JP6623309B2 - Ｔｓｐｙｌ５タンパク質１２０番目のトレオニン残基のリン酸化抑制による、がん幹細胞の成長調節方法とリン酸化抑制機能ペプチド配列含有組成物及びその用途 - Google Patents

Ｔｓｐｙｌ５タンパク質１２０番目のトレオニン残基のリン酸化抑制による、がん幹細胞の成長調節方法とリン酸化抑制機能ペプチド配列含有組成物及びその用途 Download PDF

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Description

本発明は、TSPYL5(testis-specific protein, Y-encoded-like 5)タンパク質の120番目のトレオニン(threonine)残基のリン酸化を抑制するペプチド及びこれを用いた癌細胞の成長または転移、またはがん幹細胞の成長抑制用組成物に関する。
がん幹細胞(cancer stem cell)は、絶えず自己再生(self-renewal)することができ、一般的な幹細胞のように、様々な組織や細胞への分化が可能な潜在的な能力(pulprint potency)を示す小集団細胞群であり、少ない細胞数でも実験動物モデルに腫瘍を生成することができ、薬物治療および放射線治療に高い抵抗性能力を見せる(非特許文献１)。
がん幹細胞は、急性骨髄性白血病で初めて報告され、乳癌を含む一般的な固形がんでも、がん幹細胞が発見され、固形がん幹細胞の存在が確認された(非特許文献2、非特許文献3)。
がん幹細胞の同定のためのがん幹細胞に特異的な発現マーカーが明らかになったが、その中で脳腫瘍で膜タンパク質であるCD133が、がん幹細胞を認識して分離するためのマーカーとして使用されており、100個程度のCD133+細胞を利用してヌードマウスに移植することにより、新たな腫瘍を生成することができることが報告された(非特許文献4)。また、膜タンパク質であるCD44も、がん幹細胞マーカーとして提示され、固形癌の中で乳癌では、CD44(+)/CD24(-)/Lineage(-)で分離された細胞が、異種移植腫瘍への成長がよいことが報告された(非特許文献5)。また、他のがん幹細胞マーカーとしては、細胞内アルデヒドを酸化させるデトックス酵素であるALDH1(alde- hydrogeanse 1)がある(非特許文献6、非特許文献7)。ALDH1の活性度は、肺癌細胞株などでがん幹細胞の集団(population)を分離するのに重要に使用されているが(非特許文献8)、乳癌、肺癌などでALDH1活性が高い細胞が癌性腫瘍幹細胞の特徴である自己再生と分化能力が高いことが報告されていて、がん患者の腫瘍細胞でALDH1の活性が高い場合にも、予後が良くないことが報告されている(非特許文献9)。
しかし、前記のようながん幹細胞の特定のマーカーの発見にもかかわらず、腫瘍幹細胞特異的なネットワークとメカニズムについては、まだ多く知られていない。したがって、癌細胞の再発と転移を防ぎ、がんを完全に除去するためには、現在のがん細胞をターゲットとする癌治療法からさらに、幹細胞の特性を有するがん幹細胞をターゲットとし、がん幹細胞を除去する抗がん剤の開発が必要である。
TSPYL5遺伝子は、TSPYL(testis-specific protein、Y-encoded-like)ファミリーに属し、乳癌で多く発現して乳癌の発癌過程で重要な役割をすることが予想されている遺伝子の一つとして報告された(非特許文献10)。また、TSPYL5は、肺癌細胞株で過発現して、PTEN/AKT経路を活性化し、細胞の成長および放射線抵抗性を増加させることが報告されている(非特許文献11)。TSPYL5の相互作用タンパク質としてはUSP7(deubiquitylation enzyme for p53 activation)が報告されているが、TSPYL5がUSP7の阻害剤として作用してp53の分解を増加させる役割をして、癌の予後を悪化させることが明らかにされた(非特許文献12)。また、TSPYL5が閉経後、乳癌と関連があるテストステロンからエストラジオールへの芳香化反応を触媒させる芳香化酵素(aromatase)を含む様々な遺伝子の転写因子との関連があると報告されている(非特許文献13)。
現在、TSPYL5遺伝子とがん幹細胞の細胞生理学的な側面は、かなりの部分が解明され、放射線抵抗性およびがん幹細胞の特性に関与するTSPYL5タンパク質の機能を抑制することができる方法として、shRNAもしくはsiRNAを用いる方法を使用している。しかし、これを活用して、放射線敏感剤や放射線抵抗性を有するがん幹細胞の抑制因子を開発するには、技術的な限界がある。
そこで、本発明者らは、TSPYL5タンパク質内での腫瘍幹細胞特性および放射線抵抗性特性に関連する特定のアミノ酸残基およびその多様な変異体を究明して、がん幹細胞を制御することができる方法を探そうとした。そんな中、TSPYL5の120番目のトレオニンアミノ酸がPTEN/AKTによってリン酸化が調節されることを確認し、TSPYL5の120番目のトレオニン(T120)残基の突然変異体であるT120D-またはT120A-TSPYL5遺伝子を作製し、細胞に形質転換させた結果、正常型TSPYL5とT120Dは、核内にも移動して存在しているが、T120Aの場合はTSPYL5タンパク質が核内に移動できず、細胞質内でのみ発現され、AKTと結合できないことを確認した。また、リン酸化されない場合、TSPYL5タンパク質のユビキチン化(ubiquitination)が増加し、SUMO化(SUMOylation)が抑制されることを確認し、がん幹細胞の特性を示す代表的なマーカーであるALDH1A1、ALDH1A3、CD44遺伝子および蛋白質の発現が減少したことを確認した。これにより、肺がん細胞の成長および転移も減少し、sphere形成が減少したことを確認した。以上のように、本発明では、TSPYL5の120番目のトレオニン残基のリン酸化を抑制することにより、がん細胞の成長または転移、またはがん幹細胞の成長抑制が可能であることを究明し、リン酸化部位である120Tを含む配列番号43のTS120Tペプチドとそのリン酸化類似体である配列番号44のTS120Dペプチドが癌細胞の成長または転移、またはがん幹細胞の成長阻害剤として有用に用いることができることを明らかにすることによって本発明を完成した。
B.M. Boman, M. S. Wicha, Cancer stem cells: A step toward the cure, J. Clin. Oncol. (2008年)26：2795-2799 D. Bonnet, JE Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. (1997年)3：730-737 M. Al-Hajj, MF Clarke, Self-renewal and tumor stem cells. Oncogene (2003年)23：7274-7284 SK Singh, C. Hawkins, ID Clarke, et al, Identification of human brain tumor initiating cells. Nature(2004年)432：396-401 M. al-Hajj, MS Wicha, A. Bentino-Hernandez et al, Proc. Natl. Acad.Sci. USA (2003年)100：3983-3988 M. Magni, S. Shammah, R. Schiro. et al, Blood (1996年)87:1097-1103 NA Sophos, V. Vasiliou, Chem. Biol. Interact. (2003年)143-144：5-22 F. Jiang, Q. Qiu, A. Khanna et al, Mol. Cancer. Res. (2009年)7：330- 338 E. Charafe-Jauffret et al, Clin. Cancer. Res. (2010年)16：45-55 LJ van't Veer, et al, Nature. (2002年)415：530-536 EJ Kim. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2010年)392(3)：448-453 MT Epping, et al., Nat. Cell Biol. (2011年)13(1)：102-108 Liu M1, et al., Mol Endocrinol. (2013年)27(4)：657-70
