JP6603663B2 - マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法 - Google Patents

マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6603663B2
JP6603663B2 JP2016540965A JP2016540965A JP6603663B2 JP 6603663 B2 JP6603663 B2 JP 6603663B2 JP 2016540965 A JP2016540965 A JP 2016540965A JP 2016540965 A JP2016540965 A JP 2016540965A JP 6603663 B2 JP6603663 B2 JP 6603663B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
enclosure
cell
nucleic acid
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016540965A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017504315A5 (ja
JP2017504315A (ja
Inventor
ティー． チャプマン，ケヴィン
ディー． ホッブズ，エリック
ダブリュ． ショート，スティーヴン
ピー． ホワイト，マーク
マレオ，ダニエレ
Original Assignee
バークレー ライツ，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バークレー ライツ，インコーポレイテッド filed Critical バークレー ライツ，インコーポレイテッド
Publication of JP2017504315A publication Critical patent/JP2017504315A/ja
Publication of JP2017504315A5 publication Critical patent/JP2017504315A5/ja
Priority to JP2019188011A priority Critical patent/JP6954972B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6603663B2 publication Critical patent/JP6603663B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C5/00—Separating dispersed particles from liquids by electrostatic effect
    • B03C5/005—Dielectrophoresis, i.e. dielectric particles migrating towards the region of highest field strength
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C5/00—Separating dispersed particles from liquids by electrostatic effect
    • B03C5/02—Separators
    • B03C5/022—Non-uniform field separators
    • B03C5/026—Non-uniform field separators using open-gradient differential dielectric separation, i.e. using electrodes of special shapes for non-uniform field creation, e.g. Fluid Integrated Circuit [FIC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0424—Dielectrophoretic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0454—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces radiation pressure, optical tweezers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)

