JP6689280B2 - リアルタイムなインビボ分子分析のための装置 - Google Patents

Description

本発明は、リアルタイムなインビボ分子分析のための装置に関する。

本発明の分野は、有機生命体の細胞を分析する分野である。

病変を早期に診断することは、外科医や臨床医にとって極めて重要な工程である。診断により、可能な限り迅速に、患者（人間又は動物）の生理病理学的状態について明確な判断を下すべきである。この工程は、患者に対して更なる合併症を生じることなく、患者への被害を最小限に抑えるように、あまり時間をかけずに行われるべきである。

２５年の間に、特に核磁気共鳴画像法、スキャナ、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）又は副鼻腔撮影法といった非侵襲的診断器具が幾つか開発されている。これらの技術は、組織の観点から、がんの領域のような異常領域の観察、場所の特定及び大きさの判定をするのに有効である。これらの技術の中には、こうした領域内での新たな血管の生成（血管新生）や細胞異化のような、より具体的な情報を与えるものもある。

しかしながら、これらの技術はいずれも、対象領域の分子含有量に関する情報を与えることはできない。この情報は、特に、病変の診断や予後を伝える際にも欠けてしまう。病院内で非常に広く用いられている方針は、形態学的特徴、細胞的特徴、組織的特徴、又は分子的特徴を求めるために異常領域中の組織を切除し（生検）、その後、特に組織学的技術（例えば病理解剖検査）といった他の技術により、組織に対してエクスビボ分析を行うことである。がんの範囲においては、そのような慣習により、悪性腫瘍の存在を確認可能にし、その組織学的分類（種類、等級）が得られる。ある病変のマーカーや特定の変異を探す目的で、診断を得るために、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はＰＣＲ技術といった、より対象が絞られた他の技術が適用されることもある。

この方針は広く用いられているが、時間がかかる場合があり、この間、患者は自身の診断を待ちつつ手術室に取り残されてしまう。従って、インビボ分子情報の収集が可能な技術を開発することへの強い関心がある。求められる装置は、手術室にいる間、リアルタイムにこのインビボ情報を得ることが可能であるべきである。

インビボ分子情報の取得を可能とし得る技術のうち、分光技術に対する需要が存在する。ラマン分光法、赤外分光法及び蛍光分光法は、これらの基準を満たす技術である。しかしながら、これらの技術は、対象の領域を見るのにトレーサーを使用する必要があるか、又は複雑なプロファイル（つまり、各分子が、分析した領域において複雑なスペクトルを有し、分析した細胞領域のスペクトルが、その領域を構成する分子のスペクトル全体の重なりである）を収集する必要がある、という欠点を有し、正常領域と病変領域との間の分子変異の観察を必ずしも可能としないため、極めて複雑な統計処理操作を使用する必要がある。

他方、他の分光法である質量分析法は、リアルタイムでの迅速なインビボ診断に対する需要を満たし得る。質量分析法は、種の分子量を測定することに基づく技術である。従来、質量測定は、図を用いて、機器のイオン生成ソースによって（インビトロ）試料から気相イオンを生成し、分析部にて、形成されたイオンを比率ｍ／ｚに従って分離し、その後イオン電流を検出することで行われる。分析された試料は固体、液体又は気体であり得る。しかしながら、使用されるイオンソースは、試料の状態に適合されるであろう。複雑な混合物であっても、質量分析法は、化合物が同一の分子式を有する場合又は機器の性能が不十分である場合を除き、種をｍ／ｚに従って分離するため、各種に対するシグナルの観察が可能という利点をもたらす。歴史的には、質量分析法は、イオン生成ソース及び分析部のための様々な技術の登場に至り、それらのソースと分析部とを様々な形で互いに組み合わせることによって、分析し得る化合物、試料の状態及び機器の性能に関して規定される特徴を持った機器を作成することが可能である。より最近では、質量分析技術は進化してきており、インビトロでの抽出物の分析から、エクスビボでの有機体又は有機体部分の分析への変遷を可能にする。これらの技術の発展は、質量顕微鏡法という名の新たな研究分野の登場に貢献してきている。現在、互換性のためにこの分野において現時点で使用されているイオン生成ソースは、所謂二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）生成ソース、レーザー脱離イオン化法（ＬＤＩ）ソース、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）ソース、脱離エレクトロスプレーイオン化法ソース（ＤＥＳＩ）及びレーザーアブレーション誘導結合プラズマ法（ＬＡ−ＩＣＰ）である。そういったこれらの技術は、エクスビボでの有機体又は有機体部分の分析を可能とし、これらに対して分子的特徴付けを可能にするが、有機生命体に対してはインビボで使用することができない。

