JP6586884B2 - Chip and surface plasmon enhanced fluorescence measurement method - Google Patents
Chip and surface plasmon enhanced fluorescence measurement method Download PDFInfo
- Publication number
- JP6586884B2 JP6586884B2 JP2015546701A JP2015546701A JP6586884B2 JP 6586884 B2 JP6586884 B2 JP 6586884B2 JP 2015546701 A JP2015546701 A JP 2015546701A JP 2015546701 A JP2015546701 A JP 2015546701A JP 6586884 B2 JP6586884 B2 JP 6586884B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liquid
- fluorescence
- excitation light
- incident
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
本発明は、表面プラズモン増強蛍光測定装置で使用されるチップ、および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。 The present invention relates to a chip used in a surface plasmon enhanced fluorescence measurement device and a surface plasmon enhanced fluorescence measurement method.
臨床検査などにおいて、タンパク質やDNAなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。 In a clinical test or the like, if a very small amount of a substance to be detected such as protein or DNA can be detected with high sensitivity and quantity, it becomes possible to quickly grasp the patient's condition and perform treatment. For this reason, a method capable of detecting a minute amount of a substance to be detected with high sensitivity and quantity is demanded.
被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法(Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy:以下「SPFS」と略記する)が知られている。SPFSでは、所定の条件で光を金属膜に照射すると、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance:以下「SPR」と略記する)が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体(例えば1次抗体)を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む試料液を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された2次抗体を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、SPRにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。SPFSでは、SPRにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。 As a method for detecting a substance to be detected with high sensitivity, surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy (hereinafter abbreviated as “SPFS”) is known. SPFS utilizes the fact that surface plasmon resonance (hereinafter abbreviated as “SPR”) occurs when a metal film is irradiated with light under a predetermined condition. A capture body (for example, a primary antibody) that can specifically bind to the substance to be detected is immobilized on the metal film to form a reaction field for specifically capturing the substance to be detected. When a sample solution containing a substance to be detected is provided in this reaction field, the substance to be detected is bound to the reaction field. Next, when a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is provided to the reaction field, the target substance bound to the reaction field is labeled with the fluorescent substance. When the metal film is irradiated with excitation light in this state, the fluorescent substance that labels the substance to be detected is excited by the electric field enhanced by SPR and emits fluorescence. Therefore, the presence or amount of the substance to be detected can be detected by detecting fluorescence. In SPFS, a fluorescent substance is excited by an electric field enhanced by SPR, so that a substance to be detected can be detected with high sensitivity.
SPFSは、励起光と表面プラズモンとを結合(カップリング)させる手段により、プリズムカップリング(PC)−SPFSと、格子カップリング(GC)−SPFSとに大別される。PC−SPFSでは、1つの面に金属膜を形成されたプリズムを使用する(特許文献1参照)。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。 SPFS is roughly classified into prism coupling (PC) -SPFS and lattice coupling (GC) -SPFS by means for coupling (coupling) excitation light and surface plasmons. In PC-SPFS, a prism having a metal film formed on one surface is used (see Patent Document 1). In this method, the excitation light is totally reflected at the interface between the prism and the metal film, thereby coupling the excitation light and the surface plasmon.
これに対し、GC−SPFSは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる(特許文献2参照)。GC−SPFSでは、回折格子を形成された金属膜を使用する。この方法では、回折格子に励起光を照射することで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。PC−SPFSでは、蛍光は全方向に出射されるのに対し、GC−SPFSでは、蛍光は特定の方向に指向性を持って出射されることが知られている。 On the other hand, GC-SPFS couples excitation light and surface plasmons using a diffraction grating (see Patent Document 2). In GC-SPFS, a metal film on which a diffraction grating is formed is used. In this method, excitation light and surface plasmons are combined by irradiating the diffraction grating with excitation light. In PC-SPFS, it is known that fluorescence is emitted in all directions, whereas in GC-SPFS, fluorescence is emitted in a specific direction with directivity.
GC−SPFSにおいて、回折格子の上に液体を提供して蛍光を検出する場合、液体の上に蓋が存在しないことが好ましい。励起光が蓋を透過する時に蓋の自家蛍光によりバックグラウンドが増大してしまうからである。特に、被検出物質が低濃度の場合、バックグラウンドの増大は被検出物質の検出の失敗に繋がるおそれもある。 In GC-SPFS, when a liquid is provided on a diffraction grating to detect fluorescence, it is preferable that a lid does not exist on the liquid. This is because the background is increased by the autofluorescence of the lid when the excitation light passes through the lid. In particular, when the substance to be detected is at a low concentration, an increase in background may lead to failure in detection of the substance to be detected.
