ES2952390T3 - Dispositivo para análisis molecular en tiempo real in vivo - Google Patents

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Universite Lille 2 Droit et Sante
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Abstract

La invención se refiere a un dispositivo de análisis molecular de material biológico caracterizado porque incluye: - un láser (34) que utiliza opcionalmente un oscilador óptico paramétrico (OPO), configurado para emitir una longitud de onda entre 2,5 ym y 12 put, dicho láser configurado (34) estando destinado a extirpar dicho material biológico mediante la expulsión de partículas cargadas y/o no cargadas; - un espectrómetro de masas (31); y - una sonda (S, 10) que comprende al menos una primera fibra de análisis (A, 14), conectada al láser (34), y un tubo de transferencia (T, 21), conectado al espectrómetro de masas (31). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo para análisis molecular en tiempo real in vivo
La presente invención se refiere a un dispositivo de análisis molecular in vivo en tiempo real.
El campo de la invención es el del análisis de células de un organismo vivo.
El diagnóstico precoz de patologías es un paso crucial para cirujanos y médicos. El diagnóstico debe conducir a una decisión clara y lo más rápida posible sobre el estado fisiopatológico del paciente (humano o animal). Este paso debe llevarse a cabo en un corto período de tiempo y esto con un mínimo de daño para el paciente y sin causarle complicaciones adicionales.
Durante 25 años, se han desarrollado varias herramientas de diagnóstico no invasivas, como la toma de imágenes por resonancia magnética, el escáner, la tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) o la sinografía. Estas técnicas son efectivas para observar, localizar y determinar el tamaño de regiones anormales de tejido tales como regiones cancerosas. Algunas de estas técnicas incluso pueden dar información más precisa, como la producción de nuevos vasos sanguíneos dentro de estas regiones (neoangiogénesis) o el catabolismo celular.
Sin embargo, ninguna de estas técnicas tiene la capacidad de dar información sobre el contenido molecular de la región en cuestión. Esta información falta especialmente para hacer un diagnóstico o incluso un pronóstico de la patología. Una estrategia ampliamente empleada en el ámbito hospitalario es la escisión de tejido (biopsia) en la región anormal y luego efectuar análisis ex-vivo del tejido mediante diferentes técnicas y especialmente histológicas (por ejemplo, examen anatomopatológico) para buscar características morfológicas, celulares, tisulares o moleculares. En el contexto de los cánceres, tal práctica permite confirmar la presencia de tumores malignos y obtener su clasificación histológica (tipo, grado). Se pueden implementar otras técnicas más específicas para obtener un diagnóstico, como técnicas de inmunohistoquímica (IHC) o PCR para buscar marcadores específicos de la patología o mutaciones particulares.
Aunque esta estrategia es muy utilizada, puede ser larga, y dejar al paciente esperando en el quirófano a que le diagnostiquen. Por lo tanto, existe un interés real en el desarrollo de técnicas que permitan la recopilación de información molecular in vivo. El dispositivo deseado debe permitir obtener esta información in vivo, pero también en tiempo real mientras el paciente está en el quirófano.
Entre las técnicas que pueden permitir la obtención de información molecular in-vivo hay que avanzar hacia las técnicas espectroscópicas. La espectroscopia Raman, IR o de fluorescencia son técnicas que cumplen estos criterios. Ahora bien, estas técnicas presentan ciertos inconvenientes, que son, o bien la necesidad de utilizar un trazador para visualizar la región de interés, o la recogida de perfiles complejos (es decir, cada molécula presente en la región analizada da un espectro complejo y el espectro de la región celular analizada es una superposición de todos los espectros de las moléculas que componen la región) no siempre permitiendo observar variaciones moleculares entre una zona normal y una patológica y requiriendo la utilización de tratamientos estadísticos extremadamente complejos.
Por otro lado, otro método espectroscópico, la espectrometría de masas, puede satisfacer esta necesidad de diagnóstico rápido in vivo en tiempo real. La espectrometría de masas es una técnica basada en la medición del peso molecular de las especies. Convencionalmente, la medición de masa se efectúa de acuerdo con el patrón, la creación de iones en la fase gaseosa de la muestra (in vitro) por la fuente de producción de iones del instrumento, la separación de los iones formados de acuerdo con la relación m/z en la parte del analizador y luego la detección de la corriente de iones. Las muestras analizadas pueden ser sólidas, líquidas o gaseosas. Sin embargo, la fuente de iones utilizada se adaptará al estado en el que se encuentre la muestra. A partir de mezclas complejas, la espectrometría de masas ofrece la ventaja de permitir la observación de una señal para cada especie ya que estas se separan de acuerdo con m/z a menos que los compuestos tengan la misma fórmula molecular o si el desempeño del instrumento es insuficiente. Históricamente, la espectrometría de masas ha llevado al advenimiento de diferentes tecnologías para fuentes y analizadores de producción de iones, fuentes y analizadores que pueden combinarse entre sí de diferentes maneras para crear instrumentos con características definidas en términos de compuestos analizables, estado de la muestra, desempeño instrumental. Más recientemente, las técnicas de espectrometría de masas han evolucionado para permitir pasar del análisis de extractos in vitro al análisis de organismos o partes de organismos ex-vivo. El desarrollo de estas técnicas ha contribuido al advenimiento de una nueva área de investigación denominada obtención de imágenes por espectrometría de masas. Actualmente, las fuentes de producción de iones más utilizadas por ser compatibles en este campo son las denominadas fuentes de espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS, por sus siglas en inglés), fuentes de desorción/ionización láser (LDI, por sus siglas en inglés), fuentes de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés), fuentes de desorción/ionización por electronebulización (DESI, por sus siglas en inglés) y fuentes de ablación láser / plasma inducido (LA-ICP, por sus siglas en inglés). Estas tecnologías como tales permiten el análisis de organismos o parte de organismos ex-vivo, por lo que permiten la caracterización molecular, pero no se pueden emplear in vivo sobre organismos vivos.
