 확인하고 메탄올을 적가하여 급냉시켰다. 혼합물을 아세트산으로 중화시키고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 현탁시키고, 수성 NaHSO3 용액으로 세척하고, MgSO4상에서 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 디클로로메탄 중 2% 메탄올 및 실리카겔을 사용하여 플래시 칼럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하였다. 유도체의 구조는 LCMS 및 1H-NMR 분광법에 의해 확인되었다.
구조 A) 수율 200 mg (56%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 11.31 (s, 1H, NH), 7.50 (d, 1H, 6-H), 6.82 (dd, 1H, I'-H), 6.42 (dd, 1H, 3'-H), 5.91 (dd, 1H, 2'-H), 4.88 (s, 1H, 4'-H), 3.56 (m, 2H, 5'-H), 3.28 (s, 3H, OCH3), 1.75 (s, 3H, CH3).
구조 B) 67 mg (18.7%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 7.56(s, 1H, 6-H), 6.88 (dt, 1H, 1'-H), 6.43 (dd, 1H, 3'-H), 5.90 (d, 1H, 2'-H), 4.89 (s, 1H, 4'-H), 3.56 (m, 2H, 5'-H), 3.27 (s, 3H, OCH3), 3.18 (s, 3H, NCH3), 1.8 (s, 3H, CH3).
구조 C) 1g-규모의 수율은 0.4g 고형분 (36%)이었다. 1H NMR(500 MHz, DMSO) 11.31 (s, 1H, NH), 7.56 (d,1H, 6-H), 6.88 (dt, 1H, 1'-H), 6.43 (dd, 2H, 3'-H), 5.91 (m, 2H, 2'-H), 4.89(s, 1H, 4'H), 6.43 (dd, 1H, 3'-H), 5.91 (d, 2H, 2'-H), 4.89 (s, 1H, 4'-H), 3.55(t, 2H, 5'-H), 3.27 (s, 3H, OCH3), 3.18 (s, 3H, NCH3), 1.8 (d, 3H, CH3).
구조 D) 오일 (0.5g, 46%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 7.56 (d, 1H, 6-H), 6.88 (dt, 1H, 1'-H), 6.43 (dd, 2H, 3'-H), 5.91 (m, 2H, 2'-H), 4.89(s, 1H, 4'H), 6.43 (dd, 1H, 3'-H), 5.91 (d, 2H, 2'-H), 4.89 (s, 1H, 4'-H), 3.55(t, 2H, 5'-H), 3.27 (s, 3H, OCH3), 3.18 (s, 3H, NCH3), 1.8 (d, 3H, CH3).
구조 E) 반응은 1 시간 내에 종료되었다. 수율 0.224g(55%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) 7.81 (d, 1H, H6), 6.23 (t, 1H, H4'), 6.09 (d. 1H, H5), 5.31 (t, 1H, H2'), 3.70 (m, 2H, H6'), 3.43 (dd, 1H, H5'b), 3.34 (s, 3H, OCH3), 3.08 (dd, 1H, H5'a), 3.04 (s, 6H, N(CH3)2).
실시예 2
본 실시예에서, "카무부딘(Kamuvudines)"이라고도 불리는 고유의 NRTIs의 구조를 연구한다. 이들 카무부딘의 합성 과정은 본 명세서에 기술되어 있다.
또한 이들 카무부딘에 대한 NMR 및 질량 분석 데이터와 카무부딘의 생물학적 활성에 관한 데이터도 제공된다.
5'-O- 알킬 치환된 및 디알킬 치환된 카무부딘의 합성
건식 THF (5 mL) 중 뉴클레오티드 (1.5 m-몰)의 현탁액에 NaH (4.5 m-몰)를 첨가하고, 그 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 알킬 요오드화물 (4.5 m-몰)을 상기 혼합물에 한 번에 첨가하고 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 여부를 TLC로 확인한 후 메탄올을 적가하여 급냉시켰다. 혼합물을 아세트산으로 중화시키고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 현탁시키고, 수성 NaHSO3 용액으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 용매로서 에틸아세테이트/헥산을 사용하여 실리카겔을 이용하는 플래시 칼럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하였다. 유도체의 구조는 LCMS 및 1H-NMR 분광법에 의해 확인되었다.
비대칭 디-치환 카무부딘의 합성
A) N-치환된 뉴클레오시드의 합성. 디클로로메탄 (5 mL) 중 뉴클레오티드 (1.5 m-몰)의 현탁액에 NaH (1.5 m-몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 알킬 요오드화물 (1.5 m-몰)을 상기 혼합물에 한 번에 첨가하고 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 반응완료 여부를 TLC로 확인하였다. 추출물을 염수로 씻고 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 증발시키고 플래시 크로마토그래피에 의해 N-치환된 생성물을 정제하였다.