実際に、「脱離エレクトロスプレーイオン化法」の略であるＤＥＳＩの場合は、電子噴霧処理によって生成された溶媒の、荷電液滴のジェットが、試料の表面に導かれる。液滴は、液滴と表面との相互作用の間に表面分子を捕捉する過程を伴って、試料の表面で跳ね返る。分子は、質量分析計に入るようになっているキャピラリーによって吸引される。ＤＥＳＩソースは、組織や臓器といった複数の生物試料に有用であることが示されている。このことは非特許文献１の記事に例示されており、ＤＥＳＩが従来のインビボ画像法と組み合わされている。インビボでのＤＥＳＩの使用を試みるために、機器の変更が行われた（非特許文献２）。この場合、加圧された溶媒ジェットが組織上に導かれる。ジェットは、ジェットによって生成された荷電分子を質量分析計に向けて確実に運ぶことを可能にする移送チューブ内に位置付けられる。この機器は、インビボで使用するにも関わらず、分析すべき領域との接触を必要とする。表面を連続して分析すると、生物組織の特徴付けに対して汚染の影響を引き起こすことがある。

この問題を回避するための解決策は脱離法としてのレーザーアブレーションである（非特許文献３及び４）。電子噴霧溶媒ジェットによってアブレートされた分子の捕捉を続けて行うレーザーアブレーション技術は、ＬＡＥＳＩ（「レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化」）という略称で知られる技術であり、同チーム及びＫ．Ｍｕｒｒａｙ教授のチームによって同年（２００７年）に導入された。アブレーションは、赤外領域で出射するパルスレーザーによって実現される。アブレートされた分子は、エレクトロスプレージェットによってイオン化され、質量分析計の入口に向けて移送される。利点は、水のような、空間分解能の低い生物分子が豊富に励起されることにある。この技術は有機生命体に対してすでに使用されていた。この技術は小型化が困難であり、また、インビボでの使用に焦点を当てた場合に欠点を含む溶媒を使用する必要がある。

本装置及び特にメス（手動、電気等、その性質は無関係）に頼る装置の場合、侵襲的技術は考慮しない。

特許文献１には、ＬＡＥＳＩ技術に基づくエクスビボ３Ｄ分子画像法が教示されている。ＬＡＥＳＩ法では、分子をアブレートするのに赤外レーザーが使用される。アブレートされた分子は、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）によるイオン化によって生成された有機溶媒の荷電液滴のジェットにより捕捉され、その後電場を用いて、インターフェースを介して質量分析計に向けて運ばれる。ここでは、アブレートした材料は、分析をするために、電場の印加と同様、インビボでの使用と互換性のない、有機溶媒の液滴のジェットにより捕捉されるべきである。
ＬＡＥＳＩ技術に使用される装置は基本的にエクスビボでの使用のために設計されているため、ここでの装置はインビボでの使用のための構造をもつことから互換性がない。

特許文献２は、上の文献に関連し、ＬＡＤＣ（レーザーアブレーション液滴捕捉）技術に基づくエクスビボ分析法を有する。ここでは、試料は表面から脱離されて、その後アブレーション点上のキャピラリー内の溶媒に捕捉される。従って、分析すべき試料は、質量分析部に移送される前に、溶媒中に溶解する。試料が分析部に達するのにかかる時間及び移送中の材料に起こり得る損失のために、この装置についてはリアルタイム分析を考えることはできない。

特許文献３では、組織をリアルタイムにインビボ分析するためのシステムが提案されている。分析すべき組織のアブレーションは、電極又は電気メスによって実現される。従って、これは侵襲法である。

非特許文献５である記事では、多様な種類のがんに対する診断又は外科手術の範囲内での、生物組織のためのＩｎ−Ｓｉｔｕ分析法が議論されている。装置は、イオン化ソースを介して質量分析計と接続されている移送チューブと連結されたレーザーからなる。第一に、イオン化ソースは、高分子量を有する分子を損傷させるという欠点を有する。第二に、この装置はＩｎ−Ｓｉｔｕ分析を可能にするように大型であるため、インビボ分析に適合しない。第三に、対象の情報をリアルタイムに提供することができない。

米国特許出願公開第２０１０／００１２８３１号明細書 米国特許第７，９１０，８８１号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０１５６７１２号明細書

Calligaris D外、J Mass Spectrometry、２０１３年、第４８巻、第（ＩＩ）号、p.1178−87 Chen CH外、Anal. Chem.、２０１３年、第８５巻、第２４号、p.１1843−50 Nemes P、Vertes A、Anal. Chem.、２００７年、第７９巻、第２１号、p.8098−106 Park SG、Murray KK、J. Am. Soc. Mass Spectrom.、２０１１年、第２２巻、第８号、p.1352−62 「In Situ, Real-Time Identification of Biological Tissues by Ultraviolet and Infrared Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry」、Anal. Chem.、２０１１年、第８３巻、p.1632−40 Gonzalez-Mertinez外、「Robot-assisted stereoactic laser ablation in medically intractable epilepsy: operating technique」、Neurosurgery、２０１４年、suppl 2、p.167−172