本発明の目的は、TSPYL5(testis-specific protein、Y-encoded-like 5)の機能調節による癌細胞の制御機序(mechanism)を提示し、その結果に基づいて、本発明者らが考案したペプチド及びその誘導体を用いてTSPYL5タンパク質の120番目のトレオニン(threonine)残基のリン酸化を抑制し、癌細胞もしくはがん幹細胞の成長または転移を抑制する組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、本発明のペプチドを癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法および癌の転移抑制方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、癌の予防または治療用組成物、癌転移抑制用組成物およびがん幹細胞の成長抑制用組成物として用いるための本発明のペプチドの用途を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号43または配列番号44のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有する癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有する癌の転移予防または抑制用組成物を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有するがん幹細胞の成長抑制用組成物を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを個体に投与する工程を含む、癌の予防方法を提供する。
また、本発明は、癌の予防または治療用組成物として用いるための、前記ペプチドの用途を提供する。
また、本発明は、前記ペプチドを癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の転移抑制方法を提供する。
また、本発明は、癌の転移抑制用組成物として用いるための、前記ペプチドの用途を提供する。
さらに、本発明は、がん幹細胞の成長抑制用組成物として用いるための、前記ペプチドの用途を提供する。
本発明は、TSPYL5(Testis-specific Y-like protein 5)タンパク質の120番目のトレオニン(threonine)残基のリン酸化を抑制するペプチドに関するものであり、前記ペプチドが、肺癌細胞の成長および転移を減少させ、sphere形成を抑制できることを確認することにより、本発明のTSPYL5の120番目のトレオニン残基のリン酸化を抑制する配列番号43または44の塩基配列からなるペプチドは、癌細胞の成長または転移の阻害剤、またはがん幹細胞の成長阻害剤として有効に活用することができる。
PTEN遺伝子の過発現によるがん幹細胞マーカーであるALDH1活性とCD44の発現の変化を、肺癌細胞株であるH460で、フローサイトメトリー分析法で分析した図である。 PTEN遺伝子の過発現によるがん幹細胞マーカーであるALDH1活性とCD44の発現の変化を、肺癌細胞株であるA549で、フローサイトメトリー分析法で分析した図である。 TSPYL5遺伝子とタンパク質発現との関連性を確認するために、逆転写重合反応(RT-PCR)で、ALDH1 isozyme A1、A3、CD44およびTSPYL5の発現を分析した結果を示した図である。 TSPYL5遺伝子とタンパク質発現との関連性を確認するために、ウェスタンブロットで、ALDH1 isozyme A1、A3、CD44およびTSPYL5の発現を分析した結果を示した図である。 肺がん細胞株であるH460とA549でAKT発現増加および発現抑制によるTSPYL5、ALDH1およびCD44の遺伝子および蛋白質の発現変化を示した図である。 AKTタンパク質活性の阻害剤であるMK2206の処理に伴うTSPYL5の遺伝子および蛋白質の発現変化を示した図である。 AKT活性剤(MK2206)またはPI3K活性阻害剤(LY294002)の処理に伴うTPSYL5タンパク質の細胞内分布様相および発現量を分析した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120A、pcDNA3.1/TSPYL5-409AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させた肺がん細胞で、TSPYL5タンパク質の発現位置を蛍光顕微鏡で分析し、ウェスタンブロットでTSPYL5およびHDAC1タンパク質の発現量の変化を確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5-326AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-177Aを過発現させた肺がん細胞で、TSPYL5タンパク質の発現位置を蛍光顕微鏡で分析し、ウェスタンブロットでALDH1A1、CD44、およびTSPYL5タンパク質の発現量の変化を確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)とpcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた肺がん細胞で、TSPYL5タンパク質とAKTタンパク質の相互結合を免疫沈降法で確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)とpcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた肺がん細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形によるユビキチン化(Ubiquitination)の変化を確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)とpcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた肺がん細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形に伴うSUMO化(SUMOylation)の変化を確認した図である。 肺癌細胞株であるA549で、SUMO化阻害剤(Ginkgolic acid)処理時、TSPYL5の核内発現が阻害されたことを確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-12Dを過発現させた細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形に伴うTSPYL5のがん幹細胞マーカーであるALDH1 isozymeの発現の変化をフローサイトメトリー分析法で分析した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-12Dを過発現させた細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形に伴うTSPYL5のがん幹細胞マーカーであるCD44の発現の変化をフローサイトメトリー分析法で確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-12Dを過発現させた細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形に伴うTSPYL5のがん幹細胞マーカーであるALDH1 isozyme及びCD44の発現の変化をRT-PCRとウエスタンブロットで確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させた細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形による癌細胞の成長、転移能力およびsphere形成の変化を確認した図である。 pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させた細胞で、TSPYL5の120番目のトレオニン残基の変形による放射線抵抗性を確認した図である。 TSPYL5の転写活性因子としての機能をクロマチン沈降法で確認した図である。 TS120T、TS120AおよびTS120Dペプチド処理時、癌細胞の成長(CFA：colony-orming ability)および転移程度(Invasion/migration)とSphere形成能(SFA：Sphere formation ability)を確認した図である。 H460から分離したALDH陰性細胞(ALDH- H460)に、pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120DまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた後、Sphere形成能(Sphere formation)を確認した図である。 TSPYL5の120番目のトレオニンのリン酸化によるがん幹細胞化の増加機序を図式化したものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いたアミノ酸配列は、IUPAC-IUB命名法に応じて、次のように記載した。
トレオニン(Threonine)：T、
アスパラギン酸(Aspartic acid)：D、
アラニン(Alanine)：A。
本発明は、配列番号43または配列番号44のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
前記ペプチドは、癌細胞の成長、転移、またはsphere形成を抑制することを特徴とし、TSPYL5の120番目のアミノ酸のリン酸化を抑制し、TSPYL5のユビキチン化(ubiquitination)を促進し、SUMO化(SUMOylation)を抑制すること特徴とする。
本発明の具体的な実施例では、配列番号43または配列番号44のアミノ酸配列からなるペプチドを癌細胞に処理したとき、細胞の成長と転移が減少し、sphere形成が抑制されることを確認した(図10参照) 。
したがって、本発明のペプチドは、癌細胞の成長または転移の阻害剤、またはがん幹細胞の成長阻害剤として有用に用いることができる。
本発明のペプチドは、この分野でよく知られている方法、例えば、自動ペプチドシンセサイザーによって合成することができ、遺伝子操作技術によって産生することもできる。例えば、遺伝子操作を介して融合パートナーと本発明のペプチドからなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子を製造し、それに宿主微生物を形質転換させた後、宿主微生物で融合タンパク質の形で発現させた後、タンパク質分解酵素または化合物を利用して、融合タンパク質から、本発明のペプチドを切断、分離して、目的ペプチドを産生することができる。このため、例えば、Factor Xaやエンテロキナーゼのようなタンパク質分解酵素、CNBrまたはヒドロキシルアミンのような化合物によって切断することができるアミノ酸残基をコードするDNA配列を融合パートナーと本発明のペプチド遺伝子の間に挿入することができる。
また、本発明は、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する癌の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する癌転移の予防または抑制用組成物を提供する。
本発明の具体的な実施例では、本発明のペプチドを癌細胞に処理したとき、細胞の成長および転移が減少し、sphere形成が抑制されることを確認したので、これを有効成分として含有する組成物は、癌の予防または治療、または癌転移の予防または抑制に有用に用いることができる。
また、本発明は、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有するがん幹細胞の成長抑制用組成物を提供する。
前記がん幹細胞は、がん幹細胞マーカーであるCD133(prominin-1; AC133)、CD44(hyaluronate receptor; Pglycoprotein 1)およびALDH1(Aldehyde dehydrogenase 1)からなる群から選択されるいずれか一つのマーカーによって選別されたことを特徴とする。
本発明に係る薬学的組成物は、本発明のペプチドを単独で含有するか、または複数の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含有することができる。
薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体または非経口投与用の担体をさらに含むことができる。経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含むことができる。
併せて、ペプチド製剤に対する経口投与用に使用される多様な薬物送達物質を含むことができる。また、非経口投与用担体は、水、適切な油、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができ、安定化剤、および保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロライド、メチル-またはプロピル-パラベン、およびクロロブタノールがある。本発明の薬学的組成物は、前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤などをさらに含むことができる。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。
また、本発明の組成物は、人間をはじめとする哺乳動物にどのような方法でも投与することができる。例えば、経口または非経口的に投与することができる。非経口的な投与としては、注射投与を含む消化管を通さないすべての投与経路をいう。非経口的な投与方法としてはこれに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸内投与であり得る。局所投与は、クリーム、軟膏、ゲルおよび経皮パッチを含むが、これに限定されない皮膚を通じたすべての投与経路を含む。
本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路に応じて経口投与用または非経口投与用製剤に剤形化することができる。
経口投与用製剤の場合に、本発明の組成物は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液などとして、当業界に公知された方法を用いて剤形化することがことができる。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体賦形剤と配合して、これを粉砕して適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物に処理することにより、錠剤または糖衣錠剤を得ることができる。適切な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、およびマルチトールなどを含む糖類とトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、およびジャガイモ澱粉などを含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどの充填剤を含むことができる。また、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネートなどを崩解剤として添加することができる。さらに、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、および防腐剤などをさらに含むことができる。
非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、点眼剤、エアゾールおよび鼻腔吸入剤の形で、当業界に公知された方法で製剤化することができる。