B) 디클로로메탄 (5 mL) 중의 N-치환된 뉴클레오티드 (1.5 m-몰)의 현탁액에 NaH (1.5 m-몰)을 첨가하고, 그 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 알킬 요오드화물 (1.5 m-몰)을 상기 혼합물에 한 번에 첨가하고 1 내지 3시간 동안 교반하였다. 반응완료 여부를 TLC로 확인하였다. 추출물을 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 증발시키고, 플래시 크로마토그래피로 디-치환된 생성물을 정제하였다.
카무부딘에 대한 NMR 및 질량 분광분석 데이터
Figure pct00039
1. a) O-Me-d4T
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11.37 (s, 1H), 7.26 (q, J = 1.3 Hz, 1H), 6.85 (dt, J = 3.6, 1.7 Hz, 1H), 6.44 (dt, J = 6.0, 1.6 Hz, 1H), 6.05 (dt, J = 6.1, 1.8 Hz, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.41 (t, J = 2.7 Hz, 2H), 3.17 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.75 (d, J = 1.3 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]+ 질량 이론치 C11H14N2O4Na+ = 261.23, 실측치=261.2.
1. b) 2-Me-d4T
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.56 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 6.89 (ddd, J = 3.4, 1.9, 1.4 Hz, 1H), 6.44 (dt, J = 6.0, 1.8 Hz, 1H), 5.91 (ddd, J = 6.0, 2.5, 1.4 Hz, 1H), 4.96-4.83 (m, 1H), 3.60-3.52 (m, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 2.08 (s, 2H), 1.81 (d, J = 1.2 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]+ 질량 이론치 C12H16N2O4Na+ = 275.28, 실측치 275.2.
1. c) 2-Et-d4T
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.50 (t, J = 1.3 Hz, 1H), 6.89 (dq, J = 3.4, 1.5 Hz, 1H), 6.44 (dt, J = 5.9, 1.6 Hz, 1H), 5.93 (ddt, J = 6.0, 2.5, 1.4 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 3.93-3.78 (m, 2H), 3.59 (td, J = 3.1, 1.3 Hz, 2H), 3.45 (qt, J = 7.0, 1.5 Hz, 3H), 1.80 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.10 (tdd, J = 7.0, 5.2, 1.3 Hz, 6H). MS (ESI): [M+Na]+ 질량 이론치 C14H20N2O4Na+ = 303.3, 실측치 303.2.
1. d) N-Et d4T
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.69 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 6.89 (dt, J = 3.4, 1.7 Hz, 1H), 6.41 (dt, J = 6.0, 1.8 Hz, 1H), 5.92 (ddd, J = 6.0, 2.4, 1.4 Hz, 1H), 5.01 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.84-4.75 (m, 1H), 3.85 (qd, J = 7.1, 1.8 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 5.3, 3.4 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.09 (t, J = 7.0 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]+ 질량 이론치 C12H16N2O4Na+ = 275.28, 실측치 275.2.
1. e) O-Me N-Et d4T
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.55 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 6.90(dt, J = 3.3, 1.7 Hz, 1H), 6.45 (dt, J = 6.0, 1.7 Hz, 1H), 5.93 (ddd, J = 6.1, 2.3, 1.4 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 3.91-3.81 (m,2H), 3.56 (dd, J = 3.1, 1.5 Hz, 2H), 3.28 (s, 3H), 1.81 (d, J = 1.2Hz, 3H), 1.10 (t, J = 7.0 Hz, 3H). MS (ESI): [M+Na]+ 질량 이론치 C13H18N2O4Na+ 289.31, 실측치 289.2.
Figure pct00040
2. a) O-MeAZT
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11.30 (s, 1H), 7.50 (q, J = 1.1 Hz, 1H), 6.82 (dt, J = 3.3, 1.6 Hz, 1H), 6.41 (dt, J =6.1, 1.7 Hz, 1H), 5.91 (ddd, J = 6.2, 2.5, 1.3 Hz, 1H), 4.93-4.77 (m, 1H), 3.55 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 3.28 (s, 3H), 1.75(d, J = 1.3 Hz, 3H). MS (ESI): [M+H]+, C11H15N5O4 +, 이론치 282.26, 실측치 282.2.
