JP6594905B2 - 生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスおよび方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスおよび方法に関する。

生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスが、先行技術から知られている。

パーク ケー（Ｐａｒｋ Ｋ）、ジャン ジェイ（Ｊａｎｇ Ｊ）、イリミア ディー（Ｉｒｉｍｉａ Ｄ）、ストゥルギス ジェイ（Ｓｔｕｒｇｉｓ Ｊ）、リー ジェイ（Ｌｅｅ Ｊ）、ロビンソン ジェイピー（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＪＰ）、トナー エム（Ｔｏｎｅｒ Ｍ）、バシール アール（Ｂａｓｈｉｒ Ｒ）のＬｉｖｉｎｇ ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｆｌｕｉｄｓ．Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．８：１０３４−４１（２００８）において、カンチレバーアレイが、溶液中の細胞の質量を決定するために開発されている。これらのアレイは、互いに対向する２つのセットのカンチレバーによって形成されている。誘電泳動によって細胞を捕獲する不均一な電界を発生させるために、外部正弦波パワー供給源は、１８０°の位相シフトで、対向するカンチレバーセットに接続されている。カンチレバーを振動させるための積極的な励起方法は存在しない。カンチレバーは、熱雑音だけに起因して振動し、これは、質量変化を測定するためのこのデバイスの感度および時間分解能を減少させる。質量測定を開始する前に、細胞がカンチレバーの上で成長するために、数日間、通常は３日間必要とされる。これは、実験のためにランダムな細胞が選択されるということを意味している。このデバイスの設計に起因して、その使用は、たとえば、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または位相コントラスト顕微鏡などの、生物学に関する現代の光学顕微鏡技法と互換性がない。これらの技法は、生物学において非常に重要である。その理由は、それらが、特徴のある細胞または生物学的システムについての追加的な形態学的情報および機能的情報を与えるからである。

パーク ケー（Ｐａｒｋ Ｋ）、ミレット エルジェイ（Ｍｉｌｌｅｔ ＬＪ）、キム エヌ（Ｋｉｍ Ｎ）、リー エイチ（Ｌｉ Ｈ）、ジン エックス（Ｊｉｎ Ｘ）、ポペスキュー ジー（Ｐｏｐｅｓｃｕ Ｇ）、アルル エヌアール（Ａｌｕｒｕ ＮＲ）、フシア ケイジェイ（Ｈｓｉａ ＫＪ）、バシール アール（Ｂａｓｈｉｒ Ｒ）のＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ．ＰＮＡＳ，１０７： ２０６９１−６（２０１０）の研究は、流体中の単一の付着性細胞の質量および機械的特性を決定するためにマイクロ膜レゾネーターを使用するデバイスを示している。この膜は、ローレンツ力を使用して積極的に励起される。これを行うために、膜は、均一な磁界内へ浸漬されており、交流電流が膜を通って流れる。膜の移動は、レーザードップラー干渉計（ＬＤＩ）を使用することによって検出される。細胞を膜に取り付けるために、細胞は、デバイスの上で培養される。そのようにすることにより、いくつかの細胞は、膜の上部にランダムに接着することとなる。細胞がデバイス内へ注入されると、測定を開始する前に、少なくとも２時間の待機時間が必要とされ、これは、重要なことには、検討されることとなる細胞プロセスを制限する。このシステムは、蛍光顕微鏡とは互換性があるが、ＤＩＣ顕微鏡または位相コントラスト顕微鏡とは互換性がない。

エス サン（Ｓ．Ｓｏｎ）、エイ ツズール（Ａ．Ｔｚｕｒ）、ワイ ウェン（Ｙ．Ｗｅｎｇ）、ピー ジョーゲンセン（Ｐ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）、ジェイ キム（Ｊ．Ｋｉｍ）、エム ダブリュー キルシュナー（Ｍ．Ｗ．Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ）、エス アール マナリス（Ｓ．Ｒ．Ｍａｎａｌｉｓ）． Ｄｉｒｅｃｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９：９１０−２（２０１２）におけるデバイスは、マイクロチャネルレゾネーターに基づいており、それは、真空によって取り囲まれている中空のカンチレバーである。流体の中に浮遊している懸濁した細胞は、カンチレバーの中へ、および、カンチレバーを通して、ポンプ送りされ得る。細胞がカンチレバーの自由端部のそばを通るとき、その浮遊質量（ｂｕｏｙａｎｔ ｍａｓｓ）は、カンチレバーの合計質量を増加させ、それは、カンチレバーの共振周波数を減少させる。そのうえ、高分解能の蛍光顕微鏡検査法が、別の貯蔵部を通過する細胞だけについて実施され得るが、細胞が質量センサーを通るときには実施されない。細胞はカンチレバーを通して浮遊することができるように懸濁していなければならないので、このツールは、付着性細胞に適切ではない。そのうえ、デバイスは浮遊質量だけを検出することが可能であるので、いくつかの細胞プロセスは、検討されることができない。このアッセイの別の否定的な問題は、蛍光信号（たとえば、顕微鏡）および単一細胞の浮遊質量の両方が、長期間（＞＞１秒）にわたって連続的に獲得され得ず、また、同時に獲得され得ず、浮遊質量および細胞状態を相関させることを非常に困難にするということである。