一方、蓋を設けずに液体の上部を外部に開放すると、メニスカスにより液体の表面に傾きが生じる。このように液体の表面に傾きが生じると、励起光の入射角および蛍光の出射角にずれが生じてしまい、光検出部に適切に蛍光が到達できず、被検出物質の検出に失敗してしまうおそれがある。蛍光の出射角のずれに対応するためにレンズなどを用いて光検出部の検出範囲を拡げることも考えられるが、バックグラウンドの低減の観点からはレンズなどの使用は好ましくない。 On the other hand, when the upper part of the liquid is opened to the outside without providing a lid, the liquid surface is inclined by the meniscus. When the liquid surface is tilted in this way, the incident angle of the excitation light and the emission angle of the fluorescence are shifted, and the fluorescence cannot properly reach the light detection unit, and the detection of the target substance fails. There is a risk that. Although it is conceivable to expand the detection range of the light detection unit using a lens or the like in order to cope with the deviation of the emission angle of fluorescence, the use of a lens or the like is not preferable from the viewpoint of reducing the background.
本発明の目的は、GC−SPFSを利用する測定装置に用いられるチップおよびGC−SPFSを利用する測定方法であって、バックグラウンドの増大を防ぎつつ、蛍光の出射角のずれによる検出精度の低下を抑制することができるチップおよび測定方法を提供することである。 An object of the present invention is a chip used in a measuring apparatus that uses GC-SPFS and a measuring method that uses GC-SPFS, and prevents an increase in background while reducing detection accuracy due to a deviation in the emission angle of fluorescence. It is providing the chip | tip and the measuring method which can suppress this.
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係るチップは、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置で使用されるチップであって、液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、を有し、前記液溜部の深さ方向の断面における前記液溜部の水平方向の大きさは、上に行くほど大きい。 In order to solve the above-described problem, a chip according to an embodiment of the present invention detects a fluorescence emitted from a fluorescent substance that labels a target substance by being excited by an electric field based on surface plasmon resonance. A chip used in a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus for detecting the presence or amount of a substance, including a liquid reservoir for holding a liquid and a diffraction grating disposed at the bottom of the liquid reservoir And the horizontal size of the liquid reservoir in the cross section in the depth direction of the liquid reservoir increases toward the top.
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、を有するチップを準備する工程と、前記液溜部に試料液を導入する工程と、前記液溜部内の前記試料液を別の液体に置換する工程と、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記液溜部の開口部側から前記回折格子に励起光を照射し、前記被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含み、前記蛍光を検出する工程における前記液溜部内の前記液体の表面積は、前記液溜部に前記試料液を導入する工程における前記液溜部内の前記試料液の表面積よりも大きい。 In addition, in order to solve the above-described problem, the surface plasmon enhanced fluorescence measurement method according to an embodiment of the present invention uses a fluorescent material that labels a target substance to emit fluorescence that is excited by an electric field based on surface plasmon resonance. A surface plasmon enhanced fluorescence measurement method for detecting the presence or amount of the substance to be detected, a liquid reservoir for holding a liquid, and a diffraction grating disposed at the bottom of the liquid reservoir A step of preparing a chip having a metal film including a capture body fixed to the diffraction grating, a step of introducing a sample liquid into the liquid reservoir, and a step of separating the sample liquid in the liquid reservoir From the fluorescent substance that labels the substance to be detected by irradiating the diffraction grating with excitation light from the opening side of the liquid reservoir so that surface plasmon resonance occurs in the diffraction grating. Released Detecting the fluorescence, and the surface area of the liquid in the liquid reservoir in the step of detecting fluorescence is the surface area of the sample liquid in the liquid reservoir in the step of introducing the sample liquid into the liquid reservoir. Greater than surface area.
本発明によれば、GC−SPFSを利用する測定装置および測定方法において、被検出物質をより高感度かつ高精度に検出することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, in a measuring device and measuring method using GC-SPFS, a to-be-detected substance can be detected more highly sensitively and with high precision.
