JP5975480B2 - Biochip, bioassay kit, and bioassay method - Google Patents
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Description
本発明は、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって発生する表面プラズモン共鳴光により蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、表面プラズモン励起増強蛍光（以下、単に「増強蛍光」ともいう）を検出することにより抗原抗体反応を検出できるバイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び、それらを用いた抗原抗体反応の検出方法に関する。 The present invention detects surface plasmon excitation enhanced fluorescence (hereinafter also simply referred to as “enhanced fluorescence”) by exciting a fluorescent substance with surface plasmon resonance light generated by surface plasmon resonance and generating fluorescence. The present invention relates to a biochip capable of detecting an antigen-antibody reaction, a kit for detecting an antigen-antibody reaction, and a method for detecting an antigen-antibody reaction using them.
生体分子の相互作用を調べる技術であるバイオセンシング、及びそれに使用されるバイオチップの開発が成されている。生体分子の相互作用を調べる方法の一つに、表面プラズモン共鳴を使用した分光分析法が知られている。例えば、下記特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。 Biosensing, which is a technique for investigating the interaction of biomolecules, and biochips used therefor have been developed. As one of methods for examining the interaction of biomolecules, a spectroscopic analysis method using surface plasmon resonance is known. For example, Patent Document 1 below discloses an apparatus and method for determining the binding of an analyte to a solid phase by separately analyzing signals obtained by surface plasmon resonance measurement and fluorescence measurement.
また、下記特許文献２には、抗原抗体反応などの生体分子相互作用を高精度で検出することができる装置及び方法が開示されている。 Patent Document 2 below discloses an apparatus and method that can detect biomolecular interactions such as antigen-antibody reaction with high accuracy.
また、下記特許文献３〜６には、クレッチマン型のようにプリズムを使用する必要がない、表面に周期構造を有するマイクロプレート及びバイオチップ、並びに、それらを用いた表面プラズモン励起増強蛍光の検出装置（顕微鏡）及び方法が開示されている。特許文献３〜６に開示されたマイクロプレート及びバイオチップでは、ベース基板の表面に周期構造を形成し、周期構造の上に、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属層（金、銀等）、及び消光抑制層（ＳｉＯ２、ＺｎＯ等）を形成する。さらに、必要に応じて、ベース基板と金属層との間、及び、金属層と消光抑制層との間に、接着層（Ｃｒ等）を形成する。 Patent Documents 3 to 6 listed below do not require the use of a prism as in the Kretschmann type, and include a microplate and biochip having a periodic structure on the surface, and a surface plasmon excitation enhanced fluorescence detection device using them. (Microscope) and method are disclosed. In the microplate and biochip disclosed in Patent Documents 3 to 6, a periodic structure is formed on the surface of the base substrate, and a metal layer (gold, silver, etc.) capable of generating surface plasmon resonance light on the periodic structure, And a quenching suppression layer (SiO 2 , ZnO, etc.). Furthermore, an adhesive layer (Cr or the like) is formed between the base substrate and the metal layer and between the metal layer and the quenching suppression layer as necessary.
本願発明者は、生活習慣病マーカの一つの候補として考えられるＩＬ−６（インターロイキン−６）を抗原抗体反応によって検出するイムノアッセイのために、従来の周期構造を有するチップ（ベース基板／Ｃｒ／Ａｇ／Ｃｒ／ＳｉＯ２）を用いて表面プラズモン励起増強蛍光の測定を試みた。周期構造（ピッチ５００ｎｍ（ナノメートル））を有するベース基板には、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）系高分子を使用し、その上に、膜厚１ｎｍのＣｒ、膜厚４０ｎｍのＡｇ、膜厚１ｎｍのＣｒ、及び膜厚４０ｎｍのＳｉＯ２を形成した。このチップに対して、公知の検出用キットを用いて、公知のマルチステップアッセイを行なった。即ち、チップ表面の処理（アミノ基修飾）及び洗浄を行ない、抗ＩＬ−６抗体の固定、ブロッキング処理、抗原（ＩＬ−６）の注入、及び蛍光分子（蛍光標識蛋白質）の注入を行なった。 The inventor of the present application uses a chip having a conventional periodic structure (base substrate / Cr /) for immunoassay for detecting IL-6 (interleukin-6), which is considered as one candidate for lifestyle-related disease markers, by antigen-antibody reaction. Measurement of surface plasmon excitation enhanced fluorescence was attempted using (Ag / Cr / SiO 2 ). For the base substrate having a periodic structure (pitch 500 nm (nanometer)), a polymethyl methacrylate (PMMA) polymer is used, and further, a 1 nm thick Cr film, a 40 nm thick Ag film, and a 1 nm thick film thickness. Cr and SiO 2 with a film thickness of 40 nm were formed. This chip was subjected to a known multi-step assay using a known detection kit. That is, chip surface treatment (amino group modification) and washing were performed, and anti-IL-6 antibody fixation, blocking treatment, antigen (IL-6) injection, and fluorescent molecule (fluorescence-labeled protein) injection were performed.
マルチステップアッセイにおいて、ブロッキングのためにブロッキング剤（ブロックエース（登録商標））溶液又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液を投入した段階から、チップ上に形成した多層膜の剥離が発生し始めた。さらに、蛍光分子（蛍光標識蛋白質）を結合させるためにビオチンラベル抗体を注入した段階で、チップ上の溶液の白濁が始まった。剥離及び白濁は、周期構造上に形成した多層膜中の銀が酸化したことによるものである。銀の酸化の原因としては、洗浄に使用したＰＢＳ（燐酸緩衝液）に含まれる界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）、高濃度のブロッキング剤、及び、多段階のアッセイであること等が考えられる。これらの点は、抗原抗体反応の検査等におけるバイオアッセイにおいては、不可欠である。 In the multi-step assay, peeling of the multilayer film formed on the chip began to occur from the stage when the blocking agent (Block Ace (registered trademark)) solution or BSA (bovine serum albumin) solution was added for blocking. Furthermore, the white turbidity of the solution on the chip started when a biotin-labeled antibody was injected to bind a fluorescent molecule (fluorescently labeled protein). Separation and white turbidity are due to the oxidation of silver in the multilayer film formed on the periodic structure. Possible causes of silver oxidation include a surfactant (Tween 20) contained in PBS (phosphate buffer) used for washing, a high concentration blocking agent, and a multistage assay. These points are indispensable in bioassays for testing antigen-antibody reactions.
特許文献４〜６には、金属層として銀を使用する場合、水中で非常に不安定な銀を保護するために、銀の酸化を防止するための層（酸化防止層）を形成することが望ましいことが記載されている。また、特許文献４〜６には、金属層と消光抑制層とを接着する接着層を、Ｃｒで膜厚０．１〜３ｎｍに形成すれば、銀の金属層を保護できることが記載されている。 In Patent Documents 4 to 6, when silver is used as the metal layer, a layer (antioxidation layer) for preventing silver oxidation may be formed in order to protect very unstable silver in water. It is stated that it is desirable. Patent Documents 4 to 6 describe that the silver metal layer can be protected by forming an adhesive layer for bonding the metal layer and the quenching suppression layer with Cr to a film thickness of 0.1 to 3 nm. .
しかし、上記したように膜厚１ｎｍのＣｒで接着層を形成したチップを用いても、上記のようなバイオアッセイを実行すると、剥離及び白濁が発生する。即ち、チップの用途によっては、Ｃｒの接着層は、銀で形成された金属層の保護に有効であるとしても、上記のようなマルチステップのバイオアッセイにおいては、銀で形成された金属層を十分に保護できなかった。そして、バイオアッセイにおいて、銀で形成された金属層を十分に保護し、且つ、十分な蛍光強度を得るためのチップの構造及び材質は知られていなかった。 However, even when a chip having an adhesive layer formed of Cr having a thickness of 1 nm as described above is used, peeling and clouding occur when the bioassay is performed. That is, depending on the application of the chip, even if the Cr adhesion layer is effective in protecting the metal layer formed of silver, in the multi-step bioassay as described above, the metal layer formed of silver is used. It was not able to protect enough. And in the bioassay, the structure and material of the chip | tip for fully protecting the metal layer formed with silver and obtaining sufficient fluorescence intensity were not known.
したがって、本発明は、バイオアッセイにおいて周期構造上の多層膜が剥離しないバイオチップ、バイオアッセイ用キット、及びバイオアッセイ方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a biochip, a bioassay kit, and a bioassay method in which a multilayer film on a periodic structure is not peeled in a bioassay.
上記の目的は、下記によって達成することができる。 The above object can be achieved by the following.
即ち、本発明に係るバイオチップは、蛍光分子を用いて抗原抗体反応を検出するために使用されるバイオチップであって、表面に周期構造を有するベース基板と、周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、金属層の上に、直接又は第２の接着層を間に挟んで形成された保護層と、保護層の上に形成された消光抑制層とを備え、金属層は、表面プラズモン共鳴光を発生し且つ水溶液中で酸化され得る金属で形成され、保護層は、酸化亜鉛又は酸化チタンで形成され、消光抑制層は、二酸化ケイ素で形成され、金属層に光が入射されることにより、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生し、発生した電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光を出力する。 That is, the biochip according to the present invention is a biochip used for detecting an antigen-antibody reaction using a fluorescent molecule, and directly or directly on a base substrate having a periodic structure on the surface and the periodic structure. Formed on a metal layer formed with a first adhesive layer sandwiched therebetween, a protective layer formed on the metal layer directly or with a second adhesive layer sandwiched therebetween, and a protective layer A quenching suppression layer, the metal layer is formed of a metal that generates surface plasmon resonance light and can be oxidized in an aqueous solution, the protective layer is formed of zinc oxide or titanium oxide, and the quenching suppression layer is silicon dioxide When the light is incident on the metal layer, an electric field enhanced by surface plasmon resonance light is generated, and enhanced fluorescence is output using the generated electric field as an excitation field of fluorescent molecules.