Ｌｉｖｉｎｇ ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｆｌｕｉｄｓ，パーク ケー（Ｐａｒｋ Ｋ）、ジャン ジェイ（Ｊａｎｇ Ｊ）、イリミア ディー（Ｉｒｉｍｉａ Ｄ）、ストゥルギス ジェイ（Ｓｔｕｒｇｉｓ Ｊ）、リー ジェイ（Ｌｅｅ Ｊ）、ロビンソン ジェイピー（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＪＰ）、トナー エム（Ｔｏｎｅｒ Ｍ）、バシール アール（Ｂａｓｈｉｒ Ｒ），Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．８：１０３４−４１（２００８） Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ，パーク ケー（Ｐａｒｋ Ｋ）、ミレット エルジェイ（Ｍｉｌｌｅｔ ＬＪ）、キム エヌ（Ｋｉｍ Ｎ）、リー エイチ（Ｌｉ Ｈ）、ジン エックス（Ｊｉｎ Ｘ）、ポペスキュー ジー（Ｐｏｐｅｓｃｕ Ｇ）、アルル エヌアール（Ａｌｕｒｕ ＮＲ）、フシア ケイジェイ（Ｈｓｉａ ＫＪ）、バシール アール（Ｂａｓｈｉｒ Ｒ），ＰＮＡＳ，１０７： ２０６９１−６（２０１０） Ｄｉｒｅｃｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，エス サン（Ｓ．Ｓｏｎ）、エイ ツズール（Ａ．Ｔｚｕｒ）、ワイ ウェン（Ｙ．Ｗｅｎｇ）、ピー ジョーゲンセン（Ｐ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）、ジェイ キム（Ｊ．Ｋｉｍ）、エム ダブリュー キルシュナー（Ｍ．Ｗ．Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ）、エス アール マナリス（Ｓ．Ｒ．Ｍａｎａｌｉｓ）．Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９：９１０−２（２０１２）

本発明の目的は、これらの公知のデバイスを改善することである。

本発明の第１の態様によれば、この技術的な問題に対する解決策は、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスであって、測定デバイスは、マイクロカンチレバーと、カンチレバーを励起する強度変調された光源、好ましくは、レーザーとを含み、カンチレバーは、生物学的システムに接着するように機能化されている（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）、測定デバイスを提供することによって実現される。測定デバイスは、時間とともに、および、生理学的に関連した環境で、単一細胞または小組織などの生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定することを可能にする。そのうえ、測定デバイスは、細胞−細胞の相互作用または細胞−組織の相互作用を検討するのに有用である。

「生物学的システム」は、たとえば、細胞、細胞のグループ、または小組織である。細胞は、付着性または非付着性であり、また、人間、動物、酵母、および細菌などの、さまざまな起源のものであることが可能である。

「光源」は、好ましくは、３５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲の波長を備える電磁信号を発生させることができる任意のデバイスであるが、これに限定されない。電磁信号は、干渉性または非干渉性、単色性または非単色性であってもよい。

細胞などの生物学的システムに接着するために、カンチレバーは機能化される。カンチレバーの機能化は、それが、異なる物理的な、化学的な、または生物学的な特性を示すために、物理的にまたは化学的に修正されるということを意味することが可能である。機能化は、たとえば、生物学的なサンプルをカンチレバーに取り付けること、または、サンプルの特別な挙動を誘導することなどのような、異なる用途を有することが可能である。カンチレバーの化学的な機能化に対する代替例として、生物学的システムをカンチレバーに接着するための他の方法も可能である。具体的には、マイクロチャネルドカンチレバー（ｍｉｃｒｏ−ｃｈａｎｎｅｌｌｅｄ ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ）が使用され得、これは、吸引メカニズムによって、生物学的システムをカンチレバーに接着する。稀に、サンプルとカンチレバーとの間のすでに存在している物理的なまたは化学的な相互作用に起因して、特定の結合手段なしに、生物学的システムがカンチレバーに接着する場合には、特定の機能化は必要でないこととなる。これらの代替例は、当業者による化学的な機能化と同等であると考えられることとなる。

単一細胞（または、細胞のグループ）は、それらをカンチレバーと直接接触させることによって、カンチレバーに取り付けられ得る。測定システムは、培養下の細胞集団の中から特定の細胞を選びピックアップすることが可能であり、それによって、選ばれた細胞の質量および／または機械的特性のターゲットにされる測定を可能にする。また、非付着性細胞はカンチレバーの端部に固定化され得るので、非付着性細胞の測定も可能である。細胞がピックアップされるとすぐに測定が開始され得るので、これは、非常に短い期間での測定を可能にする。したがって、測定は、通常で数秒以内または最大で数分以内で開始することが可能である。カンチレバーに取り付けられている生物学的システムは、すべてのその質量をカンチレバーの質量に加え、その共振周波数を修正するので、測定デバイスは、合計質量を直接的に測定することができる。加えて、生物学的なサンプルの乾燥質量は、ＳＬＩＭ（空間光干渉顕微鏡）などの我々のデバイスと互換性がある光学的な方法によって検出され得る。細胞の合計質量を直接的に検出することが可能であるということは、細胞周期制御、または、細胞が水を取り込むまたは放出し得る任意の他のプロセスを理解するために、極めて重要である。他の先行技術のシステムは、単一細胞の合計質量を検出することができず、その浮遊質量だけを検出することができるということに留意することが重要である。異なる密度を備える２つの流体の中の単一細胞の浮遊質量を測定することによって、および、細胞の体積および質量がこれらの条件の下で一定に維持されるということを仮定することによって（それは、正しくない可能性もある）、それらのシステムは、合計質量を推定しようとすることが可能である。しかし、すべての測定に関して、細胞がその中に生きている培地を変化させることを要求することは、細胞にとって非常にストレスが多い可能性があり、また、それは、間違いなく生理学的な条件から離れている。