2. b) 2-Me-AZT
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.63 (q, J = 1.2 Hz, 1H, H6), 6.15 (t, J =6.4 Hz, 1H, H1', 4.43 (dt, J = 7.3, 5.4 Hz, 1H, H3', 3.97 (dt, J = 5.1, 4.1 Hz,1H, H4', 3.67-3.50 (m, 2H, H5', 3.35 (s, 3H, OCH3), 3.17 (s, 3H, NCH3), 2.46-2.27 (m, 2H, H2', 1.85 (d, J = 1.2 Hz, 3H, CH3).
MS (ESI): [M+H]+ C12H18N5O4 +, 이론치 = 296.29, 실측치 296.2.
2. c) 2-Et-AZT
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.62 (t, J = 1.2 Hz, 1H, H6),6.16 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H1', 4.43 (q, J = 5.8 Hz, 1H, H3', 3.96 (q, J =4.4 Hz, 1H, H4', 3.83 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.68-3.55 (m, 2H, H5', 3.55-3.44 (m, 2H), 2.37 (dp, J = 20.5, 7.0 Hz, 2H, H2', 1.84 (d, J= 1.2 Hz, 3H, CH3), 1.15 (td, J = 7.0, 1.1 Hz, 3H), 1.08 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
MS (ESI): [M+H]+ 이론치 C14H22N5O4 + = 324.35, 실측치 324.2.
Figure pct00041
3. a) 3-Me-3TC
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.82 (d, J=7.8 Hz,1H), 6.23 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.31(t, J = 4.7 Hz, 1H), 3.77-3.65 (m, 2H), 3.44 (dd, J = 11.7,5.5 Hz, 1H), 3.34 (s, 3H), 3.09 (dd, J = 11.7, 4.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H).
MS (ESI): [M+H]+, C11H18N3O3S+ 이론치 272.34, 실측치 272.2.
3. b) 3-Et-3TC
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.89-7.77 (m, 1H), 6.22 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.29 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.60-3.48 (m,4H, CH2), 3.32 (s, 2H), 3.10 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 1.18-1.01(m, 9H, CH3).MS (ESI): [M+H]+, C14H24N3O3S+ 이론치 314.41, 실측치 314.4.
NRTIs 및 카무부딘의 특성
일부 실시형태에서, 원래의 NRTIs (d4T, 3TC, AZT)와 비교하여, 카무부딘 (변형된 NRTIs)은 보다 바람직한 약물 유사 특성을 갖는다. 예를 들면, 아래의 표 1을 참고하면, NRTIs와 비교하여, 카무부딘은 더 큰 LogP 값 (0보다 크고 1에 가까움) 및 물에서의 낮은 용해도를 갖는다. 안구내 서방성 약물 전달 시스템과 같은 특정 유형의 화합물 방출 중, LogP 값이 더 크고 카무부딘의 용해도가 더 낮으면, 원래의 NRTIs에 비해 유리체액(vitreous humor) 및 망막에서 더 긴 체류 시간 (즉, 더 긴 반감기)을 제공한다.
명칭 LogP 용해도 (mg/ml)
d4T -0.23 106
Me-d4T 0.41 30
2Me-d4T 0.63 10
2Et-d4T 1.35 0.09
O-Me, N-Et-d4T 0.99 1.5
3TC -1.1 64
TM-3TC 0.09 7
3Et-3TC 1.16 1.6
AZT -0.41 16
2Me-AZT 0.45 0.94
2Et-AZT 1.17 0.01
LogP: 1-옥탄올에서의 분배 계수.
물에서의 용해도, pH 7.2, 37 ℃.
세포에서의 NRTIs 및 카무부딘의 효능
도 64 내지 73 및 도 74 내지 78을 참고로 하면, 본 명세서에 기재된 화합물은 카스파제-1 활성화를 억제한다. 카스파제-1은 인플라마솜 복합체의 핵심에서 효소이며, AMD에서 RPE 세포 사멸의 중요한 위험 반응 신호이자 매개체이다. 또한, 도 64 내지 73은 카무부딘이 생쥐 J774 iGluc 세포에서 iGluc 발광분석에 의해 결정된 바와 같이 투여량-의존적으로 카스파제-1을 억제한다는 것을 나타낸다. 중요한 것은 각 화합물 (독특한 R기(들))을 시험할 필요가 있음을 강조하면서 투여량 반응곡선 면에서 개별 화합물간에 약간의 차이가 있다는 것이다. 또한, 카무부딘은 카스파제-1 활성화의 다양하고 불완전한 억제를 나타냈으며, 카무부딘 계열 내에서 화합물 활성의 차이가 있음을 제시하였다.