好ましくは、保護層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、消光抑制層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下である。 Preferably, the thickness of the protective layer is 5 nm or more and 50 nm or less, and the thickness of the quenching suppression layer is 5 nm or more and 50 nm or less.
より好ましくは、金属層は、銀で形成され、保護層は、厚さ５ｎｍ以上３０ｎｍ以下の酸化亜鉛である。 More preferably, the metal layer is made of silver, and the protective layer is zinc oxide having a thickness of 5 nm to 30 nm.
さらに好ましくは、第２の接着層はチタンで形成される。 More preferably, the second adhesive layer is made of titanium.
好ましくは、第１の接着層はチタンで形成される。 Preferably, the first adhesive layer is made of titanium.
より好ましくは、第２の接着層の厚さは０．１ｎｍ以上３ｎｍ以下である。 More preferably, the thickness of the second adhesive layer is not less than 0.1 nm and not more than 3 nm.
さらに好ましくは、第１の接着層の厚さは０．１ｎｍ以上３ｎｍ以下である。 More preferably, the thickness of the first adhesive layer is not less than 0.1 nm and not more than 3 nm.
本発明に係るバイオアッセイ用キットは、表面に周期構造を有するベース基板と、周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、金属層の上に、直接又は第２の接着層を間に挟んで酸化亜鉛又は酸化チタンで形成された保護層と、保護層の上に二酸化ケイ素で形成された消光抑制層とを有するチップと、バイオアッセイ用薬剤と、蛍光分子とを含み、チップの周期構造を有する側の面に、バイオアッセイ用薬剤及び蛍光分子を注入した後、表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用される。 The bioassay kit according to the present invention comprises a base substrate having a periodic structure on the surface, a metal layer formed on the periodic structure directly or with the first adhesive layer interposed therebetween, and a metal layer. A chip having a protective layer formed of zinc oxide or titanium oxide directly or with a second adhesive layer interposed therebetween, and a quenching suppression layer formed of silicon dioxide on the protective layer, and a bioassay agent And a fluorescent molecule, the bioassay agent and the fluorescent molecule are injected into the surface of the chip having the periodic structure, and then used for detection of surface plasmon excitation enhanced fluorescence.
好ましくは、バイオアッセイ用薬剤は、特定の抗原に結合する抗体と、チップの表面をアミノ基修飾するためのシランカップリング剤と、抗体をチップに対して固定するための架橋剤とを含み、蛍光分子は、抗原又は抗体に、直接又は媒介分子を介して結合される分子であり、消光抑制層の表面にシランカップリング剤が注入されて消光抑制層の表面がアミノ基修飾され、アミノ基修飾された消光抑制層の表面に架橋剤が注入された後、抗体が注入されて、抗体がチップに対して固定され、抗体が固定されたチップの表面に抗原が注入され、蛍光分子が注入された後、表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用される。 Preferably, the bioassay agent comprises an antibody that binds to a specific antigen, a silane coupling agent for modifying the surface of the chip with an amino group, and a cross-linking agent for immobilizing the antibody to the chip, A fluorescent molecule is a molecule that is bound to an antigen or an antibody directly or via a mediator molecule, and a silane coupling agent is injected into the surface of the quenching suppression layer to modify the surface of the quenching suppression layer with an amino group. After the cross-linking agent is injected on the surface of the modified quenching suppression layer, the antibody is injected, the antibody is fixed to the chip, the antigen is injected on the surface of the chip on which the antibody is fixed, and the fluorescent molecule is injected And then used to detect surface plasmon excitation enhanced fluorescence.
本発明に係るバイオアッセイ方法は、表面に周期構造を有するベース基板と、周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、金属層の上に、直接又は第２の接着層を間に挟んで酸化亜鉛又は酸化チタンで形成された保護層と、保護層の上に二酸化ケイ素で形成された消光抑制層とを有するチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、チップの周期構造を有する側の面に、バイオアッセイ用薬剤及び蛍光分子を注入する第１ステップと、第１ステップが実行された後のチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を前記蛍光分子の励起場として用いて増強蛍光を検出する第２ステップとを含む。 The bioassay method according to the present invention includes a base substrate having a periodic structure on the surface, a metal layer formed on the periodic structure directly or with the first adhesive layer interposed therebetween, and a metal layer. Antigen-antibody reaction is carried out using a chip having a protective layer made of zinc oxide or titanium oxide directly or with a second adhesive layer in between and a quenching suppression layer made of silicon dioxide on the protective layer A first method for injecting a bioassay agent and a fluorescent molecule into a surface of the chip having a periodic structure, and light is incident on the chip after the first step is executed. A second step of generating an electric field enhanced by surface plasmon resonance light and detecting the enhanced fluorescence using the generated electric field as an excitation field of the fluorescent molecule.
好ましくは、第１ステップは、消光抑制層の表面にシランカップリング剤を注入して消光抑制層の表面をアミノ基修飾するステップと、アミノ基修飾された消光抑制層の表面に架橋剤を注入した後、特定の抗原に対する抗体を注入して、抗体をチップに対して固定するステップと、抗体が固定されたチップの表面に抗原を注入した後、抗原又は抗体に、直接又は媒介分子を介して結合する蛍光分子を注入するステップとを含む。 Preferably, the first step includes injecting a silane coupling agent on the surface of the quenching suppression layer to modify the surface of the quenching suppression layer with an amino group, and injecting a crosslinking agent on the surface of the quenching suppression layer modified with an amino group. Then, injecting an antibody against a specific antigen and immobilizing the antibody to the chip, and injecting the antigen onto the surface of the chip on which the antibody is immobilized, the antigen or the antibody directly or via a mediator molecule Injecting a fluorescent molecule to bind.
本発明によれば、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生する金属層として銀を用いたバイオチップに、抗原抗体反応等を検出するためのマルチステップのバイオアッセイが実行されても、剥離及び白濁を生じない。したがって、表面プラズモン励起増強蛍光を安定して検出することができ、ＥＬＩＳＡ法等の従来の検出方法よりも短時間で抗原抗体反等の生物反応を検出することが可能になる。 According to the present invention, even when a multi-step bioassay for detecting an antigen-antibody reaction or the like is performed on a biochip using silver as a metal layer that generates an electric field enhanced by surface plasmon resonance light, peeling is performed. And no cloudiness occurs. Accordingly, surface plasmon excitation enhanced fluorescence can be detected stably, and biological reactions such as antigen-antibody reaction can be detected in a shorter time than conventional detection methods such as ELISA.
少なくとも、金属層と保護層とを接着するための第２接着層をチタンで形成することにより、マルチステップのバイオアッセイに対するバイオチップの耐性をより向上することができ、界面活性剤を含む洗浄液によって洗浄されても剥離が生じない。バイオアッセイにおいては、蛋白質等の非特異吸着を抑制するために、界面活性剤を含む洗浄液が一般に使用されるので、界面活性剤への耐性が高いバイオチップは特に有効である。 At least by forming the second adhesive layer for bonding the metal layer and the protective layer with titanium, the resistance of the biochip to the multi-step bioassay can be further improved. Even if washed, no peeling occurs. In the bioassay, since a washing solution containing a surfactant is generally used to suppress nonspecific adsorption of proteins or the like, a biochip having a high resistance to the surfactant is particularly effective.
また、第１及び第２接着層をチタンで形成することにより、クロムを使用する場合よりも、接着層の厚さを薄くすることができ、表面プラズモン共鳴による増強蛍光強度をより増大させることができる。 Further, by forming the first and second adhesive layers with titanium, the thickness of the adhesive layer can be made thinner than when chromium is used, and the enhanced fluorescence intensity due to surface plasmon resonance can be further increased. it can.
また、消光抑制層を二酸化ケイ素で形成しているので、市販の抗原抗体反応等のバイオアッセイ用の薬剤をそのまま適用することができる。したがって、安価に実験することができる。 Moreover, since the quenching suppression layer is formed of silicon dioxide, a commercially available drug for bioassay such as antigen-antibody reaction can be applied as it is. Therefore, the experiment can be performed at a low cost.
また、本発明のバイオチップは、抗原抗体反応の検出に限らず、比較的長期間を要する細胞培養等にも使用可能である。本発明のバイオチップを細胞培養に使用する場合、バイオチップの上で直接、細胞培養が可能であり、長期間にわたって細胞培養を行ないながら、適宜、表面プラズモン共鳴蛍光顕微鏡で観察することが可能になる。 The biochip of the present invention can be used not only for detection of antigen-antibody reaction but also for cell culture that requires a relatively long time. When the biochip of the present invention is used for cell culture, cell culture can be performed directly on the biochip, and it can be appropriately observed with a surface plasmon resonance fluorescence microscope while performing cell culture over a long period of time. Become.
以下の実施の形態では、同一の部品には同一の参照番号を付してある。それらの名称及び機能も同一である。したがって、それらについての詳細な説明は繰返さない。 In the following embodiments, the same parts are denoted by the same reference numerals. Their names and functions are also the same. Therefore, detailed description thereof will not be repeated.