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[実施の形態1]
図1は、表面プラズモン増強蛍光測定装置(以下「SPFS装置」という)100と、本発明の実施の形態1に係るチップ200の構成を示す模式図である。図1に示されるように、SPFS装置100は、光源110、コリメートレンズ120、励起光フィルター130、蛍光フィルター140、光検出部150および制御部160を有する。SPFS装置100は、チップホルダー(不図示)にチップ200を装着した状態で使用される。そこで、チップ200について先に説明し、その後にSPFS装置100について説明する。[Embodiment 1]
FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus (hereinafter referred to as “SPFS apparatus”) 100 and a
チップ200は、基板210と、回折格子230を含む金属膜220と、液体を保持するための液溜部250を形成する側壁240とを有する。金属膜220には、回折格子230が形成されている。回折格子230には捕捉体(例えば1次抗体)が固定化されており、回折格子230の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図1では、捕捉体および被検出物質を省略している。なお、チップ200は、好ましくは、各片の長さが数mm〜数cmである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
The
基板210は、金属膜220および側壁240の支持部材である。基板210の材料は、金属膜220および側壁240を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板210の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
The
金属膜220は、液溜部250の底部に位置するように基板210上に配置されている。前述のとおり、金属膜220には、回折格子230が形成されている。金属膜220に光を照射すると、金属膜220中に生じる表面プラズモンと、回折格子230により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴(SPR)が生じる。金属膜220の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜220の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜220の形成方法は、特に限定されない。金属膜220の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜220の厚みは、特に限定されない。たとえば、金属膜220の厚みは、30〜70nm程度である。
The
回折格子230は、金属膜220に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子230の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子230は、図2Aに示されるように1次元回折格子であってもよいし、図2Bに示されるように2次元回折格子であってもよい。図2Aに示される1次元回折格子では、金属膜220の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図2Bに示される2次元回折格子では、金属膜220の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角(六方)格子などが含まれる。回折格子230の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子のピッチは、SPRを発生させる観点から、100〜2000nmの範囲が好ましい。なお、本明細書において、「回折格子のピッチ」とは、図2A,Bに示されるように、凸部の配列方向における凸部の中心間距離Λをいう。
The
回折格子230の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板210の上に金属膜220を形成した後、金属膜220に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板210の上に、金属膜220を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子230を含む金属膜220を形成することができる。
The method for forming the
回折格子230(反応場)には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。たとえば、回折格子230の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体(1次抗体)またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。
A capture body for capturing a substance to be detected is immobilized on the diffraction grating 230 (reaction field). The capturing body specifically binds to the substance to be detected. For example, the capturing body is fixed substantially uniformly on the surface of the
捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子230の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜(以下「SAM膜」という)または高分子膜を形成すればよい。SAM膜の例には、HOOC−(CH2)11−SHなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびMPCポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基(または反応性基に変換可能な官能基)を有する高分子を回折格子230に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。The method for immobilizing the capturing body is not particularly limited. For example, a self-assembled monomolecular film (hereinafter referred to as “SAM film”) or a polymer film to which a capturing body is bonded may be formed on the
図3に示されるように、励起光αは、所定の入射角θで金属膜220(回折格子230)に照射される。照射領域では、金属膜220で生じた表面プラズモンと、回折格子230により生じたエバネッセント波が結合し、SPRが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、SPRにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。前述のとおり、GC−SPFSでは、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。
As shown in FIG. 3, the excitation light α is irradiated onto the metal film 220 (diffraction grating 230) at a predetermined incident angle θ. In the irradiation region, the surface plasmon generated in the
