JP2014081385A - Microplate having periodic structure, surface plasmon excitation enhanced fluorescence microscope or fluorescence microplate reader using the same, and detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下ＳＰＲとも記す）によって発生する表面プラズモン共鳴光により、蛍光物質を励起して蛍光を発生させる表面プラズモン励起増強蛍光（Surface Plasmon Fluorescence）を用いた高感度蛍光顕微鏡およびマイクロプレートリーダーに関する。 The present invention uses surface plasmon excitation enhanced fluorescence (Surface Plasmon Fluorescence) that excites a fluorescent substance to generate fluorescence by surface plasmon resonance light generated by surface plasmon resonance (hereinafter also referred to as SPR). The present invention relates to a sensitive fluorescence microscope and a microplate reader.
汎用のエピ蛍光（落射蛍光）顕微鏡を用いて試料の蛍光観察を行う場合、暗くて十分に見えないときや、バックグラウンドが非常に高くて（明るくて）試料が十分に見えないときには、より高感度でＳ／Ｎの高い測定が必要とされる。これまでは全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）や、高分解能を特徴とする共焦点顕微鏡を用いて観測されてきた。 When performing fluorescence observation of a sample using a general-purpose epifluorescence (epi-illumination) microscope, it is higher when the sample is dark and not sufficiently visible, or when the background is very high (bright) and the sample is not sufficiently visible. Measurement with high sensitivity and S / N is required. Until now, it has been observed using a total reflection fluorescence microscope (TIRF) and a confocal microscope characterized by high resolution.
一方、表面プラズモン共鳴顕微鏡に関して、種々の論文や特許出願（下記特許文献１〜５参照）がなされており、装置として市販もされている。しかし、特許文献１〜５に開示されている基本光学系を応用して、蛍光顕微鏡であるＳＰＦＭ（Surface Plasmon Fluorescence Microscopy）を実現することは現状では不可能である。その理由は、市販の表面プラズモン共鳴顕微鏡では、入射光学系に高屈折率対物レンズを用いており、この対物レンズの屈折率の制限によって使用可能な光の波長が近赤外領域に制限されることになり、一般的な蛍光分子の励起光として用いることができないからである。 On the other hand, regarding the surface plasmon resonance microscope, various papers and patent applications (see Patent Documents 1 to 5 below) have been made, and are commercially available as devices. However, at present, it is impossible to realize SPFM (Surface Plasmon Fluorescence Microscopy) which is a fluorescence microscope by applying the basic optical systems disclosed in Patent Documents 1 to 5. The reason is that a commercially available surface plasmon resonance microscope uses a high refractive index objective lens for the incident optical system, and the wavelength of light that can be used is limited to the near infrared region by limiting the refractive index of the objective lens. This is because it cannot be used as excitation light for general fluorescent molecules.
これに対し、下記特許文献６、７には、プリズムを用いた光学系をもつ表面プラズモン共鳴顕微鏡からＳＰＦＭへの展開が開示されている。 On the other hand, the following Patent Documents 6 and 7 disclose development from a surface plasmon resonance microscope having an optical system using a prism to SPFM.
上記したように、高感度・高分解能蛍光検出が可能な顕微鏡として、全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡があるが、高出力レーザー等を装備していることが多く、光学系が複雑なシステムであり、そのため操作が複雑であり、且つ高価格であるという問題がある。 As mentioned above, there are total reflection microscopes and confocal microscopes as microscopes that can detect fluorescence with high sensitivity and high resolution, but they are often equipped with high-power lasers, etc. Therefore, there is a problem that the operation is complicated and the price is high.
上記した特許文献６、７に開示されたＳＰＦＭに関しても、図１０に示すクレッチマン型の配置を採用しているために光学系が複雑であり、操作が複雑である問題がある。 The SPFMs disclosed in Patent Documents 6 and 7 described above also have a problem that the optical system is complicated and the operation is complicated because the Kretschmann type arrangement shown in FIG. 10 is adopted.
一方、蛍光を観測するための別の装置として、マイクロプレートリーダーがある。従来のマイクロプレートリーダーで蛍光検出する場合、十分な強度の蛍光を発生させるためには、高濃度でかつ微量とは言えない程度の試料を準備する必要がある問題がある。 On the other hand, there is a microplate reader as another apparatus for observing fluorescence. In the case of detecting fluorescence with a conventional microplate reader, there is a problem that it is necessary to prepare a sample having a high concentration and not a very small amount in order to generate fluorescence with sufficient intensity.
本発明は、上記の課題を解決すべく、単純な光学系を採用し操作が簡便であり、且つ低価格の高感度な蛍光検出を実現する表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a surface plasmon excitation enhanced fluorescence microscope that adopts a simple optical system, is easy to operate, and realizes low-cost, highly sensitive fluorescence detection in order to solve the above-described problems. To do.
また本発明は、既存の蛍光マイクロプレートリーダーよりも高感度な表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーを提供することも目的とする。 Another object of the present invention is to provide a surface plasmon excitation enhanced fluorescent microplate reader that is more sensitive than existing fluorescent microplate readers.
本願発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、周期構造上に金属および保護膜を調製した基板で発生した表面プラズモンを利用することによって、プリズムを使用しない高感度の蛍光顕微鏡および蛍光マイクロプレートリーダーを実現できることを見出した。 As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventor has made use of surface plasmons generated on a substrate in which a metal and a protective film are prepared on a periodic structure, thereby making it possible to use a highly sensitive fluorescence microscope that does not use a prism. And found that a fluorescent microplate reader can be realized.
即ち、本発明に係るマイクロプレートは、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートであって、表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。 That is, the microplate according to the present invention is a microplate that is used in a fluorescence microscope or a fluorescence microplate reader, is equipped with a sample to be observed, and detects enhanced fluorescence due to surface plasmon excitation. A plurality of grooves each including a base substrate having a structure, a metal layer formed on the periodic structure, and a protective layer formed on the metal layer, wherein the periodic structure is formed along one direction. The metal layer has a slope on the surface, the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation type surface plasmon resonance light, incident light from the protective layer side of the microplate, Generating an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light, and using the generated electric field as an excitation field of a fluorescent molecule, Detecting from either the substrate side or the protective layer side, the enhanced fluorescence from the microplate is detected and the incident direction of the light incident from the protective layer side, and the protection The angle formed by the perpendicular of the plane on which the light is incident is an angle at which the light can be incident on the microplate without the light being bent by the bending means, and the surface plasmon resonance light is generated. It is characterized by a small angle.
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。 Further, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be in the range of 10 degrees to 25 degrees.
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であることができる。 In addition, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be within a range of 15 degrees to 20 degrees.
また、前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上８００ｎｍ以下であることができる。 The period of the periodic structure may be 10 nm or more and 800 nm or less.
また、前記周期構造は、前記一方向と交差する方向に沿って形成された複数の溝部をさらに備えることができる。 The periodic structure may further include a plurality of grooves formed along a direction intersecting the one direction.
また、前記保護層の厚さは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることができる。 The protective layer may have a thickness of 10 nm to 100 nm.