図１を参照して、本発明の実施の形態に係るバイオチップ１００は、周期的構造を有するベース基板１０２と、周期的構造の上に形成された第１接着層１０４、金属層１０６、第２接着層１０８、保護層１１０及び消光抑制層１１２からなる多層膜とを備えて構成されている。 Referring to FIG. 1, a biochip 100 according to an embodiment of the present invention includes a base substrate 102 having a periodic structure, a first adhesive layer 104, a metal layer 106, a first layer formed on the periodic structure. 2 and a multilayer film composed of a protective layer 110 and a quenching suppression layer 112.
バイオチップ１００が抗原抗体反応の検出に使用されるとき、消光抑制層１１２の表面に抗体を含む溶液が滴下され、抗体が消光抑制層１１２の表面に結合した後、抗原を含む溶液が滴下され、抗原抗体反応を生じさせる。このとき、抗原又は抗体に蛍光標識蛋白質（蛍光分子）を結合させる。バイオチップ１００は、その状態で図２に示したように、バイオチップ１００の正面（周期構造を有する面）又は背面から所定波長の光Ｌｉｎ１、Ｌｉｎ２が照射される。これによって、表面プラズモン共鳴が発生し、抗原又は抗体に結合された蛍光標識蛋白質からの増強蛍光Ｌｐを検出することができる。 When the biochip 100 is used for detecting an antigen-antibody reaction, a solution containing an antibody is dropped on the surface of the quenching suppression layer 112, and after the antibody is bound to the surface of the quenching suppression layer 112, a solution containing the antigen is dropped. To produce an antigen-antibody reaction. At this time, a fluorescently labeled protein (fluorescent molecule) is bound to the antigen or antibody. In this state, the biochip 100 is irradiated with light Lin1 and Lin2 having a predetermined wavelength from the front surface (surface having a periodic structure) or the back surface of the biochip 100 as shown in FIG. As a result, surface plasmon resonance occurs, and the enhanced fluorescence Lp from the fluorescently labeled protein bound to the antigen or antibody can be detected.
ベース基板１０２は、表面に周期的構造である格子が形成されている。ベース基板１０２は、入射光及び放射される蛍光に対して透明な材質、例えばガラス、又はプラスチック（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等）等で形成されていれば、正面及び背面の何れからの照射においても使用できる。光の照射と検出を同じ側から行なうのであれば、ベース基板１０２は透明である必要はない。 The base substrate 102 has a lattice having a periodic structure formed on the surface thereof. If the base substrate 102 is made of a material transparent to incident light and emitted fluorescence, such as glass or plastic (polymethyl methacrylate (PMMA), etc.), the base substrate 102 can be irradiated from either the front surface or the back surface. Can also be used. If light irradiation and detection are performed from the same side, the base substrate 102 does not need to be transparent.
周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状である。溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。上記した特許文献３〜６に開示されたマイクロプレートと同様に形成することができる。ナノスケールの周期構造を持つ周期構造は、例えば、特許第３３５０７１１号公報、特許第２８３２３３７号公報、特開２００４−１１７８１０号公報などに開示されている方法を使用して形成することができる。プラスチックであれば、スタンパー（型）を用いたプレス成型法又は射出成型法、モールド（型）を用いた熱ナノインプリント法、モールドを用いた光硬化樹脂による光ナノインプリント法等、公知の方法によって形成することもできる。 The periodic structure has, for example, a shape having a plurality of grooves arranged at almost equal intervals along one direction. The groove is, for example, a sawtooth groove, a sine wave groove, or a rectangular groove. It can be formed in the same manner as the microplate disclosed in Patent Documents 3 to 6 described above. A periodic structure having a nanoscale periodic structure can be formed using, for example, methods disclosed in Japanese Patent No. 3350711, Japanese Patent No. 2832337, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-117810, and the like. In the case of plastic, it is formed by a known method such as a press molding method or an injection molding method using a stamper (mold), a thermal nanoimprint method using a mold (mold), or a photo nanoimprint method using a photocurable resin using a mold. You can also.
具体的には、ベース基板１０２の表面の周期構造は、断面形状が図３に示した矩形状である。周期構造の周期（ピッチとも記す）、即ち隣接する溝の間隔（Ｍ＋Ｖ）は、蛍光観察に使用する波長以下又は波長程度、例えば１０〜１０００ｎｍであり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さｄ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比ｄ／Ｖは０．００５〜１０である。凸部の長さをＭ、凹部の長さ（溝の幅）をＶとして、Ｍ／（Ｍ＋Ｖ）でデューティ比を定義する。望ましい溝の深さｄは２０〜４０ｎｍであり、望ましいデューティ比は０．５である。 Specifically, the periodic structure of the surface of the base substrate 102 has the rectangular shape shown in FIG. The period (also referred to as pitch) of the periodic structure, that is, the interval between adjacent grooves (M + V) is equal to or less than the wavelength used for fluorescence observation, for example, 10 to 1000 nm, and preferably 100 to 600 nm. The periodic structure has a height d (groove depth) of 4 to 400 nm and an aspect ratio d / V of 0.005 to 10. The duty ratio is defined as M / (M + V) where M is the length of the convex portion and V is the length of the concave portion (groove width). A desirable groove depth d is 20 to 40 nm, and a desirable duty ratio is 0.5.
第１接着層１０４は、ベース基板１０２と金属層１０６とを接着するための層である。ベース基板１０２自体が安定して金属層１０６と固着する材質であれば、第１接着層１０４はなくてもよい。第１接着層１０４は、できるだけ薄いことが好ましく、例えば膜厚０．１〜３ｎｍのクロム（Ｃｒ）の薄膜として形成される。 The first adhesive layer 104 is a layer for bonding the base substrate 102 and the metal layer 106. The first adhesive layer 104 may be omitted as long as the base substrate 102 itself is a material that is stably fixed to the metal layer 106. The first adhesive layer 104 is preferably as thin as possible. For example, the first adhesive layer 104 is formed as a thin film of chromium (Cr) having a thickness of 0.1 to 3 nm.
金属層１０６は、銀（Ａｇ）であり、例えばスパッタによって形成される。背面から光Ｌｉｎ２が入射される場合、金属層１０６の膜厚は、好ましくは１０〜５０ｎｍであり、より好ましくは２０〜５０ｎｍである。正面から光Ｌｉｎ１が入射される場合、金属層１０６の膜厚は、好ましくは５０ｎｍ以上であり、より好ましくは１００ｎｍ以上である。なお、ベース基板１０２の表面に、スパッタなどによって金属層１０６を形成した場合、図４に示すように、ベース基板１０２の周期構造の段差部分に対応する部分が傾斜（以下、この部分をスロープ部ＳＬという）する。図４において、第１接着層１０４は図示していない。また、後述する金属層１０６の上の保護層１１０及び消光抑制層１１２も同様にスロープＳＬを有する形状に形成される。 The metal layer 106 is silver (Ag), and is formed by sputtering, for example. When light Lin2 is incident from the back surface, the thickness of the metal layer 106 is preferably 10 to 50 nm, and more preferably 20 to 50 nm. When light Lin1 is incident from the front, the thickness of the metal layer 106 is preferably 50 nm or more, and more preferably 100 nm or more. When the metal layer 106 is formed on the surface of the base substrate 102 by sputtering or the like, as shown in FIG. 4, a portion corresponding to a step portion of the periodic structure of the base substrate 102 is inclined (hereinafter, this portion is referred to as a slope portion). SL). In FIG. 4, the first adhesive layer 104 is not shown. Further, a protective layer 110 and a quenching suppression layer 112 on the metal layer 106 to be described later are similarly formed in a shape having a slope SL.
第２接着層１０８は、金属層１０６と保護層１１０とを接着するための層である。金属層１０６が保護層１１０と安定して固着する材質であれば、第２接着層１０８はなくてもよい。第２接着層１０８は、できるだけ薄いことが好ましく、例えば膜厚０．１〜３ｎｍのクロムの薄膜として形成される。 The second adhesive layer 108 is a layer for bonding the metal layer 106 and the protective layer 110. As long as the metal layer 106 is a material that is stably fixed to the protective layer 110, the second adhesive layer 108 may be omitted. The second adhesive layer 108 is preferably as thin as possible. For example, the second adhesive layer 108 is formed as a chromium thin film having a thickness of 0.1 to 3 nm.