従って、本発明の第一の目的は、質量分析法に基づき、生物材料をインビボでリアルタイムに分析するための装置を開発することである。

本発明によれば、生物材料の分子分析のための装置は、
任意選択で光パラメトリック発振器により補助され、２．５μｍ〜１２μｍの波長を出射するように構成され、そのように構成されるレーザー（３４）が、荷電を帯びた及び／又は荷電を帯びていない粒子を放出することにより生物材料をアブレートするように意図されているレーザーと、
質量分析計と、
プローブであって、
レーザーに接続された少なくとも１つの第１の分析ファイバーと、
質量分析計に接続された移送チューブと、
を含むプローブと、
を備える。

すなわち、これによって、インビボ分析に適合する小型化された機器が利用可能になる。

本発明の要旨における分析とは、現時点（診断）又は未来の時点（予後）における、患者の生理学的状態に関する情報の可能性を与える分子データを得ることをいう。これらの分子データは、患者から直接生じてもよいし、患者の共生有機体（ウィルス、バクテリア等）から生じてもよい。

分析ファイバーが、アブレーションレーザーに接続されている。

例として、アブレーションレーザーの波長は、２．８μｍ〜３．２μｍであってもよい。より一般的には、レーザーは、任意選択で光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）により補助され、２．５μｍ〜１２μｍの波長を提供するように構成されている。

移送チューブが、質量分析計に接続されている。

装置の更なる特徴によれば、レーザーは、エネルギーが２ｍＪ／パルス〜１５ｍＪ／パルスであり、表面が３０μｍ^２〜３ｍｍ^２であるビームを生成するように構成されたパルスレーザーである。更なる特徴によれば、イオンを集束及び移送するためのシステムが、移送チューブと質量分析計との間に置かれている。

別の更なる特徴によれば、有利には非常に薄い金属グリッドが移送チューブと質量分析計との間に導入されている。

このグリッドは、イオンの生成を増加させることによって分析の感度を増加することが可能である点で有利である。

本発明の別の更なる特徴によれば、噴霧キャピラリーが減圧キャピラリーに接続されている。

そして、噴霧キャピラリーは溶媒分配手段に接続されている。

第２の分析ファイバーを設けることを要する場合がある。

本発明によれば、装置は、レーザー治療のための治療ファイバーを更に含む。

有利には、治療ファイバーは、細胞を破壊するのに適した波長のレーザーに接続される。

システムの利点は、分析システムと治療システムのそれとを組み合わせることが可能なことである。分析部を通じて得られた結果に応じて、組織を治療ファイバーで処理してもよい。

特定の実施例によれば、プローブは照明チャンネルと撮像チャンネルとを更に含む。

この実施例は、特に内視鏡としての使用にとりわけ適している。

本発明は、下記を例示する添付の図を参照して、例示として与えられた代表的な実施例に従う記載の範囲内で、より詳細に表されるであろう。

本発明の第１の実施例に係るプローブの斜視図を示す。 本発明に係る、内視鏡プローブの斜視図を示す。 このプローブが、その適用に必要な設備に接続されている図を示す。 プローブを質量分析計に接続する移送ラインの図を示す。 エクスビボの生物組織、特に牛の肝臓の分析に関する分光図を示し、より詳細には、図５ａは、取得期間全体に亘る合計のイオン電流を示し、図５ｂはレーザー照射期間に得られたスペクトルを示す。 ラットの肝臓と脳との間の、エクスビボ分析の比較を示し、より詳細には、図６ａは肝臓について得られた結果を示し、図６ｂは脳について得られた結果を示す。 犬のリンパ腫のがん生検の分析を示す。 デジタルインプリントの分析であって、男／女の比較（指についてのインビボ分析）を示す。

幾つかの図に示される要素には、単一かつ同一の参照符合が付されている。

図１を参照すると、この場合患者の皮膚（しかしこれは臓器の場合も大いにあり得る）である分析すべき生物材料Ｐに略接触している、本発明に係るプローブが例示されている。

プローブＳは、分析ファイバーＡ及び移送チューブＴが現れるシリンダーとして現れる。これらの要素の両方は、分析すべき生物材料に近付くプローブの前面と面一である。これらの要素の機能は後に説明される。

これは、肌や髪、爪の外部分析又は開腹手術中の臓器の内部分析を行うことを可能にする、本発明の基礎にある実施例である。

本発明の開発によれば、プローブは実際に追加の要素を含む内視鏡プローブである。

図２を参照すると、内視鏡プローブ１０は、ここでは軸方向凹部１１を有するシリンダーとして現れる。

内視鏡プローブ１０は、図中で視認可能な分析面又は前面を有し、また、図には現れない後面である反対面も有する。

事実上の凹部１１も円筒形であり、移送チューブ２１がその中に挿入されている。この移送チューブの詳細は後で更に述べられる。

凹部１１と並列に幾つかの要素が配置されており、これらもまた円筒形である。

第一に、光ファイバーといった照明チャンネル１２が後面上に開口しており、不図示の照明装置に接続される。

第二に、撮像チャンネル１３が、照明チャンネル１２の近くに位置付けられている。撮像チャンネル１３は、カメラといった撮像装置を含み、後面上への出力はビデオリンク２３を通して実現される。