また、前記金属層は、遷移金属の膜厚１０〜５００ｎｍの薄膜で形成されていることができる。 The metal layer may be formed of a transition metal film having a thickness of 10 to 500 nm.
また、前記ベース基板と前記金属層との間、および前記金属層と前記保護層との間に、それぞれ第１の接着保護層および第２の接着保護層をさらに備え、前記第１の接着保護層および第２接着保護層のそれぞれが膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜で形成されていることができる。 The first adhesion protection layer further includes a first adhesion protection layer and a second adhesion protection layer between the base substrate and the metal layer and between the metal layer and the protection layer, respectively. Each of the layer and the second adhesion protective layer can be formed of a thin film having a thickness of 0.1 to 3 nm.
また、前記金属層は銀で形成され、前記保護層はＳｉＯ2で形成されることができる。 The metal layer is formed of silver, the protective layer may be formed by SiO 2.
また、前記金属層が銀で形成される場合、前記保護層の厚さは２０〜５０ｎｍであることができる。 In addition, when the metal layer is formed of silver, the protective layer may have a thickness of 20 to 50 nm.
また、前記金属層が金で形成され、前記保護層の厚さが４０〜７０ｎｍであってもよい。 The metal layer may be formed of gold, and the protective layer may have a thickness of 40 to 70 nm.
また、前記ベース基板の表面の前記周期構造は、矩形の周期構造であり、前記金属層は、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
１５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
であることが望ましい。
Further, the periodic structure on the surface of the base substrate is a rectangular periodic structure, and the metal layer has the slope on the surface corresponding to the rectangular step portion, and is formed to a thickness of 200 nm,
The ratio of the length of the slope to the period is 10 ± 5%;
The depth of the groove is dnm, and the ratio of the peak length to the period is M%.
5 ≦ d <15, and 0 <M <70, or 70 <M <100,
15 ≦ d <25 and 0 <M <80, or 80 <M <100,
25 ≦ d <35 and 0 <M <60, or 60 <M <100, or
35 ≦ d <45 and 0 <M <60, or 60 <M <100
It is desirable that
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡は、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートを有する蛍光顕微鏡であって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記蛍光顕微鏡が、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。 A surface plasmon excitation enhanced fluorescence microscope according to the present invention is a fluorescence microscope having a microplate for loading a sample to be observed and detecting enhanced fluorescence by surface plasmon excitation, wherein the microplate has a period on the surface. A base substrate having a structure; a metal layer formed on the periodic structure of the base substrate; and a protective layer formed on the metal layer, wherein the periodic structure is formed along one direction. A plurality of grooves, wherein the metal layer has a slope on the surface, the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation surface plasmon resonance light, and the fluorescence microscope is configured to protect the microplate. Injecting light from the layer side to generate an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light, and using the generated electric field as an excitation field of fluorescent molecules, Detecting the enhanced fluorescence from the microplate by a method including detecting the enhanced fluorescence from either the base substrate side or the protective layer side, and entering the light incident from the protective layer side The angle formed by the direction and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident is an angle at which the light can be incident on the microplate without being bent by a bending means, and the surface plasmon The angle is small enough to generate resonance light.
ここで、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。 Here, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be in the range of 10 degrees to 25 degrees.
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であってもよい。 Further, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be within a range of 15 degrees to 20 degrees.
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーは、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートを有する蛍光マイクロプレートリーダーであって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記蛍光マイクロプレートリーダーが、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。 A surface plasmon excitation enhanced fluorescence microplate reader according to the present invention is a fluorescence microplate reader having a microplate for mounting a sample to be observed and detecting enhanced fluorescence due to surface plasmon excitation, A base substrate having a periodic structure on the surface, a metal layer formed on the periodic structure of the base substrate, and a protective layer formed on the metal layer, wherein the periodic structure is unidirectional A plurality of grooves formed along the metal layer, the metal layer has a slope on the surface, the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation-type surface plasmon resonance light, and the fluorescent microplate reader comprises: A step in which light is incident from the protective layer side of the microplate to generate an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light. And detecting the enhanced fluorescence from either the base substrate side or the protective layer side using the generated electric field as an excitation field of a fluorescent molecule, The angle formed between the incident direction of the light incident from the protective layer side that detects fluorescence and the perpendicular of the plane of the protective layer on which the light is incident is not required to be bent by the bending means. The angle is such that the light can be incident on the microplate, and the angle is small enough to generate the surface plasmon resonance light.
ここで、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。 Here, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be in the range of 10 degrees to 25 degrees.
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であってもよい。 Further, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be within a range of 15 degrees to 20 degrees.
本発明に係る検出方法は、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、マイクロプレートを用いて、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出する方法であって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記方法が、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含み、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。 A detection method according to the present invention is a method for detecting enhanced fluorescence by surface plasmon excitation using a microplate in a fluorescence microscope or a fluorescence microplate reader, wherein the microplate has a periodic structure on the surface. And a metal layer formed on the periodic structure, and a protective layer formed on the metal layer, and the plurality of grooves in which the periodic structure is formed along one direction. The layer has a slope on the surface, the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation type surface plasmon resonance light, and the method is configured such that light is incident from the protective layer side of the microplate, Generating an electric field enhanced by surface plasmon resonance light, and using the generated electric field as an excitation field of a fluorescent molecule, Detecting from either the plate side or the protective layer side, and an angle formed by an incident direction of the light incident from the protective layer side and a perpendicular of a plane on which the light of the protective layer is incident However, the angle is such that the light can be incident on the microplate without being bent by the bending means, and the angle is small enough to generate the surface plasmon resonance light.
ここで、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。 Here, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be in the range of 10 degrees to 25 degrees.
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であってもよい。 Further, the angle formed by the incident direction of the light and the perpendicular of the plane on which the light of the protective layer is incident may be within a range of 15 degrees to 20 degrees.
本発明によれば、クレッチマン型のようにプリズムを使用することなく、光の入射角度を小さくすることができるので、従来の落射照明を採用した蛍光顕微鏡を使用することができる。従って、操作が簡単であり、ＮＡの小さい対物レンズを使用することができ、明るい蛍光観測が可能である。 According to the present invention, since the incident angle of light can be reduced without using a prism as in the Kretschmann type, a conventional fluorescence microscope employing epi-illumination can be used. Therefore, the operation is simple, an objective lens having a small NA can be used, and bright fluorescence observation is possible.
また、蛍光観察において空間選択性を高くすること、即ち、マイクロプレート界面だけ（マイクロプレート表面から２００ｎｍ未満の範囲）を観測することができるので、エピ蛍光顕微鏡に比べてバックグラウンドによるノイズの影響をほとんど受けない。 In addition, it is possible to increase the spatial selectivity in fluorescence observation, that is, to observe only the microplate interface (range less than 200 nm from the microplate surface). I hardly receive it.
また、マイクロプレート界面の表面プラズモン共鳴光は入射光強度の１００倍以上に増強されるので、高出力のレーザーを用いる必要がなく、ランプ光源でも既存のエピ蛍光顕微鏡よりも１００倍程度明るい蛍光を観測することができる。 In addition, since the surface plasmon resonance light at the microplate interface is enhanced to 100 times or more of the incident light intensity, it is not necessary to use a high-power laser, and even a lamp light source emits fluorescence about 100 times brighter than the existing epifluorescence microscope. It can be observed.
