JP6593811B2

JP6593811B2 - 神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導方法

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Publication number: JP6593811B2
Application number: JP2017521742A
Authority: JP
Inventors: 泰之木田; 祐三 ▲高▼山
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2019-10-23
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: EP3305889A4; EP3305889B8; EP3305889A1; EP3305889B1; WO2016194522A1; US20180155682A1; JPWO2016194522A1; US11186821B2

Description

本発明は、神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導方法、当該分化誘導方法により得られた自律神経系の細胞、及び、当該分化誘導方法に用いられるキットに関する。

自律神経系の細胞は末梢神経系に属する細胞種であり、中枢神経系と各臓器を接続する神経路を形成している。また、自律神経系の細胞は身体機能調節において重要な役割を担っており、たとえば精神性の心拍調節などにおいては、中枢からの刺激が末梢の自律神経を介して心臓を制御する。また、自律神経系の細胞の脱落や機能障害は各臓器の機能不全につながる。
iPS細胞の出現により、ヒト細胞を用いての創薬支援や細胞移植治療が現実化してきた。これら創薬支援や細胞移植治療において、単一種の細胞で賄える課題に対して、臓器形成も含めた複合組織で化合物スクリーニング等に使用される創薬支援材料を構築するためには、臓器や組織への補給路である血管系に加え、刺激の感知と制御を担う末梢神経系の試験管外における作製が急務である。
これまでに、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞から、神経堤細胞への分化誘導方法が種々検討されてきたが、ヒト多能性幹細胞より自律神経系の細胞を選択的に誘導する技術は存在しなかった。また、そもそも神経堤細胞から自律神経系の細胞を選択的に分化誘導する技術も存在していない。

非特許文献１には、マウス及びサル由来のES細胞を、間質細胞由来の誘導物質SDIA(Stromal cell-derived inducing activity)とBMP4を用いて神経堤細胞を誘導し、さらにBMP4の濃度を調整することにより自律神経系の細胞や感覚神経系の細胞を分化誘導する方法が開示されている。非特許文献１の方法で誘導された細胞のうちの一部は、ペリフェリン陽性であり、かつ、チロシンヒドロキシラーゼを発現している細胞として確認されている。ペリフェリン及びチロシンヒドロキシラーゼが陽性であるこれらの細胞は自律神経系の細胞に分化していると考えられる。しかしながら、非特許文献１には、当該方法により自律神経系と考えられる細胞へ分化誘導効率について、2〜4％程度の作出効率であることが記載されている。
また、非特許文献２には、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞から神経堤細胞を分化誘導する方法が開示されている。非特許文献２に記載の方法によれば、多能性幹細胞をLefty/Activin/TGFβ経路阻害剤であるSB431542(SB)やCHIR99021(CHIR)を添加したCDM培地(Wataya et al., Proc Natl Acad Sci USA 105:11796-11801 (2008))で培養することで神経堤細胞に分化誘導させ、その後、細胞塊を形成させてBDNF、GDNF、NT-3、及び、NGFを用いて末梢神経へ分化誘導させたことが記載されている。なお、非特許文献２は、多能性幹細胞由来の神経堤細胞を末梢神経系の細胞に分化したことについて記載されているが、自律神経系の細胞は確認されておらず、また、自律神経系の細胞へ分化誘導することを課題としていない。
また、非特許文献３には、FGF2とノギン(noggin)を添加した培養溶液を用いてES細胞から神経前駆細胞塊を作出し、次いでラミニン(laminin)でコートしたカバースリップ上で培養することにより末梢神経系の細胞へ分化させることが記載されている。非特許文献３は、多能性幹細胞から末梢神経系への分化誘導を目的としているものであり、70％以上の細胞が末梢神経系に分化し、また、そのうちの30％の細胞が感覚神経に分化したことが報告されている。なお、非特許文献３の誘導方法によっても、ペリフェリンとチロシンヒドロキシラーゼを発現している細胞が観察されているが、その割合は、ペリフェリン陽性細胞のうち、わずか3〜5％であることが示されている。
このように、多能性幹細胞や神経堤細胞から末梢神経系への分化誘導方法はいくつかの報告がなされているが、末梢神経の中でも自律神経系へ特異的に誘導する方法については報告がない。たとえば、上記非特許文献１及び３は、上述の通り、多能性幹細胞から末梢神経系の細胞へ分化誘導を試みたものであるが、分化誘導後のサンプルにわずかながらチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性の神経細胞が含まれていることが報告されているに留まり(多くて約5％の細胞がTH陽性反応を示したことが記載されている)、種々の末梢神経系の細胞が混在することになる。なお、THは、自律神経系のマーカータンパク質であるため、非特許文献１及び非特許文献３の方法によっても、その一部は自律神経系に誘導されていると考えられるが、分化効率が低いので治療への応用に向けた実用化に耐えない。また、非特許文献１〜３に記載の各方法は、末梢神経系への分化誘導に長期間の培養を必要としており、さらなる短期間の分化誘導方法が望まれていた。

Mizuseki et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:5828-5833(2003) Fukuta et al., PLoS ONE 9(12):e112291(2014) Valensi-Kurtz et al., PLoS ONE5(2):e9290(2010)

上記の問題点に鑑み、本発明は、神経堤細胞から自律神経細胞を短期間かつ高効率で自律神経細胞を分化誘導する方法を提供することにある。

上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討したところ、神経堤細胞から神経細胞を分化誘導する工程(たとえば、非特許文献２の方法に対応して言えば、BDNF、GDNF、NT-3、NGFを用いた分化誘導処理工程)の前に、培養中の神経堤細胞のBMPシグナル経路を活性させ、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路(sonic hedgehog signaling pathway)及びWntシグナル経路(wnt signaling pathway)を阻害することで、より短期間で、かつ、高効率で神経堤細胞を自律神経細胞へ特異的に分化誘導することができることを発見した。上記知見に基づき、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
〔１〕神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法であって、
(ａ)前記神経堤細胞を、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの剤の存在下で培養を行う工程を含む方法に関する。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔２〕上記〔１〕の分化誘導方法であって、
前記工程(ａ)の後に、(ｂ)前記神経堤細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、CNTFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、及び、アスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物の存在下で培養する工程を含むことを特徴とする。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕の分化誘導方法であって、
前記(ａ)の工程が、前記神経堤細胞を、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤の組み合わせの存在下で培養を行う工程であることを特徴とする。
また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の分化誘導方法であって、
前記神経堤細胞が生体由来の神経堤細胞であることを特徴とする。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔５〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の分化誘導方法であって、
前記神経堤細胞が多能性幹細胞由来であることを特徴とする。
また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔６〕上記〔５〕に記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ａ)の前に、前記多能性幹細胞を、BMPシグナル経路阻害剤、TGFシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路活性化剤、FGFシグナル経路活性化剤、EGFシグナル経路活性化剤からなる群より選択される化合物の組み合わせの存在下で培養することにより、前記多能性幹細胞由来の神経堤細胞を誘導する工程を含むことを特徴とする。
また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔７〕上記〔５〕又は〔６〕に記載の分化誘導方法であって、
Y-27632を含有する培地を用いて、前記多能性幹細胞を前培養する工程をさらに含むことを特徴とする。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ａ)において、前記BMPシグナル経路活性化剤が、BMP2、BMP4、BMP7、又はBMP2/4からなる群より選択される少なくとも１つのBMPシグナル経路活性化剤であるか、
SHHシグナル経路阻害剤が、SANT、JK184、ジェルビン(Jervine)からなる群より選択される少なくとも１つのSHHシグナル経路阻害剤であるか、又は、
Wntシグナル経路阻害剤が、IWR、XAV939、IWPからなる群より選択される少なくとも１つのWntシグナル経路阻害剤であることを特徴とする。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔９〕上記〔２〕〜〔８〕のいずれかに記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ｂ)における前記神経堤細胞の播種濃度が、2×10⁵ 個/cm²以上であることを特徴とする。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法の一実施の形態によれば、
〔１０〕上記〔２〕〜〔８〕のいずれかに記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ｂ)が、BDNFシグナル経路活性化剤及びCNTFシグナル経路活性化剤の存在下で培養を行う工程であり、前記BDNFシグナル経路活性化剤が10〜100ng/mlのBDNFであり、前記CNTFシグナル経路活性化剤が10〜100ng/mlのCNTFであることを特徴とする。

また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法により得られた自律神経系の細胞に関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔１２〕BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの剤を含む、神経堤細胞を自律神経系の細胞へ分化するためのキットに関する。

本発明の分化誘導方法によれば、神経堤細胞から高い割合で選択的に自律神経系の細胞へ分化誘導することができる。また、本発明の分化誘導方法は、従来の分化誘導方法と比較して短期間の培養期間で自律神経系の細胞への分化誘導を可能とするものである。
さらに、本発明の分化誘導方法によれば、神経堤細胞を、自律神経系の細胞を構成する交感神経細胞又は副交感神経細胞のそれぞれへと選択的に分化誘導することができる。
なお、本発明により得られた自律神経系の細胞は、再生医療の手法として移植による治療の用途に使用することができ、また、神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化のメカニズムの解明や末梢神経に関連した疾患の治療法確立のための試験に供することができる。