側壁240は、金属膜220を取り囲むように基板210上に配置されている。側壁240は、金属膜220上に液体を保持するための液溜部250を形成する。液溜部250の開口部は蓋で閉塞されていないため、液溜部250内の液体の表面は外部に露出される。したがって、液溜部250内の液体の表面は、液体表面の大きさや側壁240内面の疎水度、液体の表面張力などに依存してメニスカスを形成する。この後説明するように、本実施の形態に係るチップ200では、蛍光検出時におけるメニスカスの影響を低減するために、液溜部250の深さ方向の断面における液溜部250の水平方向の大きさ(互いに対向する側壁240間の間隔)は、上に行くほど(金属膜220から離れるほど)大きい。より具体的には、液溜部250上部における側壁240間の間隔は、液溜部250下部における側壁240間の間隔よりも大きくなっており、液溜部250上部の側壁240内面と、液溜部250下部の側壁240内面とは、水平面で接続されている(図1参照)。
The
側壁240の材料は、金属膜220上に液体を保持できるものであれば特に限定されず、必要とされる性質(例えば表面の疎水度)などに応じて適宜選択されうる。側壁240の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。また、側壁240は、基板210と一体成形されていてもよい。
The material of the
次に、SPFS装置100の各構成要素について説明する。前述のとおり、SPFS装置100は、光源110、コリメートレンズ120、励起光フィルター130、蛍光フィルター140、光検出部150および制御部160を有する。
Next, each component of the
光源110、コリメートレンズ120および励起光フィルター130は、励起光照射ユニットを構成する。励起光照射ユニットは、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、チップ200の金属膜220表面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。また、励起光照射ユニットは、金属膜220中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子230で生じるように、金属膜220に対するP波のみを金属膜220に向けて出射する。励起光照射ユニットは、励起光αの光軸が、回折格子230における周期的構造の配列方向(図2A,Bにおけるx軸方向)に沿うように、励起光αを金属膜220に照射する。したがって、x軸に垂直かつ金属膜220の表面に垂直な軸(液溜部250の高さ方向の軸)をy軸とした場合、励起光αの光軸はxy平面に平行である(図1参照)。
The
光源110は、チップ200の金属膜220に向けて励起光α(シングルモードレーザー光)を出射する。光源110の種類は、蛍光物質を励起できる波長(例えば400〜1000nm)の光を出射できれば特に限定されない。光源110の例には、レーザーダイオード、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。
The
コリメートレンズ120は、光源110から出射された励起光αをコリメートする。光源110から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である場合がある。このため、金属膜220表面における照射スポットの形状が略円形となるように、光源110は所定の姿勢で保持される。
The
励起光フィルター130は、例えば、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターを含み、光源110から出射された励起光αを整波する。光源110からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、光源110からの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、光源110からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、光源110からの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルター130は、金属膜220にP波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
The
金属膜220(回折格子230)に対する励起光αの入射角θ(図3参照)は、SPRにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角θは、回折格子230のピッチΛや励起光αの波長、金属膜220を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。たとえば、励起光αの入射角θは、以下の式(11)を満たすように設定される。
λ0:真空中の励起光αの波長
n:回折格子230上の媒質(液溜部250内の液体)の屈折率
θ:励起光αの回折格子230に対する入射角
m:整数
Λ:回折格子230のピッチThe incident angle θ (see FIG. 3) of the excitation light α with respect to the metal film 220 (diffraction grating 230) has the highest intensity of the enhanced electric field formed by SPR, and as a result, the intensity of the fluorescence β from the fluorescent material is the highest. A stronger angle is preferred. The incident angle θ of the excitation light α is appropriately selected according to the pitch Λ of the
λ 0 : wavelength of excitation light α in vacuum n: refractive index of medium (liquid in liquid reservoir 250) on
ここで、kspは、2種類の媒質の界面(金属膜220と液溜部250内の液体との界面)において励起されるプラズモンの波数であり、以下の式(12)のように定義される。
c:光速度
ε1:回折格子230上の媒質(液溜部250内の液体)の誘電率=n2
ε2:回折格子230を構成する媒質(金属)の誘電率Here, k sp is the wave number of plasmon excited at the interface between the two types of media (the interface between the
ε 2 : dielectric constant of medium (metal) constituting
励起光αの最適な入射角θは、各種条件の変更により変わるため、SPFS装置100は、励起光αの光軸とチップ200とを相対的に回転させることで入射角θを調整する第1角度調整部(図示省略)を有することが好ましい。たとえば、第1角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜220との交点を中心として、励起光照射ユニットまたはチップ200を回転させればよい。
Since the optimum incident angle θ of the excitation light α varies depending on various conditions, the
蛍光フィルター140および光検出部150は、蛍光検出ユニットを構成する。蛍光検出ユニットは、励起光照射ユニットに対して、励起光αの光軸と金属膜220との交点を通り、かつ金属膜220に対して垂直な直線を挟むように配置されている。蛍光検出ユニットは、回折格子230(反応場)上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。蛍光検出ユニットは、光検出部150の検出範囲を拡げるために集光レンズをさらに有していてもよいが、バックグラウンドの低減の観点からは集光レンズを含まない方が好ましい。
The
蛍光フィルター140は、例えば、カットフィルターおよび減光(ND)フィルターを含み、光検出部150に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分(例えば、励起光αや外光など)を除去したり、光検出部150に到達する光の光量を調整したりする。
The
光検出部150は、金属膜220上の蛍光像を検出する。たとえば、光検出部150は、感度およびSN比が高い光電子増倍管である。光検出部150は、アバランシェ・フォトダイオード(APD)やフォトダイオード(PD)、CCDイメージセンサなどであってもよい。