Description

背景
生物学的分野において、生体細胞から核酸材料を抽出および捕捉することは有用であり得る。かかる核酸材料の例は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマー、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する細胞小器官、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーまたはオリゴマーを包含する細胞小器官、および同様のものを含む。本発明の態様は、個々の生体細胞から特定の種類の核酸材料を抽出および選択的に捕捉するためのデバイスおよび方法を含む。
概要
本発明のいくつかの態様において、個々の生体細胞から核酸材料を捕捉する方法は、個々の生体細胞をマイクロ流体デバイスにおける異なる単離囲い（isolation pen）中に配置することを含み得る。この方法はまた、単離囲いにおける細胞の１つを溶解し、および単離囲いにおける溶解した細胞から核酸材料における捕捉物体を捕捉することを含み得る。方法は、捕捉物体を単離囲いから取り除くことをさらに含み得る。
本発明のいくつかの態様において、マイクロ流体デバイスは、共通空間、単離囲い、捕捉物体および選択手段を含み得る。捕捉物体は、単離囲いの１つにおいて置かれるように寸法決めされ得る。捕捉物体の各々は、他の種類の核酸材料に結合するよりも少なくとも２倍の特異度を以て特定の種類の核酸材料に結合する捕捉材料を含み得る。選択手段は、選択された細胞を異なる単離囲い中へ移動するためのものであり得る。
本発明のいくつかの態様において、マイクロ流体デバイスは、単離囲い、移動手段および相関手段を含み得る。単離囲いは、生体細胞および捕捉物体を包含するように寸法決めされることができ、それが生体細胞から核酸を捕捉するように構成され得る。移動手段は、個々の生体細胞を単離囲い中へ移動するためのものであり得る。相関手段は、単離囲いにおける捕捉物体と、単離囲いにおける生体細胞が由来するクローン細胞集団（clonal cell colonies）とを相関させる相関記録を生み出すためのものであり得る。
図１は、本発明のいくつかの態様に従う生体細胞から核酸材料を選択的に捕捉するための方法の例である。 図２Ａは、図１の方法が実施され得る、本発明のいくつかの態様に従うマイクロ流体デバイスの斜視図である。 図２Ｂは、図２Ａのマイクロ流体デバイスの水平、断面図である。 図２Ｃは、図２Ａのマイクロ流体デバイスの垂直、断面図である。
図３は、単離囲いが基部中のくぼみとして構成される例を示す、本発明のいくつかの態様に従う図２Ａのマイクロ流体デバイスの基部の部分的な垂直断面図である。 図４Ａは、マニピュレータが光電ピンセット（ＯＥＴ）として構成される、本発明のいくつかの態様に従う図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの部分的な垂直断面図である。 図４Ｂは、図４Ａの部分的な水平、断面図である。 図５は、本発明のいくつかの態様に従う図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの選択部における複数の細胞の例を図説する。
図６は、本発明のいくつかの態様に従うデバイスにおいて、図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの選択部における個々の生体細胞を選択し、および選択された細胞を単離囲い中へ移動する例である。 図７は、本発明のいくつかの態様に従う、図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの単離囲いにおける細胞を溶解試薬で溶解する例を示す。 図８は、本発明のいくつかの態様に従う、図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの単離囲いにおける細胞を溶解機構で溶解する例である。 図９は、本発明のいくつかの態様に従う、図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの単離囲いの内側空間中で溶解した細胞から流れる核酸材料を示す。
図１０は、本発明のいくつかの態様に従う、図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの囲いの１つにおける捕捉物体の例を図説する。 図１１は、本発明のいくつかの態様に従う、捕捉物体の構成例を示す。 図１２Ａは、細胞の外側膜を示す図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの囲いにおける細胞の例および細胞内部の要素の例を図説する。 図１２Ｂは、本発明のいくつかの態様に従う、図１２Ａの細胞を溶解する例を示す。
図１２Ｃは、本発明のいくつかの態様に従う、図１２Ａの細胞の内部要素の１つを溶解する例である。 図１２Ｄは、本発明のいくつかの態様に従う、図１２Ａの細胞の細胞核を溶解する例を示す。 図１３は、本発明のいくつかの態様に従う、捕捉物体を選択し、および単離囲いから図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイスの搬出部に移動する例である。
図１４は、本発明のいくつかの態様に従う、核酸材料をクローン生体細胞から選択的に捕捉するための方法の例である。 図１５は、本発明のいくつかの態様に従う、個々のクローン生体細胞をマイクロ流体デバイスにおける異なるクローン集団から選択し、および選択された細胞をデバイスにおける単離囲い中へ移動する例を図説する。 図１６Ａ〜１６Ｄは、マイクロ流体デバイスにおける単離囲いの内側で溶解される細胞の画像である。図１６Ａは、溶解バッファ（lysis buffer）をマイクロ流体デバイス中へ導入する前の細胞を含有する囲いの画像である。図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは夫々、溶解バッファ導入後の時間ｔ＝０分、５分および１０分での同じ囲いの画像である。Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ細胞染色が、溶解した細胞を監視するマーカーとして使用される。
例示態様の詳細な記載
本明細書は、本発明の例示態様および適用を記載する。しかしながら、本発明は、これらの例示態様および適用に、あるいは、例示態様および適用が動作するかまたは本明細書に記載されるやり方に限定されない。また、図は、簡略化されたかまたは部分的な図を示してもよく、図中の要素の寸法は、大きく見せてもよいし、またはそうでなければ、釣り合いが取れていてもよい。加えて、用語「の上にある(on)」、「付着されている(attached)」または「とカップリングされている(coupled to)」が本明細書に使用されるとき、１つの要素（例えば材料、層、基板など）は、１つの要素が直接、他の要素の上に、それに付着されているか、または、それとカップリングされているか否かにかかわらず、あるいは、１つまたは２つ以上の介在要素が一方の要素と他方の要素との間にあるか否かにかかわらず、別の要素「の上にある」か、それ「に付着されている」か、または、それ「とカップリングされてい」てもよい。提供される場合、方向（例えば、上へ(above)、下へ(below)、上端(top)、下端(bottom)、横へ(side)、上方へ(up)、下方へ(down)、下へ(under)、上へ(over)、上方へ(upper)、下方へ(lower)、水平の(horizontal)、垂直の(vertical)、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」など）もまた相対的なものであって、図説および検討を容易にするため例を用いて単に提供されるものであり、限定する目的はない。加えて、要素の一覧（例えば要素ａ、ｂ、ｃ）を参照する場合、かかる参照は、載せられた要素のいずれか１つそれ自体、載せられた要素の全部より少ないものからなるいずれかの組み合わせ、および／または、載せられた要素の全部からなる組み合わせを含むことを意図する。
本明細書に使用される「実質的に」は、本来の目的どおりに働くのに充分であることを意味する。よって、用語「実質的に」は、完全なまたは完璧な状態、寸法、大きさ、結果からの有意でない小さな変動量、あるいは、例えば当該技術分野における当業者に予期されるであろうが、全体的な性能に感知できるほどに影響を及ぼさない同種のものを許容する。数値またはパラメータまたは数値で表現され得る特徴に関して使用されるとき、「実質的に」は１０パーセント以内を意味する。用語「１つ（複数）(ones)」は１つより多いことを意味する。
本明細書に使用される用語「配置される」は、その意味「位置される」の範囲を包括的に含む。
本明細書に使用される用語「捕捉物体」は、以下の１つまたは２つ以上を包含し得る：微小粒子、マイクロビーズ（例としてポリスチレンビーズ、Luminex（登録商標）ビーズまたは同種のもの）、磁性ビーズ、マイクロロッド(microrod)、マイクロワイヤ(microwire)、量子ドットなどの無生物の微小物体；細胞等の生物学的な微小物体、リポソーム（例として合成のまたは膜調製物から派生した）、脂質ナノラフト(lipid nanoraft)など；または、無生物の微小物体と生物学的な微小物体との組み合わせ（例として細胞に付着されているマイクロビーズ、リポソームで被覆されたマイクロビーズ、リポソームで被覆された磁性ビーズまたは同種のもの）。脂質ナノラフトは、例としてRitchie et al. (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs," Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。
用語「細胞」は、生体細胞を意味し、かかる生体細胞は、植物細胞、動物細胞、細菌性細胞、真菌細胞、胚、卵母細胞、精子、組織から解離された細胞、血液細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染した細胞、形質移入および／または形質転換された細胞、レポーター細胞などであり得る。動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、馬、山羊、羊、牛、霊長目または同種のものなどの哺乳類からのものであり得る。
生体細胞について使用される「溶解する」は、核酸材料を細胞から解放するのに十分に細胞の少なくとも膜を破壊すること、破裂させること、または傷つける（compromise）ことを意味する。生体細胞について使用されるとき、「内部要素」は、細胞の外側膜内にありおよびそれ自身の膜で仕切られた生体細胞のいずれかの要素または成分を意味し、内部要素を溶解することは、核酸材料を要素から解放するのに十分に要素の少なくとも膜を破壊すること、破裂させること、または傷つけることを意味する。細胞の内部要素の例は、細胞の細胞核および細胞小器官を含む。
本発明のいくつかの態様において、個々の生体細胞は、いくつかの、異なった使用できる特徴うちのいずれかのものに基づいてマイクロ流体デバイスにおいて選択され得る。次に、細胞がマイクロ流体デバイスにおける単離囲いにある間に、核酸材料が個々の細胞から抽出される。囲いにおける捕捉物体は、各々、細胞から特定の種類の核酸材料を捕捉し得、その後、捕捉物体は、例えばマイクロ流体デバイスから搬出することで、囲いから取り除かれ得る。捕捉物体は、各捕捉物体を物体によって捕捉された核酸が由来する個々の細胞に相関させる、一意的な識別子を含み得る。一意的な識別子はまた、細胞から捕捉された核酸材料の種類などの追加の情報を提供し得る。
図１は、ステップ１０２で、個々の生体細胞がマイクロ流体デバイスにおいて選択され、およびステップ１０４で、デバイスにおける単離囲い中へ移動される、方法１００の例を図説する。代替的に、ステップ１０２で、既に囲いにある個々の細胞が１または２以上の特定の特徴のために選択され得、およびステップ１０４で、特徴（単数）または特徴（複数）が欠如して囲いにおける細胞が囲いの外に移動され得、囲いにおいて選択された細胞を残す。これに関わらず、ステップ１０６で、選択された細胞は単離囲いにおいて溶解され得、溶解された細胞から囲い中へ核酸材料を解放する。ステップ１０８で、囲いにおける捕捉物体が、特定の種類の核酸材料を捕捉し得る。次にステップ１１０で、捕捉物体は囲いから取り除かれ得、マイクロ流体デバイスから搬出、において格納、または、において処理される。
図２Ａ〜２Ｃは、その上で図１の方法１００が実施され得るマイクロ流体デバイス２００の例を示し、図４Ａおよび４Ｂは、光電ピンセット（ОＥＴ）デバイスとして構成されるデバイス２００のマニピュレータ２２２の例を図説する。図５〜１２は、マイクロ流体デバイス２００上で実施される図１の方法１００の例を図説し、マニピュレータ２２２は、例えば図４Ａおよび４Ｂに図説されるようなＯＥＴデバイスとして構成される。図５〜１２に図説されたデバイス２００で実施される方法１００の例に移る前に、マイクロ流体デバイス２００が検討される。
図２Ａ〜２Ｃは、その上で方法１００が実施され得るマイクロ流体デバイス２００の例を図説する。示されるように、マイクロ流体デバイス２００は、ハウジング２０２、マニピュレータ２２２、検出器２２４、流量コントローラ２２６、搬出機構２２８および制御モジュール２３０を含み得る。
示されるように、ハウジング２０２は、液体媒体２４４を含有するための１または２以上のチャネル２４０を含み得る。図２Ｂは、その上に媒体２４４が平らに（例えば凹凸のない）および平坦に配置され得るチャネル２４０の内表面２４２を図説する。しかしながら、内表面２４２は、代替的に平らではなく（例えば凹凸がある）、および電気端子（示されず）などの機能を含み得る。
ハウジング２０２は、それを通して媒体２４４がチャネル２４０中へ投入され得る、１または２以上の入口２０８を含み得る。入口２０８は、例えば、入口ポート、開口、バルブ、別のチャネル、流体コネクタ（fluidic connectors）または同種のものであり得る。ハウジング２０２はまた、１または２以上の出口２１０を含み得る。例えば、媒体２４４は出口２１０を通して取り除かれ得る。出口２１０は、例えば、出口ポート、開口、バルブ、他のチャネル、流体コネクタまたは同種のものであり得る。別の例として、出口１１０は、2013年4月4日に出願されたU.S.特許出願第13/856,781号（attorney docket no. BL1-US）に開示されているいずれの排出メカニズムなどの液滴排出メカニズムを含み得る。
１つの入口２０８および１つの出口２１０が図説されているが、１つ以上の入口２０８および／または１つ以上の出口２１０があり得る。さらに、入口２０８および／または出口２１０は、図２Ａ〜２Ｃに示されるものと異なる位置であり得る。例えば、選択されなかった細胞などの廃棄物のためのデバイス２００の選択部２１２として以下に記載される部分からの出口（示されず）を設けることができる。
ハウジング２０２はまた、基部（例えば、基板）２０６上に配置されたマイクロ流体構造２０４を含み得る。マイクロ流体構造２０４は、ガス透過性であり得る可撓性の材料（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）または同種のもの）を含み得る。代替的に、マイクロ流体構造２０４は、剛性の材料、または可撓性および剛性材料の組み合わせを含む他の材料を含み得る。少なくとも一部が可撓性（例えば変形可能な）表面で仕切られるチャネルおよびチャンバ（または囲い）などのマイクロ流体要素を画定するマイクロ流体構造の例は、U.S.仮特許出願第62/089065号（2014年12月8日に出願）で説明されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。基部２０６は、１または２以上の基板を含み得る。単一の構造として説明されているが、基板２０６は、多数の基板などの多数の相互接続された構造を含み得る。マイクロ流体構造２０４は同様にして、相互接続され得る多数の構造を含み得る。
マイクロ流体構造２０４および基部２０６は、チャネル２４０および／または１以上のチャンバ（例えば、単離囲い２５２）を画定し得る。図２Ａ〜２Ｃにおいて１つチャネル２４０が示されているが、マイクロ流体構造２０４および基部２０６は、媒体２４４のためのチャネル、チャンバおよび／または同様ものなどの多数を画定し得、かかるチャネルおよびチャンバは、マイクロ流体回路を形成するために相互接続されることができる。
図２Ｂおよび２Ｃに示されるように、単離囲い２５２は、チャネル２４０内に配置され得る。例えば、各単離囲い２５２は、内側空間２５６およびチャネル２４０から内側空間２５６への開口２５８を画定する筐体２５４を含み得る。かかる多くの単離囲い２５２がいずれかのパターンでチャネル２４０において配置され得、単離囲い２５２は、多くの異なる寸法および形状のいずれかであり得、および囲い２５２は、１以上の開口２５８を有し得る。各単離囲い２５２の開口２５８は、囲い２５２における液体媒体２４４と、例えば拡散によって囲い２５２の開口２５８で流出する液体媒体２４４との自然な交換を可能にするように寸法決めおよび位置づけられる。
代替的に、各単離囲い２５２の開口２５８は、水性の媒体（例えば、１または２以上の細胞、１または２以上の捕捉物体、および／または溶解バッファなどの試薬を含む）の小滴が単離囲い２５２の中へまたは外へ移動することが可能になるように寸法決めおよび位置決めされる。そうでない場合でも、しかし、筐体２５４は、１つの囲い２５２の内側空間２５６における生体材料または物体（示されず）（例えば、生体細胞、分泌材料、核酸材料、または同様のもの）と、任意の別の囲い２５２の内側空間２５６における生体材料または物体などとが混合することを防ぎ、以下に記載されるように、１つの囲い２５６における捕捉物体と、いずれかの別の囲い２５６の捕捉物体とが混合することを防ぐように、囲い２５２の内側空間２５６を十分に囲み得るものである。
３つの列に配置された１２の囲い２５２が示されているが、囲い２５２はそれ以上またはそれ以下であり得、囲い２５２は、他のパターンにおいて配置され得る。さらに、囲い２５２は、示されるものとは異なる形状、寸法、向き、または同様のものを有し得る。例えば、囲い２５２は、いずれかの形状、寸法または方向、もしくはU.S.特許出願第2014/0116881号（2013年10月22日に出願）またはU.S.特許出願第14/502,568号（2014年10月22日に出願）に記載されているいずれかのパターンにおいても配置され得る。