第三に、分析面に面一な第１の光学分析ファイバー１４が後面上に開口している。第１の光学分析ファイバー１４の接続は以下に説明される。

有利には、第２の光学分析ファイバー１５も後面上に開口して設けられていてもよい。

プローブがレーザー治療による処置にも使用される場合、プローブは、後面上に開口するレーザー治療ファイバー１６を更に含む。

図３を参照して、プローブ１０の様々な接続について説明する。

照明チャンネル１２は、照明装置３２に接続されている。

ビデオリンク２３は、閲覧画面３３に接続されている。

移送チューブ２１は、質量分析計３１に接続されている。この接続の詳細は後に提供される。

移送チューブは、アブレートした材料を、分析ファイバーを通して効率的に移送するのを確実にするように、吸収現象の最小化を図る材料からなることが好ましい。この材料は、例えばＰＴＦＥである。

第１の分析ファイバー１４は第１のアブレーションレーザー３４に接続されている。このレーザー３４は、照射を行うことで気相の荷電粒子（分子イオン）及び／又は非荷電粒子を放出させる、組織をサンプリングする機能を有する。

このレーザーの波長は、赤外から紫外に至る領域、好ましくは赤外領域から選択されてもよい。

このレーザーは、例えば２．８μｍ〜３．２μｍの波長をもつレーザー、典型的には２．９４μｍの波長を出射するエルビウムヤグレーザーである。

また、
ネオジウムヤグレーザー：１．０６４μｍ；０．５３２μｍ；０．３５５μｍ；０．２６６μｍ
Ｘｅ−Ｎｅレーザー：２μｍ〜４μｍ
ＨＦ（フッ化水素）レーザー：２．６μｍ
ビスマス、ツリウム又はホルミウムでドープしたイッテルビウム型のファイバーレーザー：１．０７μｍ〜２．１μｍ
であってもよい。

これらのレーザーは、直接の放出ソースであってもよいし、ＯＰＯ（光パラメトリック発振器）と連結されていてもよい。ＯＰＯにより、ある波長のレーザー波からより長い波長をもつ２つの波を生成することが実質的に可能となる。従って、これにより、アブレートすべき生物材料によって見られる、対象のレーザーに使用され得る波長領域を広げることを可能にする。

一般に、２．５μｍ〜１２μｍの波長領域を網羅することが求められる。実際に、この波長領域では、アブレートすべき生物材料に存在し得るＯ−Ｈ、Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｎ及びＣ−Ｃ結合の吸収バンドを網羅している。

特に、この２．５μｍ〜１２μｍの波長領域では、レーザーは、気相の荷電粒子、特に分子イオンを少なくとも生成することによって生物材料のアブレートを可能にする。

しかしながら、２．５μｍ〜３．５μｍの波長領域に限定することも可能である。実際に、この波長領域では、Ｏ−Ｈ、Ｎ−Ｈ及びＣ−Ｈ結合の吸収バンドを網羅している。

２．８μｍ〜３．２μｍの、より限定された波長領域に限定することも可能である。実際に、この波長領域では、Ｏ−Ｈ及びＮ−Ｈ結合の吸収バンドを網羅している。

更に、アブレーションレーザー３４は、有利にはエネルギーが２ｍＪ／パルス〜１５ｍＪ／パルスであるビームであって、（集束している）ビームの表面は３０μｍ^２〜３ｍｍ^２であるビームを生成するために構成されたパルスレーザーであれば有利であろう。

ビームのエネルギーは５ｍＪ／パルス〜１２ｍＪ／パルス、更には５ｍＪ／パルス〜１０ｍＪ／パルスであり、（集束している）ビームの表面積は３０μｍ^２〜３ｍｍ^２である。

先に考察されたエネルギー領域について、レーザービームは、１００μｍ^２〜３ｍｍ^２、１０^−３ｍｍ^２〜３ｍｍ^２、１０^−２ｍｍ^２〜３ｍｍ^２、１０^−１ｍｍ^２〜３ｍｍ^２、０．５ｍｍ^２〜３ｍｍ^２又は０．５ｍｍ^２〜２ｍｍ^２の表面積を更に有してもよい。特に、レーザービームは、典型的には、底面が１ｍｍ^２のオーダーである一定体積の生物材料をアブレートしてもよく、これは表面積又は集束も１ｍｍ^２のオーダーであるビームに略対応する。

本発明者らは、この、アブレーションレーザー３４のパルスにより提供されるエネルギー及びこの（集束している）ビームの表面積の選択によって分子イオンが確実により効率よく生成され、従って、先述のようにレーザーの波長領域を選択することで相乗効果がもたらされることを実際に確認することができた。