また、それは、接着、スティフネス、またはレオロジー特性などの、細胞の機械的特性を検討するために使用され得る。特定の基材または別の細胞に対する細胞の接着は、最初にカンチレバーの上に細胞を固定化すること、および、次いで、特定の量の時間にわたり、この細胞を基材または細胞に接触させることによって、測定され得る。先の時間の後に、システムは、カンチレバーの上の細胞を基材または細胞から引き出し、また、カンチレバーのたわみを測定することによって、そのプロセスに必要とされる力を測定する。カンチレバーと基材との間に細胞を封じ込めることによって、および、次いで、カンチレバーのベースと基材との間の距離が制御された方式で修正される間に、カンチレバーのたわみを分析することによって、細胞のスティフネスは測定され得る。また、カンチレバーの上に細胞を取り付けること、および、基材から離して（通常は、数十ミクロン以上）カンチレバーをセットアップすることによって、細胞のスティフネスは決定され得る。これらの条件では、カンチレバーは、共振周波数で振動させられ、そのクオリティーファクターの変化は、細胞のスティフネスの変化に相関付けされ得る。しかし、機械的特性を抽出する他の可能性も適用され得る。そのうえ、測定デバイスは、細胞と組織との間の細胞間相互作用を検討するために、単一細胞を、別の細胞または組織に接触した状態、または、近い状態にすることができる。

測定デバイスは、カンチレバーの光熱励起の原理を使用し、それによって、測定デバイスが質量感度および時間分解能を増加させることを可能にする。カンチレバーを直接的に励起し、および、デバイスのその他の部分を直接的に励起しないために（それは、雑音を持ち込む可能性がある）、強度変調された光源、好ましくはレーザーが、カンチレバーの上に向けられる（ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）。このレーザーは、非常に局所的な変調された加熱作用を作り出し、したがって、それは、カンチレバーを励起する。レーザーは、デジタルでおよび／またはアナログで変調され得る。カンチレバーは、光源の波長に関して、吸収材であり、すなわち、また、部分的に吸収材である。カンチレバーの材料は、シリコンであることが可能であるが、同様の特性を備える他の材料も同様に使用され得る。カンチレバーは、レーザーによって励起されるための任意のコーティング層を必要としないが、しかし、これは、完全にまたは部分的に、金属によってコーティングされることも可能である。好ましくは、生物学的なサンプルが設置されることとなる領域は、金属によってコーティングされていない。

質量感度を増加させるために、カンチレバーの機能化された側部は、マイクロカンチレバーの自由端部の近くに位置決めされ得る。したがって、カンチレバーは、完全にまたは部分的に機能化され得る。

生物学的システムの質量および／または機械的特性の検出は、引き起こされるカンチレバーの移動の分析から生じる。カンチレバーの共振周波数は、カンチレバーの質量の関数である。生物学的なサンプルがカンチレバーに取り付けられているときには、カンチレバーの質量が変化し、それは、その共振周波数の変化につながる。カンチレバーおよび取り付けられている生物学的なサンプルに基づいて、システムの共振周波数をチェックすると、生物学的なサンプルの質量変化がトラッキングされる。サンプルが取り付けられていないカンチレバーの共振周波数と、サンプルが取り付けられているカンチレバーの共振周波数との間の比較から、取り付けられているサンプルの質量を得ることが可能である。そのうえ、測定デバイスは、カンチレバーに伝達されるエネルギーがどれくらい速く消散させられるかということを評価することができ、それは、クオリティーファクターまたはＱファクターと呼ばれる無次元の大きさの測定である。共振周波数およびＱファクターの両方の大きさは、カンチレバーに取り付けられているサンプルの機械的特性によって影響を受け得、それは、デバイスがそれらの変化にも敏感であることを可能にする。そのうえ、たとえば、カンチレバーの移動の位相（励起信号とカンチレバー応答との間の遅れ）および振幅など、情報を抽出するために追加的なパラメーターを使用することも可能である。

カンチレバーの移動を読み取るために使用されるシステムは、カンチレバー励起方法と同程度には重要でなく、たとえば、ビームたわみ、ピエゾ抵抗検出、ドップラー干渉法など、さまざまなシステムを使用して行われ得る。このシステムは、それぞれの周波数に関して、カンチレバーの移動の２つの主要な大きさ：振幅および位相を獲得することを可能にする。振幅は、所与の周波数に関して、カンチレバーの最大伸長長さである。位相は、励起信号に対するカンチレバーの応答遅れに関連している。獲得された情報のそれぞれの計算は、質量および／または機械的特性の所望の決定につながる。

有利には、カンチレバーは、緩衝溶液中に完全に浸漬されている。これは、生理学的な条件下で、生物学的システムの合計質量を検出することを可能にする。流体細胞が使用され得る。

本発明の第２の、独立して発明的な態様は、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスに関し、測定デバイスは、マイクロカンチレバーと、カンチレバーを励起する強度変調された光源、好ましくはレーザーとを含み、カンチレバーは、可視スペクトルの波長に対して透過的である。カンチレバーは、可視スペクトルの波長に対して、部分的にまたは全体的に透過的であることが可能である。有利には、生物学的なサンプルが設置されることとなる領域は、可視スペクトルの特定の波長に対して少なくとも部分的に透過的である。これは、質量および／または機械的特性の決定と、細胞生物学における重要な光学的な技法の組み合わせを可能にする。

好ましくは、その自由端部の近くにあり、かつ、可視スペクトルの少なくともいくつかの波長に対して部分的に透過的である、カンチレバーの部分は、１０μｍ×１０μｍよりも小さくはない。可視スペクトルの少なくともいくつかの波長に対して透過性のあるまたは部分的に透過性のあるこのウィンドウは、デバイスがＤＩＣ（微分干渉コントラスト）などの技法または同等の技法と互換可能であるための要件であり、それは、生物学的なサンプルの形態についての極めて重要な情報を得ることを可能にする。これらのタイプの技法は、特別なタイプの照明を必要とし、それは、サンプルを通過することができなければならず、また、図２に見ることができるように、照明源の反対側に位置付けされている特別な光学顕微鏡を使用して収集されなければならない。ＤＩＣ情報に加えて、図２に示されている対物レンズは、我々のデバイスがサンプルから蛍光情報を得ることを可能にする。しかし、カンチレバーの透過性または部分的な透過性は、蛍光情報に関する要件ではない。その理由は、サンプルの蛍光を励起するための照明は、対物レンズを通して駆動され得、それは、サンプルから放射された蛍光を同時に収集するからである。