図１は、本発明の一実施の形態における、多能性幹細胞から自律神経系の細胞を分化誘導する方法を示す図である。本方法には、多能性幹細胞の前培養工程と６つの培養工程とが含まれ、各培養工程における培養溶液の組成と培養日数を示す。図２は、下記の実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の方法にてiPS細胞より分化誘導した自律神経系の細胞を免疫染色した後、蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。図２(ａ)は、Hoechst 33342を用いて染色した際の画像を示し、図２(ｂ)は、βチューブリンクラスIII(beta III tubulin: TUJ1)に対する抗体(抗TUJ1抗体)を用いて染色した際の画像を示し、図３(ｃ)は、抗ペリフェリン抗体を用いて染色した際の画像を示す。図３は、下記の実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の方法にてiPS細胞より分化誘導した自律神経系の細胞を免疫染色した後、蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。図３(ａ)は、Hoechst 33342を用いて染色した際の画像を示し、図３(ｂ)は、抗TUJ1抗体を用いて染色した際の画像を示し、図３(ｃ)は、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて染色した際の画像を示す。図４は、公知の多能性幹細胞から末梢神経系の細胞へ分化させる方法を示す図である。本方法には、多能性幹細胞の前培養工程と３つの培養工程とが含まれ、各培養工程における養液の組成と培養日数を示す。図５は、公知の多能性幹細胞由来神経堤細胞の末梢神経系への分化誘導方法により分化した細胞(図５(ａ))又は下記実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の方法で分化誘導した細胞(図５(ｂ))を、抗TUJ1抗体及び抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体を用いて免疫染色した後、蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。図６は、公知の多能性幹細胞由来の神経堤細胞の末梢神経系への分化誘導方法(図５(ａ))、及び、下記実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の分化誘導方法(図５(ｂ))における自律神経系の細胞への分化誘導効率を示すグラフである。グラフ中、(ａ)は公知の分化誘導方法における分化誘導効率を示し、(ｂ)は下記実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の方法における分化誘導効率を示す。また、縦軸は、TUJ1陽性の神経細胞数におけるTH陽性細胞数の割合を示す。図７は、下記実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の方法により誘導された細胞(分化誘導工程６において、培養を３５日間行い得られた細胞)の位相差画像(図７(ａ))、及び、当該細胞を用いて細胞内のカルシウムを蛍光標識によりイメージングした画像(図７(ｂ))を示す。図８は、下記実施例における「２．自律神経系への分化誘導」に記載の方法により誘導された細胞(分化誘導工程６に対して、複数回の電気刺激を加えた際のカルシウムの細胞内流入を蛍光色素により経時的に観察した結果を示す。図８(ａ)は、図７(ａ)と同じ位相差画像であり、そのうち本試験に用いた細胞を具体的に特定する画像である。図８(ｂ)は、複数回の電気刺激を加えた際の蛍光強度を経時的にプロットしたグラフを示す。図９は、下記実施例における分化誘導工程６における細胞播種濃度を、(ａ) 5×10⁴ cells/cm²、(ｂ) 1×10⁵ cells/cm²、又は、(ｃ) 2×10⁵ cells/cm²として分化誘導を行った細胞を、抗TH抗体を用いて免疫染色した後、蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。図１０は、下記実施例における分化誘導工程６における細胞播種濃度を変化させた場合の、交感神経細胞への分化誘導効率を示すグラフである。図１１は、下記実施例における分化誘導工程６で用いる培地を、(ａ)NDM、又は、(ｂ)NDM2として分化誘導を行った細胞を、抗ChAT抗体を用いて免疫染色した後、蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。図１２は、下記実施例における分化誘導工程６における細胞播種濃度を変化させた場合の、副交感神経細胞への分化誘導効率を示すグラフである。図１３は、下記実施例における分化誘導工程６における培地組成を変化させた場合の、副交感神経細胞への分化誘導効率を示すグラフである。図１４は、下記実施例における分化誘導工程６の後、薬剤耐性遺伝子を導入した細胞の(ａ)位相差画像と、(ｂ)GFP蛍光画像である。図１５は、下記実施例における分化誘導工程６の後、薬剤選択培養を行った細胞の(ａ)位相差画像と、(ｂ)GFP蛍光画像である。図１６は、薬剤選択培養後の細胞における、末梢神経細胞マーカー(ペリフェリン)、自律神経細胞マーカー(Phox2b)、交感神経細胞マーカー(TH)、及び副交感神経マーカー(ChAT)の発現量の増加を確認したグラフである。

脊椎動物の神経は、中枢神経と末梢神経に大別される。このうち、末梢神経は、運動神経や感覚神経である体性神経と、交感神経や副交感神経である自律神経とに分けられる。本発明の分化誘導方法は、神経堤細胞を末梢神経のうちの自律神経系の細胞へ分化させる方法である。

本発明者らは、神経堤細胞の分化誘導培養の工程において、BMPシグナル経路を活性化する、又は、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路、若しくは、Wntシグナル経路を阻害する培養を予め行うことにより、自律神経系の細胞に誘導可能であることを発見した。
すなわち、本来、自律神経系の細胞以外の末梢神経等に分化する能力を有する神経堤細胞を、末梢神経への分化誘導培養を行う前に予め、又は、当該分化誘導培養の前半の工程として、上記のようなシグナル経路の活性化又は阻害を可能とする条件で培養を行うことで、自律神経系の細胞に分化するように決定づけることができる。

ここで、本明細書において、「神経堤細胞」とは、脊椎動物の初期発生において表皮外胚葉と神経板の間に一時的に形成される神経堤という構造から脱上皮化し、上皮から間葉への転換後に胚体内の様々な部位に誘導される細胞群をいう。なお、神経堤細胞は、各種の末梢神経系に属する神経細胞や、シュワン細胞、メラニン細胞、心臓の平滑筋等、様々な細胞種に分化することが知られている。
また、本明細書における「神経堤細胞」は、多能性幹細胞より分化誘導処理により分化した神経堤細胞及び生体内から採取された神経堤細胞並びにそれらの継代された細胞を含む。

本発明の分化誘導方法において使用される神経堤細胞としては、上述のように、多能性幹細胞を分化させて得られた神経堤細胞のみならず、生体より採取した生体由来の神経堤細胞、その継代された細胞、又は、それらを凍結保存した細胞などを使用することもできる。神経堤細胞を生体より採取する場合、胎児や成体の神経堤やその他の組織(骨髄、心臓、角膜、虹彩、歯髄、嗅粘膜等)中から採取することができる。また、採取した神経堤細胞は、たとえば、上皮成長因子(Epidermal Growth Factor: EGF)と塩基性線維芽細胞増殖因子(basic Fibroblast Growth Factor: bFGF)を添加した培地で継代培養することができる(非特許文献２)。
また、本発明に使用される神経堤細胞および多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。哺乳動物としては、たとえば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトがあげられる。

また、本明細書において「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞をいう。多能性幹細胞としては、以下に限定されないが、たとえば、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、骨髄間葉系細胞から単離されるMuse細胞、始原生殖細胞に由来する胚性生殖細胞(EG細胞)、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離される多能性生殖幹細胞(mGS細胞)を挙げることができる。なお、ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。上記に列挙した多能性幹細胞は、それぞれ公知の方法により得ることができる。

ここで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)とは、分化した体細胞に少数の遺伝子を導入することによって様々な組織や器官の細胞へのリプログラミングが可能となった細胞をいう。本発明において、神経堤細胞を誘導するために用いられるiPS細胞は、適当なドナーから採取した体細胞の初代培養細胞由来、又は樹立細胞株由来のいずれであってもよい。樹立細胞株由来であれば、由来株として、たとえば、ヒト樹立細胞株であるMRC-5細胞が挙げられる。iPS細胞は、いかなる胚葉系細胞にも分化誘導が可能であることから、iPS細胞の調製に用いる体細胞は、原則的には外胚葉系、内胚葉系のいずれの胚葉系細胞由来のものであってもよい。侵襲性が低く採取が容易な皮膚、髪の毛、歯肉、血液等の細胞は、本態様のiPS細胞の調製に用いる体細胞として好適である。iPS細胞の調製方法については、当該分野で公知の方法に従えばよい。具体的には、たとえば、ヒト多能性幹細胞の維持培養プロトコル第2版, 2010 (理化学研究所発生・再生科学総合研究センター)等に記載されている調製方法を利用できる。

また、本発明において、神経堤細胞を誘導するために用いられるES細胞は、公知の方法により、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を採取し、当該内部細胞塊を繊維芽細胞に由来するフィーダー細胞上で培養することによって樹立することができる。その他、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したES細胞も使用することができる。また、本明細書における「ES細胞」には上記に列挙したES細胞の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したES細胞も含まれる。

（１．分化誘導前における神経堤細胞の細胞内シグナル調整）
上述のように、本発明は、神経堤細胞の分化誘導培養の工程において、BMPシグナル経路を活性化する、又は、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路若しくはWntシグナル経路を阻害する培養を予め行う方法に関する。以降、本明細書では、上記予め行う培養を「神経堤細胞の調整培養」と記載する。
ここで、BMPシグナル経路とは、骨形成タンパク質(Bone morphogenetic protein: BMP)に特異的な細胞内シグナル伝達機構をいう。BMPの細胞内シグナルはＩ型とII型に分類される膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼ受容体を介して伝達されることが知られている。BMPを結合したII型受容体は、Ｉ型受容体の細胞内領域に存在するセリンとグリシン残基に富んだGSドメインと呼ばれる領域をリン酸化し、Ｉ型受容体のキナーゼを活性化する。活性化されたＩ型受容体は、細胞質に存在する受容体制御型Smadタンパク質(R-Smad)と呼ばれるSmad1、Smad5およびSmad8のC末端に存在するセリン・バリン・セリン残基からなるSVSモチーフの２つのセリン残基をリン酸化し、これらの転写調節因子群を活性化する。また、活性化されたBMP受容体は、p38分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(p38 MAPK)等も活性化することが知られている。リン酸化されたR-Smad 2分子は、細胞質に存在するSmad4 1分子とヘテロ３量体複合体を形成し、核へ移行してDNA上のGC配列に富んだ特異的な塩基配列を認識して結合し、標的遺伝子の転写を制御する。

本発明に使用されるBMPシグナル経路活性化剤としては、上記BMPシグナル経路を活性化させることのできる化合物等であり、たとえば、BMP受容体に対するアゴニストやBMPファミリータンパク質、人工的に合成されたキメラタンパク質などを挙げることができる。具体的には、BMP2、BMP4、BMP7、又はBMP2/4などを挙げることができ、好ましくは、BMP4である。なお、本発明に使用されるBMPシグナル経路活性化剤としては、BMPシグナル経路を活性化できるものであれば、上記に列挙する化合物に限定されず公知のものを使用できる。また、BMPシグナル経路活性化剤としては、１つの化合物を用いてもよいし、複数の化合物を組み合わせて用いても良い。
BMPシグナル経路を活性化させるために培地中に添加される試薬の濃度は、BMPシグナル経路を活性化させて、神経堤細胞の自律神経系への分化誘導を促進する範囲に、当業者であれば試薬ごとに適宜設定することができる。たとえば、BMP4をBMPシグナル経路活性化剤として使用する際には、0.1〜100ng/mlの濃度の範囲で用いることが好ましく、5〜50ng/mlの濃度の範囲がより好ましい。