単離囲い２５２は、図２Ｃに図説されるように、チャネル２４０の全体の高さに延伸する（例えば、基部２０６の表面２４２からマイクロ流体構造２０４の上部へ）筐体２５４を含むが、これは例示であり、様々な変形が考えられる。例えば、筐体２５４は、チャネル２４０の全体の高さに延伸する必要はない。
図３は、筐体２５４ではなく基部２０６においてくぼみを含む、単離囲い３５２の別の例を図説する。例えば、示されるように、各囲い３５２は、基部２０６中へのくぼみの側壁３５４によって画定される内側空間３５６を含み得る。かかる各囲い３５２の開口３５８は、基部２０６の表面２４２であり得る。本文中で、囲い２５２への言及、検討、図説、または同様のもののいずれかは、側壁３５４、内側空間３５６および開口３５８がそれぞれ、筐体２５４、内側空間２５６および囲い２５２の開口２５８に対応し得る、囲い３５２に置き換え得る。
媒体２４４は、単離囲い２５２における開口２５８で流出し得る（例えば、入口２０８から出口２１０へ）。かかる媒体２４４の流れは、例えば、単離囲い２５２における生体物体（示されず）へ栄養塩類を提供し得る。別の例として、媒体２４４の流れはまた、単離囲い２５２からの廃棄物の除去を提供し得る。また、示されるように、媒体２４４の流れは、媒体における材料（例えば、以下に記載される、図７に図説されるような溶解試薬７０６）と、囲い２５２における媒体２４４との混合を引き起こし得る。代替的に、媒体２４４は、水性の媒体の小滴を含有するオイルベースの媒体であり得る。小滴は、単離囲い２５２中へ移動され、および任意にそこで組み合わされる、細胞、捕捉物体、および／または試薬（例えば、溶解バッファ）を含有し得る。
マニピュレータ２２２は、媒体２４４における物体（示されず）上に、選択的に動電学的な力を生成するように構成され得る。例えば、マニピュレータ２２２は、チャネル２４０の内表面２４２で誘電泳動（ＤＥＰ）電極を選択的に起動（例えば電源を入れる）および停止（例えば電源を切る）するように構成され得る。ＤＥＰ電極は、各電極を個々に起動および停止するために、それを通して電流および／または電圧レベルを変化させ得る電気的接続に各々接続され得る。別の例として、ＤＥＰ電極は、以下に記載されるように、図４Ａおよび４Ｂにおいて図説される例のように、光によって起動および停止できる。これに関わらず、ＤＥＰ電極は、媒体２４４における物体（示されず）を引き寄せまたは遠ざける力を媒体２４４において生成し得、次にマニピュレータ２２２は、媒体２４４における１または２以上の物体を選択および移動できる。
例えば、マニピュレータ２２２は、１または２以上の光（例えば、レーザー）ピンセットデバイス、１または２以上の光電ピンセット（ＯＥＴ）デバイス（例えば、U.S.特許第7,612,355号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）または2013年10月10日に出願されたU.S.特許出願第2014/0124370号（これもまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような）、および／または、フォトトランジスタ（例えば、ラテラルバイポーラトランジスタ）を有する１または２以上のデバイスを含み得る。さらに別の例として、マニピュレータ２２２は、物体の１または２以上が懸濁された媒体２４４の小滴を移動するための１または２以上のデバイス（示されず）を含み得る。かかるデバイス（示されず）は、光電ウェッティング（ＯＥＷ）デバイス（例えばU.S.特許第6,958,132号に開示されるとおりであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）などのエレクトロウェッティングデバイス、片面ＯＥＷデバイス（例えば2011年7月31日に出願されたU.S.特許出願第2012/0024708号、または2014年12月5日に出願されたU.S.仮特許出願第62/088532号に開示されるとおりであり、参照によりその両方の全体が本明細書に組み込まれる）、または他のエレクトロウェッティングデバイスを含み得る。よってマニピュレータ２２２は、いくつかの態様において、ＤＥＰデバイスとして特徴付けられ得る。
図４Ａおよび４Ｂは、ＤＥＰデバイスの種類であるＯＥＴデバイス４００を含むマニピュレータ２２２の例を図説する。示されるように、ＯＥＴデバイス４００は、第１電極４０４、第２電極４１０、電極起動基板４０８、電源４１２（例えば、交流電流（ＡＣ）電源）、および光源４２０を含み得る。チャネル２４０における媒体２４４および電極起動基板４０８は、電極４０４、４１０を隔て得る。光源４２０からの光４２２のパターンを変化させることで、チャネル２４０の内表面２４２の領域４１４でのＤＥＰ電極のパターン変化を選択的に起動および停止できる（以下、領域４１４は、「電極領域」ともいう）。
図４Ｂに説明される例において、基部２０６の内表面２４２上へ向けられる光パターン４２２’は、示される四角いパターンとして斜交ハッチングで示された電極領域４１４ａに光を当てる。他の電極領域４１４には光が当てられず、それを以下「暗」電極領域４１４という。各暗電極領域４１４から第２電極４１０へ電極起動基板４０８に渡る電気インピーダンスは、第１電極４０４からチャネル４４０における媒体２４４を渡り暗電極領域４１４に至るインピーダンスより大きい。しかしながら、電極領域４１４ａに光を当てることは、光が当てられた電極領域４１４ａから第２電極４１０への電極起動基板４０８に渡るインピーダンスを、第１電極４０４からチャネル２４０における媒体２４４を渡り光が当てられた電極領域４１４ａへ至るインピーダンス未満まで、低減させる。
電源４１２が起動されると、前述のものは、光が当てられた電極領域４１４ａと、近接した暗電極領域４１４との間の媒体２４４における電場勾配を引き起こし、これが順に、媒体２４４における近くの物体（示されず）を引き寄せるかまたは遠ざける局所的なＤＥＰ力を生じさせる。よって、媒体２４４における物体を引き寄せるかまたは遠ざけるＤＥＰ電極は、光源４２０（例としてレーザー源、高輝度放電ランプまたは他のタイプの光源）からマイクロ流体デバイス２００中に投影される光パターン４２２を変化させることによって、チャネル２４０の内表面２４２での多くの異なるかかる電極領域４１４で、選択的に起動および停止され得る。ＤＥＰ力が近くの物体を引き寄せるかまたは遠ざけるかは、電源４１２の周波数ならびに媒体２４４および／または物体（示されず）の誘電特性といったパラメータに依存し得る。
図２Ｂに説明される、光が当てられた電極領域４１４ａの四角いパターン４２２’は、例でしかない。電極領域４１４のいずれのパターンも、デバイス２００において投影される光のパターン４２２によって、光が当てられ得、光が当てられる電極領域４２２’は、光パターン４２２を変化させることによって繰り返し変化され得る。
いくつかの態様において、電極起動基板４０８は光伝導材料であってもよく、内表面２４２は特色がないものであってもよい。かかる態様において、ＤＥＰ電極４１４は、光パターン４２２に従い（図４Ａを参照）、チャネル２４０の内表面２４２上、どこにでも、いずれのパターンにおいても、生じさせられ得る。よって、電極領域４１４の数およびパターンは、確定されるものではないが、光パターン４２２に対応する。例は、上記U.S.特許第7,612,355号中に図説される。ここで、前述した特許の図面において示されている非ドープの非晶質ケイ素材料２４が、電極起動基板４０８を構成し得る光伝導材料の例であり得る。
他の態様において、電極起動基板４０８は、半導体分野において知られているような半導体集積回路を形成する複数のドープ層、電気絶縁層および導電層を含む半導体材料などの回路基板を含み得る。かかる態様において、電気回路要素は、チャネル２４０の内表面２４２での電極領域４１４と、光パターン４２２によって選択的に起動および停止され得る第２電極４１０との間の電気的接続を形成し得る。電極起動基板４０８のかかる構成の非限定例は、U.S.特許第7,956,339号の図２１および２２において説明される光トランジスタをベースとしたＯＥＴデバイス４００ならびに上記U.S.特許出願第14/051,004号（attorney docket no. BL9-US）において図面全体を通して図説されるＯＥＴデバイスを含む。フォトトランジスタは、例えばラテラルバイポーラトランジスタであり得る。
いくつかの態様において、該して図４Ａに説明されるとおり、第１電極４０４は、ハウジング２０２の第１壁４０２の一部であり得、電極起動基板４０８および第２電極４１０は、ハウジング２０２の第２壁４０６の一部であり得る。示されるとおり、チャネル２４０は、第１壁４０２と第２壁４０６との間にあり得る。しかしながら、前述のものは、例に他ならない。他の態様において、第１電極４０４は、第２壁４０６の一部であり得、電極起動基板４０８および／または第２電極４１０の一方または両方は、第１壁４０２の一部であり得る。別の例として、第１電極４０４は、電極起動基板４０８および第２電極４１０と同じ壁４０２または４０６の一部であり得る。例えば、電極起動基板４０８は、第１電極４０４および／または第２電極４１０を含み得る。また、光源４２０は代替的に、ハウジング２０２の下に位置づけられ得る。
よって、図４Ａおよび４ＢのＯＥＴデバイス４００として構成されると、チャネル２４０の内表面２４２の電極領域４１４での１つまたは２つ以上のＤＥＰ電極を起動するため、光パターン４２２を、物体を捕捉するパターンでデバイス２００において投影することによって、マニピュレータ２２２は、チャネル２４０における媒体２４４における物体（示されず）を選択し得る。その後、マニピュレータ２２２は、デバイス２００に対して光パターン４２２を移動させることによって、捕捉された物体を移動し得る。代替的に、デバイス２００は、光パターン４２２に対して、移動され得る。例は、図６および１２において図説され、以下で検討される。単離囲い２５２を画定する筐体２５４が、図２Ｂおよび２Ｃにおいて図説され、上記で物理的な筐体として検討されたが、筐体２５４は、代替的に光パターン４２２によって起動されるＤＥＰ力を含む仮想的な筐体であり得る。
上述のように、図４Ａおよび４ＢのＯＥＴデバイス４００は、しかし、マニピュレータ２２２の例である。例えば、電極領域４１４は、光パターン４２２を変化させることによって起動および停止されるように図説および検討されたが、デバイス４００は、その代わりに各電極領域４１４（表面２４２での電気導電端子を含み得る）への電気接続（示されず）を提供し得、電気接続を通して各電極領域４１４へ提供される電圧および／または電流を制御することによって各電極領域４１４を個々に起動および停止することもできる。そのように構成されると、デバイス４００は、光源４２０を含んだり、または光パターン４２２をデバイス４００中へ向けたりする必要がなくなる。別の代替案は、2014年4月25日に出願されたU.S.特許出願第14/262,140号、2014年4月25日に出願されたU.S.特許出願第14/262,200号で説明されているような、片面ＯＥＷデバイスなどのＯＥＷデバイス、またはＯＥＴ／ＯＥＷデバイスの組み合わせであり、参照によりその両方の全体が本明細書に組み込まれる。加えて、重力などのマイクロ流体デバイスに渡って均一に適用され得る力は、2014年12月10日に出願されたU.S.仮特許出願第62/090,303号で説明されているような記述のいずれかと併せて使用され得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
再び図２Ａ〜２Ｃを参照して、検出器２２４は、チャネル２４０における事象を検出するための機構であり得ることが言及される。例えば、検出器２２４は、媒体における物体（示されず）の１または２以上の放射エネルギーの特徴（例えば、蛍光発光またはルミネッセンス）を検出することができる光検出器を含み得る。かかる検出器２２４は、例えば、媒体２４４における１または２以上の物体（示されず）が放射する電磁放射、および／または放射の近似的な波長、明るさ、強度または同様のものを検出するように構成され得る。好適な光検出器の例は、限定されず、光電子増倍管検出器およびアバランシェ光検出器を含み得る。
検出器２２４は、媒体２４４における物体（示されず）を含むチャネル２４０のデジタル画像を捕捉するための撮像デバイスを代替的または追加的に含み得る。検出器２２４が含み得る好適な撮像デバイスの例は、デジタルカメラ、またはＣＣＤおよび相補的なＭＯＳイメージセンサーなどの光センサーを含み得る。画像は、かかるデバイスで捕捉および解析（例えば、制御モジュール２３０によって）され得る。かかる画像はまた、コンピュータモニター（示されず）などのディスプレイデバイス上に表示され得る。
流量コントローラ２２６は、チャネル２４０における媒体２４４の流れを制御するように構成され得る。例えば、流量コントローラ２２６は、流れの方向および／または速さを制御し得る。流量コントローラ２２６の非限定例は、１つまたは２つ以上のポンプまたは流体アクチュエータ(actuator)を含む。いくつかの態様において、流量コントローラ２２６は、例えばチャネル２４０における媒体２４４の流れの速さを感知するための１つまたは２つ以上のセンサ（示されず）などの追加の要素を含み得る。
搬出機構２２８は、マイクロ流体デバイス２００からの物体（示されず）の搬出を促進し得る。例えば、図２Ｂおよび２Ｃに図説されるように、搬出機構２２８は、ステージ領域２４８およびハウジング２０２を通る通路２４６を含み得る。通路２４６は、代替的に、マイクロ流体構造２０４の基部２０６または側壁を通り得る。物体（示されず）は、ステージ領域２４８に移動され、および通路２４６を通してデバイス２００から搬出され得る。搬出機構２２８は、例えば、U.S.特許出願第14/520,510号（2014年10月22日に出願）で説明されているような搬出機構の例のいずれかの様であり得る。代替的に、搬出機構２２８は、単純に出口２１０を含み得る。
制御モジュール２３０は、マニピュレータ２２２、検出器２２４、流量コントローラ２２６、および／または搬出機構２２８からの信号を受信し、ならびに、それらを制御するように構成され得る。示されるとおり、制御モジュール２３０は、コントローラ２３２およびメモリ２３４を含み得る。いくつかの態様において、コントローラ２３２は、デジタル電子的な、光学的なまたは磁気的なメモリデバイスであり得るメモリ２３４に非一過性の信号として保存された機械読取り可能な命令（例としてソフトウェア、ファームウェア、マイクロコードまたは同種のもの）に従って動作するように構成されたデジタル電子コントローラ（例としてマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、コンピュータまたは同種のもの）であり得る。代わりに、コントローラ２３２は、実配線のデジタル回路および／またはアナログ回路あるいは機械読取り可能な命令に従って動作するデジタル電子コントローラと、実配線のデジタル回路および／またはアナログ回路との組み合わせを含み得る。
図説されるように、マイクロ流体デバイス２００は、選択部２１２（デバイス２００における共有空間の例であり得る）、単離部２１４、および／または搬出部２１６を含み得る。これら部２１２、２１４、２１６は、デバイス２００の物理的なパーティション、または単に概念上のパーティションに相当し得る。これに関わらず、示されるように、生体細胞（示されず）は、生体細胞（示されず）の個々の１つが識別および選択され得る選択部２１２中へ注入され得る。単離部２１４は、選択部２１２において選択された個々の生体細胞（示されず）が置かれ、および別のものと単離される、単離囲い２５２を含み得る。
言及されたように、図５〜１２は、図２Ａ〜２Ｃのマイクロ流体デバイス２００上の方法１００の操作の例を図説する。方法１００が、図５〜１２において図説される例を参照して検討される。
図１に示されるように、方法１００では、ステップ１０２で、個々の生体細胞を選択でき得る。図５および６は、例を図説する。図５に示されるように、マイクロ流体デバイス２００の選択部２１２において生体細胞５０２がある。細胞５０２は、全てが同じ種類の細胞であり得る。代替的に、細胞５０２は、様々な異なる種類の細胞を含み得る。これに関わらず、細胞５０２は、例えば入口２０８を通して、マイクロ流体デバイス２００中へ注入され得る。
方法１００では、様々な異なる基準または所望の特徴のいずれかに基づいて細胞５０２の１または２以上を個々に選択でき得る。例えば、方法１００では、ステップ１０２の一環として、デバイス２００の選択部２１２における細胞５０２を１または２以上の特定の特徴のためにテストし、および特徴（単数）または特徴（複数）を有すると決定されたその細胞５０２選択する。別の例として、方法１００では、特徴（単数）または特徴（複数）を有さないと決定されたその細胞５０２を選択でき得る。
ステップ１０２の一環としてテストされ得る特徴の例は、細胞５０２の寸法および／または形態（例えば、形状と構造）を含み得る。したがって、例えば、検出器２２４は、デバイス２００の選択部２１２における細胞５０２の画像を捕捉し得る。細胞５０２の捕捉された画像は、１または２以上の事前設定された寸法または形態の特徴を満たす細胞５０２の１つを識別するために解析され得る。例えば、細胞５０２の捕捉された画像は、寸法に関連した以下のような特徴の１または２以上を満たす、細胞５０２の１つを識別するために解析されることができ、該特徴は：事前設定された寸法閾値より大きい、より小さい、または実質的に等しい、もしくは、高い寸法閾値と低い寸法閾値との間の寸法範囲内などがある。
別の例として、細胞５０２の捕捉された画像は、細胞５０２の形状および／または構造に関する事前設定された形態の特徴の１または２以上を満たす細胞５０２のそれを識別するために解析され得る。これに関わらず、細胞５０２の捕捉された画像は、ヒトのオペレータによって表示（例えば、電子ディスプレイデバイス（示されず））および解析され得る。代替的または追加的に、細胞５０２の捕捉された画像は、制御モジュール２３０によって解析され得る。例えば、制御モジュール２３０は、メモリ２３４において格納される機械可読命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェアまたは同様のもの）、および／または、かかる画像を解析し、および寸法または形態に関する特定の基準を満たす細胞５０２のそれを識別するための組み込み実配線の電子回路（示されず）を含み得る。