保護層１１０は、バイオアッセイに使用される水溶液（界面活性剤、ブロッキング剤等）から、金属層１０６を保護するための層である。バイオアッセイにおいて、バイオチップ１００の周期構造を有する表面は、界面活性剤、及びブロッキング剤等に繰返し比較的長時間さらされる。金属層１０６に銀を使用する場合、水中で非常に不安定な銀が酸化し、金属層１０６が損傷を受けて剥離してしまう。金属層１０６に金を使用すれば、酸化される問題はない。しかし、銀は金よりも蛍光の増強効果が大きく、イムノアッセイ等のバイオセンシング及びバイオイメージングには有効な金属である。保護層１１０は、銀の酸化を防止し、金属層１０６が損傷を受けて剥離することを防止する。保護層１１０は、入射光及び放射される蛍光に対して吸収が小さく透過率の大きい材質、例えば酸化亜鉛（ＺｎＯ）、又は酸化チタン（ＴｉＯ２）等で形成されていれば、正面及び背面の何れからの照射においても使用できる。光の照射と検出を同じ側（チップの正面）から行なうのであれば、保護層１１０は透明である必要はない。 The protective layer 110 is a layer for protecting the metal layer 106 from an aqueous solution (surfactant, blocking agent, etc.) used in the bioassay. In the bioassay, the surface having the periodic structure of the biochip 100 is repeatedly exposed to a surfactant, a blocking agent and the like for a relatively long time. When silver is used for the metal layer 106, very unstable silver is oxidized in water, and the metal layer 106 is damaged and peeled off. If gold is used for the metal layer 106, there is no problem of oxidation. However, silver has a greater fluorescence enhancement effect than gold and is an effective metal for biosensing and bioimaging such as immunoassay. The protective layer 110 prevents silver oxidation and prevents the metal layer 106 from being damaged and peeled off. If the protective layer 110 is formed of a material that absorbs little incident light and radiated fluorescence and has a high transmittance, such as zinc oxide (ZnO) or titanium oxide (TiO 2 ), the protective layer 110 is formed on the front and back surfaces. It can be used in any irradiation. If the light irradiation and detection are performed from the same side (front side of the chip), the protective layer 110 does not need to be transparent.
保護層１１０の厚さは、後述する消光抑制層の厚さも考慮して決定する必要がある。保護層１１０がＺｎＯである場合、約５〜５０ｎｍが好ましく、約５〜３０ｎｍであることがより好ましい。 The thickness of the protective layer 110 needs to be determined in consideration of the thickness of the quenching suppression layer described later. When the protective layer 110 is ZnO, about 5-50 nm is preferable and it is more preferable that it is about 5-30 nm.
消光抑制層１１２は、抗体を結合させるための層でもあり、市販のバイオアッセイ用のキット（薬剤）が使用できるように二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で形成されることが好ましい。市販の薬剤には、ＳｉＯ２への適用を想定しているものが多い。ＳｉＯ２は、通常観察に使用される入射光及び発生する蛍光の波長領域で吸収を持たない（又は吸収が少ない）ので、透明な薄膜として形成することができる。例えば、スパッタによってＳｉＯ２を形成する。 The quenching suppression layer 112 is also a layer for binding an antibody, and is preferably formed of silicon dioxide (SiO 2 ) so that a commercially available kit (medicine) for bioassay can be used. Many commercially available drugs are assumed to be applied to SiO 2 . Since SiO 2 has no absorption (or less absorption) in the wavelength range of incident light and generated fluorescence that are normally used for observation, it can be formed as a transparent thin film. For example, SiO 2 is formed by sputtering.
表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属層１０６との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。したがって、蛍光分子を金属層１０６から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが必要である。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるために、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰するため、金属層１０６の表面からおよそ１００ｎｍ以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのために、保護層１１０及び消光抑制層１１２を合わせた膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層１０６の種類、消光抑制層１１２の屈折率、入射光の波長などに応じて決定される。例えば、金属層１０６が銀であり、保護層１１０がＺｎＯであり、消光抑制層１１２がＳｉＯ２であり、６３３ｎｍの波長の励起光を用いる場合、保護層１１０及び消光抑制層１１２の合計の膜厚の最適値は好ましくは約１０〜１００ｎｍであり、より好ましくは約１０〜６０ｎｍである。消光抑制層の厚さは、好ましくは約５〜５０ｎｍであり、より好ましくは約２０〜３０ｎｍである。 In the enhanced fluorescence, which is a feature of the surface plasmon excitation enhanced fluorescence method, when the distance between the fluorescent molecule and the metal layer 106 is short, the fluorescence excited by a strong excitation field is transferred to the metal surface and quenched. Therefore, it is necessary to suppress quenching by separating the fluorescent molecules from the metal layer 106 by a predetermined distance. In addition, since the excitation field due to surface plasmon resonance is a near field, the electric field intensity decreases as the distance from the metal surface increases, so that only fluorescent molecules existing within about 100 nm from the surface of the metal layer 106 are efficiently excited. The Therefore, the total thickness of the protective layer 110 and the quenching suppression layer 112 is determined in the range of about 10 nm to 100 nm according to the type of the metal layer 106, the refractive index of the quenching suppression layer 112, the wavelength of incident light, and the like. . For example, when the metal layer 106 is silver, the protective layer 110 is ZnO, the quenching suppression layer 112 is SiO 2 , and excitation light having a wavelength of 633 nm is used, the total film of the protective layer 110 and the quenching suppression layer 112 The optimum value of the thickness is preferably about 10 to 100 nm, more preferably about 10 to 60 nm. The thickness of the quenching suppression layer is preferably about 5 to 50 nm, more preferably about 20 to 30 nm.
バイオチップ１００は上記したように、銀で形成された金属層１０６の上に酸化亜鉛又は酸化チタンの保護層１１０を備えているので、抗原抗体反応を検出するためのマルチステップアッセイが実行されても、剥離及び白濁を生じない。即ち、マルチステップアッセイにおいて、高濃度のブロッキング剤等から、金属層１０６を保護し酸化を防止することができる。 As described above, since the biochip 100 includes the protective layer 110 of zinc oxide or titanium oxide on the metal layer 106 formed of silver, a multi-step assay for detecting an antigen-antibody reaction is performed. No peeling or clouding occurs. That is, in the multi-step assay, the metal layer 106 can be protected from a high concentration blocking agent or the like to prevent oxidation.
さらに、第１接着層１０４及び第２接着層１０８に、マルチステップアッセイにおけるチップの耐性を向上させる役割を持たせることもできる。上記では、第１接着層１０４及び第２接着層１０８がクロムで形成されることを説明したが、後述するように、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をチタン（Ｔｉ）で形成することにより、洗浄に使用されるＰＢＳ（燐酸緩衝液）に含まれる界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）に対するチップの耐性を向上させることができることが分かった。第１接着層１０４及び第２接着層１０８の膜厚は、できるだけ薄いことが好ましく、例えば０．１〜３ｎｍに形成されることが好ましい。なお、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をチタンで形成することが最も好ましいが、金属層１０６と保護層１１０とを接着するための第２接着層１０８の方が、ベース基板１０２と金属層１０６とを接着するための第１接着層１０４よりも、界面活性剤と接する可能性が高いので、第２接着層１０８のみをチタンで形成しても、十分な耐性を実現できる。この場合、第１接着層１０４の材質は、接着機能があれば任意であり、クロムであってもよい。 Further, the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 can have a role of improving the resistance of the chip in the multi-step assay. In the above description, it has been described that the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of chromium. However, as described later, the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of titanium (Ti). Thus, it was found that the resistance of the chip to the surfactant (Tween 20) contained in PBS (phosphate buffer) used for washing can be improved. It is preferable that the film thickness of the 1st contact bonding layer 104 and the 2nd contact bonding layer 108 is as thin as possible, for example, it is preferable to form in 0.1-3 nm. Note that the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are most preferably formed of titanium, but the second adhesive layer 108 for bonding the metal layer 106 and the protective layer 110 is more easily bonded to the base substrate 102. Since the possibility of being in contact with the surfactant is higher than that of the first adhesive layer 104 for adhering to the metal layer 106, even if only the second adhesive layer 108 is formed of titanium, sufficient resistance can be realized. In this case, the material of the first adhesive layer 104 is arbitrary as long as it has an adhesive function, and may be chromium.
したがって、バイオチップ１００は、比較的長期間を要する実験にも使用可能である。例えば、細胞培養に使用することができる。従来の構造のバイオチップ又はマイクロプレートでは、培養液によって銀が酸化されてしまうので、細胞培養を行なった後、培養された細胞をバイオチップ又はマイクロプレートに搭載して、表面プラズモン共鳴蛍光顕微鏡で観察する必要がある。これに対して、バイオチップ１００を使用すれば、その上で細胞培養が可能であり、長期間にわたって細胞培養を行ないながら、適宜、表面プラズモン共鳴蛍光顕微鏡で観察することが可能である。 Therefore, the biochip 100 can be used for experiments that require a relatively long period of time. For example, it can be used for cell culture. In conventional biochips or microplates, silver is oxidized by the culture medium. After cell culture, the cultured cells are mounted on the biochip or microplate, and the surface plasmon resonance fluorescence microscope is used. It is necessary to observe. On the other hand, if the biochip 100 is used, cell culture can be performed on the biochip 100, and observation can be appropriately performed with a surface plasmon resonance fluorescence microscope while performing cell culture over a long period of time.
なお、周期構造の形状は、上記した１方向に溝を有する形状に限定されず、ベース基板の表面に交差する２方向に溝を形成し構造、及び円形（フレネル）の周期構造等の２次元周期構造であってもよい。図５を参照して、ベース基板２００には２次元周期構造が形成されている。ベース基板２００の表面には、複数の溝部２１２が直交する２方向に、即ち凸部２１４が直交する２方向に配列している。交差する２方向の溝部２１２は直交している場合に限らず、斜めであってもよい。 Note that the shape of the periodic structure is not limited to the shape having grooves in one direction as described above, but a two-dimensional structure such as a structure in which grooves are formed in two directions intersecting the surface of the base substrate, and a circular (Fresnel) periodic structure. It may be a periodic structure. Referring to FIG. 5, the base substrate 200 has a two-dimensional periodic structure. On the surface of the base substrate 200, the plurality of groove portions 212 are arranged in two directions orthogonal to each other, that is, the convex portions 214 are arranged in two directions orthogonal to each other. The intersecting groove portions 212 in two directions are not limited to being orthogonal to each other, and may be oblique.