本発明の第３の、独立して発明的な態様は、測定デバイスに関し、マイクロカンチレバーと、カンチレバーを励起する強度変調された光源、好ましくはレーザーとを含む、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定する測定デバイスは、光学顕微鏡、具体的には、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）顕微鏡、ＤＩＣおよび／または位相コントラスト顕微鏡を含み、具体的には、それらのすべてが倒立顕微鏡として解釈される、測定デバイスである。細胞生物学における光学的な技法と、質量および／または機械的特性の測定とのこの組み合わせは、細胞の形態が観察され得るので、質量測定のより良好な理解を可能にする。これは、測定デバイスが、細胞質量を検出すること、および、この情報を細胞状態および形状に相関させることを可能にする。

光熱励起によってカンチレバーを振動させる原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が存在しているが、それらのシステムは、ＤＩＣ、蛍光顕微鏡検査法などの現代の光学的な技法と互換性がない。典型的な理由は、一般に、それらのＡＦＭシステムが、光学顕微鏡を使用し、カンチレバーを励起する（振動させる）ために、強度変調されたレーザーの焦点をカンチレバーに合わせ、それが、蛍光イメージングのためにその顕微鏡を使用する可能性を排除するからである。それとは対照的に、本明細書で説明されているデバイスは、特別なセットの光学的なエレメントおよびナノポジショナー（図３を参照）によって、強度変調されたレーザーが、カンチレバーの上に位置決めされ得、カンチレバーに焦点を合わせ得るように設計されている。光学的な経路は、カンチレバー励起メカニズムに支障を来すことなく、デバイスの上部および底部からの光学的なアクセスを可能にする。追加的に、その逆も正しく、それは、カンチレバー励起が現代の光学的な技法による情報の獲得に支障を来さないということを意味しており、両方のタイプのシステムは同時に働くことができる。この事実は、カンチレバー、カンチレバーホルダー、およびサンプルホルダーの透過性とともに、デバイスを現代の光学的な技法と完全に互換可能にさせる。説明されているデバイスは、近接場光学に関して使用されるシステムといくつかの特徴を共有するが、しかし、大きな違いが存在するということに留意することが重要である。たとえば、近接場光学に関して使用されるいくつかのシステムは、カンチレバーを有しており、導波路をそれに取り付けられている。レーザーは、導波路に焦点を合わせられており、導波路は、プラズモンを励起するために金属を含有するサンプルの非常に近くになければならない（典型的に、数ナノメートルまたは数十ナノメートル）。本明細書で説明されているデバイスは、カンチレバーに取り付けられる導波路を有していない。加えて、本明細書で説明されているデバイスは、プラズモンの励起などの、近接場光学の効果を誘導するためにレーザーを使用せず、時間とともにカンチレバーをたわませるためにレーザーを使用している。そのうえ、本明細書で説明されているデバイスは、金属を含有する必要性なしに、サンプルからの情報を抽出することができる。このデバイスの中のサンプルは、カンチレバーに取り付けられている。サンプルの合計質量を決定する間に、（サンプルがそれに取り付けられている状態の）カンチレバーは、生物学的なサンプルが培養されるペトリ皿または受容器の表面から離れて位置付けされており、測定に影響を及ぼし得る起こり得る相互作用を回避するようになっている。丸くされたときに約１０〜２０ミクロンの直径を有する可能性がある哺乳類の細胞とともに働くとき、細胞を含有するカンチレバーとペトリ皿の表面との間の距離は、典型的に、数十ミクロンまたは数百ミクロンである。そのうえ、本明細書で説明されているデバイスは、第２のレーザーを利用しており、第２のレーザーは、カンチレバーのたわみを読み取るためにカンチレバーの自由端部の近くに位置付けされている。しかし、この第２のレーザーは、必須でなく、圧電カンチレバー、ピエゾ抵抗カンチレバー、ドップラー干渉計などの、他のシステムも適用され得る。

測定デバイスは、細胞質量を細胞の位相および形状に連続的に相関させることを可能にすることによって、高い時間分解能で、および、非侵襲性の様式で、細胞周期中を移行する単一細胞の質量および／または機械的特性を定量化することを可能にする。そのうえ、質量センサーは、単一細胞または細胞の小集団のいずれかを検討するためにカスタマイズされ得る。

好ましくは、カンチレバーは、１０μｍから１０００μｍの範囲にある長さを有している。たとえば、おおよそ２０μｍの直径を備える細胞を測定する場合に関して、カンチレバーの長さは、おおよそ７５μｍであることが可能である。そのうえ、カンチレバーは、好ましくは、１Ｈｚから１０ＭＨｚの範囲にある共振周波数、好ましくは、２０ｋＨｚから１２００ｋＨｚの範囲にある共振周波数、好ましくは、水の中に浸漬されているときに２０ｋＨｚから４００ｋＨｚの範囲にある共振周波数を有している。共振周波数のこの範囲の中で、システムは、直径が約１〜３０ミクロンの単一細胞を測定するために適合され得るが、しかし、より小さいまたはより大きい生物学的システムも測定され得る。最後に、カンチレバーは、好ましくは、０．０１ｎｍから３００ｎｍの範囲にある振動振幅、好ましくは、３０ｎｍよりも小さい振動振幅を有している。測定デバイスを最適化するために、異なる用途に関してカンチレバー寸法を適合させることによって、測定されることとなるターゲットの生物学的システムにしたがって、カンチレバーを選ぶまたは適合させることが可能である。