The
金属膜220の垂線に対する蛍光検出ユニットの光軸の角度は、回折格子230(反応場)から放出される蛍光βの強度が最大となる角度(蛍光ピーク角)であることが好ましい。したがって、SPFS装置100は、蛍光検出ユニットの光軸とチップ200とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニットの光軸の角度を調整する第2角度調整部(図示省略)を有することが好ましい。たとえば、第2角度調整部は、蛍光検出ユニットの光軸と金属膜220との交点を中心として、蛍光検出ユニットまたはチップ200を回転させればよい。
The angle of the optical axis of the fluorescence detection unit with respect to the perpendicular of the
制御部160は、励起光照射ユニット(光源110)、蛍光検出ユニット(光検出部150)、励起光照射ユニットおよび蛍光検出ユニットの角度調整部(第1角度調整部および第2角度調整部)の動作を制御する。また、制御部160は、光検出部150からの出力信号(蛍光シグナル)を解析することにより、被検出物質の存在またはその量を分析する。制御部160は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
The
次に、SPFS装置100の検出動作について説明する。図4は、SPFS装置100の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として1次抗体が金属膜220(回折格子230)上に固定化されている。
Next, the detection operation of the
まず、測定の準備をする(工程S10)。具体的には、SPFS装置100の所定の位置にチップ200を設置する。また、チップ200の金属膜220上に保湿剤が存在する場合は、1次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜220上を洗浄して保湿剤を除去する。
First, preparation for measurement is performed (step S10). Specifically, the
次いで、チップ200の液溜部250に試料液を導入して、試料液中の被検出物質と1次抗体とを反応させる(1次反応、工程S20)。試料液中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は1次抗体に結合する。このとき、図5Aに示されるように、液溜部250の下部にのみ試料液310を導入することが好ましい。液溜部250の下部の容量は、液溜部250の上部の容量よりも小さいため、液溜部250の下部にのみ試料液310を導入することで、試料液の使用量を低減することができる。この後、液溜部250内を緩衝液などで洗浄して、1次抗体に結合しなかった物質を除去する。
Next, the sample solution is introduced into the
試料液は、検体を含む水系の液体である。たとえば、試料液は、液状の検体や、液状の検体を緩衝液などの液体で希釈した希釈液である。試料液は、界面活性剤などを含んでいてもよい。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸(DNAやRNAなど)、タンパク質(ポリペプチドやオリゴペプチドなど)、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。 The sample liquid is an aqueous liquid containing a specimen. For example, the sample solution is a liquid sample or a diluted solution obtained by diluting a liquid sample with a liquid such as a buffer solution. The sample solution may contain a surfactant or the like. There are no particular limitations on the type of specimen and substance to be detected. Examples of specimens include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva and semen. Examples of substances to be detected include nucleic acids (such as DNA and RNA), proteins (such as polypeptides and oligopeptides), amino acids, carbohydrates, lipids, and modified molecules thereof.
次いで、1次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する(2次反応、工程S30)。具体的には、蛍光物質で標識された2次抗体を含む蛍光標識液を液溜部250に導入して、1次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された2次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が1次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。このときも、図5Aに示されるように、液溜部250の下部にのみ蛍光標識液を導入することが好ましい。この後、液溜部250内を緩衝液などで洗浄し、遊離の2次抗体などを除去する。なお、1次反応と2次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を2次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を液溜部250に導入してもよい。また、液溜部250に検体と蛍光標識液を同時に導入してもよい。いずれの場合であっても、液溜部250に導入された試料液は、緩衝液などの別の液体に置換される。
Next, the target substance bound to the primary antibody is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction, step S30). Specifically, a fluorescent labeling solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is introduced into the
次いで、励起光αを金属膜220に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βの強度を測定する(工程S40)。具体的には、制御部160は、光源110に励起光αを出射させる。同時に、制御部160は、光検出部150に金属膜220からの蛍光βの強度を検出させる。光検出部150は、測定結果を制御部160に出力する。このとき、図5Bに示されるように、液溜部250の上部まで液体320が導入されていることが好ましい。液溜部250上部の側壁240間の間隔は、液溜部250下部の側壁240間の間隔よりも大きいため、液溜部250の上部まで液体320を導入することで、金属膜220上部におけるメニスカスに起因する液面の屈曲度を低減することができる。すなわち、金属膜220上部の液面形状を平面に近づけて、蛍光βの出射角のずれを低減することができる。
Next, the excitation light α is irradiated onto the
最後に、制御部160は、光検出部150からの出力信号(蛍光シグナル)を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する(工程S50)。
Finally, the
以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。 By the above procedure, the presence of the substance to be detected in the sample or the amount of the substance to be detected can be detected.