上記では、金属層１０６が銀で形成されている場合を説明したが、これに限定されない。金属層１０６が水溶液によって酸化され得る金属で形成されていれば、上記のように保護層１１０を形成することによって、金属層１０６を保護することができる。 Although the case where the metal layer 106 is made of silver has been described above, the present invention is not limited to this. If the metal layer 106 is formed of a metal that can be oxidized by an aqueous solution, the metal layer 106 can be protected by forming the protective layer 110 as described above.
以下に実験結果を示し、本発明の有効性を示す。 The experimental results are shown below to show the effectiveness of the present invention.
図１に示した構造のバイオチップ２種類と、従来の構造のチップ１種類とを作製した。ベース基板には光硬化性樹脂を用い、１方向に溝を有する、ピッチが５００ｎｍの周期構造を形成した。第１接着層１０４及び第２接着層１０８はＣｒで形成し、金属層１０６、保護層１１０、及び消光抑制層１１２はそれぞれＡｇ、ＺｎＯ、ＳｉＯ２で形成した。各チップの各層の膜厚を表１に示す。第３チップが保護層を形成していない従来の構造のチップである。 Two types of biochips having the structure shown in FIG. 1 and one type of chip having a conventional structure were produced. A photocurable resin was used for the base substrate, and a periodic structure having a groove in one direction and a pitch of 500 nm was formed. The first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 were made of Cr, and the metal layer 106, the protective layer 110, and the quenching suppression layer 112 were made of Ag, ZnO, and SiO 2 , respectively. Table 1 shows the film thickness of each layer of each chip. The third chip is a chip having a conventional structure in which a protective layer is not formed.
図６に示すように、上記の各チップの周期構造及び多層膜を形成した側の面３００上に、周期構造を形成した領域３０２を囲むように、シリコン製の側壁３０４を固定し、水溶液を保持するためのウェル（以下、シリコンウェルという）を設けた。このシリコンウェルによって、約５０〜７０μＬ（マイクロリットル）の水溶液を保持することができる。 As shown in FIG. 6, a silicon side wall 304 is fixed on the surface 300 on the side where the periodic structure of each chip and the multilayer film are formed so as to surround the region 302 where the periodic structure is formed. A well for holding (hereinafter referred to as a silicon well) was provided. The silicon well can hold an aqueous solution of about 50 to 70 μL (microliter).
第１〜第３チップのそれぞれを用いて、生活習慣病マーカ（ＩＬ−６）の抗原抗体反応を検出するために、下記のステップ１〜ステップ７の順でアッセイを行なった。 In order to detect the antigen-antibody reaction of the lifestyle-related disease marker (IL-6) using each of the first to third chips, the assay was performed in the following order of Step 1 to Step 7.
［アッセイの順序］
・ステップ１：チップのＳｉＯ２表面をシランカップリング剤によりアミノ基修飾する。
（１）２％シランカップリング剤（信越シリコーン社製、化学名：Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、製品番号：ＫＢＭ−６０３）を、チップ上に滴下し、４０℃で２時間インキュベーションを実行する。
（２）１％酢酸水溶液、及びＭＩＬＬＩ−Ｑ（登録商標）水（超純水）を順次用いてチップ上を洗浄し、６０℃で４時間インキュベーションを実行する。
・ステップ２：クロスリンカー（架橋剤）により抗体を固定し、シリコンウェルをチップ上に取付ける。
（１）２ｍＭ（ミリモラー、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌ）のＢＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ社製、製造番号２１５８６）又はＰＥＧリンカーをチップ上に注入し、２５℃で１０分間インキュベーションを実行する。
（２）ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で、チップ上を洗浄する。
・ステップ３：抗ＩＬ−６抗体を固定する。具体的には、１／２００希釈抗体をチップ上に注入し、２５℃で３０分間インキュベーションを実行する。
・ステップ４：ブロッキングを行なう。具体的には、６０μｇ／ｍＬの濃度のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液を、チップ上に注入し、２５℃で５分間インキュベーションした後、ＰＢＳ（燐酸緩衝液）で、チップ上をリンス（洗浄）する。
・ステップ５：抗原ＩＬ−６をチップ上に注入し、５分間インキュベーションを実行した後、ＰＢＳで、チップ上を洗浄する。
・ステップ６：ビオチンラベル抗体をチップ上に注入し、５分間インキュベーションを実行した後、ＰＢＳでチップ上を洗浄する。
・ステップ７：１０ｎＭ（ナノモラー）のＣｙ５−ストレプトアビジン（蛍光標識蛋白質）をチップ上に注入し、５分間インキュベーションを実行した後、ＰＢＳでチップ上を洗浄する。
[Assay Order]
Step 1: Amino group modification of the SiO 2 surface of the chip with a silane coupling agent.
(1) A 2% silane coupling agent (manufactured by Shin-Etsu Silicone Co., Ltd., chemical name: N-2- (aminoethyl) -3-aminopropyltriethoxysilane, product number: KBM-603) was dropped on the chip, Incubate for 2 hours at 40 ° C.
(2) The chip is washed sequentially with 1% aqueous acetic acid and MILLI-Q (registered trademark) water (ultra pure water), and incubated at 60 ° C. for 4 hours.
Step 2: Immobilize the antibody with a crosslinker (crosslinking agent) and attach a silicon well on the chip.
(1) 2 mM (millimol, 1M = 1 mol / L) of BS3 (Thermo, product number 21586) or PEG linker is injected onto the chip, and incubation is performed at 25 ° C. for 10 minutes.
(2) Wash the chip with MILLI-Q water.
Step 3: Immobilize anti-IL-6 antibody. Specifically, 1/200 diluted antibody is injected onto the chip and incubation is performed at 25 ° C. for 30 minutes.
Step 4: Blocking is performed. Specifically, a BSA (bovine serum albumin) solution having a concentration of 60 μg / mL is injected onto the chip, incubated at 25 ° C. for 5 minutes, and then rinsed (washed) with PBS (phosphate buffer). To do.
Step 5: Inject antigen IL-6 onto the chip, incubate for 5 minutes, and then wash the chip with PBS.
Step 6: Inject biotin-labeled antibody onto the chip, incubate for 5 minutes, and then wash the chip with PBS.
Step 7: Inject 10 nM (nanomolar) Cy5-streptavidin (fluorescently labeled protein) onto the chip, incubate for 5 minutes, and then wash the chip with PBS.
上記のマルチステップアッセイを行なった後の各チップを、チップ正面から撮影した写真を図７に示す。（ａ）は第１チップ、（ｂ）及び（ｃ）は第３チップの写真である。中央の円形部分が水溶液を注入して、マルチステップアッセイを実行したシリコンウェルである。写真（ａ）の第１チップでは、シリコンウェル内の周期構造部分に剥離も白濁も発生していない。写真（ｂ）の第３チップでは、剥離が発生しており、周期構造部分が白くなっている。写真（ｃ）の第３チップでは、周期構造部分が白濁して、周期構造領域３０２が判別できるようになっているが、これもミクロな剥離が始まっていると思われる。 The photograph which image | photographed each chip | tip after performing said multi-step assay from the chip | tip front is shown in FIG. (A) is a photograph of the first chip, and (b) and (c) are photographs of the third chip. The central circular portion is a silicon well in which an aqueous solution is injected and a multi-step assay is performed. In the first chip shown in photo (a), neither peeling nor white turbidity occurred in the periodic structure portion in the silicon well. In the 3rd chip | tip of a photograph (b), peeling has generate | occur | produced and the periodic structure part is white. In the third chip in the photo (c), the periodic structure portion becomes clouded, and the periodic structure region 302 can be discriminated. However, it seems that micro-peeling has started.
図８に示した配置で、表面プラズモン共鳴による増強蛍光をＣＣＤ３１６により撮像して得られた画像を図９に示す。図８では、Ｈｅ−Ｎｅレーザ（波長６３３ｎｍ）光源３１０からの光を、偏光器３１２によって偏光させた後、ミラー３１４で反射させ、レンズ３０６及び３０８を介して各チップ１００の背面から入射した。レーザ光の利用効率を上げるために、レンズ３０６及び３０８の焦点位置がそれぞれミラー３１４の反射点及びチップ１００（ベース基板１０２）の入射点と重なる光学配置をとっている。検出角度θｏｕｔ（ＣＣＤ３１６の配置方向）を３度とし、入射角度θをミラー３１４の傾きを調整して２０〜２６°の範囲で１度ずつ動かし、共鳴角付近の蛍光像を撮影した。なお、チップ１００の透過光が直接ＣＣＤ３１６に入射しないように、ＣＣＤ３１６は、チップ１００の法線に対して、レンズ３０６及び３０８と同じ側に配置されている。 FIG. 9 shows an image obtained by imaging enhanced fluorescence due to surface plasmon resonance with the CCD 316 in the arrangement shown in FIG. In FIG. 8, light from a He—Ne laser (wavelength 633 nm) light source 310 is polarized by a polarizer 312, reflected by a mirror 314, and incident from the back surface of each chip 100 via lenses 306 and 308. In order to increase the utilization efficiency of the laser light, an optical arrangement is adopted in which the focal positions of the lenses 306 and 308 overlap with the reflection point of the mirror 314 and the incident point of the chip 100 (base substrate 102), respectively. The detection angle θout (the arrangement direction of the CCD 316) was set to 3 degrees, the incident angle θ was moved by 1 degree in the range of 20 to 26 ° by adjusting the inclination of the mirror 314, and a fluorescent image near the resonance angle was photographed. The CCD 316 is arranged on the same side as the lenses 306 and 308 with respect to the normal of the chip 100 so that the transmitted light of the chip 100 does not directly enter the CCD 316.