好ましくは、光源は、３５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲にある波長を備えるレーザーであることが可能である。それは、３５０ｎｍから５５０ｎｍの間、好ましくは、３５０ｎｍから４５０ｎｍの間であることが可能である。具体的には、４０５ｎｍの波長が使用され得、それは、蛍光顕微鏡検査法において使用される波長の多くからそれが十分に遠いという追加的な利点を有している。しかし、カンチレバー材料に応じて、他の波長も同様に使用され得る。具体的には、励起レーザーの波長は、それがカンチレバーによって強力に吸収されるように選ばれる。有利には、カンチレバーの上のレーザースポット位置、直径、および焦点が調節され得、カンチレバーのベースに位置付けされ得る。これは、励起効率を最大化する。レーザースポットは、直径が１００μｍよりも小さく、好ましくは、３０μｍよりも小さく、好ましくは、１０μｍよりも小さくなっていることが可能である。このサイズは、高い効率でカンチレバーを励起することを可能にし、同時に、サンプルとの相互作用を回避するために生物学的システムから遠くにレーザーを有することを可能にする。質量感度を増加させるために、生物学的なサンプルは、通常、カンチレバーの自由端部の近くに位置決めされている。

追加的に、および、有利には、マイクロカンチレバーの上の光源（好ましくはレーザー）のスポット、および、生物学的システムが接着している機能化された側部は、カンチレバーの反対側の面に位置付けされており、検討されることとなる細胞への任意の影響を防止することが可能である。

本発明の第４の態様は、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための方法に関し、方法は、
ａ． カンチレバーのばね定数を決定するステップと、
ｂ． 光源、好ましくは、レーザーによって、特定の周波数でカンチレバーを励起するステップと、
ｃ． 生物学的システムを取り付ける前に、カンチレバーの移動の共振周波数ならびに／または振幅および位相を測定するステップと、
ｄ． サンプルホルダーの中の選ばれた生物学的システムにカンチレバーを近づけるステップと、
ｅ． 生物学的システムをカンチレバーに取り付けるステップと、
ｆ． カンチレバーの移動の共振周波数ならびに／または振幅および位相を測定し、ステップｃ）において得られた共振周波数ならびに／または振幅および位相と比較するステップと、
ｇ．生物学的システムの質量および／または機械的特性を計算するステップと
を含む。

必要な場合には、カンチレバーの機能化は、ステップａ）の前または後に可能である。代替的に、ステップａ）は、ステップｆ）の後に実施され得る。この場合では、カンチレバーは、ステップａ）を実行する前に、サンプルから任意の残りのものを除去するためにクリーニングされなければならない。ステップｅ）において、生物学的システムが表面に結合されている場合では、カンチレバーは、サンプルに近づけられ、サンプルをピックアップすることが可能であり、次いで、カンチレバーに取り付けられているサンプルを維持している表面から引き出され、カンチレバーの共振周波数に対する、起こり得る表面の影響を回避する。サンプルが位置していた表面から遠く離れて、ステップｆ）が実施され得る。ステップｆ）は、実験の後であっても行われ得る。その理由は、それが単なる計算を意味するからである。通常、１００〜２００μｍは、十分に遠い。また、ステップｃ）は、測定に対する起こり得る表面の影響を回避するために、表面から十分に遠くで行われ得る。
追加的に、測定は、カンチレバーを引き出すことなく実施され得る。しかし、この場合では、カンチレバーは、自由に振動することはできず、したがって、得られる情報は、解釈されなければならない。
周波数スペクトルにわたるスイーピング（ｓｗｅｅｐｉｎｇ）プロセスは、カンチレバーの移動をマッピングすることによって、すなわち、振幅および位相を観察することによって、共振周波数を決定することを可能にする。

この測定方法は、ターゲットにされる細胞の選択、および、質量および／または機械的特性の特定の測定を可能にする。具体的には、浮遊質量の測定だけでなく、単一細胞の合計質量の測定も可能である。したがって、マイクロカンチレバーは、緩衝溶液中に完全に浸漬され得る。

ステップａ）におけるカンチレバーのばね定数の決定は、以下のように実施され得る。
ａ’ 特定の周波数で、レーザーによってカンチレバーを励起し、
ｂ’ カンチレバーの共振周波数を決定する。

これは、カンチレバーばね定数の較正を可能にし、それによって、合計質量を測定することを可能にする。共振周波数を決定するためにレーザーによる積極的な励起を使用するプロセスは、非常に正確である。このプロセスは、通常、空気周囲条件において行われ、その目的は、カンチレバーのばね定数を見出すことである。非常に正確な方式は、Ｓａｄｅｒ法を使用することによる。それに関して、カンチレバーは、強度変調されたレーザーを使用して励起され、カンチレバーの共振周波数を見出すのに十分な周波数の間隔をスキャンする。周波数スキャンから、カンチレバーの共振周波数およびクオリティーファクターが決定される。空気の密度、ならびに、カンチレバーの寸法および材料とともに、その情報を使用して、そのばね定数が抽出され得る。しかし、たとえば、空気周囲条件もしくは液体周囲条件のいずれかにおけるカンチレバーの熱雑音の測定に基づいて、または、ばね定数が知られている別のカンチレバーによって押されるときのカンチレバーの曲げを分析することによって、他の方法も利用され得る。カンチレバーの共振周波数を決定するときに、カンチレバーは、サンプルホルダーの底部から遠く離れ、サンプルホルダーの表面からの影響を回避するべきである（通常、１００〜２００μｍは十分に遠い）。