好ましい滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される溶媒または希釈剤中の溶液または懸濁液であり得る。薬剤学的に許容される担体またはビークルの例としては、生理食塩水、緩衝食塩水、等張性生理食塩水(例えば、リン酸一ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどや、またはそれらの混合物)、リンゲル液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物がある。好ましくは、1,3-ブタンジオール、および滅菌固定化油が溶媒または懸濁媒質として用いられる。オレイン酸のような脂肪酸も注射剤の製造に用いることができる。
これらの剤形はすべて、製薬化学において一般的に公知された処方書である文献(Remington's Pharmaceutical Science,15thEdition,1975年。Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87：Blaug,Seymour)に記載されている。
本発明の組成物の総有効量は、単一投与量(single dose)で患者に投与することができ、多重投与量(multiple dose)で長期間投与する分割治療方法(fractionated treatment protocol)によって投与することができる。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて、有効成分の含有量を異にすることができる。好ましくは、本発明のペプチドの好ましい全体容量は1日当たり患者の体重1kg当たり約0.0001μg〜500mg、最も好ましくは0.01μg〜100mgであり得る。しかし、前記ペプチドの用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌および排泄率など、さまざまな要因を考慮して、患者の有効投与量が決定されるものであるので、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されるものではない。
また、本発明は、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドを、癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
また、本発明は、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドを、個体に投与する工程を含む、癌の予防方法を提供する。
また、本発明は、癌の予防または治療用組成物として用いるための、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドの用途を提供する。
また、本発明は、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドを癌にかかった個体に投与する工程を含む、がん転移抑制方法を提供する。
また、本発明は、癌転移抑制用組成物として用いるための、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドの用途を提供する。
さらに、本発明は、がん幹細胞の成長抑制用組成物として用いるための、配列番号43または44のアミノ酸配列からなるペプチドの用途を提供する。
以下、本発明を下記の実施例及び実験例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例及び実験例は本発明を説明するためのもので、本発明は下記の実施例及び実験例によって限定されない。
<実施例1>過発現細胞作製
<1-1> TSPYL5、PTEN、AKT1遺伝子の過発現ベクター作製
TSPYL5、PTEN、AKT1遺伝子の過発現細胞を下記の方法で作製した。まず、TSPYL5、PTEN、AKT1遺伝子は、肺癌細胞であるA549またはH460細胞由来mRNAから逆転写反応で獲得した。
詳細には、肺癌細胞であるA549またはH460細胞にトリゾール1mlを加えて5分間混合した後、200μlのクロロホルム試薬を入れてもう一度5分間混合した後、4℃で10分間遠心分離し、200μlの上澄み液を新しいチューブに移した。ここで、500μlのイソプロパノール(isopropanol)を混合した後、常温で10分間反応させ、4℃で遠心分離して上澄み液を除去し、沈殿物を75％エタノールが添加されたDEPC溶液で洗浄した後、再び遠心分離して、上澄み液を除去した。沈殿物は、DEPC水溶液で溶かしmRNAを確保し、cDNAキット(iNtRON Biotechnology)を使用して定量したRNA 1μgを45℃で1時間、95℃で5分間処理してcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、I-taqポリメラーゼ(iNtRON)と作製したTSPYL5、PTENおよびAKT1プライマー(表1)を用いて重合反応を行った。重合反応は、94℃で5分間前変性させた後、94℃で1分間変性、56℃で1分間アニーリング、72℃で1分30秒間の延長を実行する工程を30回繰り返した後、72℃で5分間の後延長を行った。
重合連鎖反応で獲得したTSPYL5、PTENおよびAKT遺伝子は、pcDNA3.1(Invitrogen,米国)ベクターをそれぞれ制限酵素で処理した後、混合してリガーゼ(ligase)で連結させて完成したベクターをクローニング技法で選別して過発現用pcDNA3.1/TSPYL5、pcDNA3.1/PTENおよびpcDNA3.1/AKT1ベクターを作製した。
<1-2>TSPYL5変異体(mutation)過発現ベクター作製
TSPYL5の120番目残基のトレオニンをアラニンに(120A)、トレオニンをアスパラギン酸(120D)に変形するために、さらに、QuickChange MultiSite-Directed Mutagenesisキット(Agilent Technologies)を用いて、pcDNA3.1/TSPYL5ベクターに遺伝子変異を導入した。詳細には、pcDNA3.1/TSPYL5ベクターを表2に記載したプライマーとI-taqポリメラーゼ(iNtRON)で95℃で5分間前変性させた後、95℃で1分間変性、58℃で1分間アニーリング、72 ℃で15分間の延長を行なう工程を20回繰り返した後、72℃で7分間後延長を行った。収得物30μlにDpnI 1μlと10x buffer 3.5μlを添加して37℃で1時間反応させた後、前記実施例<1-1>と同様の方法でpcDNA3.1ベクターに連結させることで、pcDNA3.1/TSPYL5-T120A、pcDNA3.1/TSPYL5-T120D、pcDNA3.1/TSPYL5-T177A、pcDNA3.1/TSPYL5-T326AおよびpcDNA3.1/TSPYL5-T409Aを作製した。
<1-3>過発現細胞の作製
TSPYL5とAKT過発現用ベクター4μgは、2×105cell/mlのH460細胞、PTEN過発現用ベクター4μgは、2×105cell/mlのA549細胞にLipofectamine2000を使用して、ペニシリン-ストレプトマイシン(penicillin-streptomycin solution：Hyclone)が添加されていない培地で形質導入し、4〜6時間反応させた後、100units/mlのペニシリン-ストレプトマイシンを添加した培地に交換して48時間培養した。
<実施例2>TSPYL5、AKT、PTEN発現抑制
細胞内TSPYL5、AKT、およびPTENの発現を抑制するために、siRNAを利用する実験を行った。
詳細には、TSPYL5とAKTの発現抑制はA549細胞、PTEN発現抑制はH460細胞を用いて行い、細胞2×105個当たりの各遺伝子特異siRNAとScrambled StealthTM RNA分子(陰性対照群;siControl)100nMをLipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)を用いて、メーカーのプロトコルに従って、ペニシリン-ストレプトマイシンが添加されていない培地で細胞に形質導入し、4〜6時間反応させ、100units/mlのペニシリン-ストレプトマイシンを添加した培地に交換して72時間培養した。