도 64 내지 73에 나타낸 데이터를 얻기 위해서, iGLuc 분석을 실시하였다(Bartok et al. iGLuc: 루시퍼라제계 인플라마솜 및 프로테아제 활성 리포터로부터 변형됨. Nature Methods 2013; 10 (2): 147-54). 간단히 말해서, 웰당 100,000 개의 iGLuc 세포를 96 웰 플레이트에 밤새 도포하였다. 다음날 아침, 플레이트에서 배지를 흡인하고, 30분 동안 약물(NRTIs 또는 변형된 NRTIs)과 함께 무혈청 DMEM 75 μL로 교체한다. 약물 노출 30분 후, 20 mM ATP (25 μL)를 최종 농도 5 mM로 첨가하였다. 각 웰에서 50 μL의 배지를 모으고 각 샘플에 50 μL의 코엘렌테라진 4.4 μM을 첨가하여 즉시 발광을 기록하였다.
도 64는 3TC가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. 3TC (1 nM - 100 μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 65는 3Me-3TC가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. 3Me-3TC (1nM - 100μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 66은 3Et-3TC가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. 3Et-3TC (1 nM - 100 μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 67은 AZT가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. AZT (1 nM - 100 μM)에 대한 노출은 투여량 의존적 방식으로 카스파제-1 절단을 감소시킨다. N = 3이다.
도 68은 2Me-AZT가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. 2Me-AZT (1 nM - 100 μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 69는 2Et-AZT가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. 2Et-AZT (1 nM - 100 μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 70은 d4T가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. d4T (1 nM - 100 μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 71은 O-MeN-Et d4T가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. O-Me N-Et d4T (1 nM - 100 μM)에 노출되면, 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 72는 Me-d4T가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. Me-d4T (100μM)에 노출되면 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 73은 2Et-d4T가 카스파제-1 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. ATP (5 mM)는 생쥐 J774 iGLuc 세포에서 카스파제-1에 의한 루시퍼라제 절단의 발광 모니터링에 의해 측정되는 카스파제-1 활성화를 유도한다. 2Et-d4T (1 nM - 100 μM) 노출되면, 투여량-의존적으로 카스파제-1 절단이 감소된다. N = 3.
도 70 내지 도 73에 도시된 바와 같이, d4T에 비해 카무부딘 (변형된 NRTIs)에 의한 인플라마솜 활성화가 크게 감소했다. 구체적으로, d4T는 인플라마솜 활성화를 약 35% 감소시켰고, 반면에 O-Me, N-Et-d4T는 인플라마솜 활성화를 약 55% 감소시켰고, Me-d4T는 인플라마솜 활성화를 약 70% 감소시켰으며, 2Et-d4T는 인플라마솜 활성화를 약 45% 감소시켰다. 이론에 구속되지 않고, 각 카무부딘이 모 NRTI (즉, d4T)와 비교하여 인플라마솜 활성화를 더 크게 감소함에 따라, 카무부딘은 또한 망막 변성의 증가된 차단을 제공하는 것으로 믿어진다.
도 74는 카무부딘이 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링된 바와 같이 일차 인간 RPE 세포에서 Alu RNA에 의해 유도된 카스파제-1 활성화를 차단함을 나타낸다. 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링된 일차 인간 RPE 세포에서 Alu RNA로 유도된 카스파제-1 활성화는 2Et-d4T (25μM), 2Me-AZT (25μM), O-Me N-Et d4T (25μM), d4T-엔 (25-100 μM) 및 TM-3TC (25-100 μM)에 의해 감소된다. N = 3-4.
Alu RNA는 건식 AMD 환자에 축적되어 RPE의 사멸을 유발하는 독성 내인성 레트로요소이다. 도 75는 카무부딘이 철(Fe 3+) 암모늄 구연산염 (FAC)에 노출된 일차 인간 세포에서 카스파제-1 활성화를 차단함을 나타낸다. FAC는 Alu RNA 중간체를 통해 카스파제-1을 활성화시키고 NLRP3-의존성 RPE 변성을 유도한다(Gelfand et al. Cell Reports 2015). 웨스턴 블로팅으로 모니터링한 일차 인간 RPE 세포에서 Fe(III) 암모늄 구연산염 (100 μM)-유도된 카스파제-1 활성화는 TM-3TC (25μM), d4T-엔 (25μM), 2Me-d4T (25 μM), Me-AZT (25-100 μM) 및 2Me-AZT (25 μM)에 의해 감소된다. N = 3-4.