しかし、精度はずっと低いかもしれないが、較正手順を使用し、熱エネルギー振動に基づいてカンチレバーの共振周波数を決定することも可能である。熱エネルギーに起因して（それは、カンチレバーの温度に関連している）、カンチレバーは、非常に小さい振幅によって、共振周波数で振動している。いくつかの場合では、この振幅は非常に小さいので、検出することが非常に困難である可能性がある。たとえばスペクトル分析器を使用して、カンチレバーのこの移動が分析され得、その共振周波数が測定され得る。この方法は、カンチレバーを積極的に励起することを必要とはせず、それは、カンチレバーが液体の中に浸漬されているときには困難である。この問題は、提案されているように、強度変調されたレーザーを使用することによって克服され得、それは、非常にクリーンなカンチレバーの励起および応答を作り出す。

本測定方法は、
ａ” 生物学的システムを選ぶステップ、および、
ｂ” 選ばれた生物学的システムにカンチレバー寸法を適合させるステップ
という、ステップａ）の前に実施される追加的なステップをさらに含むことが可能である。

カンチレバーを生物学的システムに合わせることは、測定の分解能を増加させ、すなわち、カンチレバーのサイズを、細胞タイプ、ならびに、たとえば、そのサイズおよび／または質量に適合させる。

カンチレバーを生物学的システムに適合させる１つの方式は、焦点を合わせられたイオンビームを使用することによって、シリコンのピース、たとえば、シリコンから作製される大きいカンチレバーを切り落とすことによる。この技法は、非常に高い分解能での材料のアブレーションを可能にするが、当業者に知られている他の方法および技法は、カンチレバーを作り出すために等しく適用され得る。

さらに、フィードバックループは、高い時間分解能で、生物学的なサンプルの質量変化を時間とともにトラッキングするために、ステップｆ）において使用され得る。１つまたはいくつかのフィードバックループの使用は、感度および時間分解能を増加させる。具体的には、位相ロックループ（ＰＬＬ）が使用され得る。その中で、カンチレバーの位相が、制御変数として使用され、レーザー強度を変調させるための信号の周波数が、操作された変数として使用される。制御条件は、π／２のカンチレバー位相を作り出す励起信号の周波数を見出すことである。このシステムによって、カンチレバーの共振周波数は、自動的にトラッキングされ得、したがって、質量変化は、直接的に測定され得る。

さらに、第２のフィードバックが、独立してまたは累積的に使用され、検討されることとなる生物学的システムについてのさらなる情報を得ることが可能である。このフィードバックは、カンチレバーの振動振幅を制御変数として使用し、レーザーの強度を変調させるために使用される信号の振幅を、操作された変数として使用する。それによって、カンチレバーの振幅が長い期間にわたって一定に維持されることが確実にされる。そのようにすることにより、システムのダンピングに関連する情報が獲得され得る。

カンチレバーの基本的なたわみモードまたは高次たわみモードが使用され得る。

本発明は、例示的な実施形態を参照して、より詳細に以下で説明されることとなる。

測定デバイスの概略図である。 光学顕微鏡を備える測定デバイスの概略図である。 より高い詳細のレベルでの、光学顕微鏡を備える測定デバイスの概略図である。 移動の方向を示す矢印を備える測定デバイスの２次元の上面図である。 測定デバイスの２次元の上面図である。 測定デバイスの２次元の底面図である。 測定デバイスの２次元の断面図である。 第１の視点での測定デバイスの３次元の上面図である。 第２の視点での測定デバイスの３次元の上面図である。 測定デバイスの３次元の底面図である。 第１の視点での３次元の断面図である。 第２の視点での３次元の断面図である。

図１の測定デバイス１は、固定部３の中にカンチレバー２を有している。カンチレバー２は、強度変調された励起レーザー４によって励起される。これは、カンチレバー２に焦点を合わせられている強度変調されたレーザー４によるカンチレバー２の直接的な励起を可能にする。レーザー４は、カンチレバー２を励起する非常に局所的な変調された加熱作用を作り出す。このレーザースポットの位置、直径、および焦点は、調節され得、また、それは、通常、励起効率を最大化するために、カンチレバー２のベースに位置付けされている。生物学的システム５は、通常、マイクロカンチレバー２の自由端部の近くに位置決めされており、質量感度を増加させる。追加的に、検討されることとなる生物学的システムに対する任意の影響を防止するために、励起レーザー４および生物学的システム５（たとえば、１つまたはいくつかの細胞）は、好ましくはおよび有利には、カンチレバー２の反対側の面に位置付けされている。したがって、カンチレバー２の機能化された側部は、この自由端部の近くに設置されている。この全体の配置は、流体細胞の中に設置され得る。

図２による測定デバイス１１は、固定部１３の中にカンチレバー１２を含み、それは、カンチレバー１２のベースにおいて強度変調されたレーザーによって励起される。繰り返しになるが、ここで、生物学的なサンプル１５は、機能化によって、カンチレバー１２の自由端部に結合されている。追加的に、測定デバイス１１は、光源１７およびレンズシステム１８からなる光学顕微鏡１６を通して提供されている。使用される顕微鏡１６は、倒立顕微鏡である。

図３に示されているような測定デバイス２０は、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスを、細胞生物学における光学的な技法と組み合わせる。ＤＩＣ照明または位相コントラスト照明２１は、倒立顕微鏡３４とともに、測定デバイスのそれぞれの光学的な部分を形成する。

生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定する測定デバイスの部分に関して、強度変調されたレーザー２２は、たとえば４０５ｎｍの波長を備えるレーザービームを放射し、それは、ダイクロイックミラー２５によってカンチレバーに焦点を合わせられて反射され、ダイクロイックミラー２５は、レーザーの波長、たとえば４０５ｎｍを選択的に反射する。カンチレバー３７の上のレーザースポット直径は、レーザーの焦点の位置を変化させることによって修正され得る。