更に、レーザービームの光侵達長は、典型的には１レーザーパルスあたり数ミクロンであることに注目されたい。

第２の診断ファイバーが設けられる場合、第１のそれとは異なる種類の第２のアブレーションレーザーに接続される。これにより診断の可能性が増加する。０．５３２μｍの波長のネオジウムヤグレーザーを例として説明する。また、２．５μｍ〜３．５μｍの領域で動作するＯＰＯと任意で連結した別のレーザーも例として説明する。有利には、この第２の分析ファイバーは、分析の可能性の増加を可能にする。

こうして放出された粒子は移送チューブ２１によって管理され、質量分析計３１に送られる。

レーザー治療ファイバー１６は治療レーザー３６に接続されている。実際には、先に行われた分析により組織の処置が必要だと判明した場合、追加の設備を一切使用することなく直ちに処置が行われる。従って、例えば非特許文献６で提案されているような、９８０ｎｍで出射するレーザー（レーザーダイオード）を治療に使用することができる。

図４を参照して、プローブ１０と質量分析計３１との間の接続例を詳説する。

移送チューブ２１は、減圧キャピラリー４１がプローブ１０の反対側にある状態で延長される。キャピラリーは、金属キャピラリーであることが好ましい。キャピラリーは、移送チューブ２１よりも小さい内径を有する。これにより、粒子の加速を誘起する、質量分析計３１の減圧を強めることが可能になる。このキャピラリー４１が金属キャピラリーである場合、このキャピラリーと質量分析計３１の入口との間に電位差を生成するための電場を生成することができる。

減圧キャピラリー４１は、質量分析計３１内で統合される、イオンを集束及び移送するためのシステム４２と共に、質量分析計の入口で延長されている。

或いは、このシステム４２は、荷電粒子又は非荷電粒子の経路を参照して、質量分析計の外側、つまりその上流に位置付けられてもよい。

更に或いは、このシステム４２は、イオンを集束するためのシステム又はイオンを移送するためのシステムであってもよい。

このシステム４２は、荷電粒子を含むエアゾールを導くが、質量分析計には導かないことを可能にする。

移送チューブ２１には、温度を上昇させるための加熱手段４４が設けられてもよい。

減圧キャピラリー４１に接続される噴霧キャピラリー４５を設けることもできる。この噴霧キャピラリー４５には溶媒分配器４６が供給される。分配器４６を制御するための制御部材４７が設けられ、溶媒流速を所望のものにする。この溶媒は、荷電分子（分子イオン）の生成収率を増加させるように、従来のエレクトロスプレー処理の再現を可能にする。この場所に溶媒を導入する利点は、使用者と生物組織との両方に対して毒性が無いことである。

しかしながら、これは１つの選択肢として提案されているに過ぎない。また、溶媒分配手段に接続されたエレクトロスプレー手段が、移送チューブＴ、２１と質量分析計３１との間に設けられていない場合を考えることも可能である。実際、本発明の利点は、生物材料のアブレーション処理により、質量分析計を用いて、少なくとも後の分析に充分な量の荷電粒子（分子イオン）を放出することを可能にするという点である。

更に、減圧キャピラリーに接続される分配キャピラリーを設けることも可能である。この分配キャピラリーは、ＧＨ＋イオンを含有するガス分配器によって供給される。これにより、衝突によって移動陽子を分析すべき粒子に誘起し、それによってイオン生成の収率の増加を可能にする。この場合は、添付の図には例示されていないが、この分配キャピラリー及びガス分配器の実装はそれぞれ、エレクトロスプレーキャピラリー４５及び溶媒分配器４６の実装と同様であってもよい。

しかしながら、これは１つの選択肢として提案されているに過ぎない。実際に、ガス分配器に接続された分配キャピラリーが、移送チューブＴ、２１と質量分析計３１との間に設けられていない場合を考えてもよい。実際、且つ、備忘として、本発明の利点は、生物材料のアブレーション処理により、質量分析計によって、少なくとも後の分析に充分な量の荷電粒子（分子イオン）を放出することを可能にするという点である。

金属グリッド４８をプローブ１０から質量分析計３１へ向かう移送ラインに設けることもできる。

このグリッドは、例えば図４に示すように、移送チューブ２１と減圧キャピラリー４１との間に位置付けられている。

これは、電子顕微鏡において使用される種類の極めて薄いグリッドである。その機能は、アブレーションレーザー３４から放出された粒子又は凝集粒子を分解し、最終的に質量分析計３１のために加速させることである。このグリッド４８は、その幾つかが移送チューブＴ、２１内でイオンの形態をもつ分子は分解しないが、より大きな粒子は分解する。