도 76 내지 78은 NRTI 3TC가 일차 인간 RPE 세포에서 AMD 관련 스트레스 인자 (보체 단백질 C3a, ROS-발생 인자 파라쿼트 및 아밀로이드 베타)에 의해 유도된 카스파제-1 활성화를 차단한다는 것을 나타낸다. 도 76은 NRTIs가 인간 RPE 세포에서 보체-유도 카스파제-1 활성화를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 인간의 C3a (100 nM)-유도된 카스파제-1 활성화는 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링된 일차 인간 RPE 세포의 LPS 프라이밍 후 3TC(25 μM)에 의해 감소된다. N = 3-4. 도 77은 NRTIs가 인간 RPE 세포에서 파라콰트-유도된 카스파제-1 활성화를 감소시키는 것을 나타낸다. 웨스턴 블로팅으로 모니터링한 일차 인간 RPE 세포에서 파라쿼트(250 μM)에 의해 유도된 카스파제-1 활성화는 3TC(25 μM)에 의해 감소된다. N = 3-4. 도 78은 NRTIs가 인간 RPE 세포에서 아밀로이드 베타-유도 카스파제-1 활성화를 감소시키는 것을 나타낸다. 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링된 일차 인간 RPE 세포에서 올리고머화된 Aβ1-40 펩티드 (0.5 μM)-유도 카스파제-1 활성화는 3TC (10-25μM)에 의해 감소된다. N = 3-4.
생쥐에서의 NRTIs 및 카무부딘의 효능
건식 및 습윤 AMD 생쥐 모델에서의 카무부딘의 효능은 본 명세서에 제시되어있다. 도 79 내지 87을 참고로 하면, 본 명세서에 기재된 화합물은 "습윤 AMD"의 모델에서 맥락막 혈관신생(CNV)을 감소시키고 "건식 AMD"의 모델에서 RPE 퇴행을 차단한다.
도 79 및 80은 NRTIs 및 카무부딘이 맥락막 혈관신생 (CNV; 습윤 AMD)의 레이저 유도 모델에 효과적이라는 것을 나타낸다. 도 79는 본 명세서에 기재된 화합물이 "습윤 AMD" 모델에서 맥락막 혈관신생을 감소시키는 것을 나타낸다. 레이저 손상 후 3TC (0.55 nmol), ABC (0.64 nmol) 또는 AZT (0.55 nmol)의 유리체내 투여는 야생형 생쥐에서 레이저 손상으로 유도된 CNV 부피를 감소시켰다. PBS 또는 DMSO의 주사는 부형체 대조군이었다. N = 16. 도 80은 본 명세서에 개시된 화합물이 "습윤 AMD"모델에서 맥락막 혈관신생 (CNV)을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 레이저 손상 후 Me-d4T, O-Me-N-Et-d4T, 2Et-AZT 또는 3Et-3TC (0.14nmol)의 유리체내 투여는 7일째 야생형 생쥐에서 맥락막 혈관신생 (CNV) 부피를 감소시켰다. DMSO의 주사는 부형체 대조군이었다. N = 16. NRTIs (도 79)와 비교하여, 변형된 NRTIs (도 80)는 CNV를 억제에서 보다 강력하고(보다 작은 투여량이 요구됨)보다 효과적이다(억제 정도가 더 커짐).
이론에 구속되지 않고, NRTIs 및 카무부딘 모두는 CNV를 감소시키는 P2X7 의존 방식으로 항혈관 형성 효과를 제공한다고 믿어진다. 특히, NRTIs 또는 카무부딘의 유리체내 주사는 PBS 또는 DMSO와 비교하여 야생형 생쥐에서 레이저-유도된 CNV를 각각 억제한 반면, NRTIs의 유리체내 주사는 P2rx7-/-생쥐의 레이저-유도된 CNV를 억제하지 않았다. 또한, NRTIs의 유리체내 주사는 Nlrp3-/-생쥐에서 레이저 유도된 CNV를 억제하여 항 혈관 형성 효과가 Nlrp3-독립적임을 나타낸다. NRTIs 및 카무부딘의 P2X7 억제 및/또는 혈관 억제 효과는 또한 종양 성장을 차단 및/또는 이식편대 숙주질환을 치료하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 질병의 치료에 효과적이라고 믿어진다.
도 81 및 82는, 원래의 NRTIs와 비교하여, 카무부딘은 기존의 신생혈관 질환 치료에 강력하고 효능이 증가하였음을 나타낸다. JR5558 생쥐는 자발적인 맥락막 혈관신생(CNV)을 일으키며 습윤/혈관신생 연령-관련 황반변성 (AMD)의 동물 모델이다. CNV 병변의 활성은, 이 질환을 앓고 인간에게서도 마찬가지로, 병변에서 염료 누출의 정도를 평가하기 위해서, 플루오레신 조영술을 이용하여 모니터링될 수 있다. 도 81 및 82는 두 JR5558 생쥐 (N = 8)로부터 얻은 대표적인 이미지이다. 도 81 및 82의 제1 및 제2 JR5558 생쥐의 좌측 눈 (첫 번째 줄) 및 오른쪽 눈 (세번째 줄)에 미리 존재하는 CNV 병변으로부터 시간 의존적 염료 누출을 나타낸다. 도 81 및 도 82의 제2 열은, 3TC 125 ng의 단일 유리체내 투여 후 좌측 눈에서의 시간 의존성 염료 누출을 나타내고, 제4 열은 3-Me-3TC 62.5 ng의 단일 유리체내 투여후 우측 눈에서의 시간 의존적 염료 누출을 나타낸다. 제2 및 제4 열에서 알 수 있듯이, 3TC 및 3-Me-3TC는 모두 투여 3일 후에 기존의 CNV 병변의 활성을 억제한다(즉, 염료 누출을 감소시킴). 또한, 원래 NRTI (3TC)와 비교하여, 카무부딘 (즉, 3-Me-3TC)은 낮은 투여량 (즉, 보다 강력함)에서 CNV 병변 누출이 더 크게 감소한다 (즉, 보다 효과적임).
건식 AMD의 모델에 있어서, 도 83 내지 86은, 카무부딘이 건식 AMD 모델에서 안저 사진술과 RPE의 ZO-1 플랫 마운트 염색법으로 모니터링한 바와 같이, Alu-유발 RPE 퇴행을 차단하는 것을 나타낸다.