図９において、（ａ）は第３チップ（保護層なし）の撮像結果であり、（ｂ）は第１チップの撮像結果である。（ａ）では、増強蛍光による円形の高輝度領域以外に、細かい高輝度部分が多数観察できる。細かい高輝度部分は、通常では観測されないものであり、チップ上の多層膜が剥離し、これにより乱反射されたレーザ光が観測されたものである。これに対して、（ｂ）では、増強蛍光による高輝度領域しか観察されない。このことから、ＺｎＯの保護層を形成した第２チップでは、金属層（Ａｇ）を十分に保護できたことが分かる。 In FIG. 9, (a) shows the imaging result of the third chip (without the protective layer), and (b) shows the imaging result of the first chip. In (a), many fine high-luminance portions can be observed in addition to the circular high-luminance region due to enhanced fluorescence. The fine high-brightness portion is not normally observed, and the multilayer film on the chip is peeled off, and thereby the irregularly reflected laser light is observed. On the other hand, in (b), only a high luminance region due to enhanced fluorescence is observed. From this, it is understood that the metal layer (Ag) was sufficiently protected in the second chip on which the protective layer of ZnO was formed.
図１０に示した配置で、チップ背面からの反射光を測定した結果を図１１に示す。図１０に示すように、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源３１０からの光を、シャッタ３１８、光チョッパ３２０、及び偏光器３１２を介して、チップ１００の背面に入射した。反射光の測定には、フォトダイオード３２４を使用した。図１１の横軸は、光の入射角度θｉｎ（＝反射光の検出角度θｒ）である。図１１において、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、第１〜第３チップに関する結果である。（ａ）及び（ｂ）では、グラフに大きな谷が生じており、表面プラズモン共鳴が発生していることが分かる。したがって、第１及び第２チップは、表面プラズモン共鳴による蛍光観測に使用可能である。一方、（ｃ）のグラフでは、反射率が０．１よりも小さく、平坦であって谷が生じていない。このことから、第３チップでは、上記したように白濁が生じていたので、レーザ光が散乱され、表面プラズモン共鳴が発生していないことが分かる。したがって、第３チップは表面プラズモン共鳴による蛍光観測には使用できない。 FIG. 11 shows the result of measuring the reflected light from the back surface of the chip with the arrangement shown in FIG. As shown in FIG. 10, the light from the He—Ne laser light source 310 is incident on the back surface of the chip 100 via the shutter 318, the optical chopper 320, and the polarizer 312. A photodiode 324 was used for the measurement of the reflected light. The horizontal axis in FIG. 11 is the incident angle θin of light (= detected angle θr of reflected light). In FIG. 11, (a) to (c) are the results relating to the first to third chips, respectively. In (a) and (b), it can be seen that a large valley is generated in the graph and surface plasmon resonance is generated. Therefore, the first and second chips can be used for fluorescence observation by surface plasmon resonance. On the other hand, in the graph of (c), the reflectance is smaller than 0.1, and it is flat and has no valleys. From this, it can be seen that in the third chip, the white turbidity was generated as described above, so that the laser light was scattered and no surface plasmon resonance was generated. Therefore, the third chip cannot be used for fluorescence observation by surface plasmon resonance.
図１０に示した配置で、表面プラズモン共鳴による増強蛍光の強度を測定した結果を図１２に示す。表面プラズモン共鳴による増強蛍光は、チップの正面（周期構造を有する面）から光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）３２２で測定した。入射角度θｉｎ（度）、検出角度θｏｕｔ（度）はそれぞれ、θｉｎ＝２３〜２４、θｏｕｔ＝０ とした。 FIG. 12 shows the result of measuring the intensity of enhanced fluorescence by surface plasmon resonance in the arrangement shown in FIG. Enhanced fluorescence due to surface plasmon resonance was measured with a photomultiplier 322 from the front surface (surface having a periodic structure) of the chip. The incident angle θin (degree) and the detection angle θout (degree) were set to θin = 23 to 24 and θout = 0, respectively.
図１２の縦軸は、蛍光強度（ｃｐｓ：１秒当たりの観測数）であり、横軸は抗原ＩＬ−６の濃度である。第１チップに関する測定値を丸でプロットし、第３チップに関する測定値を三角形でプロットしている。同じ濃度の抗原ＩＬ−６に関して、第１チップを用いて測定した蛍光強度は、第３チップを用いて測定された値よりも明らかに大きい。抗原ＩＬ−６の濃度が１００ｐｇ／ｍＬの場合、表面プラズモン共鳴が確認できた第１チップの蛍光強度は第３チップの蛍光強度の約１０倍であった。 The vertical axis in FIG. 12 is the fluorescence intensity (cps: number of observations per second), and the horizontal axis is the concentration of antigen IL-6. The measurement values for the first chip are plotted as circles, and the measurement values for the third chip are plotted as triangles. For the same concentration of antigen IL-6, the fluorescence intensity measured using the first chip is clearly greater than the value measured using the third chip. When the concentration of the antigen IL-6 was 100 pg / mL, the fluorescence intensity of the first chip in which surface plasmon resonance could be confirmed was about 10 times the fluorescence intensity of the third chip.
図１３は、保護層を形成したチップ、及び抗原ＩＬ−６を用いて、上記と同様のマルチステップアッセイを行ない測定した結果である。実験Ａ（測定値を丸で示す）及び実験Ｂ（測定値を三角形で示す）は、上記の第２及び第１チップを用いた結果である。実験Ｃ（測定値を四角形で示す）は、上記の第１チップと同じ構造、同じ膜厚で作製したチップであるが、第１チップとは作製日が異なるチップを用いた結果である。 FIG. 13 shows the results of measurement using a multi-step assay similar to that described above, using a chip having a protective layer and antigen IL-6. Experiment A (measured values are indicated by circles) and Experiment B (measured values are indicated by triangles) are results obtained using the second and first chips. Experiment C (measured values are indicated by squares) is a result of using a chip manufactured with the same structure and the same film thickness as the first chip, but having a different manufacturing date from the first chip.
図１３において、実験Ａ〜Ｃの測定結果がほぼ曲線に乗っていることから、本バイオチップを用いた測定の再現性が高いことが分かる。通常、抗原ＩＬ−６の濃度が高くなると観測される蛍光強度が高くなる（図１３からもこのことが分かる）。１０ｐｇ／ｍＬ以下の濃度のＩＬ−６を公知のＥＬＩＳＡキットなどを用いて酵素反応による蛍光を計測する場合には、露光時間は数時間単位になることが知られているが、図１３のグラフから、これらのチップであれば、抗原ＩＬ−６の濃度が１０ｐｇ／ｍＬ以下であっても、約１秒で測定できることが分かる。このことから、迅速計測が可能な本バイオチップが非常に有効であることが理解できる。 In FIG. 13, since the measurement results of Experiments A to C are almost on a curve, it can be seen that the reproducibility of the measurement using this biochip is high. Usually, when the concentration of the antigen IL-6 is increased, the observed fluorescence intensity is increased (this can also be seen from FIG. 13). In the case of measuring fluorescence due to an enzyme reaction with IL-6 having a concentration of 10 pg / mL or less using a known ELISA kit or the like, the exposure time is known to be in units of several hours, but the graph of FIG. From these results, it can be seen that these chips can be measured in about 1 second even if the concentration of the antigen IL-6 is 10 pg / mL or less. From this, it can be understood that this biochip capable of rapid measurement is very effective.
図１に示した構造のバイオチップ４種類を、それぞれ複数作製した。ベース基板には光硬化性樹脂を用い、１方向に溝を有する、ピッチが５００ｎｍの周期構造を形成した。金属層１０６、保護層１１０、及び消光抑制層１１２はそれぞれＡｇ、ＺｎＯ、及びＳｉＯ２で形成した。第１接着層１０４及び第２接着層１０８は、Ｃｒ又はＴｉで形成した。各チップの各層の材質及び膜厚を表１に示す。第１チップは、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成したチップである。第２〜第４チップは、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップである。第４チップでは、ＺｎＯの保護層を形成しなかった。 A plurality of four types of biochips having the structure shown in FIG. 1 were produced. A photocurable resin was used for the base substrate, and a periodic structure having a groove in one direction and a pitch of 500 nm was formed. Metal layer 106, protective layer 110 and the quenching suppressing layer 112, was formed Ag, ZnO, and of SiO 2 respectively. The first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 were made of Cr or Ti. Table 1 shows the material and film thickness of each layer of each chip. The first chip is a chip in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Cr. The second to fourth chips are chips in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Ti. In the fourth chip, no ZnO protective layer was formed.