De hecho, en el caso de DESI «para ionización por desorción con electropulverización» en inglés, un chorro de gotas de disolvente cargadas producidas por un proceso de electronebulización se dirige sobre la superficie de la muestra. Las gotas rebotarán en la superficie de la muestra con un proceso de captura de moléculas superficiales durante la fase de interacción de las gotas con la superficie. Las moléculas son succionadas por un capilar hacia la entrada del espectrómetro de masas. La fuente DESI tiene capacidades comprobadas para múltiples muestras biológicas, como tejidos u órganos. Esto se ilustra en el artículo de Calligaris D. et al, 2013, J Mass Spectrom, 48 (II), 1178-87 donde se combina DESI con imágenes convencionales in vivo. Se efectuó una modificación instrumental para intentar la utilización de DESI in vivo: Chen CH. et al, 2013, Anal. Chem. 85(24), 11843-50. En este caso, se dirige un chorro de disolvente a presión sobre el tejido. Este chorro se pone dentro de un tubo de transferencia que garantiza el transporte de las moléculas cargadas generadas por el chorro al espectrómetro de masas. A pesar de su utilización in vivo, este instrumento requiere contacto con el área que se ha de analizar. El análisis continuo de superficies puede inducir efectos de contaminación para la caracterización de tejidos biológicos.
Para circunscribir este problema, una solución es la ablación con láser como procedimiento de desorción: Nemes P., Vertes A., 2007 Anal Chem., 79(21), 8098-106 - Park SG, Murray KK, 2011 J Am Soc Mass Spectrom 22(8), 1352-62. El mismo equipo y el equipo de Pr. K. Murray el mismo año (2007) introdujeron una técnica de ablación con láser seguida de captura de las moléculas sometidas a ablación por un chorro de disolvente de electronebulización, una técnica conocida por el acrónimo LAESI (por «Ionización por electropulverización por ablación con láser» en inglés). La ablación se hace con un láser pulsado que emite en el intervalo del infrarrojo. Las moléculas sometidas a ablación se ionizan mediante un chorro de electronebulización y se transfieren a la entrada del espectrómetro de masas. La ventaja radica en la excitación de abundantes moléculas biológicas como el agua con baja resolución espacial. Esta técnica ya se ha utilizado para organismos vivos. Esta técnica es difícil de miniaturizar y requiere el empleo de un disolvente con los inconvenientes que esto conlleva de cara a su utilización industrial in vivo.
Se dejarán de lado las técnicas invasivas en el caso del presente dispositivo y especialmente las que implican bisturí cualquiera que sea su naturaleza (manual, eléctrica, etc.).
En el documento US 2010/0012831 se enseña un método de obtención de imagen molecular 3D ex-vivo basado en la técnica LAESI. En el método LAESI, se utiliza un láser infrarrojo para la ablación de las moléculas. Las moléculas sometidas a ablación son capturadas por un chorro de gotas de disolvente orgánico cargadas producidas por ionización por electronebulización (ESI) y luego transportadas al analizador de masas a través de una interfaz en que se utilizan campos eléctricos. En este caso, el material sometido a ablación, para ser analizado, tiene que ser capturado por un chorro de gotas de disolvente orgánico, lo que no es compatible con la utilización in vivo, como tampoco lo es la aplicación de un campo eléctrico. Los dispositivos utilizados para la técnica LAESI no son estructuralmente compatibles para utilización in vivo porque están diseñados esencialmente para utilización ex vivo.
El documento US 7,910,881 es similar al documento anterior y presenta un método de análisis ex vivo basado en la técnica LADC (Laser Ablation Droplet Capture, en inglés). En este caso, la muestra se desorbe de la superficie y luego se captura en un disolvente en un capilar por encima del punto de ablación. Por lo tanto, la muestra que se ha de analizar se disuelve en un disolvente antes de transferirla al espectrómetro de masas. El análisis en tiempo real no es posible con este dispositivo debido al tiempo que tarda la muestra en llegar al analizador y la posible pérdida de material durante la transferencia.
En el documento US 2012/0156712 se propone un sistema de análisis de tejidos in vivo en tiempo real. La ablación del tejido que se ha de analizar se hace mediante un electrodo o un bisturí eléctrico. Es, por lo tanto, un método invasivo.
El artículo «In situ, Real-Time Identification of Biological Tissues by Ultraviolet and Infrared Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry», Anal. Chem., 2011, 83, 1632-40, trata de un método de análisis in situ de tejidos biológicos en el contexto del diagnóstico o tratamiento quirúrgico de varios tipos de cáncer. El dispositivo está compuesto por un láser acoplado a un tubo de transferencia que está conectado a un espectrómetro de masas a través de una fuente de ionización. En primer lugar, esta fuente de ionización presenta el inconveniente de dañar las moléculas de alto peso molecular. En segundo lugar, este dispositivo es voluminoso por lo que, aunque permite el análisis in situ, no es adecuado para el análisis in vivo. En tercer lugar, no puede proporcionar información relevante en tiempo real.