また、ランプ光源を用いることで、適当な光学フィルターを選択することで広範囲に波長選択可能になるので、レーザーを装備した顕微鏡に比べてコンパクトであり、低価格である。 In addition, by using a lamp light source, it becomes possible to select a wavelength in a wide range by selecting an appropriate optical filter, so that it is more compact and less expensive than a microscope equipped with a laser.
従来の全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡では、高出力レーザー等を装備していることが多く、また、光学系が複雑なシステムであり、操作の複雑性と高価格が問題となり、一般に広く普及することが難しい状況であったが、本発明によると、これらの問題を解決することができるので、汎用型の高感度蛍光顕微鏡として普及することが期待できる。特に、蛍光標識を行って試料を観測する医療・生物分野の普及に大きく貢献することが期待できる。 Conventional total reflection microscopes or confocal microscopes are often equipped with high-power lasers, etc., and the optical system is complicated, so the complexity of operation and high cost are problems, and it is widely spread. However, according to the present invention, these problems can be solved, so that it can be expected to spread as a general-purpose high-sensitivity fluorescent microscope. In particular, it can be expected to greatly contribute to the spread of the medical / biological field in which samples are observed by fluorescent labeling.
また、本発明を蛍光マイクロプレートリーダーに適用した場合、蛍光の増幅が期待できるため、既存のマイクロプレートリーダーでも、低濃度試料や微量試料の測定が可能となる。 In addition, when the present invention is applied to a fluorescent microplate reader, amplification of fluorescence can be expected. Therefore, it is possible to measure a low-concentration sample or a trace amount sample using an existing microplate reader.
以下に、添付の図面を参照して本発明の実施の形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
図１は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（以下、ＳＰＦＭとも記す）の構成を示すステージ付近の部分図である。下側の図は、上側の図の一部を拡大して示す断面図である。 FIG. 1 is a partial view of the vicinity of a stage showing the configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence microscope (hereinafter also referred to as SPFM) according to an embodiment of the present invention. The lower drawing is a cross-sectional view showing an enlarged portion of the upper drawing.
図１に示したように、本実施の形態に係るＳＰＦＭ１は、本体２と、ステージ３の上に搭載されるマイクロプレート４とを備えている。図１の下側の図は、マイクロプレート４の上に試料Ａが搭載され、光Ｌが入射している状態を示している。 As shown in FIG. 1, the SPFM 1 according to the present embodiment includes a main body 2 and a microplate 4 mounted on the stage 3. The lower diagram in FIG. 1 shows a state in which the sample A is mounted on the microplate 4 and the light L is incident.
本ＳＰＦＭ１は、マイクロプレート４に特徴を有し、それ以外の蛍光顕微鏡として機能する上で必要な、本体２の構成要素は従来の蛍光顕微鏡と同じである。即ち、本体２の構成要素である光源、対物レンズ、接眼レンズ、干渉ミラー（ダイクロイックミラー）、干渉フィルター（励起フィルター）、蛍光フィルターなどは、公知の落射照明の蛍光顕微鏡と同じものを使用する。従って、それらに関する説明を省略する。 The SPFM 1 is characterized by the microplate 4 and the components of the main body 2 necessary for functioning as the other fluorescence microscope are the same as those of the conventional fluorescence microscope. That is, the light source, the objective lens, the eyepiece lens, the interference mirror (dichroic mirror), the interference filter (excitation filter), the fluorescence filter, and the like, which are constituent elements of the main body 2, are the same as those of a known epi-illumination fluorescence microscope. Therefore, the description regarding them is omitted.
図２は、本実施の形態に係るマイクロプレート４の構成を示す断面図である。マイクロプレート４は、ベース基板５と、ベース基板５の表面に形成された金属層６および保護層７とを備えて構成されている。 FIG. 2 is a cross-sectional view showing the configuration of the microplate 4 according to the present embodiment. The microplate 4 includes a base substrate 5 and a metal layer 6 and a protective layer 7 formed on the surface of the base substrate 5.
ベース基板５は、表面に周期的構造である格子が形成され、観測光に対して透明なガラス、プラスチックなどで形成されている。周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状であり、溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。周期構造の周期、即ち隣接する溝の間隔は、観察に使用する波長以下、例えば１０〜８００ｎｍ（ナノメートル）であり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比は０．００５〜１０である。 The base substrate 5 has a lattice having a periodic structure formed on the surface thereof, and is formed of glass, plastic, or the like that is transparent to the observation light. The periodic structure has, for example, a shape having a plurality of grooves arranged at approximately equal intervals along one direction, and the grooves are, for example, sawtooth grooves, sinusoidal grooves, and rectangular grooves. The period of the periodic structure, that is, the interval between adjacent grooves is not more than the wavelength used for observation, for example, 10 to 800 nm (nanometers), preferably 100 to 600 nm. The periodic structure has a height (groove depth) of 4 to 400 nm and an aspect ratio of 0.005 to 10.
なお、ナノスケールの周期構造をもつ周期構造は、例えば、特許第３３５０７１１号公報、特許第２８３２３３７号公報、特開２００４−１１７８１０号公報などに開示されている方法を使用して形成することができる。 The periodic structure having a nanoscale periodic structure can be formed using, for example, a method disclosed in Japanese Patent No. 3350711, Japanese Patent No. 2832337, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-117810, and the like. .
金属層６は、金、銀、銅、プラチナ、ニッケルなどの遷移金属であることが好ましく、膜厚は１０〜５００ｎｍであることが好ましい。しかし、遷移金属に限定されず、表面プラズモンを発生可能な金属であればよく、その場合にも膜厚は１０〜５００ｎｍであることが好ましい。 The metal layer 6 is preferably a transition metal such as gold, silver, copper, platinum, nickel, and the film thickness is preferably 10 to 500 nm. However, the metal is not limited to a transition metal, and any metal that can generate surface plasmons may be used. In this case, the film thickness is preferably 10 to 500 nm.
保護層７には、ポリカーボネートやポリメタクリル酸メチルのような有機高分子やシリカ（ＳｉＯ2）など、観察に用いる入射光や発生する蛍光の波長領域で吸収のない（若しくは吸収の少ない）透明な薄膜を用いる。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。従って、試料を金属層６から所定距離だけ離隔させることが必要である。そのために、保護層７の膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層６の種類に応じて決定される。たとえば、膜厚の最適値は、金属層６が銀の場合２０〜５０ｎｍ、金の場合４０〜７０ｎｍである。 The protective layer 7 is transparent such as an organic polymer such as polycarbonate or polymethyl methacrylate, silica (SiO 2 ), or the like that has no absorption (or little absorption) in the wavelength range of incident light used for observation or generated fluorescence. A thin film is used. With enhanced fluorescence, which is a feature of the surface plasmon excitation enhanced fluorescence method, when the distance between the fluorescent molecule and the metal is short, the fluorescence excited by a strong excitation field is also transferred to the metal surface and quenched. Therefore, it is necessary to separate the sample from the metal layer 6 by a predetermined distance. Therefore, the thickness of the protective layer 7 is determined in accordance with the type of the metal layer 6 in the range of about 10 nm to 100 nm. For example, the optimum value of the film thickness is 20 to 50 nm when the metal layer 6 is silver and 40 to 70 nm when gold.