도 83은 본 명세서에 기재된 화합물이 "건식 AMD"의 모델에서 Alu RNA-유도된 RPE 퇴행을 차단한다는 것을 나타낸다. Alu RNA (0.3 ㎍)의 망막하 주사는 RPE 퇴행을 유발한다(색안저 사진에서 엷은 황색 영역 (상단 줄 줄)과 야생형 생쥐에서 육각형 배열(하단 줄)의 해체를 유도한다. 3Me-3TC (25mg/kg, 1일 2회, Alu RNA 주사 후 6일간)의 복막내 투여는 안저 사진 (상단; 변색의 흰 부분이 작음)과 ZO-1 면역 염색된 RPE 플랫 마운트(하단; 더욱 육각형이고, 모자이크 모양)에서 볼 수 있듯이 RPE 변성을 막아준다. 하단 패널은 O-MeN-Et d4T (Alu RNA 주사 후 6일 동안 하루 2회 25mg/kg)의 복강내 투여가 6 실험의 대표적인 야생형 생쥐에서 Alu RNA로 유도된 RPE 퇴행을 방지한다는 것을 보여주는 안저 사진을 나타낸다.
도 84는 본 명세서에 기재된 3Me-3TC가 "건식 AMD" 모델에서 pAlu-유도된 RPE 퇴행을 차단한다는 것을 나타낸다. Alu (pAlu)를 암호화하는 플라스미드의 망막하 주사는 야생형 생쥐에서 RPE 퇴행 (색안저 사진 (상단 줄)에서 연한 황색 영역)과 육각형 배열 (하단 줄)의 해체를 유도한다. 3Me-3TC (25mg/kg, pAlu 주사 후 6일간, 하루 2회)의 복강내 투여는, 안저 사진 (위) 및 ZO-1 면역 염색된 RPE 플랫 마운트(아래)에서 볼 수 있듯이 RPE 변성을 방지한다. 6개 실험의 대표적이 이미지.
도 85는 "건식 AMD" 모델에서 3Et-3TC가 pAlu-유도된 RPE 변성을 차단한다는 것을 나타낸다. Alu (pAlu)를 암호화하는 플라스미드의 망막하 주사는 야생형 생쥐에서 RPE 퇴행 (색안저 사진 (상단 줄) 연한 황색 영역)과 육각형 배열 (하단 줄)의 해체를 유도한다. 3Et-3TC (25 mg/kg, pAlu 주사 후 6일간 하루 2회)의 복강내 투여는 안저 사진 (위) 및 ZO-1 면역 염색된 RPE 플랫 마운트 (아래)에서 볼 수 있듯이 RPE 퇴행을 방지한다. 6개 실험의 대표적인 이미지.
도 86은 본 명세서에 개시된 화합물이 "건식 AMD" 모델에서 pAlu-유도된 RPE 퇴행을 차단한다는 것을 나타낸다. Alu (pAlu)를 암호화하는 플라스미드의 망막하 주사는 야생형 생쥐의 RPE 퇴행 (색안저 사진 (상단 줄)의 연한 황색 영역과 육각형 배열 (하단 줄)의 해체를 유도한다. 2Et-d4T 또는 2Et-AZT (25 mg/kg, pAlu 주사 후 6일간 2회)의 복강내 투여는 안저 사진에서 볼 수 있듯이 RPE 퇴행을 방지한다. 6 개 실험의 대표적인 이미지.
도 87 내지 89에서, 카무부딘은 폴리 I:C, 아밀로이드 베타 및 철의 안구내 주사 후 RPE 퇴행을 차단하는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
도 87은 본 명세서에 기재된 화합물이 "건식 AMD"의 모델에서 폴리 IC-유도된 RPE 퇴행을 차단한다는 것을 나타낸다. 야생형 생쥐의 망막하 공간에 투여된 폴리 IC (0.2 ㎍)은 RPE 퇴행 (색안저 사진 (상단 줄)에서 엷은 황색 영역과 육각형 배열(하단 줄)의 해체를 유도한다. Me-d4T 또는 2-Me-d4T (0.14 mmol) (폴리 IC 주사 후)의 유리체내 투여는 이러한 퇴화를 차단한다 (poly IC 투여 후 7일째 측정). 상단 줄은 대표적인 안저 사진을 나타낸다. 하단 줄은 대표적인 ZO-1 면역 염색된 RPE 플랫 마운트를 나타낸다. N = 4-6.
도 88은 본 명세서에 개시된 화합물이 "건식 AMD"의 모델에서 아밀로이드 베타-유도된 RPE 퇴행을 차단한다는 것을 나타낸다. 올리고머화된 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(0.83 μmol)를 생쥐의 망막하 공간에 주사하여 RPE 퇴행성 변성(색안저 사진 (상단 줄)에서 연한 황색 영역)과 육각형 배열 (하단 줄)의 해체를 유도하였다. 1일 내지 6일(25 mg/kg)에서 3TC 또는 K-2(2Me-d4T)를 복강내 투여하면 7일째에 RPE 퇴행이 진행되지 않았다. 상단 줄은 색안저 사진을 나타낸다. 하단 줄은 ZO-1로 염색된 RPE 플랫 마운트를 나타낸다.
도 89는 본 명세서에 개시된 화합물이 "건식 AMD"의 모델에서 철-유도된 RPE 퇴행을 차단한다는 것을 나타낸다. 생쥐의 망막하 공간에 Fe(III) 암모늄 구연산염 (3nM)을 주사하여 RPE 퇴행 (색안저 사진에서 연한 황색 영역 (상단 줄))과 육각형 배열의 해체 (하단 줄)를 유도하였다. 1일 내지 6일까지 (25 mg/kg) d4T, K-1 (Me-d4T) 또는 K-2 (2Me-d4T) 복강내 투여는 부형체 치료와 비교하여 7일째 RPE 변성의 발달을 차단하였다. 상단 줄은 색안저 사진을 나타낸다. 하단 줄은 ZO-1로 염색된 RPE 플랫 마운트를 나타낸다.
생쥐 및 세포에서의 카무부딘에 대한 NRTIs의 안전성/독성
화합물의 안전성 및 독성도 또한 연구하였다. 도 90은 NRTIs가 유리체내 주사 후 망막에 독성이 있음을 나타낸다. 놀랍고도 예기치 않게, NRTIs에 단일 R 치환기를 첨가하면 이러한 독성이 제거되었다. 도 91은 동일한 투여량의 카무부딘을 유리체내 주사하면 독성이 없음을 나타내는데, 이는 안구 투여를 위해 NRTIs보다 안전하다는 것을 의미한다. 또한, 도 92는 카무부딘이 유리체내 투여가 망막의 해부학적 붕괴를 유도하지 않는다는 점에서 안전하다는 것을 나타낸다.
도 90은 공지된 NRTIs가 망막 독성을 일으킬 수 있음을 나타낸다. 생쥐에게 d4T, AZT, 또는 3TC (0.56 nmol)를 유리체내 주입하면 망막 변성 (적색 화살표) 망막 독성의 영역을 유도하였다. 대표적인 색상 안저 사진 이미지가 나타나 있다(N = 8). 이러한 데이터는 NRTIs가 안구내 투여 후 부작용이 있을 수 있음을 나타낸다.