以上のように、本実施の形態に係るチップ200は、液溜部250の深さ方向の断面における液溜部250の水平方向の大きさが上に行くほど(金属膜220から離れるほど)大きい。このため、液溜部250内の液体の量を多くすることで、液溜部250の上にバックグラウンド増大の原因となりうる蓋などを配置することなく、メニスカスに起因する蛍光の出射角のずれを低減することができる。したがって、本実施の形態に係るチップ200を使用することで、高感度かつ高精度に被検出物質を検出することができる。
As described above, the
また、本実施の形態に係るチップ200は、液溜部250の深さ方向の断面における液溜部250の水平方向の大きさが下に行くほど(金属膜220に近いほど)小さい。このため、1次反応を行うときの試料液の使用量、および2次反応を行うときの試薬の使用量を減らすことができる。したがって、本実施の形態に係るチップ200を使用することで、測定コストを低減することができる。
Further, the
[実施の形態2]
実施の形態2に係るチップ200は、SPFS装置100の光検出部150の開口数に対応して、液溜部250の水平方向の大きさRと、側壁240内面の接触角θcが設定されている点で実施の形態1に係るチップ200と異なる。したがって、本実施の形態では、この点についてのみ説明する。[Embodiment 2]
In the
光検出部150において蛍光βを正確に検出するためには、蛍光βの出射角がメニスカスに起因してずれても、蛍光βが光検出部150の開口部(アパーチャ)内に到達できることが好ましい。すなわち、蛍光βの出射角のずれ幅が、光検出部150の開口数と関連付けられる所定の値よりも小さいことが好ましい。
In order to accurately detect the fluorescence β in the
図6Aは、メニスカスが無いと仮定した場合の励起光αおよび蛍光βの光路を示す模式図である。図中右側の励起光αは、励起光αの反射光である。ここで、θ1は、励起光αが液体320上の媒質(例えば空気)から液体320(例えば緩衝液)に入射したときの励起光αの入射角である。θ1’は、励起光αが液体320上の媒質から液体320に入射したときの励起光αの屈折角である。θ2は、蛍光βが液体320から液体320上の媒質に入射したときの蛍光βの屈折角である。hは、液溜部250内の液体320の深さである。この図に示されるように、蛍光βが液体320から液体320上の媒質に入射したときの蛍光βの入射角は、2θ1’で近似されうる。以下の説明では、θ2を蛍光βの出射角の基準とする。FIG. 6A is a schematic diagram showing optical paths of excitation light α and fluorescence β when it is assumed that there is no meniscus. Excitation light α on the right side in the figure is reflected light of excitation light α. Here, θ 1 is an incident angle of the excitation light α when the excitation light α is incident on the liquid 320 (for example, a buffer solution) from a medium (for example, air) on the liquid 320. θ 1 ′ is a refraction angle of the excitation light α when the excitation light α is incident on the liquid 320 from the medium on the liquid 320. θ 2 is a refraction angle of the fluorescence β when the fluorescence β enters the medium on the liquid 320 from the liquid 320. h is the depth of the liquid 320 in the
なお、励起光αの波長や、回折格子230のピッチΛ、液体320の深さh、励起光αの入射角θ1、液体320上の媒質の屈折率n1および誘電率、液体320の屈折率n2および誘電率などは、蛍光検出時に使用する液体320の種類や、蛍光物質の種類、蛍光検出時の雰囲気などに応じて従属的に決まる。Note that the wavelength of the excitation light α, the pitch Λ of the
図6Bは、メニスカスがある場合の励起光αおよび蛍光βの光路を示す模式図である。ここで、金属膜220の面方向をx軸とし、液溜部250の高さ方向をy軸とし、励起光αの光軸と回折格子230との交点を原点としたときの、液溜部250内の液体320のメニスカスの形状を表す関数を以下の式(13)のように表す。液体320の屈折率および誘電率は、水の屈折率および誘電率とほぼ同じであると考えられるため、液体320のメニスカスの形状は、液体320表面の位置の液溜部250の水平方向の大きさRおよび側壁240内面の接触角θcにより決まる。
図6Bにおいて、θ1”は、励起光αが液体320上の媒質から液体320に入射したときの、入射点を通りかつ金属膜220の表面に垂直な直線に対する液体320内の励起光αの角度である。Δθ1は、励起光αが液体320上の媒質から液体320に入射したときの入射点における液体320表面の傾きを表し、上記式(13)を利用して以下の式(14)のように表される。x1は、入射点のx座標の値である。また、Δθ2’は、蛍光βが液体320から液体320上の媒質に入射したときの入射点における液体320表面の傾きを表し、上記式(13)を利用して以下の式(15)のように表される。x2は、入射点のx座標の値である。
この場合、x1およびx2は、それぞれ以下の式(16)および式(17)のように近似される。
スネルの法則より、以下の式(18)および式(19)が成立する(図6A参照)。同様に、スネルの法則より、以下の式(20)および式(21)が成立する(図6B参照)。ここで、n1は、液体320上の媒質の屈折率である。n2は、液体320の屈折率である。
上記の式(18)〜式(21)に各数値を代入し、これらの式を解くことで、液体320のメニスカスに起因する蛍光βの出射角のずれ幅Δθ2を算出することができる。そして、前述のとおり、光検出部150において蛍光βを正確に検出するためには、蛍光βの出射角のずれ幅Δθ2が、光検出部150の開口数NAと関連付けられる所定の値よりも小さいことが好ましい。すなわち、以下の式(22)が成立することが好ましい。
前述のとおり、液体320のメニスカスの形状は、液体320表面の位置の液溜部250の水平方向の大きさRおよび側壁240内面の接触角θcにより決まる。したがって、本実施の形態に係るチップ200では、上記の式(22)が成立するように、Rおよびθcが設定される。蛍光βを正確に検出する観点からは、Rおよびθcは、蛍光βが液体320の表面で全反射しないように設定されることがより好ましい。また、Rおよびθcは、液体320の深さが変動しても蛍光βが光検出部150に到達できるように設定されることがより好ましい。また、Rおよびθcは、チップ200の位置ずれが生じても蛍光βが光検出部150に到達できるように設定されることがより好ましい。As described above, the meniscus shape of the liquid 320 is determined by the horizontal size R of the
なお、液溜部250内の液体320のメニスカスの形状(上記式(13)の関数)は、例えばレーザー変位計で測定されうる。図7は、ポリテトラフルオロエチレンで側壁240を形成した場合のTBST(Tris Buffered Saline with Tween 20)のメニスカスの測定結果を示すグラフである。図7Aは、液面の高さの液溜部250の水平断面の形状が直径18mmの円形である場合の測定結果を示すグラフであり、図7Bは、液面の高さの液溜部250の水平断面の形状が直径10mmの円形である場合の測定結果を示すグラフである。横軸は、液面の中心からの水平方向の距離を示し、縦軸は、液面の中心からの高さを示す。このような測定結果から、上記式(13)の関数が決定されうる。