さらにAKT(serine/threonine protein kinase)阻害剤であるMK2206(Santa Cruze Biotechnology)を20μM処理した後、時間によるAKTリン酸化抑制およびTSPYL5タンパク質の発現抑制を調べた。
<実験例1>PTENによるTSPYL5の発現調節効果確認
<1-1>PTEN過発現または抑制を通じたALDHおよびCD44の発現変化を確認
PTENの過剰発現または抑制によるがん幹細胞の特性の変化を確認するために、がん幹細胞マーカーであるALDH1およびCD44の発現の変化をALDEFLUOR染色およびCD44抗体染色後フローサイトメトリーで確認した。
詳細には、A549細胞(VC)、PTEN発現を過発現させたA549細胞(PTEN(+))、H460細胞(si-CTL)とPTENが抑制されたH460細胞(si-PTEN)に、0.5mlのALDEFLUOR assayバッファーを混ぜて1×106cell/mlになるように準備し、空のチューブ二つに溶解した細胞および活性化したALDEFLUOR基質を5μlずつ入れて混合した後、対照群のチューブに500μlを分けて入れて、対照群にのみALDH1活性阻害剤であるDEAB(Diethylaminobenzaldehyde)溶液を5μl入れた。以降、それぞれ37℃で30分間反応させた後、遠心分離を介して上層液を除去し、500μlのALDEFLUOR assayバッファーを入れて4℃でFACScanを用いて分析した(図1aおよび図1b)。
また、A549細胞でCD44発現の程度を比較するために、Anti-CD44抗体-APCで細胞面染色を実施してフローサイトメトリーを実施した。1×106cell/mlのA549細胞、500μlのPBSバッファーおよび10μlのAnti-CD44抗体-APC試薬を入れて、4℃で30分間反応させた。ここで、10μlのマウスF(ab')2 IgG1-APCを同じ条件で反応させて非特異的抗体反応の対照群として定め、対照群の範囲を超えるAPC蛍光を表わす領域をCD44発現細胞で分析した(図1aおよび図1b) 。
以上の実験の結果、PTEN過発現または抑制の調節によってALDEFLUOR染色およびCD44染色が減少または増加することを確認して、PTEN過発現または抑制によってがん幹細胞マーカーであるALDH1およびCD44の発現が調節されることを確認した(図1a及び図1b)。
<1-2>PTEN過発現または抑制を通じたTSPYL5の発現変化確認
PTEN過発現または抑制の調節を介してTSPYL5遺伝子および蛋白質の変化を確認するために、A549細胞(VC)、PTEN発現を過発現させたA549細胞(PTEN(+))、H460細胞(si-CTL)とPTENが抑制されたH460細胞(si-PTEN)で、がん幹細胞マーカーであるALDH1A1、ALDH1A3およびCD44のmRNAおよび蛋白質発現量を確認した。
詳細には、当該細胞からmRNAを抽出し、逆転写重合連鎖反応を実行するために、前記細胞にトリゾール1mlを入れて5分間混合した後、200μlのクロロホルム試薬を入れてもう一度5分間混合した後、4℃で10分間遠心分離して、200μlの上澄み液を得、新しいチューブに移した。その後、500μlのイソプロパノールを混ぜて常温で10分間反応させ、4℃遠心分離器を用いて上澄み液を除去した沈殿物をDEPCが添加された75％エタノールで洗浄した。再び遠心分離器を用いて上澄み液を除去し、残った沈殿物をDEPC溶液で溶解させ、定量を行った後、cDNAキット(iNtRON Biotechnology)を使用してRNA1μgを45℃で1時間、95℃で5分で増幅機械を使用してcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、I-taqポリメラーゼ(iNtRON)と表4に記載したプライマーを用いて重合反応を行った。重合反応は、94℃で5分間前変性させた後、94℃で30秒間変性、56℃で30秒間アニーリング、72℃で30秒間の延長を行う工程を30回繰り返した後、72℃で10分間後延長した後、収得物を1％アガロースゲルにロードして確認した。
また、タンパク質の発現量を確認するためウエスタンブロットは、下記のように行った。分析対象の細胞に溶解液(0.05M Tris-cl(pH7.4)、0.15M NaCl、0.25％deoxycholic acid、1％NP-40、1mM EDTA、protease inhibitor cocktail)を入れ、4℃で30分間反応させた後、4℃で遠心分離して上澄み液を得て、上澄み液を定量した後、それぞれのタンパク質を40μgずつSDS-ゲルにロードし、電気泳動した。ニトロセルロース膜にタンパク質を移動させた後、BSA含有バッファーで30分間、室温でブロッキング(blocking)した後、PBSで1：1000に希釈した一次抗体PTEN、TSPYL5(Santa Cruz)、ALDH1A1、ALDH1A3(Abcam)、CD44 、β-actinまたはGAPDH(CST)を4時間反応させた。再び二次抗体を1：10000の割合で希釈したバッファに1時間反応させた。その後、ニトロセルロース膜をPBSで5回洗浄した後、検出溶液でフィルムに感光させた。
その結果、図1cおよび図1dに示すように、肺癌細胞株A549細胞でPTENを過発現させた場合には、がん幹細胞マーカーであるALDH1A1、ALDH1A3およびCD44遺伝子とタンパク質が顕著に減少していて、肺癌細胞株H460の細胞でPTENの発現を抑制させた場合には、がん幹細胞マーカーであるALDH1A1、ALDH1A3およびCD44の遺伝子およびタンパク質の発現が増加した(図1cおよび図1d)。
また、以上の細胞でPTEN調節によってTSPYL5の細胞内の遺伝子および蛋白質の量を確認したが、TSPYL5のタンパク質の発現量は、PTENの調節によって増減したが、TSPYL5の遺伝子発現転写体の量は、変わらなかったことを確認した。
したがって、PTEN発現量の調節は、がん幹細胞マーカーであるALDH1A1、ALDH1A3およびCD44の発現と密接に関連していることを確認することができ、TSPYL5の発現がタンパク質レベルでPTENの発現に影響を受けることを確認できた。
<実験例2>AKT遺伝子発現調節もしくはAKTリン酸化活性抑制を通じたTSPYL5の発現調節確認
非小細胞性肺癌細胞株でAKT遺伝子調節および活性抑制を通じたTSPYL5遺伝子および蛋白質の変化を確認するために、本発明者らは、肺癌細胞株A549細胞にAKT(serine/threonine protein kinase)阻害剤であるMK2206(Santa Cruze Biotechnology)20μMを処理し、siRNAを介しAKT1を抑制した後、<実験例1>と同様の方法で重合酵素連鎖反応およびウェスタンブロットを行い、AKTとTSPYL5の遺伝子および蛋白質の発現の変化を確認した。また、逆にAKT過発現ベクターを<実施例1-1>の方法で作製して、肺癌細胞株のH460細胞に<実施例1-3>の方法で形質転換した細胞を作成し、<実験例1>と同様の方法で実験を行った。
その結果、図2aに示すように、AKT1遺伝子の発現によってTSPYL5の遺伝子発現転写体の量は変わらなかったが、TSPYL5、ALDH1A1、ALDH1A3およびCD44のタンパク質の発現量は、AKTによっ変化することを確認できた(図2a) 。
また、図2bに示すように、MK2206によってAKTリン酸化を抑制させた場合、処理時間に比例してTSPYL5のタンパク質の発現が抑制されることを確認し、これにより、TSPYL5の発現が調節されることを確認した(図2b)。
<実験例3>細胞内TSPYL5の発現位置確認
<3-1>AKT/PI3K阻害剤処理によるTSPYL5発現位置変化確認