実施例１と同様に、図６に示すようにシリコンウェルを設け、上記のステップ１〜ステップ７と同様のマルチステップのアッセイを行なった。但し、実施例１の場合よりも濃度の高いＢＳＡ溶液を使用した。具体的には、６ｍｇ／ｍＬの濃度のＢＳＡ溶液（市販のＥＬＩＳＡキットに含まれるＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈）を使用した。また、界面活性剤に対するチップの耐性を評価するために、界面活性剤を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）でチップを洗浄するマルチステップアッセイと、実施例１と同様に、界面活性剤を含まないＰＢＳでチップを洗浄するマルチステップアッセイとを実施した。 As in Example 1, a silicon well was provided as shown in FIG. 6, and a multi-step assay similar to Steps 1 to 7 was performed. However, a BSA solution having a higher concentration than that in Example 1 was used. Specifically, a BSA solution having a concentration of 6 mg / mL (diluted with Assay Diluent included in a commercially available ELISA kit) was used. Further, in order to evaluate the resistance of the chip to the surfactant, a multi-step assay in which the chip is washed with PBS containing a surfactant (containing 0.05% Tween 20), and the surfactant as in Example 1. A multi-step assay was performed in which the chip was washed with PBS without PBS.
マルチステップアッセイ後のチップを目視で確認した結果、界面活性剤を含まないＰＢＳでチップを洗浄するマルチステップアッセイにおいて、実施例１の場合よりもはるかに高濃度（約１００倍）のＢＳＡ溶液を使用したにもかかわらず、第１〜第４チップの何れも剥離しなかった。 As a result of visually confirming the chip after the multi-step assay, in the multi-step assay in which the chip was washed with PBS containing no surfactant, a BSA solution having a much higher concentration (about 100 times) than in the case of Example 1 was obtained. Despite the use, none of the first to fourth chips peeled off.
界面活性剤を含むＰＢＳで洗浄するマルチステップアッセイにおいては、第１チップにおいてのみ剥離が生じた。第２〜第４チップには、界面活性剤を含むＰＢＳで洗浄するマルチステップアッセイにおいても、剥離は生じなかった。但し、複数作製した第４チップの中には、明確な剥離は生じてはいないが、白濁が観察されたチップもあった。 In the multi-step assay where the detergent was washed with PBS, peeling occurred only on the first chip. No peeling occurred on the second to fourth chips even in the multi-step assay in which the detergent was washed with PBS containing a surfactant. However, among the produced fourth chips, there was a chip in which white turbidity was observed although no clear peeling occurred.
これらのことから、高濃度のＢＳＡ溶液及び界面活性剤に対してチップを保護するには、接着層をＴｉで形成し、ＺｎＯの保護層を形成することが最も好ましい。なお、接着層がＣｒで形成されていても、高濃度のＢＳＡ溶液に対して、チップを保護することができる。
For these reasons, in order to protect the chip against the high-concentration BSA solution and the surfactant, it is most preferable that the adhesive layer is formed of Ti and the protective layer of ZnO is formed. Even if the adhesive layer is made of Cr, the chip can be protected against a high-concentration BSA solution.
実施例１と同様に、図１０に示した配置で、チップ背面からの反射光を測定した結果を図１４及び図１５に示す。図１４及び図１５の横軸は、光の入射角度θｉｎ（＝反射光の検出角度θｒ）である。図１４は第１チップの条件で成膜した２枚のチップ（グラフＡ及びＢに対応）を用いた測定結果であり、図１５は第２チップの条件で成膜した２枚のチップ（グラフＡ及びＢに対応）を用いた測定結果である。図１４及び図１５のグラフＡ及びＢともに、高濃度ＢＳＡでのブロッキング処理をアッセイ過程に含み、界面活性剤を含むＰＢＳでチップを洗浄するマルチステップアッセイ後の測定結果である。 Similarly to Example 1, the results of measuring the reflected light from the back surface of the chip with the arrangement shown in FIG. 10 are shown in FIGS. The horizontal axis of FIGS. 14 and 15 represents the incident angle θin of light (= detected angle θr of reflected light). FIG. 14 shows measurement results using two chips (corresponding to graphs A and B) formed under the conditions of the first chip, and FIG. 15 shows two chips (graphs formed under the conditions of the second chip). (Corresponding to A and B). Both graphs A and B in FIGS. 14 and 15 are measurement results after a multi-step assay in which the blocking process with high-concentration BSA is included in the assay process and the chip is washed with PBS containing a surfactant.
図１４のグラフＡでは、グラフに大きな谷が生じており、反射率は下がっているものの、まだ表面プラズモン共鳴が発生していることが分かる。それに対して、グラフＢでは、反射率がほぼ０であり、表面プラズモン共鳴が発生していないことが分かる。これは、グラフＢを得た第１チップに剥離が生じたためである。グラフＡの反射率が低下しているので、グラフＡを得た第１チップにおいても、部分的にミクロな剥離が生じていると考えられる。 In the graph A of FIG. 14, it can be seen that a large valley is generated in the graph and the surface plasmon resonance is still generated although the reflectance is lowered. On the other hand, in the graph B, it can be seen that the reflectance is almost 0 and no surface plasmon resonance occurs. This is because peeling occurred in the first chip from which the graph B was obtained. Since the reflectance of the graph A is reduced, it is considered that even in the first chip obtained from the graph A, micro-peeling partially occurs.
図１５のグラフＡ及びグラフＢの何れも、グラフに大きな谷が生じており、表面プラズモン共鳴が発生していることが分かる。また、図１４のグラフＡでは、反射率は、入射角度が大きくなると減少する傾向にある（右下がりの破線の直線参照）が、図１５のグラフＡ及びグラフＢではそのような減少傾向は殆どない。即ち、図１５のグラフＡ及びグラフＢは、図１４のグラフＡと比較して反射率が保持されており、第２チップの方が第１チップよりも、表面プラズモン共鳴による蛍光観察に、より適したチップであると言える。 In both graph A and graph B in FIG. 15, it can be seen that a large valley occurs in the graph, and surface plasmon resonance occurs. Further, in the graph A of FIG. 14, the reflectance tends to decrease as the incident angle increases (see the straight line of the lower right broken line), but in the graph A and the graph B of FIG. Absent. That is, the reflectance of the graph A and the graph B in FIG. 15 is maintained as compared with the graph A in FIG. 14, and the second chip is more suitable for fluorescence observation by surface plasmon resonance than the first chip. It can be said that it is a suitable chip.
実施例３と同様に、金属層１０６、保護層１１０、及び消光抑制層１１２をそれぞれＡｇ、ＺｎＯ、及びＳｉＯ２で形成し、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉ又はＣｒで形成したチップを用いて、表面プラズモン共鳴による増強蛍光強度の評価を行なった。各層の膜厚は、実施例３と同様である。具体的には、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成したチップでは、第１接着層１０４、金属層１０６、第２接着層１０８、保護層１１０、及び消光抑制層１１２の膜厚はそれぞれ、１ｎｍ（Ｃｒ）、３９ｎｍ（Ａｇ）、１ｎｍ（Ｃｒ）、１６ｎｍ（ＺｎＯ）、２０ｎｍ（ＳｉＯ２）であった。第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップでは、第１接着層１０４、金属層１０６、第２接着層１０８、保護層１１０、及び消光抑制層１１２の膜厚はそれぞれ、０．２ｎｍ（Ｔｉ）、３９ｎｍ（Ａｇ）、０．４ｎｍ（Ｔｉ）、１６ｎｍ（ＺｎＯ）、２０ｎｍ（ＳｉＯ２）であった。 As in Example 3, forming a metal layer 106, Ag protective layer 110, and quenching suppressing layer 112, respectively, ZnO, and formed of SiO 2, the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 of Ti or Cr The enhanced fluorescence intensity by surface plasmon resonance was evaluated using the prepared chip. The thickness of each layer is the same as in Example 3. Specifically, in the chip in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Cr, the first adhesive layer 104, the metal layer 106, the second adhesive layer 108, the protective layer 110, and the quenching suppression layer 112 are included. The film thicknesses were 1 nm (Cr), 39 nm (Ag), 1 nm (Cr), 16 nm (ZnO), and 20 nm (SiO 2 ), respectively. In the chip in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Ti, the film thicknesses of the first adhesive layer 104, the metal layer 106, the second adhesive layer 108, the protective layer 110, and the quenching suppression layer 112 are respectively They were 0.2 nm (Ti), 39 nm (Ag), 0.4 nm (Ti), 16 nm (ZnO), and 20 nm (SiO 2 ).
実施したバイオアッセイは、抗原抗体反応を検出するためのアッセイではない。したがって、実施例１とは異なり、上記のステップ３〜６を含まない。また、上記のステップ１におけるアミノ基修飾には、ＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）を使用した。実施例１のステップ２では、抗体を固定するためにクロスリンカーを使用したが、ここでは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−Ｂｉｏｔｉｎによるビオチン修飾を行った。その後、ステップ７では、１００ｎＭのＣｙ５−ストレプトアビジンを注入した。 The bioassay performed is not an assay for detecting an antigen-antibody reaction. Therefore, unlike the first embodiment, the above steps 3 to 6 are not included. Further, APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) was used for the amino group modification in Step 1 above. In Step 2 of Example 1, a crosslinker was used to immobilize the antibody. Here, biotin modification with NHS-PEG-Biotin was performed. Thereafter, in step 7, 100 nM Cy5-streptavidin was injected.