En el documento DE 4200497 A1 se explica un dispositivo para analizar muestras de plástico sometidas a ablación por pirólisis con láser por medio de una sonda conectada a un espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas está configurado para atomizar las partículas sometidas a ablación.
En el documento WO 2014/079802 A2 se explica un dispositivo de espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente por ablación (LA-ICP-MS) en que se vaporizan y se atomizan partículas sometidas a ablación por medio de un plasma de argón llevado a una temperatura de 8000 °C.
En el documento US 2011/0215233 A1 se explica un sistema que permite implementar la técnica de ablación por láser seguida de captura de las moléculas sometidas a ablación por un chorro de disolvente de electronebulización.
La presente invención tiene, por tanto, como primer objeto el desarrollo de un dispositivo para el análisis de material biológico in vivo en tiempo real basado en espectrometría de masas.
Según la invención, un dispositivo para el análisis molecular de material biológico comprende:
• un láser, opcionalmente asistido por un oscilador paramétrico óptico, configurado para emitir una longitud de onda comprendida entre 2.5 μm y 12 μm, estando, por tanto, dicho láser configurado, para someter a ablación dicho material biológico mediante la expulsión de partículas cargadas y/o no cargadas;
• un espectrómetro de masas; y
• una sonda que comprende:
o al menos una primera fibra de análisis, y
o un tubo de transferencia,
estando conectada al menos dicha primera fibra de análisis (A, 14) al láser (34), estando conectado dicho tubo de transferencia al espectrómetro de masas.
Por tanto, se dispone de un instrumento miniaturizado adecuado para el análisis in vivo.
Por análisis, en el sentido de la invención, se entiende la obtención de datos moleculares que permitan proporcionar información sobre el estado fisiológico de un paciente en un momento t (diagnóstico) o futuro (pronóstico). Estos datos moleculares pueden provenir directamente del paciente, pero también de los organismos simbióticos del paciente (virus, bacterias, etc.)
La fibra de análisis está conectada a un láser de ablación.
A modo de ejemplo, la longitud de onda del láser de ablación puede estar entre 2.8 μm y 3.2 μm. Más generalmente, el láser está configurado para suministrar, opcionalmente con la ayuda de un oscilador paramétrico óptico (OPO), una longitud de onda comprendida entre 2.5 μm y 12 μm.
El tubo de transferencia está conectado a un espectrómetro de masas.
Según una característica adicional del dispositivo, el láser es un láser pulsado configurado para generar un haz cuya energía está entre 2 mJ/pulso y 15 mJ/pulso y la superficie entre 30 μm2 y 3 mm2. Según una característica adicional, se interpone un sistema de enfoque y de transferencia de iones entre dicho tubo de transferencia y el espectrómetro de masas.
Según otra característica adicional, se introduce una rejilla metálica, ventajosamente muy fina, entre el tubo de transferencia y el espectrómetro de masas.
Esta rejilla permite ventajosamente aumentar la sensibilidad del análisis aumentando la producción de iones.
Según otra característica adicional de la invención, al capilar de despresurización se le conecta un capilar de nebulización.
Por tanto, el capilar de nebulización está conectado a un medio de distribución de disolvente.
Puede ser necesario proporcionar una segunda fibra de análisis.
Según la invención, el dispositivo comprende así mismo una fibra terapéutica para terapia con láser.
Ventajosamente, la fibra de terapia está conectada a un láser con una longitud de onda adecuada para destruir las células. La ventaja del sistema es permitir la combinación de un sistema de análisis y un sistema de terapia. Dependiendo de los resultados obtenidos a través de la parte analítica, los tejidos pueden tratarse a través de la fibra de terapia. Según una realización particular, la sonda comprende así mismo un canal de iluminación y un canal de toma de imágenes.
Esta realización será particularmente adecuada para utilización endoscópica.
La presente invención aparecerá ahora con más detalle en el contexto de la siguiente descripción de un ejemplo de realización dado a modo de ilustración con referencia a las figuras adjuntas que representan:
• Figura 1. Esquema en perspectiva de una sonda según una primera realización de la invención.
• Figura 2. Diagrama en perspectiva de una sonda endoscópica según la invención.
• Figura 3. Diagrama de esta sonda conectada al equipo necesario para su implementación.
• Figura 4. Diagrama de la línea de transferencia que conecta la sonda al espectrómetro de masas.
• Figura 5. Diagrama de espectrometría relativo al análisis de tejido biológico ex vivo y especialmente de hígado de res, más particularmente:
° la figura 5a, la corriente de iones total durante todo el período de adquisición,
° la figura 5b, representa el espectro obtenido durante el período de irradiación del láser.
• Figura 6. Comparación de análisis ex vivo entre el hígado y el cerebro de una rata, más particularmente, ° la figura 6a, los resultados obtenidos en el hígado,
° la figura 6b, los resultados obtenidos en el cerebro.
• Figura 7. Análisis de una biopsia de cáncer de linfoma canino.
• Figura 8. Análisis de huellas dactilares, comparación hombre/mujer (análisis in vivo en los dedos)
A los elementos presentes en varias figuras se les asigna una única referencia.
Haciendo referencia a la figura 1, se muestra una sonda S según la invención en cuasicontacto con un material biológico que se ha de analizar P, la piel de un paciente en este caso (pero bien podría ser un órgano).