カバーガラスを含むペトリ皿に用意された1×105個のA549細胞に10μMのAKT抑制阻害剤であるMK2206および50μMのPI3K阻害剤であるLY294002を4時間処理し、4％パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)溶液で20分間細胞を固定させた。その後、PBSでカバーグラスを3回洗浄した後、0.5％TritonX-100溶液を5分間処理し、再度PBSで3回洗浄した。その後、1％BSAで20分間処理した後、PBSバッファで1：100に希釈した一次抗体TSPYL5(Santa Cruz)に2時間反応させ、1：1000に希釈した二次抗体Rabbit(Cell Signaling Technology )に1時間反応させた。その後、PBSで3回洗浄した後、DAPI溶液で5分間細胞核を染色し、蛍光顕微鏡でTSPYL5の発現位置および発現量の変化を確認した。
その結果、図3aに示すように、A549細胞でTSPYL5タンパク質が細胞核と細胞質で発現することを確認することができたが、AKTまたはPI3K阻害剤を処理した場合、核内でTSPYL発現が確認されなかった。また、実験例<1-1>と同様の方法でウエスタンブロット実験を行った結果、AKTまたはPI3K阻害剤を処理した場合、TSPYL5、リン酸化されたAKT、CD44、ALDH1A3およびALDH1A1のタンパク質発現量が減少することを確認した。
<3-2>TSPYL5変異体の細胞内発現位置確認
前記実施例<1-2>で製造したTSPYL5変異体の細胞内発現の位置を確認するために、pcDNA3.1/TSPYL5、pcDNA3.1/TSPYL5-120A、pcDNA3.1/TSPYL5-120D 5μgをLipofectamine2000(Invitrogen )を利用して、1x105個のH460細胞に形質転換させ、前記実験例<3-1>と同様の方法でTSPYL5の細胞内発現様相を確認した。
その結果、図3bに示すように、pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)およびリン酸化類似体(mimic)pcDNA3.1/TSPYL5-120Dを導入した細胞では、肺癌細胞株A549細胞のように、核内および細胞でTSPYL5が発現することを確認できた。しかし、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを導入した細胞の場合には、核内でTSPYL5の発現が確認されなかった。前記の結果を通じ、TSPYL5タンパク質の120番目のアミノ酸は、リン酸化され、リン酸化されたTSPYL5が核内に移動して、転写因子として機能するということを予想することができる。
さらに、細胞分画(cell fractionation)を実行して、TSPYL5の細胞質と細胞核での発現様相を確認した。10cm培養プレートに用意された1x106個のH460細胞に、pcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120A、pcDNA3.1/TSPYL5-120D 5μgをLipofectamine2000(Invitrogen)を用いて形質転換させ、72時間培養した後、細胞をTrypsine-EDTAで回収した。その後、PBSで2回洗浄した後、冷たいバッファーA(10mM HEPES(pH7.9)、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.5mM DTT)5mlで細胞を解いた後、氷に5分間放置した。その後、Ultra Sonic(Pulse on：2sec、Pulse off：8sec、Total working time 30sec)で細胞を破砕した後、3500rpm、4℃、10分間遠心分離を行い、上澄み液を回収して、新しいチューブに移し入れた。回収した上澄み液に50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1％NP-40および0.5％Deoxycholate組成を有するRIPAバッファーになるように10X濃度のバッファーを希釈して入れた後、細胞質タンパク質(Cytoplasmic protein )分画として使用したが、ここで、遠心分離沈殿物(pellet)は、核(nuclei)と副産物が存在することになる。沈殿物には、S1バッファー(0.25M Sucrose、10mM MgCl2)3mlを入れて、S3バッファー(0.88M Sucrose、0.5mM MgCl2)3mlを慎重に入れて、層が分離されるようにした。その後、3500rpm、4℃の条件で10分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した後、残った沈殿物にRIPAバッファーを加え、冷たい氷に30分間放置した。2000rpm、4℃の条件で30分間遠心分離して上澄み液を回収し、これを新たなチューブに移した。ここで、得られる上澄み液は、細胞核分画(Nucleus Fraction)に使用した。前記から得られた細胞質分画と細胞核分画をタンパク質定量した後、ウェスタンブロットで分析した。ここで、Tubulinは細胞質にのみ存在するタンパク質であり、細胞分画が順調に進んでいるかどうかを確認するためのマーカーとして使用した。
その結果、図3bに示すように、120番目のトレオニン残基をアラニンに変形させたTSPYL5-120A変異体は、核内に移動できずに細胞質でのみ発現し、TSPYL5(正常型)とスレオニン残基類似体のTSPYL5-120Dは、核の中では発現することを確認した(図3b)。
また、異なるリン酸化部位である326番目のトレオニンアミノ酸と409番目のトレオニンアミノ酸残基をアラニンに変形させたTSPYL5-326AとTSPYL5-409A変異体をH460細胞に導入した結果、図3cに示すように、すべての核で発現することを確認することができた(図3c)。また、実験例<1-1>と同じ方法でウエスタンブロット実験を行った結果、図3cに示すように、CD44、TSPYL5およびALDH1A1のタンパク質発現量が増加することを確認した(図3c)。
<実験例4>TSPYL5とAKTタンパク質の結合確認
TSPYL5とAKTの結合を確認するため、肺癌細胞株A549細胞またはH460細胞にそれぞれ正常型TSPYL5またはTSPYL5-120Aを形質転換させた細胞からタンパク質を分離した後、TSPYLまたはAKTに対する抗体を200：1の割合で入れて4℃の回転機に入れて12時間以上反応させた後、用意されたA+Gアガロースビーズを、一部入れて5時間さらに反応させた。その後、2000rpm、4℃の条件で3分間遠心分離した後、上澄み液を取り出し、残りのビーズをタンパク質抽出溶液で3回洗浄し、95℃でタンパク質を加熱した後、ウェスタンブロットを介してタンパク質の結合を確認した。
その結果、図4に示すように、正常型TSPYL5タンパク質はAKTと結合することを確認したが、TSPYL5-120A変異体は、AKTと結合しておらず(図4)、これを根拠にAKTがTSPYL5に結合してTSPYL5の120番目スレオニン残基をリン酸化することができることを予想することができる。
<実験例5>TSPYL5のユビキチン化分析(Ubiquitination assay)
ユビキチンプロテアソーム(Ubiquitin Proteasome)機序は、細胞内でタンパク質が合成された後、その活性が調節される機序(Post-translational modification)の一つで、真核生物で表われるタンパク質分解機序(Proteolysis)である。ほとんど(約80％)の細胞タンパク質は、ユビキチン標識化後、プロテアソームで分解される。
前記<実施例1>で作製したpcDNA3.1/TSPYL5(正常型)とpcDNA3.1/TSPYL5-120AをH460細胞に形質導入し、48時間後に10μMのMK2206を1時間処理した後、細胞を得た。その後、細胞分解液(2％SDS、150mM NaCl、10mM Tris-Hcl pH8.0)にタンパク質分解阻害酵素を混合して置いた後、100μlを細胞に入れて音波処理機を使用して細胞を破砕し、13000rpmで遠心分離を行った。以後、上層液のみを集めて希釈溶液(0.01％SDS、1.1％Triton X-100、1.2mM EDTA、16.7mM Tris-HCl(pH8.1)、167mM NaCl)に10分の1入れて、4℃で30分間反応させた後、TSPYL5またはユビキチン抗体で一晩結合させた後、Protein A/Gアガロースビーズを入れて4時間反応させた。以後、洗浄溶液(10mM Tris-HCl pH8.0、1M NaCl、1mM EDTA、1％NP40)で2回洗浄した後、ローディング溶液を混合して95℃でタンパク質を加熱した後、サンプルをロードしてTSPYL5またはユビキチン抗体で反応させてタンパク質の発現を確認した。