バイオアッセイ後のチップを用いて、図１６に示した配置で、表面プラズモン共鳴による増強蛍光の強度を測定した結果を図１７及び図１８に示す。図１６における機器の構成及び配置は、図１０と同じである。図１０では、光電子増倍管３２２の位置を固定している（検出角度θｏｕｔ＝０（度））が、ここでは、光電子増倍管３２２を回転移動させ、即ち、チップ１００と光電子増倍管３２２との距離を一定に保ち、検出角度θｏｕｔ（度）を変化させて測定した。 FIG. 17 and FIG. 18 show the results of measuring the intensity of enhanced fluorescence due to surface plasmon resonance using the chip after bioassay with the arrangement shown in FIG. The configuration and arrangement of the devices in FIG. 16 are the same as those in FIG. In FIG. 10, the position of the photomultiplier tube 322 is fixed (detection angle θout = 0 (degrees)), but here, the photomultiplier tube 322 is rotated, that is, the chip 100 and the photomultiplier tube. Measurement was carried out by keeping the distance from 322 constant and changing the detection angle θout (degrees).
図１７及び図１８において、横軸は検出角度θｏｕｔ（度）であり、縦軸は蛍光強度（ｃｐｓ）である。図１７は、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップの測定結果である。図１８は、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成したチップの測定結果である。図１７における２本のグラフは、Ｃｙ５−ストレプトアビジンをインキュベーションした後と、これをＴｗｅｅｎ入りＰＢＳで洗浄した後のチップの測定結果を表している。下側のグラフがＴｗｅｅｎ入りＰＢＳでの洗浄後の結果である。図１８の２本のグラフの意味も同様である。 17 and 18, the horizontal axis represents the detection angle θout (degrees), and the vertical axis represents the fluorescence intensity (cps). FIG. 17 shows measurement results of a chip in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Ti. FIG. 18 shows a measurement result of a chip in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Cr. The two graphs in FIG. 17 represent the measurement results of the chip after incubation with Cy5-streptavidin and after washing with PBS containing Tween. The lower graph is the result after washing with PBS containing Tween. The meanings of the two graphs in FIG. 18 are the same.
図１７及び図１８のグラフから分かるように、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップの方が、蛍光強度が大きい。それぞれのグラフのピーク位置における、共鳴角度（θｉｎ）は、図１７では８．５度、図１８では９度であった。リバースカップリング角（θｏｕｔ）は、図１７では１２度、図１８では１１度であった。平均蛍光強度は、図１７では６．９×１０８ｃｐｓ、図１８では３．１８×１０８ｃｐｓであった。 As can be seen from the graphs of FIGS. 17 and 18, the chip in which the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Ti has higher fluorescence intensity. The resonance angle (θin) at the peak position of each graph was 8.5 degrees in FIG. 17 and 9 degrees in FIG. The reverse coupling angle (θout) was 12 degrees in FIG. 17 and 11 degrees in FIG. The average fluorescence intensity was 6.9 × 10 8 cps in FIG. 17 and 3.18 × 10 8 cps in FIG.
このように、バイオチップにおいて、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成することにより、界面活性剤への耐性を向上させることができることに加えて、蛍光強度を、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成した場合と比較して、２倍以上に増大させることができる。これは、プラズモン生成の抑制原因となり得る第１接着層１０４及び第２接着層１０８を、より薄く形成することができるからである。 As described above, in the biochip, by forming the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 with Ti, resistance to the surfactant can be improved, and in addition, the fluorescence intensity can be increased by the first adhesive layer. Compared with the case where the layer 104 and the second adhesive layer 108 are formed of Cr, the thickness can be increased by a factor of two or more. This is because the first adhesive layer 104 and the second adhesive layer 108 that can cause plasmon generation can be formed thinner.
上記の実施例では、本発明のバイオチップをイムノアッセイ（免疫測定法）において使用した実験例を示したが、これに限定されない。本発明のバイオチップは、広く生物的反応を分析・評価するためのバイオアッセイにおいて有効である。 In the above-described examples, experimental examples in which the biochip of the present invention is used in an immunoassay (immunoassay) are shown, but the present invention is not limited to this. The biochip of the present invention is effective in bioassays for analyzing and evaluating biological reactions widely.
以上、実施の形態を説明することにより本発明を説明したが、上記した実施の形態は例示であって、本発明は上記した実施の形態に限定されるものではなく、種々変更して実施することができる。 The present invention has been described above by describing the embodiment. However, the above-described embodiment is an exemplification, and the present invention is not limited to the above-described embodiment, and is implemented with various modifications. be able to.
１００ バイオチップ
１０２ ベース基板
１０４ 第１接着層
１０６ 金属層
１０８ 第２接着層
１１０ 保護層
１１２ 消光抑制層
100 Biochip 102 Base substrate 104 First adhesive layer 106 Metal layer 108 Second adhesive layer 110 Protective layer 112 Quenching suppression layer
Claims (11)
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、
前記金属層の上に、第２の接着層を間に挟んで形成された保護層と、
前記保護層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層は、表面プラズモン共鳴光を発生し且つ水溶液中で酸化され得る金属で形成され、
前記保護層は、酸化亜鉛又は酸化チタンで形成され、
前記消光抑制層は、二酸化ケイ素で形成され、
前記金属層に光が入射されることにより、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生し、
発生した前記電場を前記蛍光分子の励起場として増強蛍光を出力することを特徴とするバイオチップ。 A biochip used to detect an antigen-antibody reaction using a fluorescent molecule,
A base substrate having a periodic structure on the surface;
On the periodic structure, a metal layer formed directly or with the first adhesive layer interposed therebetween,
A protective layer formed on the metal layer with a second adhesive layer interposed therebetween;
A quenching suppression layer formed on the protective layer,
The metal layer is formed of a metal that generates surface plasmon resonance light and can be oxidized in an aqueous solution,
The protective layer is formed of zinc oxide or titanium oxide,
The quenching suppression layer is formed of silicon dioxide,
When light is incident on the metal layer, an electric field enhanced by surface plasmon resonance light is generated,
A biochip that outputs enhanced fluorescence using the generated electric field as an excitation field of the fluorescent molecule.
前記消光抑制層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。 The protective layer has a thickness of 5 nm to 50 nm,
The biochip according to claim 1, wherein the thickness of the quenching suppression layer is 5 nm or more and 50 nm or less.
前記保護層は、厚さ５ｎｍ以上３０ｎｍ以下の酸化亜鉛であることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。 The metal layer is formed of silver;
The biochip according to claim 1 or 2, wherein the protective layer is zinc oxide having a thickness of 5 nm to 30 nm.
バイオアッセイ用薬剤と、
蛍光分子とを含み、
表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用されることを特徴とするバイオアッセイ用キット。 A base substrate having a periodic structure on the surface; a metal layer formed directly on the periodic structure with the first adhesive layer sandwiched therebetween; and a second adhesive layer on the metal layer. A chip having a protective layer formed of zinc oxide or titanium oxide sandwiched between and a quenching suppression layer formed of silicon dioxide on the protective layer;
A bioassay drug;
Including fluorescent molecules,
Kits for bioassay, characterized in that it is used for the detection of the front surface plasmon excitation enhanced fluorescence.
特定の抗原に結合する抗体と、
前記チップの表面をアミノ基修飾するためのシランカップリング剤と、
前記抗体を前記チップに対して固定するための架橋剤とを含み、
前記蛍光分子は、前記抗原又は前記抗体に、直接又は媒介分子を介して結合される分子であることを特徴とする請求項８に記載のバイオアッセイ用キット。 The bioassay agent is:
An antibody that binds to a specific antigen;
A silane coupling agent for modifying the surface of the chip with an amino group;
A crosslinking agent for immobilizing the antibody to the chip,
The fluorescent molecule is the antigen or the antibody, biological assay kit according to claim 8, wherein the Ru Ah with molecules bound directly or through an intermediary molecule.
前記チップの前記周期構造を有する側の面に、バイオアッセイ用薬剤及び蛍光分子を注入する第１ステップと、
前記第１ステップが実行された後の前記チップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を前記蛍光分子の励起場として用いて増強蛍光を検出する第２ステップとを含むことを特徴とするバイオアッセイ方法。 A base substrate having a periodic structure on the surface; a metal layer formed directly on the periodic structure with the first adhesive layer sandwiched therebetween; and a second adhesive layer on the metal layer. A method for detecting an antigen-antibody reaction using a chip having a protective layer formed of zinc oxide or titanium oxide sandwiched between and a quenching suppression layer formed of silicon dioxide on the protective layer,
A first step of injecting a bioassay agent and a fluorescent molecule into the surface of the chip having the periodic structure;
After the first step is executed, light is incident on the chip to generate an electric field enhanced by surface plasmon resonance light, and the generated electric field is used as an excitation field of the fluorescent molecule to detect enhanced fluorescence. And a second step. A bioassay method comprising:
前記消光抑制層の表面に前記シランカップリング剤を注入して前記消光抑制層の表面をアミノ基修飾するステップと、
アミノ基修飾された前記消光抑制層の表面に架橋剤を注入した後、特定の抗原に対する抗体を注入して、前記抗体を前記チップに対して固定するステップと、
前記抗体が固定された前記チップの表面に前記抗原を注入した後、前記抗原又は前記抗体に、直接又は媒介分子を介して結合する蛍光分子を注入するステップとを含むことを特徴とする請求項１０に記載のバイオアッセイ方法。 The first step includes
Injecting the silane coupling agent onto the surface of the quenching suppression layer to modify the surface of the quenching suppression layer with an amino group;
After injecting a crosslinking agent on the surface of the quenching suppression layer modified with an amino group, injecting an antibody against a specific antigen, and fixing the antibody to the chip;
Injecting the antigen onto the surface of the chip on which the antibody is immobilized, and then injecting the antigen or the antibody with a fluorescent molecule that binds directly or via a mediator molecule. The bioassay method according to 10.
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