La sonda S presenta forma de cilindro que contiene una fibra de análisis A y un tubo de transferencia T. Estos dos elementos están enrasados con la cara frontal de la sonda, la que se acerca al material biológico que se ha de analizar. La función de estos elementos se aclara a continuación.
Esta es la realización básica de la invención que permite efectuar un análisis externo de la piel, el cabello, las uñas o un análisis interno de un órgano durante una cirugía abierta.
Según una evolución de la invención, la sonda es, en realidad, una sonda endoscópica que comprende elementos adicionales.
Haciendo referencia a la Figura 2, la sonda endoscópica 10 se presenta en este caso como un cilindro que presenta un rebaje axial 11.
Presenta una cara de análisis o cara anterior que es visible en la figura y, por tanto, presenta una cara opuesta, la cara posterior que no aparece en la figura.
El rebaje axial 11 también es cilíndrico y en él se inserta un tubo de transferencia 21. La función de este tubo de transferencia se detalla más adelante.
Paralelamente al rebaje 11 están dispuestos varios elementos que también son cilíndricos.
En primer lugar, en la cara posterior emerge un canal de iluminación 12 a modo de fibra óptica para conectarse a un dispositivo de iluminación no mostrado en esta figura.
En segundo lugar, un canal de toma de imágenes 13 está dispuesto cerca del canal de iluminación 12. Comprende un dispositivo de toma de imágenes, como una cámara, y la salida en la cara posterior se hace a través de un enlace de video 23.
En tercer lugar, por la cara posterior emerge una primera fibra óptica de análisis 14 que está enrasada con la cara de análisis. Su conexión se aclara a continuación.
Ventajosamente, se puede prever una segunda fibra óptica de análisis 15 que también desemboca en la cara posterior. En el caso de que la sonda se utilice también para el tratamiento mediante terapia con láser, esta comprende además una fibra de terapia con láser 16 que todavía emerge en la cara posterior.
Con referencia a la figura 3, se aclaran las diversas conexiones de la sonda 10.
El canal de iluminación 12 está conectado a un dispositivo de iluminación 32.
El enlace de video 23 está conectado a una pantalla de visualización 33.
El tubo de transferencia 21 está conectado a un espectrómetro de masas 31. El detalle de esta conexión se proporciona más adelante.
Este tubo de transferencia está preferiblemente constituido de un material para minimizar los fenómenos de absorción para asegurar una transferencia efectiva del material sometido a ablación por la fibra de análisis. Este material es, por ejemplo, PTFE.
La primera fibra de análisis 14 está conectada a un primer láser de ablación 34. La función de este láser 34 es muestrear el tejido que irradia, provocando así la expulsión de partículas cargadas (iones moleculares) y/o no cargadas en fase gaseosa.
La longitud de onda de este láser se puede elegir en el intervalo que se extiende desde el infrarrojo hasta el ultravioleta, preferiblemente en el infrarrojo.
Es, por ejemplo, un láser con una longitud de onda entre 2.8 μm y 3.2 μm; normalmente un láser Erbio-YAG que emite a una longitud de onda de 2.94 μm.
También podemos mencionar:
• Láseres de Neodimio-YAG: 1.064 μm, 0.532 μm, 0.355 μm, 0.266 μm
• Láseres Xe-Ne: de 2 μm a 4 μm
• Láseres HF (fluoruro de hidrógeno): 2.6 μm
• Láseres de fibra del tipo iterbio, dopados con bismuto, tulio u holmio: de 1.07 μm a 2.1 μm
Estos láseres se pueden utilizar como fuentes de emisión directa o acoplados a un OPO (oscilador paramétrico óptico). Un OPO permite, a partir de una onda láser de determinada longitud de onda, producir dos ondas de mayor longitud de onda. Esto permite, por lo tanto, ampliar la gama de longitudes de onda utilizable para el láser considerado, visto por el material biológico para someter a ablación.
En general, se busca cubrir el intervalo de longitudes de onda desde 2.5 μm hasta 12 μm. De hecho, en este intervalo de longitudes de onda, se cubren las bandas de absorción de los enlaces O-H, N-H, C-H, C=O, C=N, C=C, C-O, C-N y C-C que probablemente estén presentes en el material biológico para someter a ablación.
En particular, en este intervalo de longitudes de onda de 2.5 μm a 12 μm, el láser permite someter a ablación el material biológico generando al menos partículas cargadas, en particular, iones moleculares, en fase gaseosa. Sin embargo, es posible limitarse al intervalo de longitudes de onda comprendido entre 2.5 μm y 3.5 μm. De hecho, en este intervalo de longitudes de onda se cubren las bandas de absorción de los enlaces O-H, N-H y C-H.
Es posible limitarse a un intervalo de longitudes de onda más restringido, comprendido entre 2.8 μm y 3.2 μm. De hecho, en este intervalo de longitudes de onda, las bandas de absorción de los enlaces O-H y N-H están cubiertas. Además, el láser de ablación 34 será ventajosamente un láser pulsado configurado para generar un haz cuya energía esté ventajosamente entre 2 mJ/pulso y 15 mJ/pulso, estando la superficie del haz (enfoque) entre 30 μm2 y 3 mm2. La energía del haz puede estar entre 5 mJ/pulso y 12 mJ/pulso, o incluso entre 5 mJ/pulso y 10 mJ/pulso, siendo la superficie del haz (enfoque) entre 30 μm2 y 3 mm2.