ステップ１０２の一環としてテストでき得る特徴の他の例は、細胞５０２が、特定の物質（例えば、特定のプロテイン、特定の抗体、または同様のもの）の１または２以上を含むまたは作り出す（例えば、発現または分泌）ことができるかどうかを決定することを含む。例えば、細胞５０２は、かかる特定の物質の１または２以上の存在に顕著に検出できる方法で反応する試薬と共に処理され得る（デバイス２００の選択部２１２中へ充填される前または後）。かかる試薬の例は、特定の物質を含むまたは作り出す染色細胞５０２のマーカーを含む。検出器２２４は、デバイス２００の選択部２１２において処理された細胞５０２の画像を捕捉し得、および細胞５０２の画像は、特定の物質の存在（または不在）を指摘する細胞５０２のそれを識別するために解析され得る。言及されたように、細胞５０２の画像は、ヒトの利用者によって表示および解析され得、および／または上記で検討されたように概して制御モジュール２３０によって解析される。寸法、形態、および／またはタンパク質の発現（例えば、抗体の発現）などの細胞性の特徴を検出する方法は、例えば、共に2014年10月22日に出願されたU.S.特許出願第14/520,568号および14/521,447号で説明されており、参照によりその両方の全体が本明細書に組み込まれる。
デバイス２００の選択部２１２における細胞５０２の画像を解析するようにプログラムされた検出器２２４および／またはコントローラ２３０は、特定の特徴のために個々の生体細胞を識別するための手段の例であり得る。
したがって、ステップ１０２で、方法１００では、１または２以上の特定の特徴（異なる特徴であり得る）のために、デバイス２００の選択部２１２における細胞５０２をテストし、およびこれらの特定の特徴の１または２以上の陽性をテストする細胞５０２の１または２以上を選択できる。代替的に、方法１００では、ステップ１０２で、かかる特徴のために陰性をテストする細胞５０２の１または２以上を選択できる。
これに関わらず、方法１００では、ステップ１０４で、ステップ１０２でデバイス２００の選択部２１２から選択された細胞５０２を、デバイス２００の単離部２１４における単離囲い２５２中へ移動でき得る。例えば、各選択された細胞５０２は、各囲い２５２がステップ１０２で選択された唯一の細胞５０２を含有するように、異なる囲い２５２中へ移動でき得る。
図６は、デバイス２００の選択部２１２における個々の細胞５０２を選択して（ステップ１０２の一部であり得る）、選択された個々の細胞５０２を単離囲い２５２中へ移動する（ステップ１０４）例を図説する。図６に示されるように、方法１００では、デバイス２００の選択部２１２における光トラップ６０２で所望の細胞５０２を捕えることによって、ステップ１０２で特定の、個々の細胞５０２を選択できる。例えば、図４Ａおよび４ＢのＯＥＴデバイス４００として構成されるマニピュレータ２２２（図２Ａ〜２Ｃ参照）は、個々の細胞５０２を捕える光トラップ６０２を生み出し得る。次にＯＥＴデバイス４００は、光トラップ６０２を囲い２５２中に移動し得、それにより捕えられた細胞５０２を囲い２５２中へ移動する。図説されたように、各細胞５０２は、個々に捕えられ、および保持囲い２５２中へ移動され得る。
光トラップ６０２は、図４Ａおよび４Ｂに関連して上記で検討されたように、マイクロ流体デバイス２００のチャネル２４０の内表面２４２の上に投影される光の変化パターン４２２の一部であり得る。選択された細胞５０２が囲い２５２に入ると、細胞５０２に対応する光トラップ６０２は電源が切られる。検出器２２４は、細胞５０２および囲い２５２の画像を含む、チャネル２４０の全てまたは一部の画像を捕捉し得、およびこれらの画像は、特定の、個々の細胞５０２を捕えて、および特定の囲い２５２中へ移動することを促進する。したがって、検出器２２４および／またはマニピュレータ２２２（例えば、図４Ａおよび４ＢのＯＥＴデバイスとして構成された）は、デバイス２００の単離部２１４において個々の細胞５０２を選択部２１２から選択および囲い２５２中へ移動するための手段の１または２以上の例であり得る。
マニピュレータ２２２は、個々の生体細胞５０２を選択して（例えば、デバイス２００の選択部２１２および／または囲い２５２）、および選択された個々の細胞５０２を（例えば、単離囲い２５２中または外へ）移動するための手段の例である。したがって、本明細書において図説、検討または開示されたマニピュレータ２２２の構成のいずれかは、デバイス２００における個々の生体細胞５０２を選択する、および／またはデバイス２００において選択された個々の細胞５０２を移動するための手段の例であり得る。重力などの全地球的に作用する力（例えば、マイクロ流体デバイス２００を傾けるか、または傾け可能なサポートを使用して適用される）は、細胞５０２の移動を補助するために使用でき得る。代替的に、水性の媒体の小滴内に含有される個々の細胞５０２が、ＯＥＷデバイスを使用して選択され、および保持囲い２５２中へ移動され得る。
上記で言及されたように、代替的に、細胞５０２は、ステップ１０２の前に囲い２５２にあってもよく、方法１００では、ステップ１０２で、上記のように概してに１またｈ２以上の特徴のために囲い２５２における細胞５０２を選択でき得る。方法１００では、ステップ１０４で、選択されなかった細胞５０２を囲い２５２の外に移動して、選択された細胞５０２を囲い２５２に残すことができる。
図１を再び参照して、方法１００では、ステップ１０６で、単離囲い２５２における細胞５０２を溶解できる。図７および８は、囲い２５２における細胞５０２を溶解する例を図説し、したがってそれは囲いの溶解の例であり得る。ステップ１０６で溶解された細胞５０２は、図７〜１２において７０２でラベルされる。
図７に示されるように、単離囲い２５２における細胞５０２は、デバイス２００の単離部２１４を通した溶解試薬７０６の流れ７０４によって、溶解細胞７０２を作り出すために溶解され得る。例えば、溶解試薬７０６は、溶解試薬７０６が囲い２５２の内側空間２５６中へ入り（例えば、囲い２５２の開口２５８を通した拡散によって）、および囲い２５２における細胞５０２を溶解するのに十分な期間、入口２０８から出口２１０へ流され得る。示されていないが、その後の媒体２４４は、溶解試薬７０６をデバイス２００から十分に洗い流すように、デバイスの単離部２１４を通して流され得る。代替的に、融解試薬７０６の１または２以上の小滴は、各囲い２５２中へ移動され（例えば、ＯＥＷデバイスを使用して）、溶解される細胞５０２を含む小滴とマージされ得る。
溶解試薬７０６は、当技術分野で周知の好適な溶解バッファのいずれか（または、組み合わせ溶解／核酸結合バッファ）であり得る。例えば、溶解バッファは、緩衝剤、キレート剤、塩、洗浄剤またはカオトロピック剤、ＲＮａｓｅ阻害剤、プロテアーゼ、変性剤、または、それらのいずれの組み合わせを含み得る。緩衝剤は、例えば、トリス塩酸などのトリス緩衝剤（例えば、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で）であり得る。緩衝剤は、生理学的−相溶性のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５）を提供し得る。キレート剤は、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ（例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で）などの二価陽イオンキレート剤であり得る。
塩は、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム（例えば、約１００ｍＭ〜約１Ｍの濃度で）などの塩化物塩であり得る。洗浄剤は、例えば、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、硫酸ドデシルリチウム（ＬｉＤＳ）または同様のもの（例えば、約０．１％〜約１．０％の濃度）などのイオン性洗浄剤、もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、ＮＰ−４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））または同様のもの（例えば、約０．１％〜約２．０％の濃度で）などの非イオン性洗浄剤でありうる。カオトロピック剤は、例えば、グアニジン（塩化グアニジンまたはグアニジンイソチオシアネート）または尿素（例えば、約０．１Ｍ〜約６．０Ｍの濃度で）を含み得る。ＲＮａｓｅ阻害剤は、マイクロリットルあたり、約０．１〜２．０ユニットの濃度であり得る。
プロテアーゼは、例えば、プロテイナーゼＫまたは同様のもの（例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で）であり得る。変性剤は、例えば、ホルムアミドまたはＤＴＴ（例えば、約０．０１Ｍ〜約１Ｍの濃度で）を含み得る。したがって、ある態様において、溶解試薬７０６は、緩衝剤（例えば、トリス塩酸）、塩化物塩（例えば、塩化ナトリウム）、イオン性および／または非イオン性洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、プロテイナーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤を含み得る。他の態様において、溶解試薬７０６は、緩衝剤（例えば、トリス塩酸）、塩化物塩（例えば、塩化リチウム）、二価陽イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、変性剤（例えば、ＤＴＴ）、およびイオン性および／または非イオン性洗浄剤（例えば、ＬｉＤＳ）を含み得る。
図８は、溶解細胞７０２を作り出すために囲い２５２における細胞５０２を溶解する別の例を図説する。示されるように、図８は、デバイス２００の一部または分離したものであり得る、溶解機構８０６を含む。溶解機構８０６は、溶解細胞７０２を作り出すために、囲い２５２における細胞５０２の１または２以上に溶解ビーム８０８を向けるように制御し得る。各溶解ビーム８０８は、細胞５０２の１つを溶解するのに十分なエネルギーを含み得る。溶解機構８０６は、例えば、レーザー機構であり得、および溶解ビーム８０８は、レーザービームを含み得る。溶解機構８０６は、細胞５０２の特定の１つに溶解ビーム８０８を向けるように制御し得る（例えば、図２Ａの制御モジュール２３０によって）。
溶解機構８０６は、個々の細胞５０２を選択的に一度に一つずつ溶解するように制御され得る。例えば、溶解機構８０６は、囲い２５２における細胞５０２を一つずつ順次連続的に一度の溶解するように制御され得る。別の例として、溶解機構８０６は、囲い２５２における１つ以上で全てより少ない細胞５０２のサブセットを実質的に並行して溶解するように制御され得る。さらに別の例として、溶解機構８０６は、囲い２５２における細胞５０２のすべてを実質的に同時に溶解するように制御され得る。
図７および８は、囲い２５２における細胞５０２を溶解する例を図説する。溶解の他の例は、電気穿孔法、温度（例えば、溶解閾値の上限を超える熱、または溶解閾値の下限よ以下の冷気）、電界エネルギー、または音響エネルギーを囲い２５２における細胞５０２の１または２以上に適用することを含む。例えば、溶解機構８０６は、細胞５０２を溶解するために細胞５０２の１または２以上に電気穿孔法、電界エネルギー、または音響エネルギーを適用する、またはその温度を制御するための同様の機構に置き換え得る。細胞５０２を溶解するための代替的な別の例は、細胞５０２を捕捉して、刃構造、槍構造または同様のものなどの機械的穿刺デバイス（示されず）と接触させるために（例えば、図２Ａ〜２Ｃのマニピュレータ２２２で）移動することである。ステップ１０６で溶解細胞７０２を作り出すために、前述のまたは他のデバイスおよび方法のいずれかが、囲い２５２における細胞５０２の１または２以上を溶解するために使用され得る。
どのように溶解されるかに関わらず、溶解細胞７０２の膜は、溶解細胞７０２からの核酸材料が溶解細胞７０２の外に対応する囲い２５２の内側空間中（または、対応する囲い２５２内に包含される水性の小滴内）へ自由に流れるように、十分に破壊される。図９において示される例は、囲い２５２における溶解細胞７０２からの核酸材料９０２を示す。言及されたように、単離囲い２５２は、１つの囲い２５２における溶解細胞７０２からの核酸材料９０２が、別の囲い２５２における異なる溶解細胞７０２からの核酸材料９０２中へ流れて混合されることを防ぎ得る。単離囲い２５２はまた、１つの囲い２５２における小滴、材料、要素または物体（例えば、以下で検討される捕捉物体１００２）が、他の囲い２５２における小滴、材料、要素または物体と混合されることを防ぎ得る。
核酸材料９０２は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）または同様のものを含み得る。かかるＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｉｔＤＮＡ）、核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）、またはエキソームＤＮＡを含む、いずれの種類のＤＮＡであり得る。かかるＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｒｎＲＮＡ）、または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、いずれの種類のＤＮＡであり得る。
溶解エネルギー８０８（例えば、レーザービーム）を生み出して単離囲い２５２における個々の細胞５０２に向けるように構成される溶解機構８０６（例えば、レーザー）、単離囲い２５２における細胞５０２に電気穿孔法で穴をあけるように構成される電気穿孔デバイス、細胞５０２を十分に溶解するように単離囲い２５２における細胞５０２を熱するまたは冷却するように構成される温度制御デバイス、または細胞５０２を溶解するように単離囲い２５２における細胞５０２に十分な音響エネルギーを適用するように構成される音響デバイスは、全て、単離囲い２５２における細胞５０２を溶解するための溶解手段の例である。
いくつかの態様において、方法１００では、ステップ１０６の一環として、囲い２５２における細胞５０２の１または２以上の溶解の時間を制御し得る。
例えば、方法１００では、ステップ１０６の一環として、細胞５０２を選択するためのステップ１０２で使用される細胞５０２の１または２以上の特徴に対応するように、囲い２５２における１または２以上の細胞の溶解の時間を合わせ得る。したがって、方法１００では、ステップ１０２の一環として検出された細胞５０２の特定の形態または寸法、もしくは材料構成、もしくは細胞５０２からの分泌に対応するように、囲い２５２における１または２以上の細胞の溶解タイミングを制御できる。したがって、例えば、第１の寸法範囲の寸法を有する囲い２５２における１または２以上の細胞５０２が、第１の時間に溶解され、次に第２の寸法範囲（第１の寸法範囲と異なり得る）の寸法を有する囲い２５２における１または２以上の細胞５０２が、第２の時間（第１の時間と異なる（例えば、時間的に遅いまたは早い）時間であり得る）に溶解され得る。
別の例として、特定の形態特徴を有する囲い２５２における細胞５０２が第１の時間で溶解され得、次に異なる形態特徴を有する囲い２５２における細胞５０２が第２の時間（例えば、第１の時間と異なる（例えば、時間的に遅いまたは早い）時間であり得る）で溶解され得る。ある態様において、１または２以上の細胞を溶解するのに要する総時間は、例えば、約１〜約１０分（例えば、約５〜約１０分）であり得る。
ステップ１０６で溶解のタイミングを制御する別の例として、方法１００では、特定の事象に対応するように囲い２５２における１または２以上の細胞５０２の溶解の時間を合わせ得る。例えば、ステップ１０６は、特定の事象のために囲い２５２および／または選択領域２１２を監視することを含み得るものであり、および、方法１００では、囲い２５２における１または２以上の細胞５０２の溶解の時間を検出される事象から合わせ得る。事象の例は、囲い２５２または選択領域２１２における１または２以上の細胞５０２の形態または分泌または分割における変化を含み得る。囲い２５２および／または選択領域２１２の画像を検出器２２４で捕捉することによって、かかる事象のために選択領域２１２および／または囲い２５２を監視でき、ならびに、画像は、ヒトのオペレータ、および／または、かかる画像を概して上記で検討されたように解析するように構成された（例えば、ソフトウェア、マイクロコード、ファームウェア、または同様のものでプログラムされた）制御モジュール２３０によって解析され得る。
溶解のタイミングは、上記で検討された溶解機構のいずれかを制御することによって制御され得る。例えば、ヒトの利用者および／または制御モジュール２３０は、囲い２５２における特定の細胞５０２を特定の時間で溶解するように、溶解機構８０６を制御し得る。別の例として、示されてはいないが、デバイス２００は、チャネル２４０の様な多数のチャネルを含み得るものであり、これらチャネル２４０の各々は、単離囲い２５２のセットを含み得る。かかる各チャネル２４０における囲い２５２における細胞５０２の溶解時間は、各チャネル２４０への溶解の適用を選択的に制御することによって制御され得る。例えば、溶解試薬（例えば、７０６の様な）は、各個々のチャネル２４０を通して異なる回数で流され得る。別の例として、溶解温度、溶解電界エネルギー、溶解音響エネルギー、または同様のものは、各チャネル２４０に異なる回数で選択的に適用でき得る。
再び図１を参照して、ステップ１０６で溶解された細胞からの１または２以上の種類の核酸材料は、ステップ１０８で、囲いにおける１または２以上の捕捉物体と共に捕捉され得る。囲い２５２の１つを描く図１０は、例を図説する。
図１０に示されるように、１または２以上の捕捉物体１００２（２つが示されるがそれ以上またはそれ以下であり得る）は、溶解細胞７０２と共に囲い２５２の内側空間２５６において配置され得る。分かるように、かかる各捕捉物体１００２は、囲い２５２における溶解細胞７０２からの特定の種類の核酸材料９０２に結合するように構成され得る。デバイス２００における囲い２５２の各々において１または２以上の類似の捕捉物体が存在し得る。