試料を含む水溶液（燐酸緩衝液など）をマイクロプレート４上に搭載して観測する場合が想定される。従って、金属層６に銀を使用する場合には、水中で非常に不安定な銀を保護するために、ベース基板５と銀との間および銀と保護層７（例えば、ＳｉＯ2）との間にさらに、それぞれ第１の接着保護層および第２の接着保護層を形成することが望ましい。例えば、第１および第２の接着保護層は、それぞれ膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜として形成される。第２の接着保護層は、銀を保護できる材質の層であればよく、例えばクロム（Ｃｒ）、アルミニウム、チタン、パラジウムで形成される。なお、第２の接着保護層は保護層７の接着性を高める役割をもする材質が望ましく、この意味でもクロム（Ｃｒ）が適している。 It is assumed that an aqueous solution containing a sample (such as a phosphate buffer) is mounted on the microplate 4 for observation. Therefore, when silver is used for the metal layer 6, in order to protect silver which is very unstable in water, between the base substrate 5 and silver and between the silver and the protective layer 7 (for example, SiO 2 ). Further, it is desirable to form a first adhesive protective layer and a second adhesive protective layer respectively in between. For example, the first and second adhesion protective layers are each formed as a thin film having a thickness of 0.1 to 3 nm. The second adhesion protective layer may be a layer made of a material that can protect silver, and is formed of, for example, chromium (Cr), aluminum, titanium, or palladium. The second adhesive protective layer is preferably made of a material that also serves to enhance the adhesiveness of the protective layer 7, and in this sense, chromium (Cr) is suitable.
次に、図３を参照して、入射光の偏光方向と周期構造の方向との関係について説明する。表面プラズモン共鳴光の発生には、ｐ偏光の光が必要である。また、周期構造の配置との関係では、ｐ偏光が、周期構造の方向（格子の溝に垂直な方向）の成分を含んでいることが必要である。 Next, the relationship between the polarization direction of incident light and the direction of the periodic structure will be described with reference to FIG. Generation of surface plasmon resonance light requires p-polarized light. Further, in relation to the arrangement of the periodic structure, it is necessary that the p-polarized light includes a component in the direction of the periodic structure (direction perpendicular to the grooves of the grating).
図３の（ａ）は、マイクロプレート４に光が入射する状態を示す斜視図であり、（ｂ）はその平面図である。平面Ｕ１、Ｕ２は、マイクロプレート４の表面に垂直であり、且つマイクロプレート４表面に形成された格子８の方向（格子の溝に垂直な方向）Ｖ１と平行な平面Ｕ１と、それに直交する平面Ｕ２である。入射光Ｌ１、Ｌ２は、光源から出力され、対物レンズによって円錐形に集光されてマイクロプレート４に入射する光のうち、それぞれ平面Ｕ１内、Ｕ２内を進行する光である。ここで、入射光Ｌ１、Ｌ２は、偏光フィルターなどによる偏光を受けていない光であるとする。従って、マイクロプレート４に対する入射光Ｌ１、Ｌ２のｐ偏光成分Ｖ２、Ｖ３の成分のうちＶ１と平行な成分によって表面プラズモン共鳴光が発生する。このように、マイクロプレート４への入射光が偏光していない場合、マイクロプレート４の表面に形成された格子８の方向Ｖ１に平行な成分をもつ入射光のｐ偏光によって表面プラズモン共鳴光が発生する。 FIG. 3A is a perspective view showing a state where light is incident on the microplate 4, and FIG. 3B is a plan view thereof. The planes U1 and U2 are perpendicular to the surface of the microplate 4 and parallel to the direction V1 of the grating 8 formed on the surface of the microplate 4 (direction perpendicular to the grooves of the grating), and a plane orthogonal to the plane U1. U2. Incident light L1 and L2 are light that is output from the light source, condensed in a conical shape by the objective lens, and incident on the microplate 4, respectively, traveling in the planes U1 and U2. Here, it is assumed that the incident lights L1 and L2 are lights that have not been polarized by a polarizing filter or the like. Accordingly, surface plasmon resonance light is generated by a component parallel to V1 among the components of the p-polarized components V2 and V3 of the incident lights L1 and L2 with respect to the microplate 4. As described above, when the incident light on the microplate 4 is not polarized, surface plasmon resonance light is generated by the p-polarized light of the incident light having a component parallel to the direction V1 of the grating 8 formed on the surface of the microplate 4. To do.
その一方、入射光が偏光フィルターなどによって所定の方向に偏光されている場合、マイクロプレート４の配置によっては、表面プラズモン共鳴光がほとんど発生しない場合がある。図４は、図３と同様の斜視図であるが、マイクロプレート４が図３の状態から９０度回転されて配置されている。また、図４では、偏光フィルターなどによって偏光軸Ｓの入射光が対物レンズによって円錐形に集光されているが、平面Ｕ１およびＵ２内を伝播する光Ｌ１、Ｌ２に対しては、平面Ｕ１の面内方向と、平面Ｕ２に対する法線方向にそれぞれ偏光（Ｖ２とＶ４）されることとなる。この場合、ｐ偏光成分Ｖ２が格子の方向Ｖ１と直交しており、Ｖ４はマイクロプレート４に対してｓ偏光になるため、光Ｌ１、Ｌ２の何れによっても表面プラズモン共鳴光が発生しない。Ｌ１、Ｌ２以外の入射光に対してもｐ偏光性とＶ１との平行性が低いために効率よく表面プラズモン共鳴光は発生しない。よって、図４のような偏光軸の入射光と格子の配置では、明るい蛍光画像は得られない。 On the other hand, when incident light is polarized in a predetermined direction by a polarizing filter or the like, surface plasmon resonance light may hardly be generated depending on the arrangement of the microplate 4. 4 is a perspective view similar to FIG. 3, except that the microplate 4 is rotated 90 degrees from the state of FIG. In FIG. 4, the incident light having the polarization axis S is condensed in a conical shape by the objective lens by a polarizing filter or the like, but the light L1 and L2 propagating in the planes U1 and U2 are The light is polarized (V2 and V4) in the in-plane direction and in the normal direction to the plane U2. In this case, since the p-polarized component V2 is orthogonal to the grating direction V1, and V4 is s-polarized with respect to the microplate 4, no surface plasmon resonance light is generated by either the light L1 or L2. Even for incident light other than L1 and L2, the surface plasmon resonance light is not generated efficiently because the parallelism between the p-polarization property and V1 is low. Therefore, a bright fluorescent image cannot be obtained with the arrangement of the incident light of the polarization axis and the grating as shown in FIG.