また、SHHシグナル経路とは、主に、リガンドであるソニック・ヘッジホッグにより制御されるシグナル経路である。ソニック・ヘッジホッグは45kDaほどの前駆体として翻訳される。その後、自触媒反応的にN末端側20kDaのシグナルドメイン(SHH-N)とC末端側25kDa(SHH-C)とに切断される。この切断に際してコレステロール分子がSHH-NのC末端側に付加され、細胞外への放出や受容体との相互作用を行うようになる。SHHは、その受容体であるPTCH1(Patched-1)に結合することが知られている。また、SHHがない状態ではPTCH1はSMO(Smoothened)を阻害し、その下流の経路を抑制している。SHHの存在によりSMOへの抑制がなくなると、GLI(Glioma-associated oncogene)転写因子が活性化され、活性化したGLIは核に蓄積し、ヘッジホッグの標的遺伝子の転写を制御すると考えられている。

本発明に使用されるSHHシグナル経路阻害剤としては、上記SHHシグナル経路を阻害できる化合物等であり、たとえば、SMO受容体に対するアンタゴニスト、GLI転写因子の阻害剤などを挙げることができる。具体的には、SANT、JK184、ジェルビンなどを挙げることができ、好ましくは、SANTである。なお、本発明に使用されるSHHシグナル経路阻害剤としては、SHHシグナル経路を阻害できるものであれば、上記に列挙する化合物に限定されず公知のものも使用できる。また、SHHシグナル経路阻害剤としては、１つの化合物を用いてもよいし、複数の化合物を組み合わせて用いても良い。
SHHシグナル経路を阻害させるために培地中に添加される試薬の濃度は、SHHシグナル経路を阻害することにより神経堤細胞の自律神経系への分化誘導を促進する範囲に、当業者であれば試薬ごとに適宜設定することができる。たとえば、SANTをSHHシグナル経路阻害剤として使用する際には、20nM〜2μMの濃度の範囲で用いることが好ましく、100〜500nMの濃度の範囲がより好ましい。

また、Wntシグナル経路とは、Wntが細胞に作用することにより、活性化される細胞内シグナル伝達機構のことである。Wnt遺伝子はヒトやマウスのゲノム上に多数存在している。Wnt受容体として７回膜貫通型受容体Frizzledが10種類存在する。Wnt受容体の共役受容体として、１回膜貫通型受容体LRP5、LRP6、Ror1、Ror2、Ryk等が存在する。本シグナル経路には（ｉ）β-カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ-カテニン経路、（ｉｉ）細胞の平面内極性を制御する平面内細胞極性(planar cell polarity: PCP)経路、（ｉｉｉ）Ca²⁺の細胞内動員を促進するCa²⁺経路の少なくとも３種類が存在している。
本発明において、Wntシグナル経路を阻害するというときは、特に、上記(ｉ)β-カテニンを介した遺伝子発現を制御するβ-カテニン経路の阻害を目的とする。Wntシグナル経路のうち、特に、当該(ｉ)の経路を阻害することにより、神経堤細胞を自律神経系の細胞に分化誘導することができる。なお、好ましい一実施の形態としては、たとえば、Wntファミリーの一種であるWnt-3aの阻害を挙げることができる。Wnt-3aはLRP5/6膜貫通タンパク質とともにFrizzled受容体タンパク質に結合し、細胞内カスケードを介して細胞内β‐カテニン濃度を上昇させる。そして、最終的に、Wnt/β-カテニン応答性遺伝子を活性化させることが知られている。
なお、本発明において、Wntシグナル経路の阻害というとき、このようなWnt-3aに依存したシグナル経路の阻害(たとえばWnt-3aそのものに結合することや、あるいはその受容体との結合を阻害)に限定されず、Wnt-1やその他のWnt関連シグナル経路、それらの下流の伝達シグナル経路を阻害することも含まれる。

本発明に使用されるWntシグナル経路阻害剤としては、上記Wntシグナル経路を阻害できる化合物等であり、たとえば、Wntリガンド(たとえばWnt-3aなど)そのものに結合する化合物、Wntリガンドの受容体に対するアンタゴニスト、Wntリガンドより下流のシグナル経路を阻害する化合物などを挙げることができる。具体的には、IWR、XAV939、IWP、などを挙げることができ、好ましくはIWRである。また、本発明に使用されるWntシグナル経路阻害剤としては、Wntシグナル経路を阻害するものに限られず、Wnt非依存的β-カテニンシグナルを阻害できるものも含まれる。なお、本発明に使用されるWntシグナル経路阻害剤は、Wntシグナル経路を阻害するもの、又は、Wnt非依存的β-カテニンシグナルを阻害できるものであれば、上記に列挙する化合物に限定されず公知のものを使用できる。また、Wntシグナル経路阻害剤としては、１つの化合物を用いてもよいし、複数の化合物を組み合わせて用いても良い。
Wntシグナル経路を阻害するために培地中に添加される試薬の濃度は、Wntシグナル経路を阻害することにより神経堤細胞の自律神経系への分化誘導を促進する範囲に、当業者であれば試薬ごとに適宜設定することができる。たとえば、IWRをWntシグナル経路阻害剤として使用する際には、0.5〜100μMの濃度の範囲で用いることが好ましく、2〜20μMの濃度の範囲がより好ましい。

本発明の神経堤細胞の調整培養は、神経堤細胞から自律神経系の細胞へ分化誘導可能な限りにおいて、
（１）BMPシグナル経路の活性化
（２）ソニック・ヘッジホッグシグナル経路の阻害
（３）Wntシグナル経路の阻害
のうちの少なくとも１つを行うものであってもよい。好ましくは(１)〜(３)のうちの２つの経路を活性化又は阻害する方法であり、最も好ましくは(１)〜(３)の３つ全ての経路を活性化又は阻害する方法である。
また、上記(１)〜(３)の経路のうちの２つ以上の経路を活性化又は阻害する際は、神経堤細胞から自律神経系の細胞へ分化誘導可能な限りにおいて、各経路の活性化又は阻害を同時期に行ってもよく、それぞれ異なるタイミングで行ってもよく、又は、それらを組み合わせても良い。
また、多能性幹細胞から神経堤細胞を分化誘導し、その後さらに自律神経系の細胞へ分化誘導を行う際には、上記(１)〜(３)の経路の活性化又は阻害する方法を、多能性幹細胞から神経堤細胞へ分化誘導する培養工程の後半に組み入れてもよい。

なお、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路阻害剤は、hESMやN-2培地またはそれらの混合物を基本培地として、当該基本培地に添加して使用することができる。好ましい基本培地は、hESM及びN-2培地の混合培地である。当該混合培地を用いる際には、hESMとN-2培地との割合は、1：3〜3：1の範囲とすることが好ましい。なお、基本培地は、神経堤細胞を自律神経系の細胞に分化誘導可能である限りにおいて、その他の公知の培地を使用することができる。また、基本培地には、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路阻害剤以外の成分として、bFGF、EGF、等を含有させてもよい。なお、細胞増殖および神経分化の観点から、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路阻害剤以外の成分としてbFGFを含有することが好ましい。
BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤からなる群から選択されるすくなくとも１つの剤を添加した培地で神経堤細胞を培養する工程は、5〜7日間行うことが好ましく、6日間行うことがより好ましい。
また、本発明の神経堤細胞の調整培養は、接着培養法によって行ってもよいし、浮遊培養法によって行ってもよい。

また、一実施の形態として、上記(１)〜(３)のシグナル経路の活性化又は阻害する工程は、２つ以上の工程により構成されていてもよい。複数の工程を含む好ましい一実施の形態としては、hESMとN-2培地を1:1(v/v)で混合した培地を基本培地として培養する工程を2〜3日、好ましくは2日行い、その後、hESMとN-2培地を1:3(v/v)で混合した培地を基本培地として培養する工程を3〜5日、好ましくは4日行う方法を挙げることができる。このように培養の後半にhESMに対するN-2培地の濃度を上げることが好ましい。また、このように基本培地の組成を変更して２つ以上の培養工程を組み合わせると、神経分化を促進させることができ、好ましい。なお、このように２つ以上の培養工程を組み合わせることで、細胞の分化誘導を継時的に制御することができ、培養中の細胞の分化段階を均一化させることができる。このように分化誘導中の細胞の分化段階を均一化することより、その後の分化誘導が制御しやすくなり(言い換えれば、適切なタイミングで適切な化合物を作用させることが可能となり、期待する効果を得やすくなり)、分化誘導効率を高めることができる。

なお、（１）BMPシグナル経路の活性化、（２）ソニック・ヘッジホッグシグナル経路の阻害、又は、（３）Wntシグナル経路の阻害のうちの少なくとも１つを行う培養工程として、好ましい一実施の形態の具体例を下記に示す(なお、下記の例は、上記(１)〜(３)の３つの経路を活性化又は阻害する方法である)。
当該方法は、
10μMのIWR-1、250nMのSANT1、25ng/mlのBMP4、及び、10ng/mlのbFGFを含有するhESMとN-2培地との混合培地(1:1(v/v))にて2〜3日間、好ましくは約2日間の培養を行う第一の培養工程と、
10μMのIWR-1、250nMのSANT1、25ng/mlのBMP4、及び、10ng/mlのbFGFを含有するhESMとN-2培地との混合培地(1:3(v/v))にて3〜5日間、好ましくは約4日間の培養を行う第二の培養工程とを含む方法である。
なお、2日以上同じ培地で培養する際には、2日間の培養時点で培地の全量交換を行うことが好ましい。また、上記(１)〜(３)のシグナル経路を活性化又は阻害する工程は、上記の例に限定されず、神経堤細胞から自律神経系の細胞へ分化誘導できる限りにおいて、培地の組成の設計や各培地における培養期間、培養の工程数を適宜設計することができる。