その結果、図5に示すように、AKT阻害剤の処理時TSPYL5リン酸化が抑制され、ユビキチン化が増加され、TSPYL5-120Aが過発現する場合には、AKT活性とは無関係にTSPYL5-T120Aタンパク質のユビキチン化が起こることを確認した。また、前記の結果とプロテアソーム阻害剤であるMG132の処理結果から、TSPYL5は120番目のアミノ酸がリン酸化される場合には、タンパク質の分解が抑制され、リン酸化されないTSPYL5-120Aはユビキチン・プロテアソーム機序過程によって分解されることが分かる(図5)。
<実験例6>TSPYL5のSUMO化分析(SUMOylation assay)
ユビキチンタンパク質は、特定のタンパク質を分解させる作用をするが、これとは異なり構造的に類似したSUMOタンパク質は、細胞内のタンパク質を核内に移動させたり、結合するタンパク質の変更またはDNA転写因子のDNA結合および転写能力の変化などのタンパク質の機能的変化を調整することが知られている。そこで、本実験でTSPYL5のSUMO化とTSPYL5タンパク質の核内移動との関連性を調べるためにSUMO化分析実験を行った。
詳細には、前記<実施例1>で作製したpcDNA3.1/TSPYL5(正常型)およびpcDNA3.1/TSPYL5-120AとHis-taggingされたSUMO-発現ベクターをさらに形質導入したH460細胞をRIPAバッファーに溶解させた後、上澄み液のみを集めてHis-tag親和性ビーズと4時間反応させた。以後、ビーズのみを回収して、サンプルバッファーを処理して、ウェスタンブロット後、TSPYL5抗体を反応させた。
その結果、図6に示すように、肺がん細胞株H460の細胞にpcDNA3.1/TSPYL5(正常型)を形質注入した細胞では、SUMO化が確認されたが、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを発現させた細胞では、SUMO化が確認されなかった。また、SUMO化の抑制を確認するために、SUMO1阻害剤であるGinkgolic acid(Abcam)3uMを2時間A549細胞に処理した結果、TSPYL5タンパク質が核で発現しなかった。このような結果を通じてTSPYL5のユビキチン化とSUMO化は、120番目のトレオニン残基のリン酸化によって調節されることを確認し、SUMO化によりTSPYL5の核への移動が調節されることを確認することができる(図6)。
<実験例7>TSPYL5の120番目のトレオニンアミノ酸残基の変形によるALDH1 isozymeおよびCD44の発現変化確認
前記<実験例1>の方法を利用して、H460細胞にpcDNA3.1/TSPYL5(正常型)とpcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させた後、がん幹細胞マーカーであるALDH1およびCD44の発現量を確認した。
その結果、図7a〜図7cに示すように、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた場合には、ALDH1A1、ALDH1A3およびCD44遺伝子、およびタンパク質の発現が減少することを確認し、ALDEFLUORとCD44-APCを用いてFACScanでALDH活性およびCD44の発現を確認した結果、TSPYL5(正常型)では、ALDH1の発現量が19％だったが、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aの場合、12.8％に減少し、CD44の発現量はTSPYL5(正常型)では51.7％であったが、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた場合には、38.1％に減少することが確認された(図7a〜図7c)。
したがって、TPSYL5の120番目のトレオニンアミノ酸残基のリン酸化によって、ALDH1 isozymeおよびCD44の遺伝子、およびタンパク質の発現量が増加することが分かる。
<実験例8>TPSYL5の120番目のトレオニンのアミノ酸残基変形による癌細胞転移能力の分析
TPSYL5の120番目のトレオニンのアミノ酸残基変形による癌細胞の転移を測定するために、0.8μmのporeサイズを有するTranswell(Falcon、米国)を用いて移動分析(Migration assay)を行った。
詳細には、H460細胞と前記<実施例1>で作製されたpcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させたH460細胞5×104個をSerum-free RPMI1640培地100μlに混合して、Transwell upperチャンバーに入れて、lowerチャンバーには7％FBSが添加されたRPMI1640培地500μlを入れて、二つのチャンバーを結合させた。以降、約40時間、細胞を5％CO2の条件である37℃培養器で維持させた後、Upperチャンバーの膜をCotton swabsを利用して拭いて、Crystal Violet溶液で染色した後、顕微鏡で観察した。
また、浸潤分析(Invasion assay)は、Transwell upperチャンバーに事前にMatrigel(20μg/well; BD GBiosciences)を100μl入れてコーティングさせて準備した後、前記移動分析と同様に行った。クリスタルバイオレット溶液で染色された細胞を、10％酢酸500μlで溶出した後、O.D 600の値を測定し、H460細胞に対する移動/浸潤の相対値を測定した。
その結果、図8aに示すように、TSPYL5(正常型)とpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させた細胞では、癌細胞の転移がよく起きたが、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた細胞は、H460対照群細胞よりも癌細胞の転移が減少することを確認した(図8a)。
<実験例9>TPSYL5の120番目のトレオニンアミノ酸残基変形によるsphere formation形成の変化確認
H460細胞と前記<実施例1>で製造されたpcDNA3.1/TSPYL5(正常型)、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させたH460細胞のsphere formation形成能力を分析するために、Stem cell-permissive培地が含まれているDMEM(Invitrogen)培地に2×104個の非小細胞性肺癌細胞を浮遊状態で準備した。以後、DMEM-F12培地(Invitrogen)に20ng/mlのEGF、20ng/mlのbasic fibroblast growth factor(bFGF)およびB27 Serum-free Supplement(50X; Invitrogen)を混合し、0.8％agarで前処理コーティングされた60mmプレートに培養した。37℃の培養器で5％CO2の条件を維持しつつ、10日間培養した後、Sphere形成程度を測定した。
その結果、図8aに示すように、TSPYL5(正常型)およびpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させた細胞では、Sphereが形成されたが、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた場合には、Sphereの形成および成長が減少することを確認した(図8a)。
<実験例10>TPSYL5の120番目のトレオニンアミノ酸残基変形による癌細胞の成長と放射線感度確認