従来の蛍光顕微鏡において、偏光子を挿入しなくとも、通常組み込まれているフィルターセットの中に偏光依存性のある素子（ダイクロイックミラーなど）が含まれている場合、上記したように表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するように、マイクロプレート４の配置、即ち格子の方向を調節することが必要である。 In a conventional fluorescence microscope, if a polarization-dependent element (such as a dichroic mirror) is included in a filter set that is normally incorporated without inserting a polarizer, surface plasmon resonance light is used as described above. Therefore, it is necessary to adjust the arrangement of the microplate 4, that is, the direction of the lattice so as to generate efficiently.
以上、本発明の実施の形態を、蛍光顕微鏡に適用する場合について説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されず、種々変更して実施することができる。また、蛍光マイクロプレートリーダーに対しても同様に適用可能である。 As described above, the case where the embodiment of the present invention is applied to a fluorescence microscope has been described. However, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made. Further, it can be similarly applied to a fluorescent microplate reader.
例えば、周期構造の形状は、上記した一方向に溝を有する形状に限定されず、図５に示すような、ベース基板５’の表面に交差する２方向に溝を形成した２次元周期構造や円形の周期構造であってもよい。図５は、２次元周期構造が形成されたベース基板５’の平面図である。ベース基板５’の表面には、複数の溝部９が直交する２方向に、即ち凸部１０が直交する２方向に配列している。なお、溝９を形成する２方向は、直交していなくてもよく、斜めであってもよい。 For example, the shape of the periodic structure is not limited to the shape having the grooves in one direction as described above, and a two-dimensional periodic structure in which grooves are formed in two directions intersecting the surface of the base substrate 5 ′ as shown in FIG. It may be a circular periodic structure. FIG. 5 is a plan view of the base substrate 5 ′ on which the two-dimensional periodic structure is formed. On the surface of the base substrate 5 ′, the plurality of groove portions 9 are arranged in two directions perpendicular to each other, that is, the convex portions 10 are arranged in two directions perpendicular to each other. Note that the two directions in which the grooves 9 are formed do not have to be orthogonal, and may be oblique.
２次元周期構造が形成されたベース基板を用いる場合、偏光した入射光を使用する場合にも、マイクロプレートの配置による蛍光強度への影響を小さくすることができる。また、偏光していない光を使用する場合、入射光の利用効率が高くなり、より明るい蛍光を観測することができる。 In the case of using a base substrate on which a two-dimensional periodic structure is formed, the influence on the fluorescence intensity due to the arrangement of the microplate can be reduced even when polarized incident light is used. In addition, when unpolarized light is used, the utilization efficiency of incident light is increased and brighter fluorescence can be observed.
蛍光マイクロプレートリーダーに使用する本発明に係るマイクロプレートに関しては、図６（上側は縦断面図、下側は平面図）に示したように、ベース基板５表面上の、アレイ状に配置された複数の領域１１に周期構造を形成した後、ベース基板５の上に金属層６、保護層７を順に形成すればよい。このとき、全ての領域１１において周期構造の溝を同じ方向になるように形成することが望ましい。蛍光マイクロプレートリーダーで観測する場合、これらの複数の領域１１の上に微量の試料をスポッティングして観測する。 Regarding the microplate according to the present invention used for the fluorescent microplate reader, as shown in FIG. 6 (upper side is a longitudinal sectional view, lower side is a plan view), it is arranged in an array on the surface of the base substrate 5. After forming the periodic structure in the plurality of regions 11, the metal layer 6 and the protective layer 7 may be sequentially formed on the base substrate 5. At this time, it is desirable to form grooves having a periodic structure in the same direction in all regions 11. When observing with a fluorescent microplate reader, a small amount of sample is spotted on the plurality of regions 11 and observed.
また、図６では、ベース基板５の表面全体に金属層６および保護層７を形成しているが、これに限定されず、少なくとも周期構造が形成された領域１１の上に金属層および保護層が形成されていればよい。また、各領域１１に、図５に示した２次元周期構造を形成してもよい。 In FIG. 6, the metal layer 6 and the protective layer 7 are formed on the entire surface of the base substrate 5. However, the present invention is not limited to this, and at least the metal layer and the protective layer are formed on the region 11 where the periodic structure is formed. Should just be formed. Further, the two-dimensional periodic structure shown in FIG. 5 may be formed in each region 11.
以下に、実施例を示し、本発明の特徴をさらに明らかにする。 Hereinafter, the features of the present invention will be further clarified by showing examples.
ベース基板としてガラス基板を使用し、その表面に観測波長オーダー以下の周期構造をもつ格子を形成し、さらにその上に金属薄膜、Ｃｒ、ＳｉＯ2薄膜を形成してマイクロプレートを製作した。 A glass substrate was used as a base substrate, a grating having a periodic structure below the observation wavelength order was formed on the surface, and a metal thin film, Cr, SiO 2 thin film was further formed thereon to produce a microplate.
ｐ偏光入射光を使用する場合におけるマイクロプレートの配置の影響を調査した結果を図７に示す。図７の右側に、入射光の偏光面と格子の方向との関係を示す。左側に、観測した反射率（％）の結果を示す。 The result of investigating the influence of the arrangement of the microplate when using p-polarized incident light is shown in FIG. The relationship between the polarization plane of incident light and the direction of the grating is shown on the right side of FIG. On the left side, the observed reflectance (%) results are shown.
左側に示した観測結果のグラフから、入射角度φと、入射光の偏光面および格子の方向の成す角度Ψとによって、反射率が大きく変化することが分かる。即ち、Ψが小さくなるほど反射率が減少し、表面プラズモン共鳴光の発生が観測できる。図７では、Ψ＝０（度）、φ＝１５（度）である場合に、表面プラズモン共鳴光が最も強く発生している。従って、ＮＡの小さい対物レンズでも十分明るい蛍光観測が可能になることを示唆している。その一方で、このような表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するのはｐ偏光入射光のときのみならず、角度Ψ回転させた光を用いて入射した場合にも発生させることができる。図７左側では、格子を角度Ψ回転させた場合の表面プラズモン光は効率が減少しているが、偏光軸を角度Ψ回転させた入射光を用いることで補償され、角度φの位置に変化なく角度Ψ＝０（度）の共鳴光と同じ強さの表面プラズモン共鳴光が発生することもわかっている。 From the graph of the observation result shown on the left side, it can be seen that the reflectance varies greatly depending on the incident angle φ and the angle Ψ formed by the polarization plane of the incident light and the direction of the grating. That is, as Ψ becomes smaller, the reflectance decreases and the generation of surface plasmon resonance light can be observed. In FIG. 7, the surface plasmon resonance light is most strongly generated when ψ = 0 (degrees) and φ = 15 (degrees). Therefore, it is suggested that sufficiently bright fluorescence observation is possible even with an objective lens having a small NA. On the other hand, such surface plasmon resonance light can be efficiently generated not only in the case of p-polarized incident light but also in the case of incidence using light rotated by an angle Ψ. On the left side of FIG. 7, the efficiency of the surface plasmon light when the grating is rotated by the angle Ψ is reduced, but it is compensated by using the incident light whose polarization axis is rotated by the angle Ψ, and there is no change in the position of the angle φ. It is also known that surface plasmon resonance light having the same intensity as resonance light at an angle ψ = 0 (degrees) is generated.