質量分析計は従来、各部を以下の順序で備える：
ソース
イオンを移送及び集束するためのシステム
少なくとも１つの質量分析部。

また、質量分析計は検出システムも備える。

本発明の特定の実施例によれば、質量分析計はいかなるソースも含まず、移送チューブとその質量分析部との間に置かれた、イオンを集束及び／又は移送するための少なくとも１つのシステムを備える。

非限定的に、イオンを集束及び／又は移送するためのシステム、移送キャピラリー、スキマー、集束レンズ、多重極場をもつ移送システム、イオンファンネル又は静電レンズの例があってもよい。

質量分析計は、例えばイオン移動度システムといった、性能の向上を図る要素も含んでもよい。

可能な実施例によれば、イオンを集束及び移送するためのシステムは移送キャピラリーである。

分析計は、質量分析部４９を備える。使用する質量分析部は、いかなる種類でもよいが、単純（例えば単純磁場セクター型（Ｂ）又は二重集束型（ＢＥ型、ＥＢ型）、四重極型（Ｑ）、イオントラップ型（ＩＴ）、飛行時間型（ＴＯＦ）、イオンサイクロトロン共鳴型（ＣＩＲ）、オービトラップ型）であるか、複合型（例えばトリプル四重極型）又はハイブリッド型（例えばＱ−オービトラップ型、Ｑ−ＴＯＦ型）であるべきである。

或いは、使用する質量分析部はイオン（例えばイオン移動度）を分離するための別のシステムでもよい。

本発明を利用するにあたって考察した方法に取り掛かる。

本発明に係る装置は、分析すべき生物材料のサンプリングを可能にするレーザーアブレーション処理に基づいて動作する。これにより、（荷電又は非荷電の）気相の粒子が放出される。アブレートした材料は、移送チューブ２１を介して、リアルタイムに質量分析計３１へ運ばれる。実際には、このアブレーションに関するアブレーション処理及び粒子の放出は、移送チューブ内での通過時間と同様に短く、リアルタイムと描写されてもよい。これにより、分析する領域に特徴的な分子プロファイル（有機化合物、アミノ酸、代謝物質、脂質、ペプチド等の種類の生体分子に対応する生物材料を分析することで生じるシグナル）を収集することを可能にする。

有利には、これらのプロファイルは、本装置を使用することで得られる分子プロファイルのデータバンクと比較され、リアルタイムで情報を迅速に得ることが可能となる。

分子データのバンクは、病変の等級及び段階が異なる対象患者の生検に対して、本装置をエクスビボで使用することにより確立される。健康的な患者等からの一群の試料もデータバンクへと統合される。

しかしながら、別の方法でデータバンクを確立することも可能である。

特定の使用法によれば、がん領域内にあるかを判定するために、外科医は、患者の体表又は体内において、対象の生物材料の上でプローブを変位させ、これにより、患者への処置や、特に外科的に除去する必要のある領域を迅速に考慮することができる。これらの除去すべき領域は、有利には、本発明に係る装置の特定の実施例に係る治療ファイバーで除去してもよい。

本発明により、以下の結果を得ることが可能となった。
結果１： 生物組織のエクスビボ分析

ＬｉＮｂＯ_３の結晶を用いたＯＰＯシステム（２．５〜４．５μｍの波長で変化可能、ベルギー国マロンネ市所在のLaserSpec社製）に接続され、２９４０ｎｍの波長に調整された、１０Ｈｚのレーザー放射ナノ秒パルス（フランス国レ・ジュリス市所在のQuantel Easy Brillant社製）が使用される。テフロン（登録商標）移送チューブ（内径１０ｍｍ）が荷電粒子及び非荷電粒子を移送するために使用され、ソースが撤廃されたイオントラップ型の質量分析計に直接接続されている（ドイツ国ブレーメン市所在のBruker Daltonics社製HCT Ultra）。移送チューブ内の吸引流速の増加を図ったポンプを追加できるように、質量分析計のＮ_２が到達できないようにした。レーザー照射から生じる化合物の分析は、質量分析計を用いて、質量対電荷の比（ｍ／ｚ）の範囲が１５０〜１０００のネガティブモードにて行われている。

図５に示される第一の実験は、牛の肝臓の一片のエクスビボ分析である。この牛の肝臓に、１ｍｍ^２の面積に渡り７ｍＪ／レーザー照射が実現されている（１回のレーザー照射＝１つのレーザーパルス）。取得工程の間に３つのフェーズが選択され、レーザー照射がない第１工程と、レーザー照射のあるフェーズと、レーザー照射のない別のフェーズとであった。図５Ａには、取得期間全体に亘る合計のイオン電流が示され、図５Ｂには、レーザー照射期間に得られたスペクトルが示される。合計のイオン電流から、検出されたシグナルの存在がレーザー照射と相関していることが示される。従って、移送チューブの内壁に付着する化合物は存在せず、これによりリアルタイムで迅速な分析が示される。典型的には、分析時間は１秒未満である。