（２−１．神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導方法）
本発明の方法では、上記の神経堤細胞の調整培養の後に、分化誘導処理を行う。
分化誘導処理は、公知の方法(たとえば、非特許文献１や非特許文献２に記載の方法)により行うことができる。たとえば、DMEM/Ham’s F-12培地(和光:048-29785)、ヒト幹細胞用培地(hESM)、N-2培地などを基本培地として、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、CNTFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、アスコルビン酸などの群より選択される化合物または複数の化合物の組み合わせの存在下で培養を行うことができる。このような化合物としては、目的とするシグナル経路の活性化やcAMPの産生を促進するものであれば公知のものを使用することができる。なお、具体的には、以下に列挙する化合物に限定されないが、たとえば、cAMP産生促進剤としてはForskolin (FSK)、L-858051、cAMPアナログであるDB-cAMPなどを使用することができ、BDNFシグナル経路活性化剤としては脳由来神経栄養因子(Brain Derived Neurotrophic Factor: BDNF)などを使用することができ、CNTFシグナル経路活性化剤としては毛様体神経栄養因子(Ciliary Neurotrophic Factor: CNTF)などを使用することができ、GDNFシグナル経路活性化剤としてはグリア細胞株神経栄養因子(Glial-cell Derived Neurotrophil Factor: GDNF)などを使用することができ、NGFシグナル経路活性化剤としては神経成長因子Nerve Growth Factor-β(NGF)などを使用することができ、NT-3シグナル経路活性化剤としてはニューロトロフィン３(Neurotrophin-3: NT-3)などを使用することができる。さらに、基本培地には、Knockout Serum Replacement(KSR)、MEM非必須アミノ酸溶液(non-essential amino acids solution: NEAA)、モノチオグリセロール溶液、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(P/S)、N2サプリメントなどを適宜含ませることができる。

FSKを培地に添加する際には5〜50μMの範囲の濃度とすることが好ましく、BDNFを培地に添加する際には1〜100ng/mlの範囲の濃度とすることが好ましく、CNTFを培地に添加する際には1〜100ng/mlの範囲の濃度とすることが好ましく、GDNFを培地に添加する際には1〜50ng/mlの範囲の濃度することが好ましく、NT-3を培地に添加する際には1〜50ng/mlの範囲の濃度とすることが好ましく、NGFを培地に添加する際には1〜50ng/mlの範囲の濃度とすることが好ましく、アスコルビン酸を培地に添加する際には10〜100μg/mlの範囲の濃度とすることが好ましい。なお、上記の例に限らず、分化誘導試薬の選択や濃度の設定は、組み合わせる試薬の条件などにより適宜行うことができる。

神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導培養は、接着培養法により行う。培養に用いるプレートは、PLO、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ-D-リジン、マトリゲル、またはそれらの組み合わせでコーティングされていることが好ましく、より好ましくはPLO及びラミニンの両方でコーティングされたプレートである。

分化誘導処理の一実施の形態としては、PLO及びラミニンのコーティング処理をしたプレート上で、10μMのFSK、10ng/mlのBDNF、10ng/mlのGDNF、10ng/mlのNT-3、10ng/mlのNGF、及び50μg/mlのアスコルビン酸が含有されるように各試薬を添加したN-2培地を用いて培養することで、神経堤細胞から自律神経系の細胞へ分化誘導を行うことができる。上記の条件で培養する場合、培養期間は10〜30日間が好ましく、20日間がより好ましい。

このように、神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導を行う培養の前に、上記(１)〜(３)の経路の活性化又は阻害を行うことにより、自律神経系への分化誘導効率を高め、さらに分化誘導に必要な培養時間を短くすることができる。
たとえば、非特許文献３に記載の分化誘導方法(多能性幹細胞由来の神経堤細胞から末梢神経系の細胞への分化誘導方法)によれば、少なくとも60日の培養期間を必要とするが、本発明の分化誘導方法によれば40日以内、好ましくは、30日以内の培養期間で分化誘導を行うことができる。

なお、分化誘導培養により、神経堤細胞から自律神経系の細胞へ分化誘導したことを確かめるには、たとえば、下記実施例に示すように免疫染色法により確認することができる。より具体的には、神経細胞の分化マーカーであるTUJ1、末梢神経細胞であることを示すマーカータンパク質であるペリフェリン、交感神経細胞であることを示すマーカータンパク質であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、副交感神経細胞であることを示すマーカータンパク質であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)などのタンパク質を免疫染色することにより確認することができる。なお、本発明により得られる分化誘導培養後の細胞は、上記３つのマーカータンパク質を発現しており、自律神経系の細胞であることを確認することができる。
免疫染色の方法は、下記実施例に記載の条件により行うこともできるし、当業者であれば公知の方法にならい適宜実施することができる。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法によれば、神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導効率を40％以上とすることができ、より好ましくは50％以上であり、さらに好ましくは70％以上である。
なお、本明細書において、神経堤細胞から自律神経系の細胞への誘導効率とは、TUJ1陽性の神経細胞数におけるTH陽性細胞数の割合を意味する。なお、TUJ1陽性又はTH陽性細胞の神経細胞数は、免疫染色等により蛍光標識した後、冷却CCDカメラなどにより撮影された画像を用いて計測することができる。

また、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法により得られる自律神経系の細胞は、機能的な神経細胞に成熟した状態の細胞として得ることができる。分化誘導により得られた神経細胞が機能的であるかを評価するためには、たとえば、下記実施例５．に示されるような、カルシウムイメージングによる電気刺激に対する反応を確認することで評価することができる。一実施の例としては、fluo-4/AMなどの蛍光カルシウム指示薬を細胞内に負荷し、電気刺激を印加することにより、カルシウムの細胞内への流入を観察する。その他、公知の方法により、分化誘導した細胞の機能評価を行ってもよい。
なお、本発明の神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法により得られる自律神経系の細胞によれば、神経細胞に特有の波形・時間幅を持つカルシウム信号の発生を確認することができる。すなわち、本発明の分化誘導方法により得られる自律神経系の細胞は、機能的に成熟した神経細胞として得ることが可能である。

（２−２．神経堤細胞から交感神経系の細胞への分化誘導方法）
また、一実施の形態として、上記２−１．の分化誘導培養において、神経堤細胞を2×10⁵ 個/cm²以上の濃度で播種することにより、神経堤細胞を、自律神経系細胞の、特に交感神経細胞へと選択的に分化誘導することができる。神経堤細胞の播種濃度は、好ましくは2×10⁵〜5×10⁵個/cm²の範囲であり、特に好ましくは4×10⁵〜5×10⁵個/cm²の範囲である。神経堤細胞の播種濃度以外の培養条件は、上記２−１の分化誘導培養と同様であってよい。

本実施形態によれば、神経堤細胞から交感神経細胞への分化誘導効率を30％以上とすることができる。なお、本明細書において、神経堤細胞から交感神経細胞への分化誘導効率とは、ディッシュ内の全細胞数に対するTH陽性細胞数の割合を意味する。なお、TH陽性細胞は、免疫染色等により同定し、計測することができる。

（２−３．神経堤細胞から副交感神経系の細胞への分化誘導方法）
また、一実施の形態として、上記２−１．の分化誘導培養において、10〜100ng/mlのBDNF及び10〜100ng/mlのCNTFを含有する培地を用いることにより、神経堤細胞を、自律神経系細胞の、特に副交感神経細胞へと選択的に分化誘導することができる。BDNF及びCNTFの濃度は、それぞれ、好ましくは40〜100ng/mlの範囲であり、特に好ましくは100ng/mlである。また、BDNF及びCNTFに代えて、同等の作用を有するBDNFシグナル経路活性化剤及びCNTFシグナル経路活性化剤を使用することができる。培地組成以外の培養条件は、上記２−１．の分化誘導培養と同様であってよい。神経堤細胞の播種濃度は、上記２−２．と同様であってよいが、上記２−２．よりも低濃度であると交感神経細胞の増殖を抑制できるため好ましく、特に好ましくは5×10⁴〜1×10⁵個/cm²の範囲である。

本実施形態によれば、神経堤細胞から副交感神経細胞への分化誘導効率を、上記２−１．において一実施の形態として示した従来の培地(10ng/mlのBDNFを含み、CNTFを含まない)を用いた場合と比較して4倍以上とすることができる。なお、本明細書において、神経堤細胞から副交感神経細胞への分化誘導効率とは、ChAT陽性細胞数に基づいて算出した数値である。なお、ChAT陽性細胞は、免疫染色等により同定し、計測することができる。

（３．多能性幹細胞由来の神経堤細胞の調整）
多能性幹細胞由来の神経堤細胞を利用する場合、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導方法は、公知の方法(たとえば、非特許文献２に記載の方法)により行うことができる。たとえば、DMEM/Ham’s F-12(和光:048-29785)、ヒト幹細胞用培地(hESM)、N-2培地などを基本培地として、BMPシグナル経路阻害剤、TGFシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路活性化剤、FGFシグナル経路活性化剤、EGFシグナル経路活性化剤からなる群より選択される試薬の組み合わせの存在下で培養することにより行うことができる。
なお、基本培地には、KSR、NEAA、モノチオグリセロール溶液、P/S、N2サプリメントなどをさらに適宜含ませることができる。
ここで、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導工程において使用されるBMPシグナル経路阻害剤としては、ドルソモルフィン(Dorsomorphin: DM)、LDN-193189 、ノギン(Noggin)など公知の化合物を挙げることができる。また、TGFシグナル経路阻害剤としては、SB431542 hydrate(SB)などの公知の化合物を使用することができる。また、Wntシグナル経路活性化剤としては、CHIR99021(CHIR)、Wnt-3a、BIOなどの公知の化合物を使用することができる。また、FGFシグナル経路活性化剤としては、線維芽細胞成長因子(bFGF)などの公知の化合物を使用することができ、EGFシグナル経路活性化剤としては上皮成長因子(EGF)など公知の化合物を使用することができる。
BMPシグナル経路阻害剤としてDMを培地に添加する際には1〜5μMの範囲の濃度とすることが好ましく、ALK阻害剤としてSBを培地に添加する際には1〜20μMの範囲の濃度とすることが好ましく、GSK-3β阻害剤CHIRを培地に添加する際には1〜6 μMの範囲の濃度することが好ましく、成長因子としてbFGFを培地に添加する際には4〜20ng/mlの範囲の濃度とすることが好ましい。
このような方法で、多能性幹細胞から神経堤細胞へ分化誘導する培養は、約6〜16日間の期間行うことが好ましい。また、本培養工程は、接着培養法により行ってもよいし、浮遊培養法により行ってもよい。
なお、上記の例に限らず、各試薬は適宜選択され、組み合わせる試薬の条件などにより適宜試薬の濃度や培養期間を設定することができる。