よって、図７の結果は、実験条件、即ち使用する蛍光顕微鏡の光学系およびマイクロプレートに依存するので、全ての表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡においてΨ＝０（度）であることが最適条件ではない。実際には、試料を搭載したマイクロプレートの配置および入射光の角度を調節し、最適状態を決定することが望ましい。 Therefore, since the result of FIG. 7 depends on the experimental conditions, that is, the optical system and the microplate of the fluorescence microscope to be used, it is not optimal that Ψ = 0 (degrees) in all surface plasmon excitation enhanced fluorescence microscopes. . Actually, it is desirable to determine the optimum state by adjusting the arrangement of the microplate on which the sample is mounted and the angle of the incident light.
さらに、（１）一般的なスライドガラス、（２）ガラス（LaSFN9）／金／ＳｉＯ２基板（周期構造なし）、（３）周期構造を形成したガラス／金／ＳｉＯ２マイクロプレートの３種類を用い、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）発現細胞を基板に吸着させて正立顕微鏡で蛍光を観測した。蛍光観測においては、ハロゲンランプとＧＦＰ対応フィルター（励起側４６０〜４８０ｎｍ、蛍光側４９５〜５４０ｎｍ）を用いた。 Furthermore, (1) general slide glass, (2) glass (LaSFN9) / gold / SiO 2 substrate (without periodic structure), (3) glass / gold / SiO 2 microplate with periodic structure formed Using, GFP (Green Fluorescence Protein) -expressing cells were adsorbed to the substrate, and fluorescence was observed with an upright microscope. In the fluorescence observation, a halogen lamp and a GFP-compatible filter (excitation side: 460 to 480 nm, fluorescence side: 495 to 540 nm) were used.
観測結果を図８に示す。図８の（１）〜（３）はそれぞれ、上記した３種類の基板を用いて得られた写真である。何れも同じ縮尺であり、上段は落射光の写真、下段は落射蛍光の写真である。図８の下段の写真から、（３）周期構造ガラス／金／ＳｉＯ２基板に吸着した細胞からの蛍光が、他の基板の細胞よりも強く観測されていることが分かる。 The observation results are shown in FIG. (1) to (3) in FIG. 8 are photographs obtained using the three types of substrates described above. All are the same scale, the upper stage is a photograph of epi-illumination, and the lower part is a photograph of epi-fluorescence. From the photograph in the lower part of FIG. 8, it can be seen that (3) fluorescence from cells adsorbed on the periodic structure glass / gold / SiO 2 substrate is observed more strongly than cells on other substrates.
周期構造を形成したガラス／金／ＳｉＯ２マイクロプレートを用い、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）発現細胞を基板に吸着させて正立顕微鏡で蛍光を観測した。蛍光観測においては、ハロゲンランプとＧＦＰ対応フィルター（励起側４６０〜４８０ｎｍ、蛍光側４９５〜５４０ｎｍ）を用い、偏光子を挿入して、対物レンズ通過前の偏光軸がΨ＝０（度）のときの格子の溝方向と直交する方向になるように入射光を調整した。Ψ＝０（度）、９０（度)で観測した蛍光画像の結果が図９の（１）、（２）である。Ψ＝０（度）のときの画像が明るく、マイクロプレートの配置の調節が重要であることを証明することができた。 Using a glass / gold / SiO 2 microplate having a periodic structure, GFP (Green Fluorescence Protein) -expressing cells were adsorbed to the substrate, and fluorescence was observed with an upright microscope. In fluorescence observation, when a halogen lamp and a GFP-compatible filter (excitation side 460 to 480 nm, fluorescence side 495 to 540 nm) are inserted, a polarizer is inserted, and the polarization axis before passing through the objective lens is Ψ = 0 (degrees) Incident light was adjusted so as to be in a direction perpendicular to the grating groove direction. The results of the fluorescence images observed at Ψ = 0 (degrees) and 90 (degrees) are (1) and (2) in FIG. The image when Ψ = 0 (degrees) was bright, and it was proved that adjustment of the arrangement of the microplate was important.
さらに本願発明者は、類似した周期構造を形成した基板を用いても、増強蛍光効果を生じさせる表面プラズモン共鳴場を発生しない基板が存在することを見出した。これについて、実験結果とシミュレーション結果との比較検討を行い、表面プラズモン共鳴発生の条件として、周期構造のデューティ比（duty ratio）、溝部の深さ、形状が重要であることを見出した。そして、シミュレーションにより、これら条件の望ましい範囲を決定することができた。以下に、具体的に説明する。 Furthermore, the inventor of the present application has found that there is a substrate that does not generate a surface plasmon resonance field that causes an enhanced fluorescence effect even when a substrate having a similar periodic structure is used. In this regard, the experimental results were compared with the simulation results, and it was found that the duty ratio of the periodic structure, the depth of the groove, and the shape were important as conditions for generating surface plasmon resonance. The desired range of these conditions could be determined by simulation. This will be specifically described below.
（１）まず、類似した周期構造をもつ次の２枚のベース基板（ＳｉＯ２）を用いて、スパッター法により、ベース基板の周期構造上に金属層および保護層を調製してマイクロプレートを製作した。具体的には、周期構造の上に約200nmの厚さで銀薄膜を形成し、さらにその上に約20nmの厚さで保護層としてＳｉＯ２を形成した。そして、これらのマイクロプレートを用いて、図３を参照して上記で説明したように表面プラズモン共鳴を観測した。
基板１：周期が480nm、溝部の深さが31nm、デューティ比が0.4
基板２：周期が480nm、溝部の深さが39nm、デューティ比が0.54
ここで、ベース基板表面の周期構造は、断面形状が図１１に示した矩形状である。デューティ比は、周期に対する凸部の長さの割合をＭ％、周期に対する凹部の長さの割合をＶ％として、Ｍ／（Ｍ＋Ｖ）である。
(1) First, using the following two base substrates (SiO 2 ) having a similar periodic structure, a metal layer and a protective layer are prepared on the periodic structure of the base substrate by sputtering, and a microplate is manufactured. did. Specifically, a silver thin film having a thickness of about 200 nm was formed on the periodic structure, and SiO 2 was further formed thereon as a protective layer with a thickness of about 20 nm. Then, using these microplates, surface plasmon resonance was observed as described above with reference to FIG.
Substrate 1: Period is 480 nm, groove depth is 31 nm, duty ratio is 0.4
Substrate 2: Period is 480 nm, groove depth is 39 nm, duty ratio is 0.54
Here, the periodic structure on the surface of the base substrate has the rectangular shape shown in FIG. The duty ratio is M / (M + V) where the ratio of the length of the convex portion to the period is M% and the ratio of the length of the concave portion to the period is V%.
観測結果を図１２に示す。図１２の（ａ）、（ｂ）は、それぞれ基板１及び基板２に関する観測結果である。図１２から分かるように、基板１では表面プラズモン共鳴が観測されたが、基板２では表面プラズモン共鳴が観測されなかった。 The observation results are shown in FIG. 12A and 12B show the observation results regarding the substrate 1 and the substrate 2, respectively. As can be seen from FIG. 12, surface plasmon resonance was observed on the substrate 1, but surface plasmon resonance was not observed on the substrate 2.