Para los intervalos de energía considerados anteriormente, el haz láser además puede presentar una superficie de entre 100 μm2 y 3 mm2, entre 10-3 mm2 y 3 mm2, entre 10-2 mm2 y 3 mm2, entre 10-1 mm2 y 3 mm2, entre 0.5 mm2 y 3 mm2, o entre 0.5 mm2 y 2 mm2. En particular, el haz del láser normalmente permite someter a ablación un volumen de material biológico cuya superficie de base es del orden del milímetro cuadrado, que corresponde sustancialmente a un haz cuya superficie o foco es también del orden del milímetro cuadrado.
En efecto, los autores han podido observar que esta selección en la energía suministrada por un pulso del láser de ablación 34 y en la superficie (enfoque) de este haz aseguraba una mejor producción de iones moleculares y, por lo tanto, producía un efecto sinérgico con la selección del intervalo de longitudes de onda del láser especificado anteriormente.
Además, se debe tener en cuenta que la profundidad de penetración del haz de láser es normalmente de unos pocos micrómetros por pulso láser.
Si se proporciona una segunda fibra de diagnóstico, esta se conecta a un segundo láser de ablación de un tipo diferente al primero. Esto aumenta, por tanto, las posibilidades de diagnóstico. Se hará mención, a modo de ejemplo, del láser Neodimio-YAG a una longitud de onda de 0.532 μm. También se hará mención, a modo de ejemplo, de otro láser, opcionalmente acoplado a un OPO para actuar en el intervalo de 2.5 μm a 3.5 μm. Dicha segunda fibra de análisis permite ventajosamente aumentar las posibilidades de análisis.
Las partículas expulsadas, por tanto, son recogidas por el tubo de transferencia 21 que las transporta al espectrómetro de masas.31.
La fibra de terapia láser 16 está conectada a un láser de terapia 36. En efecto, si el análisis efectuado anteriormente revela que los tejidos deben tratarse, el tratamiento puede tener lugar inmediatamente, sin utilizar ningún equipo adicional. Por tanto, podemos, por ejemplo, utilizar, para la terapia, un láser (diodo láser) que emita a 980 nm, como proponen Gonzalez-Mertinez & al., «Robot-assisted stereoactic laser ablation in medically intractable epilepsy: operative technique», Neurosurgery, 2014, suplemento 2: 167-172.
Haciendo referencia a la figura 4, se detalla un ejemplo de enlace entre la sonda 10 y el espectrómetro de masas 31.
El tubo de transferencia 21 se prolonga por un capilar de despresurización 41 en el lado opuesto al de la sonda 10. El capilar es preferiblemente metálico. Tiene un diámetro interno menor que el del tubo de transferencia 21. Esto permite aumentar la despresurización del espectrómetro de masas 31, lo que induce una aceleración de las partículas. Si este capilar 41 es metálico, se puede generar un campo eléctrico para crear una diferencia de potencial entre este capilar y la entrada del espectrómetro de masas 31.
El capilar de despresurización 41 se extiende en la entrada del espectrómetro de masas 31 mediante un sistema de transferencia y enfoque de iones 42 integrado dentro del espectrómetro de masas.
Alternativamente, este sistema 42 puede disponerse fuera del espectrómetro de masas, aguas arriba de este, con referencia al recorrido de las partículas cargadas o no cargadas.
Además, también alternativamente, este sistema 42 puede ser un sistema de enfoque de iones o un sistema de transferencia de iones.
Este sistema 42 permite guiar el aerosol que comprende partículas cargadas o no cargadas hacia el espectrómetro de masas.
El tubo de transferencia 21 puede estar provisto de un medio de calentamiento 44 para aumentar su temperatura.
También es posible proporcionar un capilar de nebulización 45 que esté conectado al capilar de despresurización 41. Este capilar de nebulización 45 es alimentado por un distribuidor de disolvente 46. Se proporciona un órgano de control 47 para regular el distribuidor 46 de modo que el caudal de disolvente sea el deseado. Este disolvente permite reproducir un proceso de electronebulización convencional para aumentar el rendimiento de producción de moléculas cargadas (iones moleculares). La ventaja de introducir el disolvente en este lugar es la ausencia de toxicidad tanto para los usuarios como para los tejidos biológicos.
Sin embargo, esto solo se ofrece como una opción. Asimismo, se puede prever que entre el tubo de transferencia T, 21 y el espectrómetro de masas 31 no se prevea ningún medio de nebulización conectado a un medio de distribución del disolvente. En efecto, una ventaja de la invención es que el proceso de ablación del material biológico permite expulsar al menos partículas cargadas (iones moleculares) en cantidad suficiente para su posterior análisis por el espectrómetro de masas.
Además, también es posible prever un capilar de distribución que esté conectado al capilar de despresurización. Este capilar de distribución es entonces alimentado por un distribuidor de gas que contiene iones GH+. Esto permite inducir, por colisión, una transferencia de protones a las partículas que hay que analizar y, por tanto, aumentar el rendimiento de producción de iones. Este caso no se muestra en las figuras adjuntas, pero la disposición de este capilar de distribución y del distribuidor de gas puede ser similar a la del capilar de nebulización 45 y de su distribuidor de disolvente 46, respectivamente.