도 91은 본 명세서에 개시된 화합물이 망막에 유해하지 않음을 나타낸다. 생쥐에서 카무부딘 1-9 (2.8 nmol)의 유리체내 주사는 망막 독성을 유도하지 않았다. 대표적인 색상 안저 사진 이미지가 나타나 있다(N = 8). 이들 데이터는 NRTIs와는 달리, 카무부딘이 안구내 투여의 경우보다 더 안전하다는 것을 나타낸다.
또한, 도 92는 본 명세서에 개시된 화합물이 망막에 유해하지 않음을 나타낸다. 생쥐에게 카무부딘 1-5 (2.8 nmol)의 유리체내 주사를 하면, 망막의 해부학적 파열 (H & E 염색-상단 줄) 또는 망막의 다양한 층의 두께 변화를 유도하지 않았다 (ILM: 내부 제한 막; OLM: 외부 제한 막; IPL: 내부 얼기(plexiform) 층; INL: 내부 핵층, ONL: 외부 핵층, IS: 내부 분절, OS: 외부 분절). N = 8. 이들 데이터는 NRTIs와 달리 카무부딘이 매우 높은 농도에서도 안구내 투여에 안전하다는 것을 나타낸다.
마지막으로, 도 93 및 94는 카무부딘이 NRTIs의 "오프-표적" 중합효소 억제 없다는 것을 나타낸다. 즉, NRTIs 상의 R기 치환은 중합효소 억제에 대한 활성을 완전히 변화시켰다.
도 93은 카무부딘이 아닌 NRTIs가 배양액 중 일차 인간 RPE 세포에서 미토콘드리아 DNA 복제 수를 차단한다는 것을 나타낸다. NRTIs는 DNA 중합효소 감마에 대한 내인성 뉴클레오티드에 필적하여 미토콘드리아(mt) DNA를 고갈시킨다. mtDNA 결핍은 NRTI 사용과 관련된 많은 부작용에 크게 원인이 있을 것으로 생각된다. mtDNA 수준의 해결에서 카무부딘들 사이에는 약간의 차이점이 있었는데, 이는 각 변형된 화합물을 개별적으로 시험할 필요가 있음을 나타낸다. 그래프는 모든 약물에 대해 50 μM 농도의 부형체 처리 (DMSO, "No Tx"라고도 함)에 비해, NRTIs (d4T, 3TC 또는 AZT)로 처리된 일차 인간 RPE 세포 또는 변형된 NRTIs (Me-d4T, 2Me-d4T, TM-3TC Me-AZT, 또는 2Me-AZT)에서 mtDNA의 상대적인 양을 나타낸다. 약물에 노출된 세포 배양에서 4일 후에 DNA를 수집하였다. mtDNA에 대해 정량적 중합효소 연쇄반응을 수행하고 게놈 DNA 서열로 표준화하였다. D4T, 3TC 및 AZT는 mtDNA 결핍을 나타낸다. d4T 및 AZT의 변형된 버전은 mtDNA 결핍을 나타내지 않는다. N = 3-4/기이고, 오차 막대는 S.E.M이다. 이들 데이터는 NRTIs가 미토콘드리아 독성을 유도할 수 있는 반면, 대부분의 변형된 NRTIs는 미토콘드리아 독성을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다. 미토콘드리아 독성이 NRTIs를 복용중인 환자에서 관찰되는 근육병증, 말초신경병증 및 유산증과 관련하여 미토콘드리아 독성을 일으키고 변형된 NRTIs가 미토콘드리아 독성을 일으키지 않기 때문에, 변형된 NRTIs가 원래의 NRTIs보다 더 안전(미토콘드리아 독성이 감소 또는 제거)할 것으로 기대된다.
도 94는, EGFP 리포터가 성공적인 역전사 및 인간 LINE-1 레트로전이의 통합시에만 발현되는 L1 레트로전이 분석의 결과를 나타낸다. 카무부딘이 아닌 NRTIs는 L1 레트로전이를 차단하여 RNA-의존성 DNA 중합효소 활성을 차단하지 못함을 나타낸다. 이러한 사실은 새로운 치료제로서의 뉴클레오시드 유사체의 합리적인 재설계 및 개선을 위한 길을 열어준다. 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 세포 배양 L1 레트로전이분석은 HeLa 세포에서 수행되었다. 세포는 부형체 (RPS) 또는 NRTIs (d4T, AZT 또는 3TC) 또는 메톡시-NRTIs (Me-d4T, 2Me-d4T, Me-AZT, 2Me-AZT, 3Me-3TC, 2Et-d4T, 2Et-AZT 또는 3Et-3TC)의 존재하에 EGFP 리포터로 표지된 활성 L1 서열을 발현하는 플라스미드로 형질 감염되었다. 형질 감염된 세포는 퓨로마이신에서 선택되었다. 형질 감염 7일 후, 역전이된 세포 (EGFP-양성)를 유세포 분석법(flow cytometry)으로 분석하였다. 세포는 레트로전이를 폐지하는 L1-ORF1에서 2점 돌연변이를 갖는 플라스미드 JM111의 배경 형광에 기초하여 게이팅(gate)되었다. 데이터는 RPS를 1로 설정하여 표준화되었다. 이들 데이터는 NRTIs가 내인성 L1 활성을 저해함을 나타내지만, 변형된 NRTIs는 세포의 자연적 L1 활성을 간섭하지 않는다. 3Et-3TC는 자연적인 L1 활성에 대해 일부 잔류 간섭을 갖는 반면, 다른 카무부딘 (변형된 NRTIs)은 L1 활성에 영향을 미치지 않는다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 하기 목록에 기재된 참고 문헌을 포함하여 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 편입된 것과 동일한 정도로 본 발명에서 참고로 포함된다.
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당업자는 추가의 실시형태 또는 구현예가 본 발명의 교시 또는 이하의 특허청구범위를 벗어나지 않고 가능하다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 상세한 설명, 및 특히 본 명세서에 개시된 예시적인 실시형태 및 구현예의 특정 세부 사항은 주로 이해의 명확성을 위해 주어지며, 당업자라면 본 명세서를 읽고 특허청구된 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 변경할 수 있기 때문에, 이로부터 불필요한 제한이 있는 것으로 이해해서는 안 된다.