基板１、２を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で検査したところ、ベース基板表面は矩形状の周期構造であるが、その上に形成された金属層の表面は、図１３に示すように周期構造の段差部分に対応する部分が傾斜（以下、この部分をスロープという）していることが分かった。図１３では、金属層の上の保護層は省略している。周期構造の山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）の比率は、基板１に関してはＶ：Ｍ：ＳＬ＝33：39：14であり、基板２に関してはＶ：Ｍ：ＳＬ＝24：60：8であった。 When the substrates 1 and 2 are examined with an atomic force microscope (AFM), the surface of the base substrate has a rectangular periodic structure, but the surface of the metal layer formed thereon has a periodic structure as shown in FIG. It was found that the portion corresponding to the step portion of the slope is inclined (hereinafter, this portion is referred to as a slope). In FIG. 13, the protective layer on the metal layer is omitted. The ratio of the peak (M%), valley (V%), and slope (SL%) of the periodic structure is V: M: SL = 33: 39: 14 for the substrate 1 and V: M: for the substrate 2. SL = 24: 60: 8.
そこで、公知の厳密結合波解析（ＲＣＷＡ）によるシミュレーションを行った。その結果を図１４に示す。図１４の（ａ）、（ｂ）は、それぞれ基板１、２に関するシミュレーション結果であり、実験データである図１２（ａ）、（ｂ）を再現できていることが分かる。なお、シミュレーションは、実際のマイクロプレートとは異なり、銀薄膜の上に形成されたＳｉＯ２が銀薄膜の平らな山及び谷のみに存在し、スロープ上には存在しない条件で行った。 Therefore, a simulation by a well-known exact coupled wave analysis (RCWA) was performed. The result is shown in FIG. 14 (a) and 14 (b) are simulation results for the substrates 1 and 2, respectively, and it can be seen that the experimental data of FIGS. 12 (a) and 12 (b) can be reproduced. Note that, unlike an actual microplate, the simulation was performed under the condition that SiO 2 formed on the silver thin film exists only in the flat peaks and valleys of the silver thin film and does not exist on the slope.
（２）次に、図１３に示した形状において、周期構造の山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）の比率を変化させて、厳密結合波解析（ＲＣＷＡ）によるシミュレーションを行った。 (2) Next, in the shape shown in FIG. 13, the ratio of the peak (M%), valley (V%), and slope (SL%) of the periodic structure is changed, and simulation by rigorous coupled wave analysis (RCWA) is performed. Went.
その結果、次のことが分かった。
i） 図１５のように表面がほぼ垂直なスロープ（傾斜角度αが90度）をもつ周期構造では、表面プラズモン共鳴はデューティ比に敏感に依存し、プラズモン共鳴場が発生する条件が制限されるが、図１３のような表面にスロープ（高さ１０〜５０ｎｍ、且つＳＬ＝４０〜１００ｎｍ、即ち傾斜角度αが６〜５０度）のある構造では、表面プラズモン共鳴発生のデューティ比への依存度が小さく、限られた一部の条件でプラズモン共鳴が発生しないことが分かった。特にスロープの傾斜が緩い程、表面プラズモン共鳴のデューティ比への依存度は小さくなる。
ii） 金属層表面にスロープをもたせた構造にすることで、表面プラズモン共鳴の溝部の深さへの依存度も軽減される。
iii） 表面プラズモン共鳴は周期にはあまり依存しない。
As a result, the following was found.
i) As shown in FIG. 15, in a periodic structure having a substantially vertical slope (tilt angle α is 90 degrees), the surface plasmon resonance depends sensitively on the duty ratio, and the conditions for generating the plasmon resonance field are limited. However, in the structure having a slope (height of 10 to 50 nm and SL = 40 to 100 nm, that is, the inclination angle α is 6 to 50 degrees) as shown in FIG. 13, the dependence of the surface plasmon resonance generation on the duty ratio It was found that plasmon resonance does not occur under some limited conditions. In particular, the gentler the slope slope, the smaller the dependence of the surface plasmon resonance on the duty ratio.
ii) Dependence of the surface plasmon resonance on the depth of the groove is reduced by providing a structure having a slope on the surface of the metal layer.
iii) Surface plasmon resonance is not very dependent on the period.
金属層（特に銀薄膜）の厚さが約２００ｎｍの場合の望ましい条件を具体的に示せば、次のとおりである。
金属層表面にスロープが無く垂直な段差が形成されている（α＝９０°）場合、ベース基板の凹部の深さをｄ（ｎｍ）として、
ｄ＝１０±５（５以上１５未満）、且つ、１５≦Ｍ＜４５、４５＜Ｍ＜８５、若しくは８５＜Ｍ＜１００、
ｄ＝２０±５（１５以上２５未満）、且つ、１０≦Ｍ＜１００、
ｄ＝３０±５（２５以上３５未満）、且つ、１０≦Ｍ≦４０、６０≦Ｍ≦７０、若しくは７５≦Ｍ≦９５、
ｄ＝４０±５（３５以上４５未満）、且つ、０＜Ｍ≦４０、４５≦Ｍ≦５５、若しくは６０≦Ｍ≦７０
である。
金属層表面がスロープを有し（α＜９０°）、ＳＬ＝１０±５の場合（ベース基板はα＝９０°）、ベース基板の凹部の深さをｄ（ｎｍ）として、
ｄ＝１０±５（５ｎｍ以上１５ｎｍ未満、即ちαが約１２度）、且つ、０＜Ｍ＜７０、または７０＜Ｍ＜１００
ｄ＝２０±５（１５ｎｍ以上２５ｎｍ未満、即ちαが約２３度）、且つ、０＜Ｍ＜８０、または８０＜Ｍ＜１００
ｄ＝３０±５（２５ｎｍ以上３５ｎｍ未満、即ちαが約３２度）、且つ、０＜Ｍ＜６０、または６０＜Ｍ＜１００
ｄ＝３０±５（３５ｎｍ以上５５ｎｍ未満、即ちαが約４０度）、且つ、０＜Ｍ＜６０、または６０＜Ｍ＜１００
である。
The specific conditions when the thickness of the metal layer (particularly the silver thin film) is about 200 nm are specifically shown as follows.
When the metal layer surface has no slope and a vertical step is formed (α = 90 °), the depth of the recess of the base substrate is d (nm),
d = 10 ± 5 (5 or more and less than 15) and 15 ≦ M <45, 45 <M <85, or 85 <M <100,
d = 20 ± 5 (15 or more and less than 25), and 10 ≦ M <100,
d = 30 ± 5 (25 or more and less than 35), and 10 ≦ M ≦ 40, 60 ≦ M ≦ 70, or 75 ≦ M ≦ 95,
d = 40 ± 5 (35 or more and less than 45) and 0 <M ≦ 40, 45 ≦ M ≦ 55, or 60 ≦ M ≦ 70
It is.