図１１は、物体１００２の構成例を図説する。つまり、デバイス２００の囲い２５２のいずれかにおける各捕捉物体１００２は、図１１において図説される捕捉物体１００２の様に構成され得る。
図１１に示されるように、捕捉物体１００２は、基部１１０２および捕捉材料１１０４を含み得る。基部１１０２は、マイクロ−ビーズ、マイクロ−ロッド、または同様のものなどのマイクロ−物体であり得る。基部は、例えば、ストレプトアビジン被覆のビーズ、磁気ビーズ、または同様のものであり得る。捕捉材料１１０４は、他の種類の核酸材料よりも、非常に大きな（例えば、２倍、３倍、５倍、１０倍、またはそれ以上大きな）特異性で特定の種類の核酸材料に結合する材料を含み得る。例えば、捕捉材料１１０４は、他の種類のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかよりも、大きな（例えば、２倍、３倍、５倍、１０倍、またはそれ以上大きな）特異性で特定の種類のＤＮＡまたはＲＮＡ（上記で確認されたいずれかの種類のＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合し得る。
溶解細胞７０２を伴う囲い２５２における各捕捉物体１００２は、異なる捕捉材料１１０４を有し得るため、囲い２５２における溶解細胞７０２から異なる種類の核酸材料（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を捕捉する。代替的に、溶解細胞７０２を伴う囲い２５２における各捕捉物体１００２は、同じ捕捉材料１１０４を有し得る。１つの例において、ｍＲＮＡに結合するためにｐｏｌｙ−ｄＴオリゴが使用され得る。代替的に、オリゴは、抗体重鎖および／または軽鎖をエンコードするｍＲＮＡの保存された領域に特異的に結合し得る。
図１１にも示されるように、各捕捉物体１００２は、捕捉物体１００２を一意的に識別するコードを含み得る。囲い２５２における各捕捉物体１００２は、したがって、デバイス２００における捕捉物体１００２の全てが別々に一意的に識別され得るように、一意的な識別子１１０６を有し得る。
識別子１１０６は、捕捉物体１００２を一意的に識別し、および１つの捕捉物体１００２を別の捕捉物体１００２と区別するのを促進し得る要素または材料のいずれかであり得る。例えば、識別子１１０６は、捕捉物体１００２を一意的に識別する生体物質を含み得る。一意的な、ユーザー指定の配列を有するように製造された、オリゴヌクレオチド（例えば、比較的短い、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子）などの人工的な核酸材料は、かかる識別子１１０６の例である。複数の捕捉物体１００２の各々の識別子１１０６は、異なるかかるユーザー指定の配列を有し得、捕捉物体１００２が別々に簡単に区別されることを可能にする。別の例として、識別子１１０６は、捕捉物体１００２を一意的に識別するコードを具備する、電子的、光学的または磁気的に可読の要素を含み得る。
捕捉物体１００２は、図１のステップ１０８の一環として囲い２５２中に置かれ得る。代替的に、捕捉物体１００２は、ステップ１０２〜１０６のいずれかの前、間または後に、囲い２５２中に置かれ得る。捕捉物体１００２は、捕捉物体１００２と標的核酸との間の結合を促す結合バッファに沿って、囲い２５２中に置かれ得る。
結合バッファは、上記のような溶解バッファと同一であり得る。したがって、例えば、化合された溶解／結合バッファは、図１の方式のステップ１０６および１０８の両方のために使用され得る。ある態様において、好適な溶解／結合バッファは、緩衝剤、キレート剤、塩、洗浄剤、変性剤、またはこれらいずれかの組み合わせを含み得る。緩衝剤は、例えば、トリス塩酸などのトリス緩衝剤（例えば、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で）であり得る。緩衝剤は、生理学的−相溶性のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５）を提供し得る。キレート剤は、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ（例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で）などの二価陽イオンキレート剤であり得る。
塩は、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム（例えば、約１００ｍＭ〜約１Ｍの濃度で）などの塩化物塩であり得る。洗浄剤は、例えば、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、硫酸ドデシルリチウム（ＬｉＤＳ）または同様のもの（例えば、約０．１％〜約１．０％の濃度）などのイオン性洗浄剤、もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、ＮＰ−４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））または同様のもの（例えば、約０．１％〜約２．０％の濃度で）などの非イオン性洗浄剤でありうる。変性剤は、例えば、ホルムアミドまたはＤＴＴ（例えば、約０．０１Ｍ〜約１Ｍの濃度で）を含み得る。したがって、例えば、化合された溶解／結合バッファは、緩衝剤（例えば、トリス塩酸）、塩化物塩（例えば、塩化リチウム）、二価陽イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、変性剤（例えば、ＤＴＴ）、およびイオン性および／または非イオン性洗浄剤（例えば、ＬｉＤＳ）を含み得る。
ある態様において、好適な結合バッファは、緩衝剤、キレート剤、塩、または、それらのいずれの組み合わせを含み得る。緩衝剤は、例えば、トリス塩酸などのトリス緩衝剤（例えば、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で）であり得る。緩衝剤は、生理学的−相溶性のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５）を提供し得る。キレート剤は、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ（例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で）などの二価陽イオンキレート剤であり得る。塩は、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム（例えば、約１００ｍＭ〜約１Ｍの濃度で）などの塩化物塩であり得る。したがって、例えば、緩衝剤は、緩衝剤（例えば、トリス塩酸）、塩化物塩（例えば、塩化リチウム）、および二価陽イオンキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含み得る。
特定の個々の捕捉物体１００２は、囲い２５２の各々において置かれ得、例えば、同様に、選択された細胞５０２は、囲い２５２中に置かれ：捕捉物体１００２は、入口２０８を通してデバイス２００の選択部２１２中へ充填され得、および特定の個々の捕捉物体１００２は、上記で検討されたように、概して選択された細胞５０２が光トラップ６０２によって捕えられおよび囲い２５２中へ移動される様に、光トラップ（示されず）で個々に捕えられ、および特定の囲い２５２中へ移動され得る。代替的に、捕捉物体１００２は、水性の小滴内に含有され得、小滴は例えばＯＥＷを使用して囲い２５２中へ移動され得る。個々の捕捉物体１００２は、囲い２５２中へ移動され得、かかる移動は、並行して、一つずつが連続して、または一部が並行しておよび一部が連続して起こり得る。
言及されたように、溶解細胞７０２を伴う囲い２５２における１または２以上の物体１００２の各々は、異なる捕捉材料１１０４を有し得、したがって、異なる、特定の種類の核酸材料を囲い２５２における溶解細胞７０２から捕捉し得る。
言及されたように、各囲い２５２の筐体２５４は、核酸材料９０２を囲い２５２の内側空間２５６内に保つように構成され得る。代替的または追加的に、ブロック物体１００４は、例えば、図１０において図説されるように、概して囲い２５２の開口２５８において置かれ得る。ブロック物体１００４は、囲い２５２における溶解細胞７０２からの異なる種類の核酸材料９０２のほとんどまたは全てと比較的高い特異性で結合するように構成され得ることを除いては、概して捕捉物体１００２と類似し得る。他に代替的に、ＯＥＷ−タイプの構成に使用されるオイルは、単離囲い２５２（例えば、チャネル）と、任意に囲い２５２の開口２５８との間の空間において位置づけられ得る。ブロック物体１００４またはオイル（示されず）は、囲い２５２からの溶解細胞７０２からの核酸材料９０２が、囲い２５２を逃れ、および別の囲い２５２における核酸材料９０２と混合することを防ぐ。
ブロック物体１００４は、捕捉物体１００２と類似のものであり得る。例えば、ブロック物体１００４は、基部（示されないが、図１１の基部の様であり得る）および捕捉材料（示されないが、捕捉材料１１０４の様であり得る）を含み得る。言及されたように、しかしながら、ブロック物体１００４の捕捉材料（示されず）は、囲い２５２における溶解細胞７０２からの核酸材料９０２のほとんどまたは全てと結合し得る。
図７〜１０において図説される例において、囲い２５２における細胞５０２の外側膜および細胞５０２の内側にある要素の膜のゼロから全てまでのいずれの数の膜も、図１のステップ１００６で溶解され得る。したがって、各溶解細胞７０２は、自身の外側膜、およびステップ１０６で溶解された細胞７０２の内側の内部膜のいずれかを、有さないか、いくつか有するか、またはすべてを有し得るものであり、核酸材料９０２は、溶解細胞７０２の内側の核酸材料９０２のいくつかまたは全てを含み得る。上記で検討されたように、ステップ１０８で、囲い２５２における特定の種類の核酸材料９０２は囲い２５２における１または２以上の捕捉物体１００２で捕捉できる。
図１２Ａおよび１２Ｂは、膜の全てではなく、細胞５０２の膜の選択された１または２以上だけが溶解されるように実施され得る、図１のステップ１０６の例を図説する。
図１２Ａ（図１０の様に、デバイス２００における囲い２５２の１つを示す）は、囲い２５２における細胞５０２の成分例を図説する。細胞５０２の成分は、細胞核１２０４および細胞小器官（２つが示されるが、それ以上またはそれ以下であり得る）を含み得る。知られているように、外側膜１２０２は、細胞の境界であり、核膜１２０６は、細胞核１２０４の境界であり、ミトコンドリア膜１２１０は、各細胞小器官１２０８の境界である。
図１２Ｂに示されるように、ステップ１０６で、囲い２５２における細胞５０２の全ての膜１２０２、１２０６、１２１０を溶解するのではなく、膜１２０２、１２０６、１２１０の１または２以上であるが全てより少ない膜をステップ１０６で溶解し得る。例において、図１２Ｂにおいて図説される、細胞５０２の核膜１２０６ではなく外側膜１２０２、または、ミトコンドリア膜１２１０のいずれかが、ステップ１０６で溶解される。したがって、解放された核酸材料１２２２は、細胞核１２０４または各細胞小器官１２０８の内部からの核酸材料を含まない。したがって、図１２Ｂにおいて図説された例において、解放された核酸材料１２２２は、ＲＮＡ（例えば、上記で識別されたいずれの種類のＲＮＡ）であり得る。
したがって、ステップ１０６は、概して上記で検討されたように、溶解細胞７０２から現在解放された核酸材料１２２２の種類の１または２以上を捕捉するように実施され得る。例えば、図１２Ｂにおいて示されるように、溶解細胞７０２から解放された１または２以上の種類の核酸材料１２２２を捕捉するように構成された１または２以上の物体１００２ａ（１つが示されるがそれ以上であり得る）が囲い２５２においてあり得る。
図１２Ｃおよび１２Ｄにおいて図説されるように、ステップ１０６および１０８は、囲い２５２における現在の溶解細胞７０２の１または２以上のさらなる膜を溶解するように１または２以上の回数で繰り返され得、したがって、各さらなる膜が溶解されることで解放されるさらなる種類の核酸材料を解放および捕捉する。
図１２Ｃにおいて図説された例において、各細胞小器官１２０８の１つのミトコンドリア膜１２１０は、図１のステップ１０６の繰り返しで溶解され、それで現在の溶解細胞小器官１２３８から核酸材料１２２４を解放し得る（溶解細胞小器官１２０８は図１２において１２３８でラベルされる）。解放された核酸材料１２２４は、通常細胞小器官で見つけられるｍｔＤＮＡなどの核酸材料を含み得る。したがって、図１のステップ１０８は、溶解細胞小器官１２３８から解放された１または２以上の種類の核酸材料１２２４を捕捉するために、概して上記で検討されたように繰り返され得る。例えば、図１２Ｃにおいて示されるように、溶解細胞小器官１２３８から解放された１または２以上の種類の核酸材料１２２４を捕捉するように構成された１または２以上の物体１００２ｂ（１つが示されるがそれ以上であり得る）が囲い２５２においてあり得る。細胞核１２０４を溶解する前に細胞小器官１２０８が溶解されるこの例においては、囲い２５２の内側空間２５６における細胞核１２０４からの自由な核ＤＮＡがないため、溶解細胞小器官１２０８からの高い濃縮性のｍｔＤＮＡが捕捉され得る。
図１２Ｄにおいて図説された例において、細胞核１２０４からの核膜１２０６は、図１のステップ１０６の別の繰り返しで溶解され得、現在の溶解細胞核１２３４から核酸材料１２２６を解放し得る。（溶解細胞核１２０４は、図１２Ｄにおいて１２３４でラベルされる）。解放された核酸材料１２２６は、細胞の細胞核において通常見つかる、様々な種類のＤＮＡなどの核酸材料を含み得る。したがって、ステップ１０８は、溶解細胞核１２３４から解放された１または２以上の種類の核酸材料１２２６を捕捉するために、概して上記で検討されたように再び繰り返され得る。例えば、図１２Ｄにおいて示されるように、溶解細胞核１２３４から解放された１または２以上の種類の核酸材料１２２６を捕捉するように構成された１または２以上の捕捉物体１００２ｃ（１つが示されるがそれ以上であり得る）が囲い２５２においてあり得る。
図１２Ａ〜１２Ｄにおいて図説された例において、膜１２０２、１２０６，１２０８は、溶解され得、捕捉物体１００２ａ、１００２ｂ、１００２ｃは、上記の図説または検討のいずれかの方法において、囲い２５２中へ移動され得る。さらに、各捕捉物体１００２ａ、１００２ｂ、１００２ｃは、ステップ１０８の各繰り返しの最後で囲い２５２から取り除かれ得（例えば、概して図１３に示され、および以下で検討されるように）、または、全ての捕捉物体１００２ａ、１００２ｂ、１００２ｃは、ステップ１０８の各繰り返しの後で囲い２５２から取り除かれ得る（例えば、概して図１３に示され、および以下で検討されるように）。
図１２Ｃおよび１２Ｄは、細胞小器官１２０８を溶解し、次に細胞核１２０４を溶解したが、他の順序も可能である。例えば、細胞核１２０４は、細胞小器官１２０８を溶解する（図１２Ｃで図説されたように）前に、溶解され得る（図１２Ｃで図説されたように）。別の例として、多数の細胞小器官１２０８が溶解され得（図１２Ｃで図説されたように）、および核膜１２０６が細胞小器官１２０８の２つを溶解する間に溶解され得る（図１２Ｃで図説されたように）。図１２Ａ〜１２Ｄは、デバイス２００の１つの囲い２５２だけを図説しているが、これらの図において図説された捕捉物体１００２を伴う溶解および捕捉はまた、デバイス１００における他の囲い２５２において実施され得る。図１２Ａ〜１２Ｄにおける細胞５０２の例は、核膜１２０６を有し、したがって真核生物細胞として図説されているが、図面において図説され、および本明細書で検討される細胞５０２は、原核生物細胞などの他の種類の細胞であり得る。
再び図１に戻って、方法１００では、ステップ１００で、囲い２５２の１または２以上から捕捉物体１００２の１または２以上を取り除き得る。図１３は、光ケージ（cage）１３０２が囲い２５２における捕捉物体１００２を捕え、および捕捉物体１００２をデバイス２００の搬出部２１６中に移動する例を示す。（したがって、上記で検討または触れられた、図４Ａおよび４Ｂにおいて図説されたように構成されるＯＥＴデバイスを含む、いずれかのＤＥＰデバイス、および代替的にＯＥＷデバイスが、デバイス２００の単離囲い２５２における個々の捕捉物体１００２（または、かかる捕捉物体を含有する小滴）を選択する手段の例であり、選択された捕捉物体１００２を単離囲い２５２の外へ移動する。）
例えば、捕捉物体１００２は、搬出機構２２８のステージ領域２４８へ移動され、および通路２４６を通してデバイス２００から搬出され得る。前述のものは、例えば、上述のU.S.特許出願第14/520,510号（2014年10月22日に出願）（代理人番号ＢＬ１４−ＵＳ）で説明されている、いずれかの方法において実施され得る。代替的に、捕捉物体１００２は、出口２１０を通してデバイス２００から搬出され得る。さらに別に代替的に、ステップ１１０で囲い２５２から取り除かれた捕捉物体１００２は、デバイス２００における他の位置に格納されおよび／またはさらに処理され得る。
したがって、図１の方法１００では、１または２以上の特定の特徴を有すると決定された特定の個々の細胞５０２をマイクロ流体デバイス２００における細胞の群から選択し得、および方法１００は、囲い２５２の各々が１つだけの選択された細胞５０２を含有するように、デバイス２００における単離囲い２５２中へ選択された細胞５０２を個々に置き得る。方法１００では、核酸材料を囲い２５２の１つにおける単一の細胞５０２から抽出し得、囲い２５２における１または２以上の捕捉物体１００２で、単一の細胞５０２からの１または２以上の特定の種類の核酸材料（上記で識別されたＤＮＡまたはＲＮＡの種類の１または２以上のいずれか）を捕捉し得る。
代替的に、方法１００では、１つ以上の細胞５０２を囲い２５２に、および／または単一の細胞５０２を囲いに置き得、囲い２５２において育成して、多数のかかる細胞として倍増させ得る。これに関わらず、したがって、方法１００では、捕捉物体１００２を個々に取り除き、および、したがって、捕捉物体１００２によって囲い２５２から核酸材料を捕捉し、デバイス２００から捕捉物体１００２を搬出し、捕捉物体１００２をデバイス２００における他の位置において格納し、またはデバイス２００における捕捉物体１００２をさらに処理でき得る。