Claims (29)

  1. 하기 화학식을 갖는 화합물:
    Figure pct00042

    상기 식에서,
    R1은 공유결합, H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고;
    R2는 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고;
    R4는 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로부터 선택되고;
    R5는 C, CH 및 S로부터 선택되고;
    R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R7은 H, 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제 1항에 있어서, R1이 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, R1이 공유결합, H 및 -CH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나에 있어서, R2가 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나에 있어서, R2가 -N(R3)2이고, 여기서 각 R3은 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 분지된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 화합물.
  6. 제 5항에 있어서, 각 R3가 H, CH3, 에틸, 부틸, t-부틸, 이소부틸, 프로필, 2-메틸프로필, 이소프로필, 펜틸 및 헥실로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 화합물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나에 있어서, R4가 -CH3 및 에틸로부터 선택되는 화합물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나에 있어서, R6은 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나에 있어서, R6가 -N=N+=NH 및 N3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나에 있어서, R7이 에틸, 부틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나에 있어서, R7이 -CH2-O-CH3, -CH3, =CH2, -CH2-NH2 및 -CH2-N=N+=NH로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나에 있어서, R7이 -CH2-O-R8이고, 여기서 R8은 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 아실, 알콕실, 아실옥실 및 아실아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  13. 제 12항에 있어서, R8이 -CH3, 에틸, 프로필, 2-메틸프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸, 및 헥실로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 뉴클레오시드 역전사 효소 억제제(NRTI)인 화합물.
  15. 제 14항에 있어서, 화합물이 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NRTI)의 포스포릴화-무력 뉴클레오시드 유사체인 화합물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적으로 허용되는 염.
  17. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물 및 약학적으로 허용되는 이들의 염:
    Figure pct00043
    ,
    Figure pct00044
    ,
    Figure pct00045
    ,
    Figure pct00046
    ,
    Figure pct00047
    ,
    Figure pct00048
    ,
    Figure pct00049
    ,
    Figure pct00050

    Figure pct00051
    ,
    Figure pct00052
    .
  18. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물 및 약학적으로 허용되는 이들의 염:
    Figure pct00053
    ,
    Figure pct00054
    ,
    Figure pct00055
    ,
    Figure pct00056
    .
  19. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물 및 약학적으로 허용되는 이들의 염:
    Figure pct00057

    Figure pct00058

    Figure pct00059

    Figure pct00060
    또는
    Figure pct00061
  20. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물 및 약학적으로 허용되는 이들의 염:
    Figure pct00062

    Figure pct00063

    Figure pct00064

    Figure pct00065

    Figure pct00066
    또는
    Figure pct00067
    .
  21. 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물 및 약학적으로 허용되는 이들의 염:
    Figure pct00068

    Figure pct00069

    Figure pct00070

    Figure pct00071

    Figure pct00072

    Figure pct00073

    Figure pct00074

    Figure pct00075

    Figure pct00076
    Figure pct00077
    Figure pct00078
    Figure pct00079
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나에 따른 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 제 22항의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 망막 손상을 치료하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 제 22항의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포와 관련된 Alu RNA에 의해 인플라마솜 활성화를 억제하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 인플라마솜이 NLRP3 인플라마솜, IL-1베타 인플라마솜 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 제 22항의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포의 ATP-유도 투과성을 감소시키는 방법.
  27. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 제 22항의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 양을 감소시키는 방법.
  28. 제 23항 내지 제 27항 중 어느 하나에 있어서, 세포가 망막색소 상피세포, 망막 광수용체 세포, 맥락막 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나에 따른 화합물 및 제 22항에 따른 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 하기에서 선택된 질환을 치료하는 방법:
    건조한 연령-관련 건식 황반변성(AMD) 및 습윤 AMD를 포함하는 망막 손상 및/또는 변성과 관련된 질환, 류마티스성 관절염 및 반응성 관절염을 포함하는 다양한 형태의 관절염, 당뇨병, 만성 폐색성 폐질환, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 뒤시엔느 근육디스트로피, 이식편대 숙주질환, 만성 통증, 증식성 유리체 망막병증, 녹내장, 다발성 경화증, 양극성 장애, 주요 우울 장애, 신장 섬유증, 신장증, 폐 섬유증, 헌팅턴 병, 골다공증, 만성 림프성 백혈병, 불안 장애, 폐결핵, 갱년기 여성 및 골절 환자에서의 골다공증, 전신성 홍반성 루푸스, 원반 모양 홍반성 루푸스, 만성 염증성 및 신경병성 통증, 상 염색체 우성 다낭 신질환, 척수 손상, 알츠하이머병, 신경병성 통증, 고혈압, 정맥류, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 통풍, 자가 면역성 간염, 이식편 혈관 손상, 죽상 동맥 경화증, 혈전증, 대사증후군, 타액선 염증, 외상성 뇌손상, 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌졸중, 파킨슨병, 흑색종, 신경 모세포종, 전립선암, 유방암, 피부암 및 갑상선암, 관상 조기 위암, 신경내분비 암, 유점액 결장암, 대장암; 고급 유성판 세포종, 신장세포 암종, 미분화 난소암종, 유두내 낭종성 유방암, 그램음성 패혈증, 감염성 녹농균, 비브리오 콜레라, 레지오넬라 종, 프란시셀라 종, 및 리슈만편모충 종, 클라미디아 종, 극저온증; 각막염, 여드름, 크론병, 궤양성 대장염, 인슐린 저항성, 비만, 용혈성 요독 증후군, 폴리오마 바이러스 감염, 면역복합체 신장질환, 급성 관상손상, 루푸스 신염, 가족성 차가운자가 염증 증후군, 머클-웰스 증후군 및 신생아 기형 다계통 염증성 질환, 만성 영아신경학적 피부 및 관절의 자가염증성 질환, 신장허혈-재관류 손상, 사구체 신염, 저온 글로빈혈증, 전신혈관염, IgA 신병증, 말라리아, 헬민스 기생충, 패혈증성 쇼크, 알레르기성 천식, 건초열, 약물유발 폐염증, 접촉성 피부염, 나병, 부르콜데리아 세노세파시아 감염, 호흡기 동기화 바이러스 감염, 건선, 경피증, 낭포성 섬유증, 매독, 쇼그렌 증후군, 염증성 관절질환, 비알콜성 지방간 질환, 심장수술(수술근처/수술후 염증), 급성 및 만성 장기이식 거부, 급성 및 만성골수이식 거부, 종양 혈관신생, 근위축성 측삭 경화증, 및 자폐증 스펙트럼 장애.
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