When the surface of the metal layer has a slope (α <90 °) and SL = 10 ± 5 (the base substrate is α = 90 °), the depth of the concave portion of the base substrate is d (nm),
d = 10 ± 5 (5 nm or more and less than 15 nm, that is, α is about 12 degrees), and 0 <M <70, or 70 <M <100
d = 20 ± 5 (15 nm or more and less than 25 nm, that is, α is about 23 degrees), and 0 <M <80, or 80 <M <100
d = 30 ± 5 (25 nm or more and less than 35 nm, that is, α is about 32 degrees), and 0 <M <60, or 60 <M <100
d = 30 ± 5 (35 nm or more and less than 55 nm, that is, α is about 40 degrees), and 0 <M <60, or 60 <M <100
It is.
１ 表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（ＳＰＦＭ）
２ 本体
３ ステージ
４ マイクロプレート
５、５’ ベース基板
６ 金属層
７ 保護層
８ 周期構造
９ 溝部
１０ 凸部
Ａ 試料
Ｌ１、Ｌ２ 入射光
Ｖ１ 格子の方向
Ｖ２、Ｖ３ 入射光のｐ偏光成分
Ｖ４ 入射光のｓ偏光成分
φ 入射角度
Ｕ１、Ｕ２ 入射平面
1 Surface plasmon excitation enhanced fluorescence microscope (SPFM)
2 Main body 3 Stage 4 Microplate 5, 5 ′ Base substrate 6 Metal layer 7 Protective layer 8 Periodic structure 9 Groove 10 Projection A Sample L1, L2 Incident light V1 Lattice direction V2, V3 p-polarized component V4 incident light incident light S-polarized component φ of incident angle U1, U2 incident plane
Claims (21)
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とするマイクロプレート。 A microplate that is used in a fluorescence microscope or a fluorescence microplate reader and that mounts a sample to be observed and detects enhanced fluorescence due to surface plasmon excitation,
A base substrate having a periodic structure on the surface;
A metal layer formed on the periodic structure;
A protective layer formed on the metal layer,
The periodic structure includes a plurality of grooves formed along one direction, the metal layer has a slope on the surface, and the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation type surface plasmon resonance light,
Injecting light from the protective layer side of the microplate to generate an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light;
Detecting the enhanced fluorescence from the microplate using the generated electric field as an excitation field of fluorescent molecules, and detecting the enhanced fluorescence from either the base substrate side or the protective layer side. And
The angle formed by the incident direction of the light incident from the protective layer side and the perpendicular of the plane of the protective layer on which the light is incident is the same even if the light is not bent by the bending means. A microplate having an incident angle and an angle small enough to generate the surface plasmon resonance light.
前記第１の接着保護層および第２の接着保護層のそれぞれが膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜で形成されていることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のマイクロプレート。 A first adhesion protection layer and a second adhesion protection layer, respectively, between the base substrate and the metal layer and between the metal layer and the protection layer;
The micro of any one of claims 1 to 7, wherein each of the first adhesive protective layer and the second adhesive protective layer is formed of a thin film having a thickness of 0.1 to 3 nm. plate.
前記保護層がＳｉＯ2で形成されていることを特徴とする請求項８に記載のマイクロプレート。 The metal layer is formed of silver;
The microplate according to claim 8, wherein the protective layer is made of SiO 2 .
前記保護層の厚さが４０〜７０ｎｍであることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載のマイクロプレート。 The metal layer is formed of gold;
The thickness of the said protective layer is 40-70 nm, The microplate of any one of Claims 1-8 characterized by the above-mentioned.
前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
１５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロプレート。 The periodic structure on the surface of the base substrate is a rectangular periodic structure;
The metal layer has the slope on the surface corresponding to the rectangular step portion, and is formed to a thickness of 200 nm;
The ratio of the length of the slope to the period is 10 ± 5%;
The depth of the groove is dnm, and the ratio of the peak length to the period is M%.
5 ≦ d <15, and 0 <M <70, or 70 <M <100,
15 ≦ d <25 and 0 <M <80, or 80 <M <100,
25 ≦ d <35 and 0 <M <60, or 60 <M <100, or
35 ≦ d <45 and 0 <M <60, or 60 <M <100
The microplate according to claim 1, wherein:
前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記蛍光顕微鏡が、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。 A fluorescence microscope equipped with a sample to be observed and having a microplate for detecting enhanced fluorescence due to surface plasmon excitation,
The microplate includes a base substrate having a periodic structure on a surface, a metal layer formed on the periodic structure of the base substrate, and a protective layer formed on the metal layer,
The periodic structure includes a plurality of grooves formed along one direction, the metal layer has a slope on the surface, and the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation type surface plasmon resonance light,
The fluorescence microscope is
Injecting light from the protective layer side of the microplate to generate an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light;
Detecting the enhanced fluorescence from the microplate by using the generated electric field as an excitation field of a fluorescent molecule and detecting the enhanced fluorescence from either the base substrate side or the protective layer side. And
The angle formed by the incident direction of the light incident from the protective layer side and the perpendicular of the plane of the protective layer on which the light is incident is the same even if the light is not bent by the bending means. A surface plasmon excitation-enhanced fluorescence microscope characterized in that the angle is an incident angle and is small enough to generate the surface plasmon resonance light.
前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記蛍光マイクロプレートリーダーが、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。 A fluorescence microplate reader having a microplate for loading a sample to be observed and detecting enhanced fluorescence due to surface plasmon excitation,
The microplate includes a base substrate having a periodic structure on a surface, a metal layer formed on the periodic structure of the base substrate, and a protective layer formed on the metal layer,
The periodic structure includes a plurality of grooves formed along one direction, the metal layer has a slope on the surface, and the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation type surface plasmon resonance light,
The fluorescent microplate reader is
Injecting light from the protective layer side of the microplate to generate an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light;
Detecting the enhanced fluorescence from the microplate by using the generated electric field as an excitation field of a fluorescent molecule and detecting the enhanced fluorescence from either the base substrate side or the protective layer side. And
The angle formed by the incident direction of the light incident from the protective layer side and the perpendicular of the plane of the protective layer on which the light is incident is the same even if the light is not bent by the bending means. A surface plasmon excitation-enhanced fluorescence microplate reader characterized by having an incident angle and an angle small enough to generate the surface plasmon resonance light.
前記マイクロプレートが、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記方法が、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含み、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とする検出方法。 A method of detecting enhanced fluorescence by surface plasmon excitation using a microplate in a fluorescence microscope or a fluorescence microplate reader,
The microplate is
A base substrate having a periodic structure on the surface;
A metal layer formed on the periodic structure;
A protective layer formed on the metal layer,
The periodic structure includes a plurality of grooves formed along one direction, the metal layer has a slope on the surface, and the metal layer is formed of a metal capable of generating a propagation type surface plasmon resonance light,
The method comprises
Injecting light from the protective layer side of the microplate to generate an electric field enhanced by the surface plasmon resonance light;
Using the generated electric field as an excitation field for fluorescent molecules, and detecting the enhanced fluorescence from either the base substrate side or the protective layer side,
The angle formed by the incident direction of the light incident from the protective layer side and the perpendicular of the plane of the protective layer on which the light is incident is the same even if the light is not bent by the bending means. A detection method characterized by being an incident angle and an angle small enough to generate the surface plasmon resonance light.
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