また、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導方法は、２つ以上の培養工程(たとえば、異なる組成の培地を用いた２つ又は３つの培養工程)から構成することもできる。たとえば、一実施の形態として、DM及びSBを含む培地で約2日間培養する第一の培養工程と、その後、CHIR及びSBを含む培地で約4〜10日間培養を行う第二の培養工程との２つの工程に分けることができる。なお、本発明者らは、鋭意検討の結果、多能性幹細胞から神経堤細胞へ分化誘導する方法において、より好ましい実施の形態も見出している。このような、本発明においてより好ましい一実施の形態としては、DM、SB、及びbFGFを含む培地で約2日間培養する第一の培養工程と、第一の培養工程の後にCHIR、SB、及びbFGFを含む培地で約2日間培養する第二の培養工程と、第二の培養工程の後にCHIR及びbFGFを含む培地で約2日間培養する第三の培養工程との３つの工程を含むものである。しかしながら、上記の例に限定されず、多能性幹細胞から神経堤細胞が分化誘導できる限りにおいて、本明細書の開示と公知の方法を参考に、培地の組成の設計や各培地における培養期間、培養の工程数を適宜設計することができる。

なお、本発明者らが見出した好ましい実施の形態の一例は、より具体的に下記のような３つの工程から構成される。
すなわち、2μMのDM、10μMのSB、及び、10ng/mlのbFGFを含有するhESM培地にて2〜3日間、好ましくは2日間培養を行う第一の培養工程と、3μMのCHIR、20μMのSB、10ng/mlのbFGFを含有するhESM培地にて1〜3日間、好ましくは2日間培養を行う第二の培養工程と、3μMのCHIR及び10ng/mlのbFGFを含有するhESMとN-2培地との混合培地(3:1(v/v))にて1〜3日間、好ましくは2日間培養を行う第三の培養工程とから構成される方法により実施することができる。なお、このように２つ以上の培養工程を組み合わせることで、神経系細胞への分化誘導効率の高い神経堤細胞の誘導が可能となり好ましい。なお、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導方法においても、このように２つ以上の培養工程を組み合わせることで、細胞の分化誘導を継時的に制御することができ、培養中の細胞の分化段階を均一化させることができる。このように分化誘導中の細胞の分化段階を均一化することは、上述のように、その後の分化誘導が制御しやすくなり(言い換えれば、適切なタイミングで適切な化合物を作用させることが可能となり、期待する効果を得やすくなり)、分化誘導効率を高めることができる。
なお、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導方法は、上記の例に限定されず、適宜使用する試薬や濃度、培養期間を調整して実施することができ、また、公知の方法に従って実施することもできる。

なお、上記の多能性幹細胞から神経堤細胞へ分化誘導する方法に用いる多能性幹細胞は、公知の方法により行うことができ、たとえば、下記のような条件で前培養を行うことが好ましい。
すなわち、前培養は、Geltrex、ビトロネクチン、マトリゲル、ラミニン511-E8などがコーティングされたウェル上にて、Y-27632含有mTeSR1培地中で多能性幹細胞がコンフルエントの状態になるまで2〜3日培養を行うことで実施することができる。コンフルエントの状態になった多能性幹細胞は、上記の神経堤細胞への分化誘導方法に使用することができる。
なお、Y-27632は、Rhoキナーゼ(Rho-associated coiled-coil kinase: ROCK)阻害剤であり、多能性幹細胞を培養する際に分散による細胞死を抑制するために加えられる試薬である。前培養では、同等の作用を有する試薬であれば、代替物を用いてもよい。なお、Y-27632を使用する際には、たとえば、5〜20μMの濃度で使用することができる。また、前培養に使用される基本培地も多能性幹細胞維持用の培地であれば、mTeSR1に限定されず用いることができる。
また、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する培養において、フィーダー細胞は使用しても使用しなくてもよい。

また、本発明の別の態様として、神経堤細胞を自律神経系の細胞へ分化させる試薬を含む、キットを提供する。
本発明のキットには、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの剤を含む。BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤は、上記に列挙される試薬から適宜選択されたものを含むことができる。
また、本発明のキットには、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、又は、Wntシグナル経路阻害剤の他に、神経堤細胞から自律神経系の細胞に分化させるのに必要な試薬や培養用のウェル等の組み合わせを含むこともできる。さらに、本発明のキットは、多能性幹細胞から神経堤細胞へ分化誘導するのに必要な試薬(たとえば、BMPシグナル経路阻害剤、TGFシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路活性化剤、FGFシグナル経路活性化剤、EGFシグナル経路活性化剤など)を含むこともできる。
また、本発明のキットには、分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。

以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
下記実施例において使用した試薬情報(試薬名、製品番号、製造元、略称など)は下記の通りである。
使用薬品
・mTeSR1 WO 2ME/MV (Stemcell Technologies:ST-05850G) - mTeSR1
・DMEM/Ham’s F-12 (和光:048-29785)
・DMEM (high-glucose) (和光:043-30085) - DMEM
・Opti-MEM (Life Technologies:31985-070)
・Fetal Bovine Serum (オーストラリア産) (和光:SFBS) - FBS
・Knockout Serum Replacement (Life Technologies:0828-028) - KSR
・N2 supplement with transferrin(Apo) (和光:41-09041) - N2 supplement
・MEM non-essential amino acids solution (和光:139-15651) - NEAA
・Monothioglycerol solution (和光:95-15791)
・Penicillin-streptomycin solution (和光:168-23191) - P/S
・Brain Derived Neurotrophic Factor, Human, recombinant(和光:020-12913) - BDNF
・Glial-cell Derived Neurotrophil Factor, Human, recombinant(和光:075-04153) - GDNF
・Nerve Growth Factor-β, Human, recombinant (和光:41-07601) - NGF
・Neurotrophin-3, Human, recombinant (和光:141-06643) - NT-3
・L-アスコルビン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光:01319641) - アスコルビン酸
・Y-27632 (和光:253-00513)
・Forskolin (和光:067-02191) - FSK
・Dorsomorphin (Simga-Aldrich:P5499-5MG) - DM
・SB431542 hydrate (Sigma-Aldrich:S4317-5MG) - SB
・CHIR99021 (Cayman Chemical Company:13122) - CHIR
・IWR-1 (Sigma-Aldrich:I0161-5MG)
・SANT1 (Sigma-Aldrich:S4572-5MG)
・骨形成因子4(truncated)、ヒト、組換え体(和光:022-17071) - BMP4
・線維芽細胞成長因子(塩基性)(basic FGF)、ヒト、組換え体(和光:064-04541) - bFGF
・iMatrix-511 (ニッピ:892002)
・Geltrex (hESC-qualified ready-to-use reduced growth factor basement membrane matrix) (Life Technologies:A15696-01)
・Poly-L-ornithine hydrobromide (Sigma-Aldrich:P3655-10MG) - PLO
・Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane (Sigma-Aldrich:L2020-1MG) - Laminin
・Accutase (Life Technologies:A11105-01)
・TrypLE express (Life Technologies:12604-013)
・Ultrapure distilled water (Life Technologies:10977-015) - DW
・D-PBS(-) (和光:045-29795) - PBS
・Tris Buffer Powder, pH7.4 (タカラバイオ:T9153)
・塩酸 (和光:080-01066)
・Albumin, from Bovine Serum (和光:017-23294) - BSA
・ジメチルスルホキシド(和光:074-29353) - DMSO
・ホルムアルデヒド液(和光:064-00406)
・10w/v％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート溶液(和光:161-24801) - Tween-20
・ブロックエース粉末 (DSファーマバイオメディカル:UKB80)
・Can Get Signal (solution 1&2) (東洋紡:NKB-101)
・Anti-beta III tubulin antibody (mouse monoclonal) (Abcam:AB7751)
・Anti-Peripherin antibody (rabbit polyclonal) (Merck Millipore:AB1530)
・Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody (rabbit polyclonal) (Merck Millipore:AB152)
・Hoechst 33342 solution (同仁化学:346-07951)
・F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor^(R)488 conjugate (Life Technologies:A11017) - Alexa Fluor488
・F(ab')2-Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor^(R)555 conjugate (Life Technologies:A21430) - Alexa Fluor555
・Ciliary Neurotrophic Factor, Human, recombinant (和光: 032-18851) - CNTF
・Anti-Tyrosine Hydroxylase (mouse monoclonal) (Merck Millipore: MAB318)
・Anti-Choline Acetyltransferase (rabbit polyclonal) (Abcam: ab68779)
・Lipidure CM-5206E (日油)
・Geneticin solution (和光: 071-04971)

各Stock solutionの調整
・FSK - DMSOを溶媒として、10mMのstock solutionを作製した。
・DM - DMSOを溶媒として、1mMのstock solutionを作製した。
・SB - DMSOを溶媒として、10mMのstock solutionを作製した。
・CHIR - DMSOを溶媒として、3mMのstock solutionを作製した。
・IWR-1 - DMSOを溶媒として、10mMのstock solutionを作製した。
・SANT1 - DMSOを溶媒として、250μMのstock solutionを作製した。
・BMP4 - 0.1％BSAを添加した4mM塩酸溶液を溶媒として、100μg/mlのstock solutionを作製した。
・bFGF - 1mM Tris buffer (pH7.4) を溶媒として500μg/mlに調整後、DMEMを用いて10g/mlのstock solutionを作製した。
・BDNF, CNTF, GDNF, NGF, NT-3 - PBSを溶媒として、10μg/mlのstock solutionを作製した。
・アスコルビン酸- PBSを溶媒として50mg/mlのstock solutionを作製した。
・Y-27632 - Opti-MEMを溶媒として10mMのstock solutionを作製した。
・PLO - DWを溶媒として1mg/mlのstock solutionを作製した。