Sin embargo, esto solo se ofrece como una opción. En efecto, se puede considerar que entre el tubo de transferencia T, 21 y el espectrómetro de masas 31 no está previsto ningún capilar de distribución conectado a un distribuidor de gas. En efecto, y como recordatorio, una ventaja de la invención es que el proceso de ablación del material biológico permite expulsar al menos partículas cargadas (iones moleculares) en cantidad suficiente para su posterior análisis por el espectrómetro de masas.
También es posible prever una rejilla metálica 48 en la línea de transferencia que va desde la sonda 10 hasta el espectrómetro de masas 31.
Esta rejilla se pone, por ejemplo, entre el tubo de transferencia 21 y el capilar de despresurización 41, como se muestra en la Figura 4.
Es una rejilla extremadamente fina del tipo utilizado en microscopía electrónica. Su función es romper las partículas o los agregados de partículas expulsados por el láser de ablación 34 para que finalmente sean aceleradas hacia el espectrómetro de masas 31. Esta rejilla 48 no rompe las moléculas, algunas de las cuales están en forma iónica en el tubo de transferencia T, 21, sino partículas de mayor tamaño.
Un espectrómetro de masas clásicamente comprende y en el siguiente orden:
• una fuente
• un sistema de transferencia y enfoque de iones
• al menos un analizador de masas
También comprende un sistema de detección.
Según una realización particular de la invención, el espectrómetro de masas no incluye fuente y comprende al menos un sistema de enfoque y/o de transferencia de iones interpuesto entre el tubo de transferencia y dicho analizador de masas.
De forma no limitativa, se pueden citar, a modo de ejemplos de sistemas de enfoque y/o de transferencia de iones, un capilar de transferencia, un skimmer, una lente de enfoque, un sistema de transferencia con campos multipolares, un túnel de iones, una lente electrostática.
El espectrómetro de masas también puede incluir elementos para mejorar su desempeño como, por ejemplo, un sistema de movilidad de iones.
Según una posible realización, el sistema de transferencia y enfoque de iones es un capilar de transferencia.
El espectrómetro comprende un analizador de masas 49. El analizador de masas empleado puede ser de cualquier tipo, ya sea simple (p. ej., sector magnético simple (B) o doble enfoque (BE, EB), cuadrupolo (Q), trampa de iones (TI), tiempo de vuelo (TOF), resonancia de ciclotrón de iones (ICR), trampa orbital), combinado (p. ej., triple cuadripolo) o híbrido (p. ej., Q-orbittrap, Q-TOF).
Alternativamente, el analizador de masas empleado puede ser otro sistema de separación de iones (por ejemplo, movilidad de iones).
Ahora discutiremos la estrategia prevista cuando se utiliza la presente invención.
El dispositivo según la invención funciona en base a un proceso de ablación por láser que permite muestrear el material biológico que hay que analizar. Esto conduce a la expulsión de partículas en fase gaseosa (cargadas o no). El material sometido a ablación se entrega en tiempo real al espectrómetro de masas 31 a través del tubo de transferencia 21. De hecho, el proceso de ablación y la expulsión de partículas, vinculadas a esta ablación, así como el tiempo de tránsito en el tubo de transferencia son cortos y pueden calificarse de tiempo real. Esto permite recoger perfiles moleculares (señales provenientes del análisis de material biológico correspondientes a biomoléculas del tipo compuestos orgánicos, aminoácidos, metabolitos, lípidos, péptidos, etc.) característicos de la zona analizada.
Ventajosamente, estos perfiles se compararán con una base de datos de perfiles moleculares obtenidos mediante la utilización del presente dispositivo, en tiempo real, lo que permitirá obtener información rápidamente.
La base de datos moleculares se establece utilizando este dispositivo de una manera ex-vivo sobre biopsias de pacientes que muestran diferentes grados y estadios de la patología considerada. También se integra en la base de datos una cohorte de muestras de pacientes, sanos o no.
Sin embargo, la base de datos se puede establecer de otra manera.
Según una utilización particular, el cirujano desplazará la sonda en la superficie o en el interior del paciente sobre el material biológico en cuestión para saber si está situado en una zona cancerosa o no, lo que le permitirá considerar rápidamente un tratamiento para el paciente y, especialmente, las zonas que tendrá que extirpar quirúrgicamente. Estas zonas para extirpar pueden extirparse ventajosamente mediante la fibra terapéutica según un modo de realización particular del dispositivo según la invención.
La invención ha permitido obtener los siguientes resultados.
Resultado 1: Análisis de tejidos biológicos ex-vivo
Se utiliza un láser que emite pulsos de nanosegundos a una frecuencia de 10 Hz (Quantel Easy Brillant, Les Ulis, Francia), conectado a un sistema OPO con un cristal de tipo LiNbO3 (longitud de onda variable entre 2.5 μm y 4.5 μm; LaserSpec, Malonne, Bélgica) sintonizado a una longitud de onda de 2940 nm. Se utiliza un tubo de transferencia de teflón (diámetro interno de 10 mm) para la transferencia de partículas cargadas y no cargadas, y se conecta directamente a un espectrómetro de masas tipo trampa de iones cuya fuente se ha eliminado (HCT Ultra, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). La entrada de N2 del espectrómetro de masas se desconectó para permitir la adición de una bomba para aumentar el caudal de succión en el tubo de transferencia. El análisis de los compuestos resultantes de la irradiación láser se efectúa mediante el espectrómetro de masas en modo negativo en un intervalo de relación masa/carga (m/z) entre 150 y 1000.