図６では、ラットの２つの臓器、脳及び肝臓について、各臓器からの取得に対して比較が行われている。各臓器の領域に渡り、７ｍＪ／レーザー照射で３０秒間照射した。図６はこれら２つの臓器間のｍ／ｚ比の差を示すものであり、ラットの肝臓と比較した際の、脳の分子組成の特異性が示される。図７では、犬のリンパ腫のがん生検の分析が行われている。この生検の領域に渡り、７ｍＪ／レーザー照射で３０秒間照射が行われている。記録されたスペクトルは、レーザー照射期間において選択されている。脂質、脂肪酸及びペプチドによる数個のシグナルに対応するシグナルの生成を示している。本発明は、テフロン（登録商標）チューブの壁を汚すことなくリアルタイムに分析を行うことのみならず、同じ動物から生じる異なる臓器間の分析を行うことを可能にする。異なる臓器に対して行われるリアルタイム分析により、かなりの数のシグナルが脂肪酸、代謝物質及び脂質に対応し得ることが示されている。図６を参照して、本発明は、調査した臓器及び生理学的状態（例えば健康的対発がん的）に基づく異なるプロファイルを検出する能力を有する。この分析の利点は、検出した分子の集団に大きな相違があることであり、分子プロファイルのデータバンクにのみならず生物組織の特徴付けにも、両方に対して重要な価値を付加し得る。
結果２：生物組織のインビボ分析

図８では、性別が異なる個人の皮膚の組織についてのインビボリアルタイム分析を、指に対して行っている。ＬｉＮｂＯ_３の結晶を用いたＯＰＯシステム（２．５〜４．５μｍの波長で変化可能、ベルギー国マロンネ市所在のLaserSpec社製）に接続され、２９４０ｎｍの波長に調整された、１０Ｈｚのレーザー放射ナノ秒パルス（フランス国レ・ジュリス市所在のQuantel Easy Brillant社製）を用いて、９ｍＪ／レーザー照射（１回のレーザー照射＝１つのレーザーパルス）が行われる。テフロン（登録商標）移送チューブ（内径１０ｍｍ）が荷電粒子及び非荷電粒子を移送するために使用され、ソースが取り外されたイオントラップ型の質量分析計に直接接続されている（ドイツ国ブレーメン市所在のBruker Daltonics社製HCT Ultra）。移送チューブ内の吸引流速の増加を図ったポンプを追加できるように、質量分析計のＮ_２が到達できないようにした。レーザー照射から生じる化合物の分析は、質量分析計を用いて、質量対電荷比（ｍ／ｚ）の範囲が１５０〜１０００のネガティブモードにて行われている。取得工程の間に３つのフェーズが選択され、レーザー照射がない第１工程と、レーザー照射のあるフェーズと、レーザー照射のない別のフェーズとであった。異なる個人の区別が、図８に見られる。本発明は、個人に対してリアルタイムにインビボ分析を行うことを可能にし、個人の性別に特有の分子プロファイルの観察を可能にする。この、個人に対するインビボ分析は、照射の際の数秒間の本発明の非侵襲且つ痛みを伴わない効果を示している。

本発明の別の利点は、実際に同一の点に対して数十秒間照射している間の、臓器への非侵襲効果である。分子プロファイルに基づき、本発明は生物組織の非常に縮小された領域（照射領域の直径４００μｍ）の区別に使用される。

また、本発明は、以下の工程を備えることを特徴とする、生物材料の分子分析のための方法に関している。
２．５μｍ〜１２μｍの波長のレーザービームを生物材料に向けて放射し、このビームと生物材料との間の相互作用により生物材料がアブレートされ、荷電粒子、特に分子イオンが少なくとも放出される工程と、
少なくともその荷電粒子を含むアブレートした生物材料を、移送チューブを介して質量分析計に向けて導く工程と、
アブレートした生物材料の組成を、質量分析計内で分析する工程。

この生物材料の分子分析方法はインビボで行ってもよい。

レーザービームは、２．５μｍ〜３．５μｍ、又は２．８μｍ〜３．２μｍの波長を有してもよい。

更に、レーザービームはパルス型であってもよく、２ｍＪ／パルス〜１５ｍＪ／パルス間のエネルギーを有してもよく、（集束している）ビームの表面は３０μｍ^２〜３ｍｍ^２であってもよい。

ビームのエネルギーは５ｍＪ／パルス〜１２ｍＪ／パルス、又は更に５ｍＪ／パルス〜１０ｍＪ／パルスであってもよく、（集束している）ビームの表面は３０μｍ^２〜３ｍｍ^２であってもよい。