（ｉ）分化誘導時に用いるヒト幹細胞用培地(hESM)の調製
ヒト幹細胞用培地(hESM)は、DMEM/Ham’s F-12に対して、20％(V/V)KSR、1％(V/V)NEAA、1％(V/V)モノチオグリセロール溶液、及び、1％(V/V)P/Sを含有するように調製した(なお、各試薬の濃度は終濃度を示す)。
（ｉｉ）分化誘導時および神経培養に用いる培地(N-2培地)の調製
N-2培地は、DMEM/Ham’s F-12に対して、1％(V/V)N2サプリメント、1％(V/V)NEAA、及び、1％(V/V)P/Sを含有するように調製することで作製した。

（１−１．分化誘導に用いるヒトiPS細胞の調製）
本試験に用いたヒトiPS細胞(201B7株)は理化学研究所バイオリソースセンターより分譲を受けたものを使用した。また、培養には6-well plate(Corning:3516)を用いた。PBSを1.5ml/wellで加え、さらにiMatrix-511(ニッピ:892002)をそれぞれのウェルに0.5μg/cm²で加えて1時間静置することでコーティング処理を行った。1時間の静置後、各ウェル内のPBS溶液を除去して、mTeSR1を2ml/wellで添加し、さらにY-27632(x1000)を10μMとなるように各ウェルに加えてヒトiPS細胞の培養溶液とした。
上記ヒトiPS細胞の培養溶液中に、(ａ)冷凍サンプル(解凍処理を行ったヒト凍結iPS細胞)、又は、(ｂ)継代したヒトiPS細胞を、4×10⁴〜1×10⁵cells/wellで播種した。ヒトiPS細胞の培養は、37℃、5％CO₂の条件下で行った(なお、以下、ヒトiPS細胞の培養(分化誘導工程における培養も含む)は同様の条件で行った)。播種した日の翌日に、培養溶液の上清を除去した後、mTeSR1(Y-27632抜き)を各ウェルに添加することで培地を交換した。なお、培地の交換は、播種した日の翌日以降、毎日繰り返した。

（１−２．ヒトiPS細胞の継代）
また、上記方法によりヒトiPS細胞を培養中、ヒトiPS細胞がセミコンフルエントになったら下記のように継代を行った。
まず、培養中のウェルからmTeSR1を除去し、37℃に温めたaccutase溶液を1ml/wellで加えて5分間インキュベートした。次に、各ウェル中のaccutase溶液をピペットを用いて培養面に噴きかけるようにしてヒトiPS細胞を剥離させた。剥離後のヒトiPS細胞は、遠沈管に回収した。また、ウェル中に残存するヒトiPS細胞を回収するため、1mlのPBSをウェルに加えて、PBS中に浮遊するヒトiPS細胞も遠沈管に回収した。ヒトiPS細胞を遠沈管に回収後、200×g、4分間の条件で遠心を行った。遠心後、上清を除去し、mTeSR1を1ml添加してヒトiPS細胞を懸濁させた。また、このとき、懸濁液中の細胞数をカウントした。
上記のように回収したヒトiPS細胞は上記１−１．に記載のiMatrixでコーティングしたウェルプレートにて継代培養するか、後述の分化誘導処理に用いた。

（２．自律神経系への分化誘導）
ヒトiPS細胞を自律神経系へ分化誘導するために、分化誘導用ヒトiPS細胞を下記の前培養工程により調製した。
前培養には、12-well plate(Corning:3513)を使用した。ウェルプレートにGeltrexを600μl/wellで加えて、1時間、37℃でインキュベートした。インキュベート後、Geltrexを除去し、10μMのY-27632を含有するmTeSR1溶液を1ml/wellで加えた。次いで、上記１−１．で回収したヒトiPS細胞をウェルプレートに4〜6×10⁵cells/wellで播種した。ヒトiPS細胞の培養は、37℃、5％CO₂の条件で行った。培養開始日の翌日以降、10μMのY-27632を含有するmTeSR1を用いて毎日培地交換を行い、ヒトiPS細胞がコンフルエントの状態になるまで2〜3日間培養を行った。
ヒトiPS細胞がコンフルエント状態になるまで培養した後、コンフルエント状態になったヒトiPS細胞を用いて下記分化誘導工程１〜６の処理を行い、ヒトiPS細胞を自律神経系へ分化誘導した。
以下では、一実施の形態として、６つの工程を行う。下記の分化誘導工程１〜３は、前培養を行った多能性幹細胞を神経堤細胞へ分化誘導する工程に相当する。下記の分化誘導工程４及び５は、神経堤細胞を上記(１)〜(３)のシグナル経路の活性化又は阻害をしながら培養する工程に相当する。下記の分化誘導工程６は、神経堤細胞から自律神経系への細胞へ分化誘導する工程に相当する。本実施形態の概要を図１に示す。
なお、本発明の分化誘導方法は、本実施形態に限定されない。

分化誘導工程１
使用培地の調製：
hESMに対して、2μMのDM、10μMのSB、及び、10ng/mlのbFGFを含有するように各試薬を添加して分化誘導工程１用の培地を調製した(各試薬の濃度は、終濃度を示す。以下、培地の調製における試薬の濃度は終濃度として示す)。
培養方法：
上記前培養によりヒトiPS細胞がコンフルエントになったウェルより10μMのY-27632を含有するmTeSR1を除去し、上記分化誘導工程１用の培地を添加した。分化誘導工程１用の培地に培地交換後、2日間培養を行った。

分化誘導工程２
使用培地の調製：
hESMに対して、3μMのCHIR、20μMのSB、10ng/mlのbFGFを含有するように各試薬を添加して分化誘導工程２用の培地を調製した。
培養方法：
上記分化誘導工程１における培養の後、分化誘導工程１用の培地を除去し、上記分化誘導工程２用の培地を添加した。分化誘導工程２用の培地に培地交換後、2日間培養を行った。

分化誘導工程３
使用培地の調製：
基本培地としてhESMとN-2培地とを3:1(V/V)で混合した培地を作製した。次いで、作製した混合培地に対して3μMのCHIR及び10ng/mlのbFGFが含有されるように各試薬を添加して分化誘導工程３用の培地とした。
培養方法：
上記分化誘導工程２における培養の後、分化誘導工程２用の培地を除去し、上記分化誘導工程３用の培地を添加した。分化誘導工程３用の培地に培地交換後、2日間培養を行った。

分化誘導工程４
使用培地の調製：
基本培地としてhESMとN-2培地とを1:1(V/V)で混合した培地を作製した。次いで、作製した混合培地に対して10μMのIWR-1、250nMのSANT1、25ng/mlのBMP4、及び、10ng/mlのbFGFが含有されるように各試薬を添加して分化誘導工程４用の培地とした。
培養方法：
上記分化誘導工程３における培養の後、分化誘導工程３用の培地を除去し、上記分化誘導工程４用の培地を添加した。分化誘導工程４用の培地に培地交換後、2日間培養を行った。

分化誘導工程５
使用培地の調製：
基本培地としてhESMとN-2培地とを1:3(V/V)で混合した培地を作製した。次いで、作製した混合培地に対して10μMのIWR-1、250nMのSANT1、25ng/mlのBMP4、及び、10ng/mlのbFGFが含有されるように各試薬を添加して分化誘導工程５用の培地とした。
培養方法：
上記分化誘導工程４における培養の後、分化誘導工程４用の培地を除去し、上記分化誘導工程５用の培地を添加した。分化誘導工程５用の培地に培地交換後、4日間培養を行った(なお、2日間の培養時点で分化誘導工程５用の培地を全量交換した)。

分化誘導工程６
培養用ウェルプレートの準備：
24-well plateに50倍希釈したPLO(20μg/ml)を用いてコーティング処理を行った。コーティング処理は、インキュベータ内において1時間行った。コーティング処理後、PLO溶液を除去し、DWでウェルプレートを１回洗浄した。ウェルプレートの洗浄後、20倍希釈したラミニン(5μg/ml)でコーティング処理を行った。コーティング処理は、インキュベータ内において2時間行った。このようにしてPLO及びラミニンのコーティング処理をしたウェルプレートを分化誘導工程６の培養に用いた。
使用培地(neural differentiation medium(NDM))の調製：
N-2培地に対して、10μMのFSK、10ng/mlのBDNF、10ng/mlのGDNF、10ng/mlのNT-3、10ng/mlのNGF、及び、50μg/mlのアスコルビン酸が含有されるように各試薬を添加して分化誘導工程６用の培地(NDM)とした。
培養：
上記分化誘導工程５における培養の後、分化誘導工程５用の培地を除去し、PBSを添加して１回洗浄した。PBSによる洗浄後、TrypLE expressを250μl/wellで添加し37℃で5分間インキュベートした。その後、10％FBSを含むDMEMを1ml/wellで加えて酵素反応を停止させ、培養細胞をウェルプレートより剥離して遠沈管に回収した。遠沈管に回収した細胞に対して、200×gで4分間遠心処理を行った。遠心処理後、上清を除去し、NDMを添加して細胞を懸濁させた。懸濁後、NDM溶液の一部を採取し、細胞数をカウントした。得られた細胞数の情報を基に、PLO/ラミニンでコーティングした24-well plateに1〜2.5×10⁵cells/wellの濃度となるように細胞を播種した。以後、1週間に２回の頻度で培養中のNDMを半量交換した。分化誘導工程６の培養は23日間行い、自律神経系へ分化誘導を行った。自律神経系へ分化していることを確認するため、23日後のサンプルを用いて下記実施例に記載の通りに、免疫染色実験を行った。