カンチレバー３７が、カンチレバーホルダー３２によって保持されている。レーザー２３による第２の光学的な経路は、カンチレバー３７の移動を読み取る。このレーザー２３は、たとえば、８５０ｎｍの波長によって動作する。この第２のレーザーのレーザービーム（実線）は、長さシステム２６によってカンチレバーに焦点を合わせられ、ダイクロイックミラー２４によってカンチレバーに方向付けされ、ダイクロイックミラー２４は、第２のレーザー２３の波長、たとえば８５０ｎｍを選択的に反射する。カンチレバーにおけるレーザービームの反射の後に、ビームは、再び、ミラー３１によって方向を変えられ、バンドパス光学フィルター３５を通され、バンドパス光学フィルター３５は、それがフォトダイオード３６に衝突する前に、それぞれの波長、たとえば８５０ｎｍに中心を合わせられ、フォトダイオード３６は、レーザービームの移動を検出することによって、カンチレバーの移動を検出することを可能にする。生物学的なサンプルの質量および／または機械的特性を連続的にトラッキングするために、ミラー３１およびフォトダイオード３６は、自動的に作動させられ、反射されたビーム２３が時間とともに中心でフォトダイオードに衝突することとなることを確実にする。生物学的なサンプルは、時間とともにカンチレバーを曲げ、フォトダイオードの中心からレーザーを引き出すことが可能であるので、この自動化は、非常に重要である可能性がある。反射されるビームの方向の補正は、カンチレバーの共振周波数のトラッキングを妨害しない。サンプルに対してカンチレバー３７の移動を可能にするために（図示せず）、すなわち、デバイスが、カンチレバー３７を用いて、たとえばペトリ皿などのサンプルホルダー３３の上に存在する特定のサンプルをピックアップすることを可能にするために、アクチュエーター２８のようなアクチュエーターが、垂直方向にカンチレバーを移動させるために使用される。追加的に、プラットフォーム２９は、２つのＸＹポジショナーを装備しており、装置２７およびサンプルホルダー３３のためのボックスを移動させる。

図５から図８の実施例に関して示されているような測定デバイス４０は、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスを、細胞生物学における光学的な技法と組み合わせる。しかし、ここでは、光学顕微鏡は示されていない。また、示されていないのは、サンプルを保持する測定デバイスの下側部分である。

図４から図１２に示されているような測定デバイスの上側パーツは、生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定することを可能にする。第１の光学的な経路は、カンチレバー６０の励起を提供する。強度変調されたレーザー（図示せず）は、４０５ｎｍの波長でレーザービーム５６を放射する。このレーザービーム５６は、４０５ｎｍレーザービームの焦点を合わせる光学的なシステム５５を通って測定デバイス４０に進入する。この光学的なシステム５５は、２つのポジショナーシステム、第１のポジショナーシステム５０および第２のポジショナーシステム５１によって保持されている。第１のポジショナーシステム５０は、４０５ｎｍレーザービーム５６の焦点を合わせるために光学的なシステム５５を保持している。第１のポジショナーシステム５０は、図４の中の矢印によって示されているように移動することが可能であり、それは、たとえば、カンチレバー６０の上のレーザースポット直径を修正することを可能にする。第２のポジショナーシステム５１は、第１のポジショナーシステム５０およびダイクロイックミラー４９を保持している。ダイクロイックミラー４９は、４０５ｎｍ波長を反射し、可視スペクトルの中の他の波長および８５０ｎｍ波長が通過することを可能にする。この第２のポジショナーシステム５１は、図４の中の矢印によって示されているように移動することが可能であり、それは、たとえばカンチレバー６０のような特定の場所に衝突するように、４０５ｎｍレーザービーム５６を位置決めすることを可能にする。レーザービーム５６を辿るシステム４０のこの第１の光学的な経路は、それによって、強度変調されたレーザー（図示せず）からカンチレバー６０へのエネルギーの調節可能な伝達を確実にする。カンチレバー６０自身は、カンチレバーホルダー６２によって保持されている。

８５０ｎｍの波長を備えるレーザービーム４４を辿る第２の光学的な経路は、カンチレバー６０の移動を読み取る。この第２のレーザービーム５４は、光学的なシステム５３を通って測定デバイスに進入し、８５０ｎｍレーザービーム５４の焦点を合わせる。光学的なシステム５３は、２つのポジショナーシステム、第１のポジショナーシステム４５および第２のポジショナーシステム４６によって保持されている。ポジショナーシステム４５は、８５０ｎｍレーザービーム５４の焦点を合わせるために光学的なシステム４３を保持している。このポジショナーシステム４５は、図４の中の矢印によって示されているように移動することが可能である。これは、たとえば、カンチレバー６０の上のレーザースポット直径を修正することを可能にする。第２のポジショナーシステム４６は、第１のポジショナーシステム４５およびダイクロイックミラー４７を保持している。ダイクロイックミラーは、８５０ｎｍ波長を反射し、可視スペクトルの中の他の波長が通過することを可能にする。また、この第２のポジショナーシステム４６は、図４の中の矢印によって示されているように移動することが可能である。これは、たとえばカンチレバー６０のような特定の場所に衝突するように、８５０ｎｍレーザービーム５４を位置決めすることを可能にする。カンチレバー６０による８５０ｎｍレーザービームの反射は、この光学的な経路が、カンチレバー６０の移動を読み取ることを可能にし、カンチレバー６０の後にミラー５７が続き、８５０ｎｍレーザービームをフォトダイオード５９に向ける。４象限フォトダイオード（ｆｏｕｒ−ｑｕａｄｒａｎｔ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）５９は、８５０ｎｍレーザービーム５４の位置を検出することによって、カンチレバー６０の移動を読み取ることを可能にする。ミラー５７は、フォトダイオード５９の上に８５０ｎｍレーザービーム５４を位置決めすることを可能にするように、回転させられ得る。したがって、アクチュエーター４３は、ミラーのホルダーをスピンさせることによって、ミラー５７を移動させる。追加的に、ポジショナーシステム４８は、図４の中の矢印によって示されているようにフォトダイオード５９を移動させることを可能にする。このシステムは、たとえば、アクチュエーター４３と組み合わせて使用され、８５０ｎｍレーザー５４をフォトダイオード５９の特定の部分に衝突させることが可能である。そのうえ、この第２の光学的な経路は、８５０ｎｍの波長に中心を合わせられているバンドパスフィルター５８を含有している。このバンドパスフィルター５８は、８５０ｎｍとは非常に異なる他の波長がフォトダイオード５９に到達することを回避し、それによって、８５０ｎｍ光を決定付けるために、フォトダイオード５９に関する信号対雑音比を増加させ、システムの中の他の波長に起因する検出の妨害の可能性を回避する。