The shape of the meniscus of the liquid 320 in the liquid reservoir 250 (the function of the above formula (13)) can be measured, for example, with a laser displacement meter. FIG. 7 is a graph showing the measurement result of meniscus of TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) when the
以上のように、本実施の形態に係るチップ200は、SPFS装置100の光検出部150の開口数に対応して、液溜部250の水平方向の大きさRと、側壁240内面の接触角θcが設定される。このため、蛍光βの出射角のずれを、光検出部150の開口数よりも小さくすることができる。したがって、本実施の形態に係るチップ200を使用することで、高感度かつ高精度に被検出物質を検出することができる。As described above, in the
なお、上記各実施の形態では、図5に示されるチップ200を使用する例について説明したが、本発明に係るチップの液溜部250の形状は、これに限定されない。これまで説明したように、液溜部250の深さ方向の断面における液溜部250の水平方向の大きさが上に行くほど(金属膜220から離れるほど)大きければ、本発明の効果を得られる。したがって、図8Aに示されるように、側壁240の内面にR面を形成してもよいし、図8Bに示されるように、側壁240の内面にテーパー面(傾斜面)を形成してもよい。
In each of the above embodiments, the example in which the
本出願は、2013年11月7日出願の特願2013−230969に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。 This application claims the priority based on Japanese Patent Application No. 2013-230969 of an application on November 7, 2013. The contents described in the application specification and the drawings are all incorporated herein by reference.
本発明は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。 Since the present invention can measure a substance to be detected with high reliability, it is useful for clinical examinations, for example.
100 表面プラズモン増強蛍光測定装置(SPFS装置)
110 光源
120 コリメートレンズ
130 励起光フィルター
140 蛍光フィルター
150 光検出部
160 制御部
200 チップ
210 基板
220 金属膜
230 回折格子
240 側壁
250 液溜部
310 試料液
320 液体
α 励起光
β 蛍光100 Surface plasmon enhanced fluorescence measuring device (SPFS device)
DESCRIPTION OF
Claims (2)
液体を保持するための液溜部と、
前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、を有し、
前記表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を前記回折格子に照射する光照射部と、蛍光を検出する光検出部と、を有し、
前記液溜部の深さ方向の断面における前記液溜部の水平方向の大きさは、上に行くほど大きく、以下の式(1)が成立するように設定されている、
チップ。
A liquid reservoir for holding liquid;
A metal film including a diffraction grating disposed at the bottom of the liquid reservoir,
The surface plasmon enhanced fluorescence measurement device has a light irradiation unit that irradiates the diffraction grating with excitation light, and a light detection unit that detects fluorescence.
Horizontal size of the liquid reservoir portion in the depth direction of the cross section of the liquid reservoir portion is closer to the upper rather large and is set by the equation (1) is satisfied or less,
Chip.
液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、を有するチップを準備する工程と、
前記液溜部に試料液を導入する工程と、
前記液溜部内の前記試料液を別の液体に置換する工程と、
前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記液溜部の開口部側から前記回折格子に励起光を照射し、前記被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
を含み、
前記表面プラズモン増強蛍光測定方法で使用される表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を前記回折格子に照射する光照射部と、蛍光を検出する光検出部と、を有し、
前記蛍光を検出する工程における前記液溜部内の前記液体の表面積は、前記液溜部に前記試料液を導入する工程における前記液溜部内の前記試料液の表面積よりも大きく、以下の式(1)が成立するように設定されている、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
Preparing a chip having a liquid reservoir for holding a liquid, a metal film including a diffraction grating disposed at the bottom of the liquid reservoir, and a capturing body fixed to the diffraction grating; ,
Introducing a sample liquid into the liquid reservoir;
Replacing the sample liquid in the liquid reservoir with another liquid;
Irradiating the diffraction grating with excitation light from the opening side of the liquid reservoir so as to cause surface plasmon resonance in the diffraction grating, and detecting fluorescence emitted from a fluorescent substance that labels the substance to be detected When,
Including
The surface plasmon enhanced fluorescence measurement device used in the surface plasmon enhanced fluorescence measurement method includes a light irradiation unit that irradiates the diffraction grating with excitation light, and a light detection unit that detects fluorescence.