（３．免疫染色）
上記２の分化誘導培養後のサンプルをPBS溶液で１回洗浄した。次に、3.7％ホルムアルデヒドを含有するPBS中で20m分間、固定処理を行った。固定処理の後、PBSでサンプルを１回洗浄し、0.2％Tween-20を含有するPBS溶液で5分間インキュベートした。その後、Tween-20含有PBS溶液を除去し、4％ブロックエース溶液(0.2％ Tween-20含有PBS溶液中に4％(w/v)ブロックエース粉末を溶解させたもの)で30分間ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理の後、0.2％ Tween-20含有PBS溶液で１回洗浄した。洗浄後、一次抗体を加えたCan Get Signal1溶液を加えて、4℃で一晩静置した。
使用した一次抗体とその希釈濃度は下記の通り：
（ｉ）抗TUJ1抗体 1:1000希釈
（ｉｉ）抗ペリフェリン抗体 1:1000希釈
（ｉｉｉ）抗TH抗体 1:500希釈
一晩静置により一次抗体反応を行った後、Can Get Signal1溶液を除去し、0.2％ Tween-20含有PBS溶液で２回洗浄を行った。洗浄後、二次抗体を加えたCan Get Signal2溶液を加え、1時間静置した。
使用した二次抗体とその希釈濃度は下記の通り：
（ｉ）Alexa Fluro488 1:1000希釈
（ｉｉ）Alexa Fluor555 1:000希釈
（ｉｉｉ）Hoechst 33342 1:3000希釈
二次抗体の反応処理後、0.2％ Tween-20含有PBS溶液で２回洗浄を行い、蛍光顕微鏡にて観察・撮影を行った。

結果を図２及び図３に示す。図２は、抗TUJ1抗体及び抗ペリフェリン抗体を一次抗体とした二重染色の結果を示す。図２に示すように、上記「２．自律神経系への分化誘導」の方法(以下、「分化誘導方法(ｂ)」と記載する)により処理されたヒトiPS細胞由来のサンプルにおいて、神経細胞の分化マーカーであるTUJ1に陽性を示す細胞群を得ることができた。さらに、図２によれば、分化誘導方法(ｂ)により処理されたヒトiPS細胞由来のサンプルにおいて、ペリフェリン陽性細胞群の反応も観察することができた。なお、ペリフェリンは末梢神経細胞であることを示すマーカータンパク質であることが知られている。よって、図２の結果は、分化誘導処理によりヒトiPS細胞が末梢神経細胞に分化したことを明示するものである。

また、図３は、抗TUJ1抗体及び抗TH抗体を一次抗体とした二重染色の結果を示す。図３に示すように、分化誘導方法(ｂ)により処理されたヒトiPS細胞由来のサンプルにおいて、TH陽性細胞群を観察することができた。なお、THは、自律神経系の細胞であることを示すマーカータンパク質であることが知られている。よって、図３の結果は、分化誘導処理によりヒトiPS細胞が自律神経系の細胞に分化したことを明示するものである。

（４．分化誘導効率の評価）
本発明の分化誘導方法の分化誘導効率を評価するために、従来の方法(以下、「分化誘導方法(ａ)」と記載する)又は分化誘導方法(ｂ)により自律神経細胞の分化誘導を行い、それぞれの分化誘導効率を評価・比較した。
分化誘導方法(ａ)の概要は、図４に示すとおり、iPS細胞の前培養工程と、下記Ａ〜Ｃの３つ分化誘導工程から成る。
より具体的には、前培養として、分化誘導方法(ｂ)と同様に、Geltrexによりコーティングされた12-well plate(Corning:3513)を使用し、10μMのY-27632を含有するmTeSR1溶液の存在下、「１−１．分化誘導に用いるヒトiPS細胞の調製」に記載の方法より得られたヒトiPS細胞(4〜6×10⁵cells/well)を培養した。当該培養は、37℃、5％CO₂の条件にて行った。培養開始日の翌日以降、10μMのY-27632を含有するmTeSR1を用いて毎日培地交換を行い、ヒトiPS細胞がコンフルエントの状態になるまで2〜3日培養を行った。
ヒトiPS細胞がコンフルエント状態になるまで培養した後、コンフルエント状態になったヒトiPS細胞を用いて下記分化誘導工程の処理を行い、ヒトiPS細胞を自律神経系へ分化誘導した。

分化誘導工程Ａ
使用培地の調製：
hESMに対して、2μMのDM、10μMのSB、及び、10ng/mlのbFGFを含有するように各試薬を添加して分化誘導工程Ａ用の培地を調製した。
培養方法：
上記前培養によりヒトiPS細胞がコンフルエントになったウェルより10μMのY-27632を含有するmTeSR1を除去し、上記分化誘導工程Ａ用の培地を添加した。分化誘導工程Ａ用の培地に培地交換後、2日間培養を行った。

分化誘導工程Ｂ
使用培地の調製：
hESMに対して、3μMのCHIR、20μMのSB、10ng/mlのbFGFを含有するように各試薬を添加して分化誘導工程Ｂ用の培地を調製した。
培養方法：
上記分化誘導工程Ａにおける培養の後、分化誘導工程Ａ用の培地を除去し、上記分化誘導工程Ｂ用の培地を添加した。分化誘導工程Ｂ用の培地に培地交換後、10日間培養を行った。なお、培地は、2日ごとに全量交換した。

分化誘導工程Ｃ
培養用ウェルプレートの準備：
24-well plateを50倍希釈したPLO(20μg/ml)を用いてコーティング処理を行った。コーティング処理は、インキュベータ内において1時間行った。コーティング処理後、PLO溶液を除去し、DWでウェルプレートを１回洗浄した。ウェルプレートの洗浄後、20倍希釈したラミニン(5μg/ml)でコーティング処理を行った。コーティング処理は、インキュベータ内において2時間行った。このようにしてPLO及びラミニンのコーティング処理をしたウェルプレートを分化誘導工程Ｃの培養に用いた。
使用培地(neural differentiation medium(NDM))の調製：
N-2培地に対して、10μMのFSK、10ng/mlのBDNF、10ng/mlのGDNF、10ng/mlのNT-3、10ng/mlのNGF、及び、50μg/mlのアスコルビン酸が含有されるように各試薬を添加して分化誘導工程Ｃ用の培地(NDM)とした。
培養：
上記分化誘導工程Ｂにおける培養の後、分化誘導工程Ｂ用の培地を除去し、PBSを添加して１回洗浄した。PBSによる洗浄後、TrypLE expressを250μl/wellで添加し37℃で5分間インキュベートした。その後、10％FBSを含むDMEMを1ml/wellで加えて酵素反応を停止させ、培養細胞をウェルプレートより剥離して遠沈管に回収した。遠沈管に回収した細胞に対して、200×gで4分間遠心処理を行った。遠心処理後、上清を除去し、NDMを添加して細胞を懸濁させた。懸濁後、NDM溶液の一部を採取し、細胞数をカウントした。得られた細胞数の情報を基に、PLO/ラミニンでコーティングした24-well plateに1〜2.5×10⁵cells/wellの濃度となるように細胞を播種した。以後、1週間に２回の頻度で培養中のNDMを半量交換した。分化誘導工程Ｃの培養は23日間行い、自律神経系へ分化誘導を行った。
このようにして得られた細胞を、従来の分化誘導方法(ａ)の自律神経系の細胞への分化誘導効率の評価のための免疫染色に用いた。

また、本発明の分化誘導方法の誘導効率を評価するために、分化誘導方法(ａ)又は分化誘導方法(ｂ)により得られた細胞について免疫染色を行った。免疫染色は、抗TUJ1抗体及び抗TH抗体を用いた以外は、上記３．に記載の方法と同様にして行った。
免疫染色の結果を図５に示す。図５(ａ)に示すように、分化誘導方法(ａ)により得られた細胞は、そのほとんどがTUJ1陽性であったが、全体的に分散して生着しており、網目状の回路網形態を示していた。また、分化誘導方法(ａ)により得られた細胞のうち、TH陽性を示す細胞はわずかしか観察することができなかった。一方、図５(ｂ)に示すように、分化誘導方法(ｂ)により得られた細胞は、細胞同士が密集し細胞塊を形成しており、そのほとんどの細胞がTUJ1陽性であった。また、分化誘導方法(ｂ)により得られた細胞の多くにおいてTH陽性細胞を観察することができた。また、細胞数をImageJソフトウェアにより測定し、TH陽性細胞数をTUJ1陽性細胞数で割ることで各分化誘導方法の分化誘導効率を評価した。その結果、分化誘導方法(ａ)の分化誘導効率は2.0±1.3％であり、一方で、分化誘導方法(ｂ)の分化誘導効率は63.0±11.8％であった(図６)。このように、本発明の分化誘導方法は、自律神経系の細胞を高い効率で誘導可能であった。

（５．分化誘導により得られた自律神経系の細胞の機能評価）
本発明の分化誘導方法により得られた自律神経系の細胞が、機能的な神経細胞に成熟しているか否かについて確認するために、カルシウムイメージングによる機能評価を行った。当該試験の評価には、上記分化誘導方法(ｂ)により分化誘導した細胞(分化誘導工程６の培養35日目の細胞)を用いた。
より具体的には、下記のようにしてカルシウムイメージングによる機能評価を行った。
まず、カルシウムプローブであるfluo-4/AM(Invitrogen :F14201)を、DMSO中に溶解させ、1mg/mlの濃度となるようにfluo-4/AM溶液を調製した。分化誘導方法(ｂ) (ただし、分化誘導工程６を35日間行った)により得られた細胞を対象に、5μg/mlとなるようにfluo-4/AM溶液を分化誘導工程６用培地に直接加えた(fluo-4/AM 溶液は200倍に希釈された)。fluo-4/AM溶液を培地に添加後、インキュベータ(37℃、5％CO₂)内で30分間インキュベートした。インキュベートを行った後、fluo-4/AMを含んだ培地を、リンガー液(149mM NaCl, 2.8mM KCl, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 10mM HEPES, 10mM D-(+)-glucose, pH7.4)に置換し、蛍光観察を行った。蛍光観察にはオリンパス顕微鏡(IX81)、EM-CCD (Andor iXon+)、Metamorphソフトウェア(Molecular Devices)を用いて、2fps(Frames per second)の条件で300frameの撮影を行った。
また、測定サンプル溶液中に白金電極(φ0.5mm、ニラコ)を刺入し、電気刺激装置(日本光電:SEN-3401)を用いて電気刺激を加えた。電気刺激には陰極性のパルス(10V振幅、3ms幅)を印加した。