El primer experimento presentado en la Figura 5 es el análisis ex vivo de un trozo de hígado de res. Sobre este se realiza una irradiación de 7 mJ / disparo láser sobre un área de 1 mm2 (1 disparo láser = 1 pulso láser). Durante el paso de adquisición se eligió un número de 3 fases: un primer paso de ausencia de irradiación láser, una fase de irradiación láser y otra fase de ausencia de irradiación láser. La figura 5A representa la corriente iónica total durante todo el período de adquisición y la figura 5B el espectro obtenido durante el período de irradiación láser. La corriente de iones total muestra que la presencia de la señal detectada se correlaciona con la irradiación láser. Por lo tanto, no hay compuestos que se adhieran a la pared interna del tubo de transferencia y esto muestra un análisis rápido, en tiempo real. Normalmente, el tiempo de análisis es inferior a un segundo.
En la Figura 6 se efectúa una comparación de 2 órganos en la rata, el cerebro y el hígado, sobre una adquisición en cada órgano. Una irradiación durante 30 segundos a 7 mJ / disparo láser en una región de cada órgano. La figura 6 muestra una diferencia en la relación m/z entre estos 2 órganos, lo que muestra una especificidad de la composición molecular del cerebro en comparación con el hígado de rata. En la Figura 7, se lleva a cabo un análisis de una biopsia de linfoma canino canceroso. Se realiza irradiación durante 30 segundos a 7 mJ / disparo láser en una región de esta biopsia. El espectro registrado se selecciona en el período de irradiación láser. Muestra generación de señales correspondientes a lípidos y ácidos grasos y algunas señales atribuibles a péptidos. La presente invención permite efectuar análisis en tiempo real sin contaminación a nivel de la pared del tubo de teflón, pero asimismo entre diferentes órganos provenientes de un mismo animal. El análisis en tiempo real efectuado en los distintos órganos muestra un gran número de señales que pueden corresponder a ácidos grasos, metabolitos y lípidos. Haciendo referencia a la Figura 6, la presente invención tiene la capacidad de detectar diferentes perfiles dependiendo de los órganos estudiados y su estado fisiológico (p. ej., sano frente a canceroso). La ventaja de este análisis es una gran disparidad en las familias de moléculas detectadas que pueden añadir un valor significativo tanto a la base de datos de perfiles moleculares como a la caracterización de tejidos biológicos.
Resultado 2: Análisis de tejidos biológicos in vivo
En la Figura 8 un análisis in vivo en tiempo real de los tejidos de la piel de individuos de diferentes sexos se efectúa al nivel de los dedos. La irradiación durante 10 segundos a 9 mJ / disparo láser (1 disparo láser = 1 pulso láser) para cada individuo se realiza mediante un láser que emite pulsos de nanosegundos a una frecuencia de 10 Hz (Quantel Easy Brillant, Les Ulis, Francia), conectado a un sistema OPO con un cristal de tipo LiNbO3 (longitud de onda variable entre 2.35 μm y 4.5 μm; LaserSpec, Malonne, Bélgica) ajustado a una longitud de onda de 2940 nm. Se utiliza un tubo de transferencia de teflón (diámetro interno de 10 mm) para la transferencia de partículas cargadas y no cargadas, y se conecta directamente a un espectrómetro de masas tipo trampa de iones cuya fuente se ha eliminado (HCT Ultra, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). La entrada de N2 del espectrómetro de masas se desconectó para permitir la adición de una bomba para aumentar el caudal de succión en el tubo de transferencia. El análisis de los compuestos resultantes de la irradiación láser se efectúa mediante el espectrómetro de masas en modo negativo en un intervalo de relación masa/carga (m/z) entre 150 y 1000. Durante el paso de adquisición se eligió un número de 3 fases: una primera fase de ausencia de irradiación láser, una fase de irradiación láser y otra fase de ausencia de irradiación láser. En la Figura 8 se visualiza una distinción de los diferentes individuos. La presente invención permite efectuar análisis in vivo en tiempo real sobre individuos y poder observar perfiles moleculares específicos según el sexo del individuo. Este análisis in vivo en individuos muestra el efecto no invasivo e indoloro de la presente invención durante varios segundos de irradiación.
Otra ventaja de la presente invención es el efecto no invasivo sobre los órganos durante la irradiación incluso de varias decenas de segundos en el mismo punto. Basándose en el perfil molecular, la presente invención se utiliza para la diferenciación de zonas muy pequeñas (diámetro de la zona de irradiación de 400 μm) de tejidos biológicos.
La invención también se relaciona con un procedimiento para el análisis molecular de material biológico, caracterizado por que comprende los siguientes pasos:
• emitir un haz láser a una longitud de onda comprendida entre 2.5 μm y 12 μm en dirección a un material biológico, provocando la interacción entre este haz y el material biológico la ablación de este último y la expulsión de al menos partículas cargadas, especialmente iones moleculares;
• dirigir el material biológico sometido a ablación que comprende al menos dichas partículas cargadas hacia un espectrómetro de masas, a través de un tubo de transferencia; y
• analizar la composición del material biológico sometido a ablación en el espectrómetro de masas.
Este procedimiento de análisis molecular de material biológico puede llevarse a cabo in vivo.
El haz láser puede presentar una longitud de onda entre 2.5 μm y 3.5 μm, o entre 2.8 μm y 3.2 μm.
Además, el haz láser puede ser pulsado y presentar una energía de entre 2 mJ/pulso y 15 mJ/pulso, siendo la superficie del haz (enfoque) entre 30 μm2 y 3 mm2.
La energía del haz puede estar entre 5 mJ/pulso y 12 mJ/pulso, o incluso entre 5 mJ/pulso y 10 mJ/pulso, siendo la superficie del haz (enfoque) entre 30 μm2 y 3 mm2.
Para los intervalos de energía considerados anteriormente, el haz láser además puede presentar una superficie de entre 100 μm2 y 3 mm2, entre 10'3 mm2 y 3 mm2, entre 10'2 mm2 y 3 mm2, entre 10'1 mm2 y 3 mm2, entre 0.5 mm2 y 3 mm2, o entre 0.5 mm2 y 2 mm2. En particular, el haz láser normalmente permite someter a ablación un volumen de material biológico cuya superficie de base sea del orden del milímetro cuadrado, que corresponde sustancialmente a un haz también del orden del milímetro cuadrado.
Así mismo, en este procedimiento se puede prever un paso de calentamiento del material biológico sometido a ablación.
En este procedimiento también se puede proporcionar un paso durante el cual el material biológico sometido a ablación sea tamizado por una rejilla, por ejemplo, metálica.
Finalmente, cabe señalar que con la invención también se propone la utilización de un dispositivo de análisis molecular según la invención para la ablación de dicho material biológico mediante la expulsión de partículas cargadas y/o no cargadas, y más concretamente para la ablación de dicho material biológico mediante la expulsión de al menos partículas cargadas, especialmente iones moleculares.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo de análisis molecular de un material biológico que comprende:
- un láser (34), asistido opcionalmente con un oscilador paramétrico óptico (OPO), configurado para emitir una longitud de onda comprendida entre 2.5 μm y 12 μm, estando configurado, por tanto, dicho láser (34) para someter a ablación dicho material biológico mediante la expulsión de partículas cargadas y/o no cargadas;
- un espectrómetro de masas (31); y
- una sonda (S, 10) que incluye:
° al menos una fibra de primer análisis (A, 14); y
° un tubo de transferencia (T, 21);
estando conectada al menos dicha primera fibra de análisis (A, 14) al láser (34), y estando conectado dicho tubo de transferencia al espectrómetro de masas (31).
2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que el láser (34), opcionalmente asistido con un oscilador paramétrico óptico (OPO) está configurado para emitir una longitud de onda comprendida entre 2.5 μm y 3.5 μm.
3. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el láser (34), asistido opcionalmente con un oscilador paramétrico óptico (OPO), está configurado para emitir una longitud de onda comprendida entre 2.8 μm y 3.2 μm.
4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el láser (34) es un láser pulsado configurado para generar un haz cuya energía está comprendida entre 2 mJ/pulso y 15 mJ/pulso y cuya superficie esté comprendida entre 30 μm2 y 3 mm2.
5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el láser (34) es un láser pulsado configurado para generar un haz cuya energía está comprendida entre 5 mJ/pulso y 12 mJ/pulso, por ejemplo, entre 5 mJ/pulso y 10 mJ/pulso y la superficie esté comprendida entre 30 μm2 y 3 mm2.
6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado por que el láser (34) está configurado para generar un haz cuya superficie esté comprendida entre 0.5 mm2 y 2 mm2.
7. Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que entre dicho tubo de transferencia (T, 21) y el espectrómetro de masas (31) se interpone un sistema (42) para enfocar y/o transferir los iones moleculares que se vayan a formar durante la ablación de material biológico.
8. Dispositivo según la reivindicación anterior, caracterizado por que dicho sistema (42) de enfoque y/o transferencia es un capilar de transferencia.
9. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho tubo de transferencia (T, 21) está provisto de un medio de calentamiento (44).
10. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que entre dicho tubo de transferencia (T, 21) y dicho sistema (42) de enfoque y/o transferencia se inserta un capilar de despresurización (41), siendo el diámetro interior de este capilar de despresurización (41) menor que el del tubo de transferencia (T, 21).
11. Dispositivo según la reivindicación anterior, caracterizado por que el capilar de despresurización (41) es un capilar metálico y por que se proporciona un medio para generar una diferencia de potencial entre dicho capilar de despresurización (41) y el espectrómetro de masas (31).
12. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se introduce una rejilla metálica (48) entre dicho tubo de transferencia (T, 21) y dicho espectrómetro de masas (31).
13. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado por que un capilar de nebulización (45) está conectado a dicho capilar de despresurización (41) y, además, está conectado a un medio para distribuir el disolvente (46).
14. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que no se prevé ningún capilar de nebulización conectado a un medio para distribuir el disolvente entre el tubo de transferencia (T, 21) y el espectrómetro de masas (31).
15. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que un capilar de distribución está conectado a dicho capilar de despresurización y está conectado, además, a un distribuidor de gas.
16. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que no se prevé ningún capilar de distribución conectado a un distribuidor de gas entre el tubo de transferencia (T, 21) y el espectrómetro de masas (31).
17. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha sonda (S, 10) incluye una segunda fibra de análisis (15).
18. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha sonda (S, 10) incluye así mismo una fibra de terapia (16).
19. Dispositivo según la reivindicación anterior, caracterizado por que dicha fibra de terapia (16) está conectada a un láser de terapia (36).
20. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha sonda (S, 10) incluye así mismo un canal de iluminación (12) y un canal de toma de imágenes (13).
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