先に考察されたエネルギー領域について、レーザービームは、１００μｍ^２〜３ｍｍ^２、１０^−３ｍｍ^２〜３ｍｍ^２、１０^−２ｍｍ^２〜３ｍｍ^２、１０^−１ｍｍ^２〜３ｍｍ^２、０．５ｍｍ^２〜３ｍｍ^２又は０．５ｍｍ^２〜２ｍｍ^２の表面積を更に有してもよい。特に、レーザービームは、典型的には、底面が１ｍｍ^２のオーダーのある体積の生物材料のアブレートを可能にし、これは１ｍｍ^２のオーダーであるビームにも略対応する。

更に、この方法は、アブレートした生物材料を加熱する工程を提供してもよい。

また、この方法は、アブレートした生物材料を、例えば金属グリッドであるグリッドでふるいにかける工程も提供してもよい。

なお、最後に、本発明は、荷電粒子及び／又は非荷電粒子を放出することによってその生物材料をアブレートするため、そしてとりわけ、荷電粒子、特に分子イオンを少なくとも放出することによってその生物材料をアブレートするための、本発明に係る分子分析装置の使用も提案する。

Claims (20)

1. 生物材料の分子分析装置であって、
   任意選択で光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）により補助される、２．５μｍ〜１２μｍの波長を出射するように構成されたレーザー（３４）であって、そのように構成されたレーザー（３４）が、少なくとも荷電粒子を放出することにより前記生物材料をアブレートするように意図されているレーザー（３４）と、
   質量分析計（３１）と、
   プローブ（Ｓ、１０）であって、
   前記レーザー（３４）に接続された少なくとも１つの第１の分析ファイバー（Ａ、１４）と、
   前記質量分析計（３１）に接続された移送チューブ（Ｔ、２１）と、
   を含むプローブと、
   を備えることを特徴とする分子分析装置。
2. 任意選択で光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）により補助される前記レーザー（３４）が、２．５μｍ〜３．５μｍの波長を出射するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
3. 任意選択で光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）により補助される前記レーザー（３４）が、２．８μｍ〜３．２μｍの波長を出射するように構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。
4. 前記レーザー（３４）が、エネルギーが２ｍＪ／パルス〜１５ｍＪ／パルスであり、且つ、表面が３０μｍ^２〜３ｍｍ^２であるビームを生成するように構成されたパルスレーザーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
5. 前記レーザー（３４）が、エネルギーが５ｍＪ／パルス〜１２ｍＪ／パルス、例えば５ｍＪ／パルス〜１０ｍＪ／パルスであり、且つ、表面が３０μｍ^２〜３ｍｍ^２であるビームを生成するように構成されたパルスレーザーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
6. 前記レーザー（３４）が、表面積が０．５ｍｍ^２〜２ｍｍ^２であるビームを生成するように構成されることを特徴とする請求項４又は５に記載の装置。
7. 生物材料のアブレーション中に形成されるようになっている分子イオンを集束及び／又は移送するためのシステム（４２）が、前記移送チューブ（Ｔ、２１）と前記質量分析計（３１）との間に介装されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
8. 前記集束及び／又は移送システム（４２）が移送キャピラリーであることを特徴とする請求項７に記載の装置。
9. 前記移送チューブ（Ｔ、２１）に加熱手段（４４）が設けられていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
10. 減圧キャピラリー（４１）が、前記移送チューブ（Ｔ、２１）と前記集束及び／又は移送システム（４２）との間に挿入され、この減圧キャピラリー（４１）の内径は、前記移送チューブ（Ｔ、２１）のそれよりも小さいことを特徴とする請求項７〜８のいずれか一項に記載の装置。
11. 前記減圧キャピラリー（４１）が金属キャピラリーであり、前記減圧キャピラリー（４１）と前記質量分析計（３１）との間に電位差を生成するための手段が設けられていることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
12. 金属グリッド（４８）が前記移送チューブ（Ｔ、２１）と前記質量分析計（３１）との間に導入されていることを特徴とする請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の装置。
13. エレクトロスプレーキャピラリー（４５）が前記減圧キャピラリー（４１）に接続され、更に溶媒を分配するための手段（４６）に接続されていることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の装置。
14. 溶媒を分配するための手段に接続されたエレクトロスプレーキャピラリーが、前記移送チューブ（Ｔ、２１）と前記質量分析計（３１）との間に設けられていないことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の装置。
15. 分配キャピラリーが前記減圧キャピラリーに接続され、更にガス分配器に接続されていることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の装置。
16. ガス分配器に接続された分配キャピラリーが、前記移送チューブ（Ｔ、２１）と前記質量分析計（３１）との間に設けられていないことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
17. 前記プローブ（Ｓ、１０）が第２の分析ファイバー（１５）を含むことを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の装置。
18. 前記プローブ（Ｓ、１０）が治療ファイバー（１６）を更に含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の装置。
19. 前記治療ファイバー（１６）が治療レーザー（３６）に接続されていることを特徴とする請求項１８に記載の装置。
20. 前記プローブ（Ｓ、１０）が照明チャンネル（１２）と撮像チャンネル（１３）とを更に含むことを特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載の装置。