その結果を図７に示す。図７(ａ)は、位相差画像を示し、図７(ｂ)は電気刺激を印加した直後におけるカルシウム蛍光強度を示す画像である。図７(ｂ)に示すように、電気刺激により、画像中央部の自律神経細胞部位においてのみ強いカルシウム蛍光強度を観察することができた。この結果より、本発明の分化誘導方法により誘導された自律神経系の細胞は、電気刺激により細胞活動が発生していることが明らかとなった。

また、図７に示す位相差画像から三個の神経細胞を選択し(図８(ａ)参照)、７回の電気刺激(10V振幅、3ms幅のパルスを10sインターバルの条件で７回印加)によるカルシウム蛍光強度の時間変化を観察した。なお、電気刺激時の測定データはImageJを用いて解析を行った。その結果を図８(ｂ)に示す。電気刺激を印加する前後には自発的な細胞活動は見られないが、電気刺激に応答する形で細胞活動を発生していることがわかる。
このような、自発活動が基本的には見られず、電気刺激等の外部刺激に応答して細胞活動を示すという性質は、ラットより採取した培養自律神経細胞に見られる性質と類似している(Schorge et al., Nature Neurosci. 2(9):785-790 (1999); Takeuchi et al., Lab Chip 11:2268-2275 (2011)参照)。
これらの結果から、本発明の分化誘導方法により誘導された自律神経系の細胞は、機能的な神経細胞へ分化・成熟していると考えられる。

また、上記実施例に記載の自律神経系の細胞への分化誘導方法および分化誘導により得られた自律神経系の細胞の機能性評価について、ヒトiPS細胞253G1株および自作のヒトiPS細胞株を用いて同様に試験を行った。その結果、201B7株と同様の自律神経系への誘導効率を確認することができた。また、201B7株と同様に、電気刺激に応答して細胞活動を示す性質を観察することができた。

なお、分化誘導方法(ｂ)を浮遊培養によって行った場合にも、同様に高い効率で自律神経系の細胞へ分化誘導できることが確認された。
浮遊培養による前培養には、6-well plateを使用した。Lipidure-CM5206Eを少量（~100 μl/well）用いてウェルをコーティングし、クリーンベンチ内で1時間乾燥させた。その後、PBSにより1回洗浄し、10μMのY-27632を含有するmTeSR1を2 ml/wellで加えた。次いで、上記１−１．で回収したヒトiPS細胞を1〜2 × 10⁶ cells/wellで播種した。培養開始日の翌日以降、10μMのY-27632を含有するmTeSR1を用いて毎日培地交換を行い、3日間培養を行った。
また、浮遊培養による分化誘導工程５の後は、培養細胞を遠沈管に回収し、遠心処理後、上清を除去し、TrypLE expressを1ml加え、37℃で10分間インキュベートした。
それ以外は、接着培養の場合と同様の条件により細胞を培養した。

（６．交感神経細胞への選択的分化誘導）
分化誘導工程６における細胞播種濃度を、5×10⁴ cells/cm²、1×10⁵ cells/cm²、又は、2×10⁵ cells/cm²とした以外は同様にして分化誘導方法(ｂ)を行い、交感神経細胞への分化誘導効率を比較した。分化誘導工程６の43日目の細胞について、交感神経細胞マーカーであるTHの発現を免疫染色により確認することにより、分化誘導効率を評価した。免疫染色は、抗TH抗体を用いた以外は、上記３．に記載の方法と同様にして行った。

免疫染色の結果を図９に示す。2×10⁵ cells/cm²の細胞播種濃度で分化誘導した場合にTH陽性細胞の出現率が増加することが確認された。また、5×10⁴ cells/cm²の細胞播種濃度で分化誘導した場合を基準とした、各細胞播種濃度で分化誘導した場合のTH陽性領域の面積比を図１０に示す。細胞播種濃度を1×10⁵ cells/cm²とした場合には、TH陽性細胞の出現率はほとんど変化しないのに対し、2×10⁵ cells/cm²とした場合には、TH陽性細胞の出現率が25倍程度に向上した。これらの結果から、分化誘導工程６における細胞播種濃度を2×10⁵ cells/cm²以上とすることにより、交感神経細胞への分化誘導効率が向上することが示された。

（７．副交感神経細胞への選択的分化誘導）
分化誘導工程６における培地としてNDM又はNDMに代えて下記のNDM2を使用し、分化誘導工程６における細胞播種濃度を5×10⁴ cells/cm²とした以外は同様にして分化誘導方法(ｂ)を行い、副交感神経細胞への分化誘導効率を比較した。
使用培地(neural differentiation medium(NDM2))：
N-2培地に対して、10μMのFSK、100ng/mlのBDNF、100ng/mlのCNTF、10ng/mlのGDNF、10ng/mlのNT-3、10ng/mlのNGF、及び、50μg/mlのアスコルビン酸が含有されるように各試薬を添加した。
分化誘導工程６の20日目の細胞について、副交感神経細胞マーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT) の発現を免疫染色により確認することにより、分化誘導効率を評価した。免疫染色は、抗ChAT抗体を用いた以外は、上記３．に記載の方法と同様にして行った。

結果を図１１に示す。NDMにより培養を行った場合(図１１(ａ))に比べ、NDM2により培養を行った場合(図１１(ｂ))にChAT陽性細胞が増加することが示された。

次いで、副交感神経細胞への分化誘導における細胞播種濃度の影響を調べるために、5×10⁴ cells/cm²、1×10⁵ cells/cm²、又は、2.5×10⁵ cells/cm²の細胞播種濃度において、上記と同様に分化誘導を行い、副交感神経細胞への分化誘導効率を比較した。分化誘導効率は、単位面積当たりのChAT陽性細胞数を比較することにより行った。

結果を図１２に示す。NDM 又はNDM2いずれの培地を使用した場合においても、分化誘導効率に対する細胞播種濃度の影響は小さいことが示された。また、各細胞播種濃度におけるNDM 又はNDM2による分化誘導効率を比較した結果を図１３に示す。いずれの細胞播種濃度においても、NDM2を用いた場合(図１３、BDNF, CNTF++)では、NDMを用いた場合(図１３、ctrl)に比べて、ChAT陽性細胞数が2〜4倍に増加した。これらの結果から、分化誘導工程６における培地にBDNF及びCNTFを添加することにより、副交感神経細胞への分化誘導効率が向上することが示された。

（８．自律神経細胞の純化）
公知の方法(Zhou, Z. et al., Mol. Brain, 7:24)に準じた薬剤耐性法により、分化した自律神経細胞を純化した。簡潔に記載すれば、シナプシン遺伝子プロモーターの下流にGFP及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだレンチウイルスベクターを、分化誘導工程６の20日目の細胞に感染させた。ウイルス感染から4日後、GFP蛍光観察により、ウイルス感染により導入された遺伝子の発現を確認した(図１４)。その後、800μg/mlのジェネティシンを含有する培地に交換し、2日間の培養後に、GFPを発現する細胞のみが生存していることを確認した(図１５)。
選択培養後の細胞について、末梢神経細胞マーカー(ペリフェリン)、自律神経細胞マーカー(Phox2b)、交感神経細胞マーカー(TH)、及び副交感神経マーカー(ChAT)の発現量を定量PCRにより評価した。定量PCRは、使用した試薬及びキット(ReliaPrep RNA Cell miniprep system (Promega)、ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO)、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO))に添付の説明書に記載の方法に準じて行った。

結果を図１６に示す。純化を行わなかった場合に比べ、いずれのマーカー遺伝子の発現も増加していることが確認された。この結果から、本発明の分化誘導方法に、さらに自律神経細胞の純化方法を組み合わせることにより、より高い効率で交感神経細胞及び／又は副交感神経細胞が得られることが示された。

Claims

ヒト神経堤細胞から自律神経系の細胞を作出する分化誘導方法であって、
(ａ)前記ヒト神経堤細胞を、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、
及び、Wntシグナル経路阻害剤の組み合わせの存在下で培養を行う工程と、
(ｂ) 前記工程(ａ)の後に、前記ヒト神経堤細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、CNTFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、及び、アスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物の存在下で培養する工程と
を含むことを特徴とする、分化誘導方法。
請求項１に記載の分化誘導方法であって、
前記ヒト神経堤細胞がヒト生体由来の神経堤細胞であることを特徴とする、分化誘導方法。
請求項１に記載の分化誘導方法であって、
前記ヒト神経堤細胞がヒト多能性幹細胞由来であることを特徴とする、分化誘導方法。
請求項３に記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ａ)の前に、前記ヒト多能性幹細胞を、BMPシグナル経路阻害剤、TGFシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路活性化剤、FGFシグナル経路活性化剤、EGFシグナル経路活性化剤からなる群より選択される化合物の組み合わせの存在下で培養することにより前記ヒト多能性幹細胞由来のヒト神経堤細胞を誘導する工程を含むことを特徴とする、分化誘導方法。
請求項３又は４に記載の分化誘導方法であって、
Y-27632を含有する培地を用いて、前記ヒト多能性幹細胞を前培養する工程をさらに含むことを特徴とする、分化誘導方法。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ａ)において、前記BMPシグナル経路活性化剤が、BMP2、BMP4、BMP7、又は、BMP2/4からなる群より選択される少なくとも１つのBMPシグナル経路活性化剤であるか、
SHHシグナル経路阻害剤が、SANT、JK184、ジェルビンからなる群より選択される少なくとも１つのSHHシグナル経路阻害剤であるか、又は、
Wntシグナル経路阻害剤が、IWR、XAV939、IWPからなる群より選択される少なくとも１つのWntシグナル経路阻害剤である
ことを特徴とする、分化誘導方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ｂ)における前記ヒト神経堤細胞の播種濃度が、2×10⁵ 個/cm²以上であることを特徴とする、分化誘導方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分化誘導方法であって、
前記工程(ｂ)が、BDNFシグナル経路活性化剤及びCNTFシグナル経路活性化剤の存在下で培養を行う工程であり、前記BDNFシグナル経路活性化剤が10〜100ng/mlのBDNFであり、前記CNTFシグナル経路活性化剤が10〜100ng/mlのCNTFであることを特徴とする、分化誘導方法。
(ａ)BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、及び、Wntシグナル経路阻害剤と、
(ｂ) cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、CNTFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、及び、アスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物と
を含む、ヒト神経堤細胞を自律神経系の細胞へ分化するためのキット。