ウィンドウ４４は、ＤＩＣ、位相コントラスト、または、他の照明タイプに関して十分なアクセスを提供することによって、光学的な技法との組み合わせを可能にする。

装置を保持するためにボックスのベース４１の上に設置されているシステム全体は、アクチュエーター４２、４２’、および４２”によって移動させられ得、それは、ボックス、および、したがってカンチレバーを、垂直方向に沿って移動させることを可能にする。これらのアクチュエーター４２、４２’、および４２”は、たとえば、サンプル（図示せず）に対してカンチレバー６０を近づけることおよび引き出すことを可能にする。

Claims (14)

1. 生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための測定デバイスであって、マイクロカンチレバーと、前記カンチレバーを励起する強度変調された光源とを備え、前記カンチレバーは、可視スペクトルの波長に対して少なくとも部分的に透過的であり、前記生物学的システムに接着するように機能化されている、測定デバイス。
2. 請求項１に記載の測定デバイスであって、
   前記カンチレバーは、緩衝溶液中に完全に浸漬されている、測定デバイス。
3. 請求項１から２のいずれか１項に記載の測定デバイスであって、
   前記測定デバイスは、光学顕微鏡、具体的には、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）顕微鏡、ＤＩＣ顕微鏡および／または位相コントラスト顕微鏡を含み、これらすべてが、倒立顕微鏡と解釈される、測定デバイス。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の測定デバイスであって、
   前記カンチレバーは、１０μｍから１０００μｍの範囲にある長さ、好ましくは、１０μｍから１００μｍのサイズにある長さ、および／もしくは、１Ｈｚから１０ＭＨｚの範囲にある共振周波数、好ましくは、２０ｋＨｚから１２００ｋＨｚの範囲にある共振周波数、好ましくは、水中に浸漬されているときに２０ｋＨｚから４００ｋＨｚの範囲にある共振周波数、および／もしくは、０．０１ｎｍから３００ｎｍの範囲にある振動振幅、好ましくは、３０ｎｍよりも小さい振動振幅を有しており、ならびに／または、前記光源は、３５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲にある波長、好ましくは、３５０ｎｍから５５０ｎｍの範囲にある波長、好ましくは、３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲にある波長を備えるレーザーである、測定デバイス。
5. 請求項１から４のいずれか１項に記載の測定デバイスであって、
   前記光源は、スポットに焦点を合わせられており、前記光源の前記スポットと、前記サンプルが取り付けられている部位とは、前記カンチレバーの反対側の面にある、測定デバイス。
6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の測定デバイスであって、
   前記光源スポットは、前記カンチレバーのベースに焦点を合わせられている、測定デバイス。
7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の測定デバイスであって、
   前記光源スポットは、直径が１００μｍよりも小さく、好ましくは３０μｍ、好ましくは１０μｍよりも小さい、測定デバイス。
8. 生物学的システムの質量および／または機械的特性を決定するための方法であって、
   ａ． カンチレバー、具体的には、請求項１から７のいずれか１項に記載の測定デバイスのカンチレバーのばね定数を決定するステップと、
   ｂ． 光源によって、特定の周波数で前記カンチレバーを励起するステップと、
   ｃ． 生物学的システムを取り付ける前に、前記カンチレバーの共振周波数ならびに／ または振幅および位相を測定するステップと、
   ｄ． サンプル内の選ばれた生物学的システムに前記カンチレバーを近づけるステップと、
   ｅ． 前記生物学的システムを前記カンチレバーに取り付けるステップと、
   ｆ． 前記カンチレバーの共振周波数ならびに／または振幅および位相を測定し、ステップｃ）において得られた前記共振周波数と比較するステップと、
   ｇ．前記生物学的システムの質量および／または機械的特性を計算するステップと
   を含む、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、
   ａ’ 特定の周波数を備えるレーザーによって前記カンチレバーを励起することと、
   ｂ’ 前記カンチレバーの前記共振周波数を測定することによって、
   ステップａ）において較正を実施する、方法。
10. 請求項８または９に記載の方法であって、
    ａ” 生物学的システムを選ぶステップと、
    ｂ” 前記選ばれた生物学的システムにカンチレバー寸法を適合させるステップ
    という、ステップａ）の前に実施される追加的なステップを含む、方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、フィードバックループが使用される、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記カンチレバーの前記位相が、制御変数として使用され、レーザー強度を変調させるために使用される信号の周波数が、操作された変数として使用される、方法。
13. 請求項１１または１２に記載の方法であって、前記カンチレバーの振動振幅が、前記制御変数として使用され、前記レーザー強度を変調させるために使用される信号の振幅が、操作された変数として使用される、方法。
14. 請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記カンチレバーの基本たわみモードおよび／または高次たわみモードが使用される、方法。
    

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