H460細胞と<実施例1>で作製したpcDNA3.1/TSPYL5、pcDNA3.1/TSPYL5-120AまたはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させたH460細胞1×103個を35mmプレートに分注して、37℃の培養器で5％CO2の条件を維持しながら、8日間培養した後、0.5％のクリスタルバイオレット試薬で10分間染色し、数回PBSで洗浄した後、細胞の成長を確認した。
その結果、図8bに示すように、H460細胞にTSPYL5(正常型)またはpcDNA3.1/TSPYL5-120Dを過発現させたとき、細胞成長が増加したが、pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた場合には、H460対照群細胞よりも細胞成長が減少することを確認した。また、放射線を処理したとき(コバルト60放射線源、2Gy)pcDNA3.1/TSPYL5-120Aを過発現させた場合は、H460対照群細胞よりも細胞成長が減少することを確認した(図8b)。
<実験例11>TSPYL5の転写活性調節因子としての機能確認
TSPYL5の転写活性調節因子としての機能を確認するためクロマチン沈降法を実施した。
詳細には、100mmプレートにA549細胞を培養した後、収得する前に培地の1％になるようにホルムアルデヒドを処理し、インキュベーターで20分間反応させた後、タンパク質分解阻害剤を入れたPBSで2回洗った後、細胞を集めて遠心分離機で分離して細胞だけを得た。固定化後、分離した細胞にSDS溶解溶液を入れて氷で反応させた後、超音波破砕機で細胞を破壊して上澄み液だけを分離した。希釈溶液(0.01％SDS、1.1％TritonX-100、1.2mM EDTA、16.7mM Tris-HCl(pH8.1)、167mM NaCl)を入れて細胞を30分間反応させた後、TSPYL5抗体を一晩結合させた後、Protein A/Gアガロースビーズを入れて4時間さらに反応させた。遠心分離器でビーズのみ取り出して添加されたバッファで複数回洗浄した後、溶出溶液(20％SDS、1M NaHCO3)で反応させた後、分離した。5MのNaClを処理し、65℃で4時間反応させた後。0.5M EDTA、1M Tris-HCl(pH6.5)および10mg/ml濃度のproteinase K 2μlを入れて、45℃で1時間反応させた。以後、これを鋳型として、表5に記載されたプライマーを使用して連鎖重合酵素反応を実施した。重合反応結果物はアガロースゲルで分析した。
その結果、図9に示すように、TSPYL5発現によって影響を受けたALDH1A1、ALDH1A3、CD44およびPTEN遺伝子がTSPYL5と結合していることを確認し、これにより当該遺伝子の発現が核内に発現するTSPYL5によって調節されることを確認した(図9)。
<実験例12>TPSYL5ペプチド処理による癌細胞の成長阻害確認
以上の実験例の結果からTSPYL5のリン酸化による機能調節が、がん幹細胞の特性に重要な遺伝子の転写調節因子として作用することを確認したので、がん幹細胞の成長を抑制する方式としてTSPYL5の120番目のトレオニンのリン酸化阻害剤を構成して活用することができる。そこで、本発明者らは下記の表6に記載されたTSPYL5の120番目のトレオニンを含む15merのアミノ酸で構成されたペプチドおよび類似体を合成して、がん細胞の成長抑制効果があるかどうかを確認した。
TSPYL5機能抑制ペプチドは、120番目のTを中心に前後7個ずつのアミノ酸配列を含むようにし、120番目のトレオニンの変異体でTがDまたはAで置換された変異ペプチドを合成した。一般的に、ペプチドは、細胞透過性がないため、これを克服するために、ペプチド配列のC末端にPEGylationを実施し、細胞透過性を有するTSPYL5由来ペプチドを合成し、効果検証試験に使用した。
詳細には、A549細胞1×103個を35mmプレートに分注し、10μMの濃度でそれぞれのペプチドを処理した。対照群には、DMSOを使用して、37℃の培養器で5％CO2の条件で8日間培養した後、0.5％のクリスタルバイオレット試薬で10分間染色し、数回PBSで洗浄した後、細胞の成長を確認した。
その結果、図10に示すように、対照群に比べてTS120TとTS120Dペプチドを処理した場合に、細胞の成長が阻害された。しかしTS120Aは対照群と差がなかった(図10)。
<実験例13>TSPYL5ペプチド処理による癌細胞転移及び浸潤能力減少確認
A549細胞5×104個をSerum-free RPMI1640培地100μlと前記表6に記載されたペプチド10μMを混合してTranswell upperチャンバーに入れて、lowerチャンバーには7％FBSが添加されたRPMI1640培地500μlを入れて、二つのチャンバーを結合させた。以降、約40時間細胞を37℃の培養器で5％CO2の条件で培養した後、Upperチャンバーの膜をCotton swabsを用いて拭き、クリスタルバイオレット溶液で染色した後、顕微鏡で観察した。
また、浸潤分析(Invasion assay)は、Transwell upperチャンバーに事前にMatrigel(20μg/well;BD Biosciences)を100μl入れてコーティングさせ、前記移動分析と同様に行った。クリスタルバイオレット溶液で染色された細胞を、10％酢酸500μlで溶出した後、OD600値を測定し、A549細胞に対する移動/浸潤相対値を測定した。
その結果、図10に示すようにTS120TとTS120Dペプチドを処理すると転移と浸潤が対照群に比べて減少することを確認できた。しかし、TS120Aペプチドを処理すると、対照群と大きな差がないことを確認した(図10)。
<実験例14>TSPYL5 peptideによるSphere形成抑制確認
TSPYL5ペプチドのsphere形成抑制能力を分析確認するために、stem cell-permissive培地が含まれているDMEM培地(Invitrogen)に2×104個の非小細胞肺癌細胞であるA549を浮遊状態で準備した。以後、DMEM-F12培地(Invitrogen)に20ng/mlのEGF、20ng/mlのbasic fibroblast growth factor(bFGF)とB27 Serum-free Supplement(Invitrogen)を混合し、0.8％agarで前処理コーティングされた96wellプレートに1個の細胞を分注し、10μMの濃度のペプチドをそれぞれ処理した後、培養し、37℃の培養器で5％CO2の条件で培養し、10日後、Sphere形成を測定した。
その結果、図10に示すように、対照群とTS120Aペプチドを処理した場合には差がなかったが、TS120TとTS120Dペプチドを処理すると、対照群に比べてsphere形成が阻害されることを確認することができた(図10)。

Claims (8)

  1. 配列番号43または配列番号44のアミノ酸配列からなるペプチド。
  2. 癌細胞の成長、転移、またはSphereの形成を抑制する組成物を製造するための請求項１に記載のペプチドの使用。
  3. TSPYL5(testis-specific protein,Y-encoded-like 5)の120番目のアミノ酸のリン酸化を抑制する組成物を製造するための請求項１に記載のペプチドの使用。
  4. TSPYL5のユビキチン化(ubiquitination)を促進し、SUMO化(SUMOylation)を抑制する組成物を製造するための請求項１に記載のペプチドの使用。
  5. 請求項１のペプチドを有効成分として含有する癌の予防または治療のための薬学的組成物。
  6. 請求項１のペプチドを有効成分として含有する癌転移の予防または抑制用組成物。
  7. 請求項１のペプチドを有効成分として含有するがん幹細胞の成長抑制用組成物。
  8. 前記がん幹細胞が、がん幹細胞マーカーであるCD133(prominin-1; AC133)、CD44(hyaluronate receptor; Pglycoprotein 1)およびALDH1(Aldehyde dehydrogenase 1)からなる群から選択されるいずれか一つのマーカーによって選別されたものであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
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