言及されたように、各捕捉物体１００２は、各捕捉物体１００２上の核酸材料と、核酸材料が由来する細胞５０２とを相関させるのを促進し得る、一意的な識別子１００６を有し得る。例えば、制御モジュール２３０は、捕捉物体１００２の一意的な識別子１００６の各々のデジタル記録、および各捕捉物体１００２のための捕捉物体１００２によって捕捉された核酸材料に関する情報を維持（例えば、メモリ２３４において格納される）するようにプログラムされ得る。例えば、コントローラ２３０は、特定の捕捉物体１００２の一意的な識別子１１０６に関連する以下の情報のいずれもメモリ２３４において格納し得、かかる情報は：核酸材料が捕捉された特定の囲い２５２の識別、核酸材料が捕捉された細胞５０２の特徴、捕捉された核酸材料の種類、核酸材料が捕捉された方法の条件、および／または同様のものである。上記に記載されたようにプログラムされるコントローラ２３０は、捕捉物体と、各捕捉物体によって捕捉された核酸材料に関するデータとの相関を格納するための手段の例であり得る。
事実、図２Ａの制御モジュール２３０は、制御するように構成され得（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、マイクロコードまたは同様のもの；実配線；または同様のもの）、または、方法１００のいくつか、ほとんど、または全てをヒトのオペレータによって制御されるように提供し得る。例えば、制御モジュール２３０は、上記のいずれの方法における方法１００のステップ１０２〜１１０のいずれかまたは全てを実行するためのマニピュレータ２２２、検出器２２４、流量コントローラ２２６、および／または出力機構２２８の操作を制御するように構成され得る。
図１に示された方法１００、および図５〜１３において図説された方法１００の操作は、例に過ぎず、変形が考えられる。例えば、ステップ１０２〜１１０の１または２以上は、図１に示されるものと異なる順序において実施され得る。別の例として、ステップ１０２〜１１０の全てが実施される必要はなく、したがって、方法１００は、ステップ１０２〜１１０の全てより少ないステップを含み得る。さらに別の例として、ステップ１０２〜１１０に追加したステップが実施され得る。例えば、捕捉物体１００２の１または２以上を洗浄するなど、１または２以上の洗浄ステップが、ステップ１０２〜１１０のいずれかの前、間または後で、実施されてもよい。
方法１００は上記のように１つの細胞５０２だけを囲い２５２に置き、および各囲い２５２において単一の細胞５０２からのみ核酸材料を抽出および捕捉するように図説および記載されているが、さらに別の例として、方法１００は、代替的に多数の細胞５０２を囲い２５２に置いて、囲い２５２における多数の細胞から核酸材料を抽出および捕捉し得る。さらに別の例として、個々の細胞５０２が囲い２５２において置かれ、細胞５０２の１または２以上から核酸材料を抽出および捕捉する前に、育成して多数の細胞に倍増することを可能にし、育成され溶解される。溶解されなかった追加的な細胞５０２は、溶解細胞７０２の生存後代（living progeny）として囲い２５２から搬出され得る。
図１４は、生体細胞から核酸材料を抽出および捕捉するための別の例の方法１４００を図説する。分かるように、方法１４００では、選択されたクローン細胞をクローン細胞集団から単離囲い中へ移動し得、ここで、方法１４００では、クローン細胞を溶解し、および細胞から解放された核酸材料を囲いにおいて捕捉物体で捕捉でき得る。方法ではまた、かかる捕捉物体と、捕捉物体によって核酸が捕捉されたクローン細胞が取得されたクローン細胞集団とを相関させる相関記録を格納し得る。
図１５は、方法１４００がその上で実施され得るマイクロ流体デバイス１５００の例の上部断面図を示す。デバイス１５００は、デバイス１５００が選択部２１２ではなく培養部１５１２を含み得ることを除いて、概してデバイス２００（例えば、図３、４Ａ、４Ｂ、７および８のいずれにおいて図示された、いずれの変形を含む図２Ａ〜２Ｃにおいて図示されたような）と同様であり得る。示されるように、培養部１５１２において培養囲い１５５２（２つが示されるが、それ以上またはそれ以下であり得る）が存在し得る。培養囲い１５５２以外にも、培養囲い１５１２は、本明細書において図示または記載されたいずれの変形を含む図２Ａ〜２Ｃの選択部２１２と概して同一または類似であり得る。
培養囲い１５５２の例が、図１５において図説される。示されるように、各培養囲い１５５２は、概して単離囲い２５２に類似し得る。例えば、培養囲い１５５２は、内側空間１５５６、およびチャネル２４０から内側空間１５５６への開口１５５８を画定する筐体１５５４を含み得る。筐体１５５４、内側空間１５５６、および開口１５５８は、それぞれ、図２Ａ〜２Ｃのデバイス２００の筐体２５４、内側空間２５６、および内側空間２５６（本明細書において図示または記載されたいずれの変形も含む）と概して類似し得る。例えば、筐体１５５４は、筐体２５４に関して上記で触れた材料のいずれも含み得る。
別の例として、各単離囲い１５５２の開口１５５８は、囲い１５５２における液体媒体２４４と、囲い１５５２の開口１５５８で流出する液体媒体２４４との自然交換を可能にするために寸法決めおよび位置づけられ得る。そうでなければ、しかし、筐体１５５４は、１つの培養囲い１５５２の内側空間１５５６における生体細胞、細胞、または物体と、別の培養囲い１５５２のいずれかの内側空間１５５６におけるかかる生体細胞、細胞、または物体との混合を防ぐように、培養囲い１５５２の内側空間１５５６を十分に囲い得る。
図５において図説された培養囲い１５５２の数、パターンおよび構成は、例であって、変形が可能である。例えば、各培養囲い１５５２は、代わりに図３において図説された囲い３５２の様であり得る。
概して図１５に図示されるように、クローン細胞１５０４の集団（colony）は、培養囲い１５５２の１または２以上において培養され得る。図１５の例において、クローン細胞１５０２ａの第１集団１５０４ａは、第１培養囲い１５５２ａにおいて培養され、およびクローン細胞１５０２ｂの第２集団１５０４ｂは、第２培養囲い１５５２ｂにおいて培養される。言及されたように、２つ以上の培養囲い１５５２があり得、クローン細胞１５０２の異なる集団１５０４が、いずれかの数の培養囲い１５５２の各々において培養され得る。
各かかる集団１５０４は、親細胞を囲い２５２中に置き、親細胞が囲い１５５２において娘細胞を作り出すことを可能にすることによって、培養囲い１５５２の１つにおいて生成され得る。例えば、親細胞および結果として生じる娘細胞は、チャネル２４０における媒体２４４の培養囲い１５５２の開口１５５８で流出する流れにおいて栄養塩類の流れを提供することによって、囲い１５５２において培養され得る。例えば、開口１５５８を通した媒体２４４の拡散によって、かかる栄養塩類は囲い１５５２中に流れ、および細胞廃棄物は囲い１５５２中の外へ流れ得る。
したがって、特定の培養囲い１５５２における細胞１５０２の全ては、囲い１５５２中に置かれた親細胞、および親細胞によってまたはから作り出された娘細胞からのみで成り得る。したがって、例えば、第１培養囲い１５５２ａにおける第１集団１５０４ａにおける細胞１５０２ａの全ては、親細胞または親細胞の後代のどちらかであり得る。したがって、第１集団１５０４ａは、クローン集団であり得、第１集団１５０４ａの細胞１５０２ａの全ては、クローン細胞であり得る。同様に、第２培養囲い１５５２ｂにおける第２集団１５０４ｂにおける細胞１５０２ｂの全ては、親細胞または親細胞の後代のどちらかであり得る。したがって、第２集団１５０４ｂは、クローン集団であり得、第２集団１５０４ｂの細胞１５０２ｂの全ては、クローン細胞であり得る。
図１４を参照して、方法１４００では、ステップ１４０２でデバイス１５００における培養囲い１５５２における集団１５０４から個々のクローン細胞１５０２を選択し得、方法１４００では、ステップ１４０４で選択された個々のクローン細胞１５０２をデバイス１５００の単離部２１４における単離囲い２５２中へ移動し得る。図１５は、例を図示する。図１５において示されるように、第１集団１５０４ａからの単一の、個々の細胞１５０２ａは、第１培養囲い１５５２ａにおいて選択され、および１５０２ａをそこから単離囲い２５２ａの第１の１つへ移動し得る。ある態様において、デバイス１５００の単離部２１４は、ＯＥＷ用に構成され得、第１集団１５０４ａからの個々の細胞１５０２ａの移動は、オイル媒体において個々の細胞１５０２ａを含有する水性の媒体の小滴を生成すること、および小滴を単離囲い２５２ａ中に移動することを含み得る。
先に言及されたように、単離囲い２５２は、溶解囲いの例であり得る。同様に、第２集団１５０４ｂからの単一、個々の細胞１５０２ｂは、第２培養囲い１５５２ｂにおいて選択され得、およびそこから単離囲い２５２ｂの第２の１つに移動され得る。言及されたように、２つ以上のかかる培養囲い１５５２が存在し得、したがって、クローン細胞集団１５０４からのクローン細胞１５０２は、単離囲い２５２の複数（例えば、すべて）において置かれ得る。例えば、１つおよび１つだけのクローン細胞１５０２が、複数の単離囲い２５２の各々において置かれ得り、各かかるクローン細胞１５０２が、異なる培養囲い１５５２における異なるクローン細胞集団１５０４からであり得る。代替的に、１以上のクローン細胞１５０２が、単離囲い２５２において置かれ得るが、いずれか１つの単離囲い２５２において置かれたクローン細胞１５０２の全てが、同じクローン細胞集団１５０４からであり得る。
各クローン細胞１５０２は、その細胞集団１５０４からランダムに、または図２のステップ１０２に関して上記で検討された選択基準のいずれかを使用して選択され得る。クローン細胞１５０２は、ステップ１０４に関して上記で検討された方法のいずれかにおいて、培養囲い１５５２において選択、およびそこから移動され得る。例えば、各クローン細胞１５５２は、図６に関して上記で検討されたように生み出されおよび操縦され得る、光トラップ６０２の様な光トラップ（図１５には示されず）で捕えられ得る。
代替的または追加的に、クローン細胞１５０２を含有する水性の媒体の小滴を生成するためにＯＥＷが使用され得る。さらに他の代替において、細胞集団１５０４は、デバイス１５００の外側に位置づけられ得、集団１５０４からの個々のクローン細胞１５０２は、デバイス１５００中に取り込まれ得る（例えば、入口２０８を通して）。したがって、ステップ１４０２は、方法１４００からスキップまたは排除され得る。一度デバイス１５００中に取り込まれると、クローン細胞１５０２は、単離囲い２５２中で選択および移動され得る（例えば、概して図５および６に示されるように）。
これに関わらず、ステップ１４０２および／または１４０４の後、１または２以上のクローン細胞１５０２は、デバイス１５００の複数の単離囲い２５２の各々にあり、各囲い２５２における１または２以上のクローン細胞１５０２は、同じクローン集団１５０４からであり得る。分かるように、したがって、細胞１５０２は、ステップ１４０６で溶解され得、溶解細胞１５０２から解放された核酸材料は、ステップ１４０８で捕捉され得る。以下で検討されるように、ステップ１４０６および１４０８は、概して図１のステップ１０６および１０８の様に実施され得る。
例えば、ステップ１４０６で、単離囲い２５２における細胞１５０２は、溶解細胞（図１５においては示されず）を作り出すために溶解され得る。細胞１５０２は、単離囲い２５２における細胞５０２を溶解するためのステップ１０６に関して上記で検討されたいずれかの方法において、単離囲い２５２において溶解され得る。例えば、１または２以上の細胞１５０２は、図７または図８で図示されたように、もしくは上記で検討された代替案のいずれかにおいて、単離囲い２５２において溶解され得る。ステップ１４０６での溶解は、概して図７、８および１２Ａ〜１２Ｄにおいて図示されたように、細胞１５０２の膜の１または２以上のいずれかを溶解することを含み得る。概して、図９および図１２Ａ〜１２Ｄに図示されるように、ステップ１５０２の溶解では、細胞１５０２から単離囲い２５２の内側空間２５６中へ核酸材料を解放し得る。
ステップ１４０８では、ステップ１４０６で溶解された細胞１５０２からの核酸材料の１または２以上の種類は、囲い２５２における１または２以上の捕捉物体１００２で捕捉され得る。ステップ１４０８は、ステップ１０８が本明細書で図示および検討されたようないずれかの変形を含んで実施されるように、同様の方法で実施され得る。例えば、
溶解細胞１５０２から解放された核酸材料の１または２以上の特定の種類は、ステップ１０８に関して上記で検討されたように、囲い２５２における１または２以上の捕捉物体１００２で、単離囲い２５２において捕捉され得る。
方法１４００では、ステップ１４１０で、単離囲い２５２における各捕捉物体１００２と、捕捉物体１００２によって捕捉された核酸材料が由来する細胞１５０２のクローン細胞集団１５０４とを相関する相関記録を生成および／または維持でき得る。例えば、単離囲い２５２における各捕捉物体１００２のために、相関記録は、捕捉物体１００２の一意的な識別子（例えば、図１で示された識別子１１０６）と、その核酸材料が捕捉物体１００２によって捕捉された細胞１５０２に対する以下の情報のいずれかとを相関し得、該情報は：そこから細胞１５０２が取得されたクローン細胞集団１５０４の識別情報（例えば、培養囲い１５５２などの位置）、細胞１５０２の１または２以上の特徴、および／または同様のものである。
図１５は、第１細胞集団１５０４ａからの第１細胞１５０２ａを伴う、第１単離囲い２５２ａにおける第１捕捉物体１００２ａを示す。ステップ１４０６で第１細胞１５０２ａが溶解された後、したがって、第１細胞１５０２ａから解放された核酸材料を捕捉し得る。同様に、第２単離囲い２５２ｂにおける第２捕捉物体１００２ｂは、第２細胞１５０２ｂが溶解された後に解放された核酸材料を捕捉し得る。したがって、図１０のステップ１４１０で生成された相関記録は、第１細胞集団１５０４ａおよび／またはその培養囲い１５５２ａの識別と相関された第１捕捉物体１００２ａの一意的な識別子を含み得、相関記録はまた、第２細胞集団１５０４ａおよび／またはその培養囲い１５５２ｂの識別と相関された第２捕獲物体１００２ｂの一意的な識別子を含み得る。いくつかの態様において、制御モジュール２３０は、かかる相関記録を生成、格納（例えば、メモリ２３４において）および維持（例えば、アップデート）するようにプログラムされ得る（例えば、機械可読の命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェアまたはマイクロコード）および／または実配線回路で）。
方法１４００では、ステップ１４１２で、捕捉物体、および、したがって捕捉物体によって捕捉された核酸材料の１または２以上を単離囲い２５２の１または２以上から取り除き得る。ステップ１４１２は、本明細書で図示または検討されたいずれかの変形を含む、概して図１のステップ１１０の様に実施され得る。
方法１４００は、例に過ぎず、変形が考えられた。例えば、ステップ１４０２〜１４１２の１または２以上は、図１４に示されるものと異なる順序において実施され得る。別の例として、ステップ１４０２〜１４１２の全てが実施される必要はなく、したがって、方法１４００は、ステップ１４０２〜１４１２の全てより少ないステップを含み得る。さらに別の例として、ステップ１４０２〜１４１２に追加したステップが実施され得る。例えば、捕捉物体の１または２以上を洗浄するなど、１または２以上の洗浄ステップが、ステップ１４０２〜１４１２のいずれかの前、間または後で、実施されてもよい。本発明の特定の態様および応用が本明細書において記載されているが、これらの態様は例に過ぎず、多くの変形が可能である。
例
例１：囲いにおける細胞溶解
マイクロ流体デバイスの単離囲いにおける細胞溶解をテストするために、単離囲い中に細胞が注入され、溶解バッファはデバイスを通して流れ、細胞溶解は、Ｃａｌｃｉｅｎ ＡＭ染色を使用して監視された。この溶解バッファは、以下のようである：
ＲＮａｓｅ阻害剤：２ユニット／マイクロリットル
塩化ナトリウム：０．１３５Ｍ；
トリス塩酸（ｐＨ８．０）：９ｍＭ；
（ＤＴＴ）４．５ｍＭおよび
ＳＤＳ：１％
図１６Ａ〜Ｄにおいて示されるように、囲い（図１６Ａ）中に注入された細胞は、
溶解バッファを注入した後のｔ＝０分でＣａｌｃｅｉｎ ＡＭを使用して検出可能である（図１６Ｂ）。溶解バッファを注入した後のｔ＝５分で、細胞は、まだ大部分が無傷であるが溶解を開始している（図１６Ｃ）。溶解バッファを注入した後のｔ＝１０分で、細胞は、細胞溶解が完了している（図１６Ｄ）。
当業者によって理解されるように、前述の溶解バッファの成分のいずれも、同等のバッファ、塩、およびキレート剤と交換できる。
例２：結合条件
マイクロ流体デバイスの単離囲いにおける細胞の溶解（例えば、例１において記載されているように）に続いて、マイクロ流体デバイスを通して結合バッファを流すことによって標的核酸の捕捉物体への結合が実施され得る一方で、捕捉物体は、細胞溶解物の存在下にある。結合バッファは、以下のようであり得る：
トリス塩酸（ｐＨ７．５）：２０ｍＭ；
塩化リチウム：１．０Ｍ；および
ＥＤＴＡ：２ｍＭ
当業者によって理解されるように、結合バッファの成分のいずれも、同等のバッファ、塩、およびキレート剤と交換できる。
例３：組み合わせ溶解／結合バッファ
分離溶解および結合バッファの使用の代替案として、細胞溶解および核酸捕捉は、組み合わせ溶解／結合バッファを使用して達成可能である。したがって、細胞は、マイクロ流体デバイスにおける単離囲い中へ注入されることができ、組み合わせ溶解／結合バッファは、細胞溶解を達成するのに十分な時間、デバイスを通して流され得る。組み合わせ溶解／結合バッファは、溶解される細胞に隣接して捕捉物体が配置される前、実質的に同時、または後に流され得る。
トリス塩酸（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ；
塩化リチウム：５００ｍＭ；
ＥＤＴＡ：１０ｍＭ；
ＬｉＤＳ：１％；および
ＤＴＴ：５ｍＭ
当業者によって理解されるように、前述の組み合わせ溶解／結合バッファの成分のいずれかは、同等のバッファ、塩、およびキレート剤と交換できる。

Claims (37)

  1. 個々の生体細胞から核酸材料を捕捉する方法であって、
    個々の生体細胞をマイクロ流体デバイスのチャネルに対して開口した単離囲い中へ置くステップであって、ここで、前記単離囲いは、
    開口であって、前記囲い内の第一液体媒体と、前記チャネル内の前記開口に流出する第二液体媒体とを拡散によって交換するように構成された前記開口と、
    筐体であって、前記単離囲いの内側空間を含み、前記内側空間内の生体細胞または捕捉物体と、前記マイクロ流体デバイスのもう一つの単離囲いの内側空間内の生体細胞または捕捉物体とが混合することを防ぐように十分に囲む、前記筐体を含む、前記ステップ；
    前記単離囲いにおける前記個々の細胞を溶解するステップ；
    前記単離囲いにおける捕捉物体で前記溶解された細胞からの核酸材料を捕捉するステップ；および
    前記捕捉の後に、前記単離囲いから前記捕捉物体を取り除くステップを含む、前記方法。
  2. 置くステップが：
    前記マイクロ流体デバイスにおける共有空間における生体細胞の群から前記個々の生体細胞を選択すること；および
    前記共有空間から前記マイクロ流体デバイスにおける前記単離囲い中へ前記個々の細胞を移動することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記選択するステップが、前記マイクロ流体デバイスにおける前記生体細胞の群の特定の特徴をテストすることを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記個々の生体細胞が、前記特定の特徴のテストで陽性である前記群における前記生体細胞の１つである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記選択するステップが、前記マイクロ流体デバイスの内側の前記共有空間中へ投影される光パターンによって前記個々の細胞を捕える個々の光ケージを生成することをさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記移動するステップが、前記個々の光ケージを前記共有空間から前記単離囲い中へ移動することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記特定の特徴が、前記生体細胞のサイズまたは前記生体細胞の形態を含む、または、
    前記特定の特徴が、前記生体細胞が特定の材料を含むか、または前記生体細胞が特定の材料を作り出すかどうかを含む、請求項３に記載の方法。
  8. 各単離囲いが単一の個々の細胞を包含するように、複数の個々の細胞が対応する複数の単離囲い中へ置かれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記溶解するステップが：
    溶解試薬を前記単離囲いが位置する前記マイクロ流体デバイスにおけるチャネルを通して流すこと、
    電磁エネルギーのビームを前記個々の細胞に向けること、
    前記個々の細胞を電気穿孔すること、
    前記個々の細胞を十分に溶解するように前記細胞の温度を変化させること、または
    前記個々の細胞を溶解するように前記個々の細胞に十分な音響エネルギーを適用することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記溶解するステップが、前記個々の細胞の第１の内部要素の膜を傷つけることなしに、前記個々の細胞の外側膜を傷つけることを含み、
    前記外側の膜を傷つけることで、前記個々の細胞から第１の種類の核酸を解放し、および、
    前記捕捉物体が、前記第１の種類の核酸を捕捉するように構成された第１の捕捉物体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記溶解するステップおよび前記捕捉するステップを以下のように繰り返すことをさらに含む、請求項１０に記載の方法であって、
    前記第１の内部要素の前記膜を傷つけることによって、前記単離囲いにおける前記個々の細胞の前記第１の内部要素を溶解する、および
    前記第１の内部要素を溶解することによって解放された第２の種類の核酸材料を前記単離囲いにおける第２の捕捉物体によって捕捉する、前記方法。
  12. 前記第１の内部要素が、細胞核の１つまたは前記細胞の１つの細胞小器官である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記細胞の１つを溶解することが、前記細胞の１つの第２の内部要素の膜を傷つけることなしに、前記細胞の１つの前記外側膜を傷つけることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記溶解するステップおよび前記捕捉するステップを以下のように再び繰り返すことをさらに含む、請求項１３に記載の方法であって、
    前記第２の内部要素の前記膜を傷つけることによって、前記単離囲いにおける前記個々の細胞の前記第２の内部要素を溶解する、
    前記第２の内部要素を溶解することによって解放された第３の種類の核酸材料を前記単離囲いにおける第３の捕捉物体として捕捉する、前記方法。
  15. 前記第１の内部要素または前記第２の内部要素の１つが、前記細胞の１つの細胞核である、および、
    前記第１の内部要素または前記第２の内部要素の別の１つが、前記細胞の１つの細胞小器官である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１の種類の核酸材料が、前記第２の種類の核酸材料とは異なる種類の核酸材料である、
    前記第２の種類の核酸材料が、前記第３の種類の核酸材料とは異なる種類の核酸材料である、および
    前記第１の種類の核酸材料が、前記第３の種類の核酸材料とは異なる種類の核酸材料である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記溶解するステップが、前記複数の単離囲いにおける前記複数の個々の細胞を溶解することを含み、
    前記捕捉するステップが、前記溶解された細胞から前記複数の単離囲いの核酸材料における複数の捕捉物体を捕捉することを含み、および
    前記取り除くステップが、前記複数の単離囲いから前記複数の捕捉物体を取り除くことを含む、請求項８に記載の方法。
  18. 前記捕捉物体の各々が、前記複数の他の捕捉物体毎から前記各捕捉物体を一意的に識別する識別子を含み、
    前記方法が、前記各捕捉物体と、前記捕捉物体によって捕捉された核酸材料に関するデータとの相関関係をメモリデバイスに格納することを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記データが、前記捕捉物体によって捕捉された前記核酸材料の種類を含む、または、
    前記相関関係が、前記捕捉物体によって捕捉された前記核酸材料が由来する前記溶解された細胞の１つの特徴を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記単離囲いの開口にブロック物体を実質的に置くことをさらに含み、前記ブロック物体が前記溶解された細胞から核酸材料を捕捉するように構成されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記個々の生体細胞が、クローン細胞集団からの細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記置くことが、前記マイクロ流体デバイスにおけるクローン細胞集団から前記単離囲い中へ前記個々の細胞を移動することを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記溶解するステップが、前記単離囲いにおける前記個々の細胞を溶解することを含み、
    前記捕捉するステップが、前記溶解された細胞から前記単離囲いにおける核酸材料の１または２以上の捕捉物体を捕捉することを含み、および
    前記取り除くステップが、前記単離囲いから１または２以上の捕捉物体を取り除くことを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記捕捉物体の各々が、前記捕捉物体の他の１つ毎から前記各捕捉物体を一意的に識別する識別子を含み、
    前記方法が、前記各捕捉物体の識別子と、前記捕捉物体によって捕捉された核酸材料が由来する前記細胞の１つからの前記クローン細胞集団の識別との相関関係をメモリデバイスに格納することを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記溶解することが、前記単離囲いの１つにおける前記細胞の１つを第１回目に溶解することを含み、
    前記方法が、前記単離囲いの第２の１つにおける前記細胞の第２の１つを第２回目に溶解することをさらに含み、および
    前記第２回目が、前記第１回目の後である、請求項８に記載の方法。
  26. 前記マイクロ流体デバイス内部の事象のために前記マイクロ流体デバイスを監視することをさらに含む、請求項２５に記載の方法であって、
    前記第１回目が、前記事象の検出からの第１期間であり、および
    前記第２回目が、前記事象の前記検出からの第２期間である、前記方法。
  27. 前記マイクロ流体デバイスにおける生体細胞の群の特定の特徴をテストすることをさらに含む、請求項２５に記載の方法であって、
    前記細胞の１つを、前記特徴の第１の１つで陽性であるとテストする、および
    前記細胞の前記第２の１つを、前記特徴の第２の１つで陽性であるとテストする、前記方法。
  28. マイクロ流体デバイスであって、
    電極起動基板であって、前記基板の表面に誘電泳動（DEP）電極を含み、前記各電極が選択的に起動および停止されるように構成される、前記電極起動基板；
    前記基板の前記表面と共にマイクロ流体チャネルを画定する、マイクロ流体構造；および
    前記チャネルにおいて配置された複数の単離囲いであって、各単離囲いは前記マイクロ流体デバイスのチャネルに対して開口しており、さらに、各単離囲いは、
    開口であって、前記囲い内の第一液体媒体と、前記チャネル内の前記開口に流出する第二液体媒体とを拡散によって交換するように構成された前記開口と、
    筐体であって、前記単離囲いの内側空間を含み、前記内側空間内の生体細胞または捕捉物体と、前記複数の単離囲いのもう一つの単離囲いの内側空間内の生体細胞または捕捉物体とが混合することを防ぐように十分に囲む、前記筐体を含む、前記複数の単離囲い；
    を含み、
    前記捕捉物体が、前記単離囲いの１つにおいて置かれるように寸法決めされており、前記各捕捉物体が、他の種類の核酸材料よりも特定の種類の核酸材料に少なくとも２倍の特異性を有する捕捉材料を含む、
    前記マイクロ流体デバイス。
  29. 前記単離囲いにおける生体細胞を溶解するための溶解手段をさらに含む、請求項２８に記載のデバイス。
  30. 前記電極の起動された１つが、前記電極の前記起動された１つに隣接する前記チャネルにおける生体細胞を捕えるのに十分なＤＥＰ力を生み出す、請求項２８または２９に記載のデバイス。
  31. 前記電極が、前記基板の前記表面上の仮想電極である、または、
    前記各電極が、前記基板の前記表面に固定された電気導電端子を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のデバイス。
  32. 前記各電極が、前記基板の前記表面の上に向けられた変化する光のパターンに応じて選択的に起動および停止される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のデバイス。
  33. 前記捕捉物体の各々が、前記捕捉物体の他の１つ毎から前記捕捉物体を一意的に識別する識別子を含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のデバイス。
  34. 生体細胞および前記生体細胞から核酸を捕捉するように構成された捕捉物体を含有するように各々が寸法決めされた単離囲いを含む、マイクロ流体デバイスを制御するコントローラであって、
    前記流体デバイスにおける生体細胞の個々の１つを選択し、および前記細胞の前記選択された１つを前記単離囲い中へ移動するための、選択／移動手段；
    前記単離囲いにおける前記生体細胞の溶解を制御するように構成された制御モジュール；および
    前記単離囲いにおける前記複数の捕捉物体の各々の１つと、前記捕捉物体の１つによって捕捉された核酸材料が由来する前記単離囲いにおける対応する生体細胞の１つとを相関させる相関記録を生み出すための相関手段を含む、前記コントローラ。
  35. 前記相関記録が、前記捕捉物体の各々の１つと、前記細胞の前記対応する１つが由来する細胞のクローン集団との相関である、請求項３４に記載のコントローラ。
  36. 前記選択／移動手段が、前記生体細胞の任意の所望の１つを選択的に捕える、誘電泳動（ＤＥＰ）力を生み出すためのＤＥＰデバイスの一部である、請求項３４または３５のコントローラ。
  37. 前記選択／移動手段が、光電ピンセットデバイスを含む、または、
    前記選択／移動手段が、ＯＥＷデバイスを含む、請求項３４〜３６に記載のコントローラ。
JP2016540965A 2013-12-18 2014-12-18 マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法 Active JP6603663B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019188011A JP6954972B2 (ja) 2013-12-18 2019-10-11 マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/133,361 US20150166326A1 (en) 2013-12-18 2013-12-18 Capturing Specific Nucleic Acid Materials From Individual Biological Cells In A Micro-Fluidic Device
US14/133,361 2013-12-18
PCT/US2014/071323 WO2015095623A1 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Capturing specific nucleic acid materials from individual biological cells in a micro-fluidic device

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019188011A Division JP6954972B2 (ja) 2013-12-18 2019-10-11 マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2017504315A JP2017504315A (ja) 2017-02-09
JP2017504315A5 JP2017504315A5 (ja) 2018-02-01
JP6603663B2 true JP6603663B2 (ja) 2019-11-06

Family

ID=53367562

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016540965A Active JP6603663B2 (ja) 2013-12-18 2014-12-18 マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法
JP2019188011A Active JP6954972B2 (ja) 2013-12-18 2019-10-11 マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019188011A Active JP6954972B2 (ja) 2013-12-18 2019-10-11 マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150166326A1 (ja)
EP (1) EP3083980B1 (ja)
JP (2) JP6603663B2 (ja)
KR (2) KR102448505B1 (ja)
DK (1) DK3083980T3 (ja)
SG (2) SG10201902353UA (ja)
WO (1) WO2015095623A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9403172B2 (en) * 2012-11-08 2016-08-02 Berkeley Lights, Inc. Circuit based optoelectronic tweezers
US20150166326A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-18 Berkeley Lights, Inc. Capturing Specific Nucleic Acid Materials From Individual Biological Cells In A Micro-Fluidic Device
WO2016172623A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Berkeley Lights, Inc. Manipulation of cell nuclei in a micro-fluidic device
IL299366A (en) 2015-11-23 2023-02-01 Berkeley Lights Inc Structures for microfluidic isolation are produced at the place of assembly, kits and their uses
WO2017117521A1 (en) 2015-12-31 2017-07-06 Berkeley Lights, Inc. Tumor infilitrating cells engineered to express a pro-inflammatory polypeptide
CN109922885B (zh) 2016-03-16 2022-05-10 伯克利之光生命科技公司 用于基因组编辑克隆的选择和传代的方法、系统和装置
CN109311930B (zh) * 2016-03-31 2023-02-24 伯克利之光生命科技公司 核酸稳定试剂、试剂盒及其使用方法
IL267008B1 (en) 2016-12-01 2024-02-01 Berkeley Lights Inc Imaging mechanisms and systems and methods for micro objects
CN110268414B (zh) * 2016-12-01 2023-08-01 伯克利之光生命科技公司 微流体装置中的微物体的自动检测和重新定位
EP3551745A4 (en) 2016-12-12 2020-07-15 Xcella Biosciences, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SCREENING USING MICROCAPILLAR ARRAYS
AU2017388874A1 (en) 2016-12-30 2019-07-18 Berkeley Lights, Inc. Methods for selection and generation of genome edited T cells
EP3623461A4 (en) * 2017-05-12 2021-01-20 Nikon Corporation OBJECT MANIPULATION DEVICE AND OBJECT MANIPULATION METHOD
CN110719956A (zh) 2017-06-06 2020-01-21 齐默尔根公司 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台
US11028401B2 (en) 2018-06-06 2021-06-08 Zymergen Inc. Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production
SG11202104544WA (en) * 2018-11-19 2021-06-29 Berkeley Lights Inc Microfluidic device with programmable switching elements
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6685812B2 (en) * 2001-01-09 2004-02-03 The Regents Of The University Of California Movement of particles using sequentially activated dielectrophoretic particle trapping
US7312085B2 (en) * 2002-04-01 2007-12-25 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
US6958132B2 (en) 2002-05-31 2005-10-25 The Regents Of The University Of California Systems and methods for optical actuation of microfluidics based on opto-electrowetting
JP5695287B2 (ja) * 2002-10-02 2015-04-01 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 微小流体の核酸解析
WO2004065618A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Thermogenic Imaging Methods and devices for monitoring cellular metabolism in microfluidic cell-retaining chambers
US20050142565A1 (en) 2003-12-30 2005-06-30 Agency For Science, Technology And Research Nucleic acid purification chip
US7612355B2 (en) 2004-04-12 2009-11-03 The Regents Of The University Of California Optoelectronic tweezers for microparticle and cell manipulation
WO2007008609A2 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for cell culture array
EP1951742A4 (en) * 2005-10-27 2011-06-01 Life Technologies Corp OPTOELECTRONIC SEPARATION OF BIOMOLECULES
EP1979079A4 (en) * 2006-02-03 2012-11-28 Integenx Inc MICROFLUIDIC DEVICES
EP2001990B1 (en) * 2006-03-24 2016-06-29 Handylab, Inc. Integrated system for processing microfluidic samples, and method of using same
US7439014B2 (en) * 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
WO2008119066A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 The Regents Of The University Of California Single-sided lateral-field and phototransistor-based optoelectronic tweezers
KR101228308B1 (ko) * 2007-05-23 2013-01-31 삼성전자주식회사 미세유동 칩을 이용한 디스크형 미세유동장치 및 생체물질마이크로어레이 칩을 이용한 디스크형 미세유동장치
WO2008147530A1 (en) * 2007-05-24 2008-12-04 The Regents Of The University Of California Integrated fluidics devices with magnetic sorting
US9533306B2 (en) 2010-08-02 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Single sided continuous optoelectrowetting (SCEOW) device for droplet manipulation with light patterns
EP2606154B1 (en) * 2010-08-20 2019-09-25 Integenx Inc. Integrated analysis system
EP2820394B1 (en) * 2012-02-29 2017-07-12 Fluidigm Corporation Methods, systems, and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics
US9857333B2 (en) 2012-10-31 2018-01-02 Berkeley Lights, Inc. Pens for biological micro-objects
US9403172B2 (en) 2012-11-08 2016-08-02 Berkeley Lights, Inc. Circuit based optoelectronic tweezers
US20150166326A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-18 Berkeley Lights, Inc. Capturing Specific Nucleic Acid Materials From Individual Biological Cells In A Micro-Fluidic Device

Also Published As

Publication number Publication date
KR102220001B1 (ko) 2021-02-25
SG10201902353UA (en) 2019-04-29
US20150166326A1 (en) 2015-06-18
EP3083980A4 (en) 2017-08-30
JP2020022479A (ja) 2020-02-13
EP3083980B1 (en) 2021-10-13
WO2015095623A1 (en) 2015-06-25
JP2017504315A (ja) 2017-02-09
KR20210022146A (ko) 2021-03-02
JP6954972B2 (ja) 2021-10-27
KR20160098341A (ko) 2016-08-18
DK3083980T3 (da) 2021-12-13
EP3083980A1 (en) 2016-10-26
SG11201604907SA (en) 2016-07-28
KR102448505B1 (ko) 2022-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6603663B2 (ja) マイクロ流体デバイスにおける個々の生体細胞から特定の核酸材料を捕捉する方法
US11318479B2 (en) Capturing specific nucleic acid materials from individual biological cells in a micro-fluidic device
CN110114520B (zh) Dna条形码组合物和在微流体装置中原位识别的方法
TWI758265B (zh) 原位產生之微流體分析結構，相關套組，及其使用方法
Voldman et al. A microfabrication-based dynamic array cytometer
US10578630B2 (en) Automated identification of assay areas in a microfluidic device and detection of assay positive areas based on rate of change of image light intensity
Kovac et al. Intuitive, image-based cell sorting using optofluidic cell sorting
JP2019070665A (ja) 生体アクティビティをアッセイするための微少流体デバイス
KR102334118B1 (ko) 마이크로유체 디바이스 상에서의 세포들의 동결 및 보관
CN106255888A (zh) 在同一微流体装置的不同部分中的dep力控制和电润湿控制
US20150165436A1 (en) Micro-Fluidic Devices for Assaying Biological Activity
CA2977546A1 (en) Generation and selection of embryos in vitro
WO2010115167A2 (en) Methods and devices for sorting cells and other biological particulates
JP2017504315A5 (ja)
EP4043475B1 (en) Nucleic acid stabilization reagent, kits, and methods of use thereof
CN109142717B (zh) 用于测定生物活性的微流体装置
CN110437975B (zh) 具有隔离围栏的微流体装置及用它测试生物微目标的方法
Charles et al. High-temporal-resolution smFISH method for gene expression studies in Caenorhabditis elegans embryos
US20220379320A1 (en) Capturing specific nucleic acid materials from individual biological cells in a micro-fluidic device
CN107427315A (zh) 体外胚胎的生殖和选择
JP2020122804A (ja) 生物学的アクティビティをアッセイするための微少流体デバイス
Berendsen The entrapment and characterization of single spermatozoa in a microfluidic system

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171218

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20171218

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20180910

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20180914

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20181204

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190304

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190409

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190815

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190912

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20191011

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6603663

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250