Wherein the surface area of the liquid in the liquid reservoir in the step of detecting the fluorescence, the liquid much larger than the surface area of the sample liquid in the liquid reservoir in the step of introducing the sample liquid into reservoir, the following equation ( A method for measuring surface plasmon enhanced fluorescence, wherein 1) is set to hold .
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013230969 | 2013-11-07 | ||
JP2013230969 | 2013-11-07 | ||
PCT/JP2014/079604 WO2015068813A1 (en) | 2013-11-07 | 2014-11-07 | Chip, and method for measuring surface plasmon-enhanced fluorescence |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015068813A1 JPWO2015068813A1 (en) | 2017-03-09 |
JP6586884B2 true JP6586884B2 (en) | 2019-10-09 |
Family
ID=53041588
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015546701A Expired - Fee Related JP6586884B2 (en) | 2013-11-07 | 2014-11-07 | Chip and surface plasmon enhanced fluorescence measurement method |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6586884B2 (en) |
WO (1) | WO2015068813A1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018021238A1 (en) * | 2016-07-28 | 2018-02-01 | コニカミノルタ株式会社 | Detection chip, detection system, and detection method |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999054711A1 (en) * | 1998-04-17 | 1999-10-28 | Ljl Biosystems, Inc. | Sample-holding devices and systems |
FR2781886B1 (en) * | 1998-07-31 | 2001-02-16 | Commissariat Energie Atomique | MULTIPLE POINT CHEMICAL OR BIOLOGICAL ANALYSIS MICROSYSTEM |
AU2849800A (en) * | 1999-01-15 | 2000-08-01 | Ljl Biosystems, Inc. | Methods and apparatus for detecting polynucleotide hybridization |
JP2003202285A (en) * | 2001-10-26 | 2003-07-18 | Fuji Photo Film Co Ltd | Measuring plate of measuring device utilizing total reflection |
JP5152917B2 (en) * | 2008-11-04 | 2013-02-27 | 富士フイルム株式会社 | Detection method, detection sample cell and detection kit |
JP2012211799A (en) * | 2011-03-31 | 2012-11-01 | Fujifilm Corp | Local plasmon enhanced fluorescence particle, carrier for detecting local plasmon enhanced fluorescence, local plasmon enhanced fluorescence detector, and fluorescence detection method |
JP2013113655A (en) * | 2011-11-28 | 2013-06-10 | Fujifilm Corp | Sensing device and sensing method using the same |
JP5975480B2 (en) * | 2012-01-31 | 2016-08-23 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Biochip, bioassay kit, and bioassay method |
JP2013170861A (en) * | 2012-02-20 | 2013-09-02 | Dainippon Screen Mfg Co Ltd | Imaging apparatus, sample holding plate and imaging method |
-
2014
- 2014-11-07 JP JP2015546701A patent/JP6586884B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-11-07 WO PCT/JP2014/079604 patent/WO2015068813A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2015068813A1 (en) | 2017-03-09 |
WO2015068813A1 (en) | 2015-05-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6565934B2 (en) | Surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus and surface plasmon enhanced fluorescence measuring method | |
JP6991972B2 (en) | Detection chip, detection system and detection method | |
JP6263887B2 (en) | Surface plasmon enhanced fluorescence measurement method and surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus | |
EP3321688B1 (en) | Detection device and detection method | |
US10677732B2 (en) | Detection chip, detection kit, detection system, and method for detecting detection target substance | |
JP6631538B2 (en) | Detection chip and detection method | |
JP2015111063A (en) | Surface plasmon-field enhanced fluorescence measurement method and surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus | |
JP6263884B2 (en) | Surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus and surface plasmon enhanced fluorescence measuring method | |
JP6586884B2 (en) | Chip and surface plasmon enhanced fluorescence measurement method | |
JP6627778B2 (en) | Detection device and detection method | |
US20190344261A1 (en) | Inspection Chip and Inspection System | |
JP6414205B2 (en) | Surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus and surface plasmon enhanced fluorescence measuring method | |
JP6711285B2 (en) | Detection method, detection device and chip | |
JP6687040B2 (en) | Shape measuring method, shape measuring apparatus, detecting method and detecting apparatus | |
JP6717201B2 (en) | Detection method and detection device | |
JP6658752B2 (en) | Detection chip, detection method, detection device and detection system |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170921 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180724 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180921 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190212 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190408 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20190708 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190813 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190826 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6586884 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |