JP5553717B2 - Light measuring method and measuring apparatus using photoelectric field enhancement device - Google Patents
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Description
本発明は、局在プラズモンを誘起しうる微細な金属凹凸構造を備えた光電場増強デバイスを用いて増強された検出光を測定する測定方法および測定装置に関するものである。 The present invention relates to a measurement method and a measurement apparatus for measuring enhanced detection light using a photoelectric field enhancement device having a fine metal relief structure capable of inducing localized plasmons.
金属表面における局在プラズモン共鳴現象による電場増強効果を利用したセンサデバイスやラマン分光用デバイス等の電場増強デバイスが知られている。ラマン分光法は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトル(ラマンスペクトル)を得る方法であり、物質の同定等に利用されている。 There are known electric field enhancement devices such as a sensor device and a Raman spectroscopic device using an electric field enhancement effect by a localized plasmon resonance phenomenon on a metal surface. Raman spectroscopy is a method of obtaining a spectrum of Raman scattered light (Raman spectrum) by dispersing scattered light obtained by irradiating a substance with single wavelength light, and is used for identification of substances.
ラマン分光法には、微弱なラマン散乱光を増強するために、表面増強ラマン(SERS)と呼ばれる、局在プラズモン共鳴によって増強された光電場を利用したラマン分光法がある(非特許文献1参照)。これは、金属体、特に表面にナノオーダの凹凸を有する金属体に物質を接触させた状態で光を照射すると、局在プラズモン共鳴による光電場増強が生じ、金属体表面に接触された試料のラマン散乱光強度が増強されるという原理を利用するものである。被検体を担持する担体(基板)として、表面に金属凹凸構造を備えた基板を用いることにより表面増強ラマン分光法を実施することができる。 In Raman spectroscopy, there is Raman spectroscopy that uses a photoelectric field enhanced by localized plasmon resonance, called surface-enhanced Raman (SERS), in order to enhance weak Raman scattered light (see Non-Patent Document 1). ). This is because, when light is applied to a metal body, particularly a metal body having nano-order irregularities on the surface, the photoelectric field is enhanced by localized plasmon resonance, and the Raman of the sample in contact with the surface of the metal body is generated. This utilizes the principle that the scattered light intensity is enhanced. Surface-enhanced Raman spectroscopy can be carried out by using a substrate having a metal concavo-convex structure on the surface as a carrier (substrate) for supporting an object.
表面に金属微細凹凸構造を備えた基板としては、Si基板の表面に凹凸を設け、その凹凸面に金属膜を形成した基板が主に用いられている(特許文献1から3参照)。
As a substrate having a metal fine concavo-convex structure on its surface, a substrate in which concavo-convex is provided on the surface of an Si substrate and a metal film is formed on the concavo-convex surface is mainly used (see
また、Al基板の表面を陽極酸化して一部を金属酸化物層(Al2O3)とし、陽極酸化の過程で金属酸化物層内部に自然形成され、金属酸化物層の表面において開口した複数の微細孔内に、金属が充填された基板も提案されている(特許文献4参照)。 In addition, the surface of the Al substrate is anodized to form a part of the metal oxide layer (Al 2 O 3 ), which is naturally formed inside the metal oxide layer during the anodic oxidation process, and is opened on the surface of the metal oxide layer. A substrate in which a plurality of fine holes are filled with metal has also been proposed (see Patent Document 4).
特許文献1〜4等に開示されている従来の光電場増強基板は、SiあるいはAlなどの不透明な基板表面に微細凹凸構造を形成し、その微細凹凸構造表面に金属膜を形成した、あるいは、凹部に金属を埋め込んだ構成である。また、特許文献4にはガラス基板のような透明基板を用いる例が挙げられているが、微細凹凸構造自体はシリコンあるはゲルマニウムなどの不透明な材料から構成されている。
Conventional photoelectric field enhancing substrates disclosed in
従来のラマン分光装置においては、サンプル表面側からラマン散乱光を検出するよう構成されている。しかしながら、細胞などのμmオーダー以上のサンプルを被検体とする場合、サンプル自身がラマン散乱光に対する遮蔽体となり、微弱なラマン散乱光を高いS/Nで受光するのは困難であった。 A conventional Raman spectroscopic apparatus is configured to detect Raman scattered light from the sample surface side. However, when a sample of μm order or more such as a cell is used as a subject, the sample itself becomes a shield against Raman scattered light, and it is difficult to receive weak Raman scattered light with high S / N.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、局在プラズモンによる光増強効果を利用して微弱な光を増強し検出する測定方法および装置において、より良好なS/Nで測定することが可能な測定方法および測定装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and in a measurement method and apparatus that enhances and detects weak light using the light enhancement effect of localized plasmons, measurement is performed with better S / N. An object of the present invention is to provide a measurement method and a measurement apparatus that can perform the above-described measurement.
本発明の測定方法は、表面に透明な微細凹凸構造を備えた透明基板と、該表面の微細凹凸構造表面に形成された金属膜とを備えた光電場増強デバイスを用い、
該光電場増強デバイスの前記金属膜上に被検体を配置し、
前記光電場増強デバイスの前記被検体の配置箇所に対して励起光を照射し、
該励起光の照射により生じた光を、前記透明基板の裏面側から検出することを特徴とする。
The measuring method of the present invention uses a photoelectric field enhancement device comprising a transparent substrate having a transparent fine concavo-convex structure on the surface and a metal film formed on the surface of the fine concavo-convex structure on the surface,
An object is disposed on the metal film of the photoelectric field enhancing device,
Irradiating excitation light to the location of the subject of the photoelectric field enhancement device,
The light generated by the irradiation of the excitation light is detected from the back side of the transparent substrate.
前記光電場増強デバイスの前記被検体の配置箇所に対して励起光を照射する場合、励起光を、デバイスに対していかなる方向から照射してもよく、例えば、金属膜の表面側、あるいは透明基板の裏面側から照射することができる。 When irradiating excitation light to the location of the subject of the photoelectric field enhancement device, the excitation light may be irradiated to the device from any direction, for example, the surface side of a metal film or a transparent substrate It can irradiate from the back side.
特に、前記励起光を、前記透明基板の裏面側から照射することが望ましい。 In particular, it is desirable to irradiate the excitation light from the back side of the transparent substrate.
前記励起光の照射により生じた光として、ラマン散乱光、蛍光および高次高調波のうちのいずれかを検出することができる。 As the light generated by the irradiation of the excitation light, any of Raman scattered light, fluorescence, and higher harmonics can be detected.
さらには、励起光の照射により生じるレーリー散乱あるいはミー散乱等を検出してもよい。 Furthermore, Rayleigh scattering or Mie scattering generated by irradiation with excitation light may be detected.
本発明の測定装置は、表面に透明な微細凹凸構造を備えた透明基板と、該表面の微細凹凸構造表面に形成された金属膜とを備え、該金属膜が形成されてなる表面側に被検体が配置される光電場増強デバイスと、
該光電場増強デバイスの前記被検体の配置箇所に対して励起光を照射する励起光照射部と、
前記光電場増強デバイスの裏面側に配置され、前記励起光の照射により生じた光を、前記透明基板の裏面側から検出する光検出部とを備えたことを特徴とするものである。
The measuring apparatus of the present invention comprises a transparent substrate having a transparent fine concavo-convex structure on the surface, and a metal film formed on the surface of the fine concavo-convex structure on the surface, and is coated on the surface side where the metal film is formed. A photoelectric field enhancement device on which the specimen is placed;
An excitation light irradiating unit that irradiates excitation light to an arrangement location of the subject of the photoelectric field enhancement device;
It is provided on the back side of the photoelectric field enhancement device, and includes a light detection unit that detects light generated by the irradiation of the excitation light from the back side of the transparent substrate.
前記励起光照射部は、前記光電場増強デバイスの裏面側に配置され、前記透明基板の裏面側から前記励起光を照射するものであることが好ましい。 It is preferable that the excitation light irradiation unit is disposed on the back side of the photoelectric field enhancing device and irradiates the excitation light from the back side of the transparent substrate.
なお、本発明の測定方法および測定装置において用いられる光電場増強デバイスの前記金属膜は微細凹凸構造表面に形成されており、この金属膜表面は透明な微細凹凸構造に応じた微細凹凸構造を有する。金属膜表面の微細凹凸構造が、光の照射を受けて局在プラズモンを生じうるものであればよい。なお、局在プラズモンを生じうる微細凹凸構造とは、一般に、凹凸構造をなす凸部および凹部の平均的な大きさと平均的なピッチが光の波長よりも小さい凹凸構造である。 In addition, the said metal film of the photoelectric field enhancement device used in the measuring method and measuring apparatus of this invention is formed in the fine concavo-convex structure surface, and this metal film surface has the fine concavo-convex structure according to the transparent fine concavo-convex structure. . Any fine concavo-convex structure on the surface of the metal film may be used as long as it can generate localized plasmons when irradiated with light. Note that the fine concavo-convex structure capable of generating localized plasmons is generally a concavo-convex structure in which the average size and average pitch of the convex portions and concave portions forming the concavo-convex structure are smaller than the wavelength of light.
特には、凹凸の平均的なピッチおよび凸部の頂点と凹部の底部間の距離(深さ)が200nm以下であることが好ましい。 In particular, it is preferable that the average pitch of the unevenness and the distance (depth) between the apex of the convex part and the bottom part of the concave part be 200 nm or less.
凹凸の平均的なピッチは、SEM(走査型電子顕微鏡)で微細凹凸構造の表面画像を撮影し、画像処理をして2値化し、統計的処理によって求めるものとする。 The average pitch of the unevenness is obtained by taking a surface image of the fine unevenness structure with an SEM (scanning electron microscope), binarizing it by image processing, and obtaining it by statistical processing.
凹凸の平均的な深さは、AFM(原子間力顕微鏡)により表面形状を測定して統計的処理によって求めるものとする。 The average depth of the unevenness is determined by statistical processing by measuring the surface shape with an AFM (Atomic Force Microscope).
ここで透明とは、前記微細凹凸構造に照射される光、および該光により被検体から生じる光に対し、透過率が50%以上であることをいうものとする。なお、これらの光に対して、透過率は75%以上、さらには90%以上であることが好ましい。 Here, the term “transparent” means that the transmittance is 50% or more for the light irradiated on the fine concavo-convex structure and the light generated from the subject by the light. Note that the transmittance of these lights is preferably 75% or more, and more preferably 90% or more.
前記光電場増強デバイスにおいて、前記透明基板は、透明基板本体と、該透明基板本体の表面に備えられた前記微細凹凸構造を構成する、該透明基板本体とは異なる物質により構成された微細凹凸構造層とからなるものとすることできる。 In the photoelectric field enhancement device, the transparent substrate has a fine concavo-convex structure made of a material different from the transparent substrate main body and the fine concavo-convex structure provided on the surface of the transparent substrate main body. It can consist of layers.
特に、前記微細凹凸構造層は、ベーマイトにより好適に形成することができる。 In particular, the fine concavo-convex structure layer can be suitably formed from boehmite.
金属膜は、前記光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属からなるものであればよいが、Au、Ag、Cu、Al、Pt、およびこれらを主成分とする合金からなる群より選択される少なくとも1種の金属からなるものであることが好ましい。特には、AuあるいはAgが好ましい。 The metal film may be made of a metal that generates localized plasmon when irradiated with the light, but is selected from the group consisting of Au, Ag, Cu, Al, Pt, and alloys containing these as a main component. It is preferably made of at least one kind of metal. In particular, Au or Ag is preferable.
前記金属膜の膜厚は、10〜100nmであることが好ましい。 The thickness of the metal film is preferably 10 to 100 nm.
前記透明基板の裏面に、反射防止膜として機能する透明な第2の微細凹凸構造を備えてなるものとすることができる。 A transparent second fine concavo-convex structure that functions as an antireflection film may be provided on the back surface of the transparent substrate.
このとき、前記第2の微細凹凸構造は、ベーマイトにより構成された微細凹凸構造層により構成することが好ましい。 At this time, the second fine concavo-convex structure is preferably constituted by a fine concavo-convex structure layer made of boehmite.
さらに、前記光電場増強デバイスは、前記透明基板の前記金属膜上に液体試料を保持するための液体試料保持部材を備えた試料セルとすることができる。 Furthermore, the photoelectric field enhancing device can be a sample cell including a liquid sample holding member for holding a liquid sample on the metal film of the transparent substrate.
また、さらには、前記光電場増強デバイスは、前記液体試料保持部材が、液体の流入部および流出部を備えてなるフローセル型の試料セルであってもよい。 Furthermore, the photoelectric field enhancing device may be a flow cell type sample cell in which the liquid sample holding member includes a liquid inflow portion and an outflow portion.
本発明の測定方法および測定装置は、表面に透明な微細凹凸構造を備えた透明基板と、該表面の微細凹凸構造表面に形成された金属膜とを備えた光電場増強デバイスを用い、該デバイスの被検体が配置された箇所への励起光の照射により生じた光(検出光)を、透明基板の裏面側から検出するよう構成されている。 The measuring method and measuring apparatus of the present invention use a photoelectric field enhancement device including a transparent substrate having a transparent fine uneven structure on the surface and a metal film formed on the surface of the fine uneven structure. The light (detection light) generated by the irradiation of the excitation light to the place where the subject is arranged is detected from the back side of the transparent substrate.
光電場増強デバイスは、透明な微細凹凸構造上の金属膜が設けられて、金属膜自体が凹凸状に形成されているため、この金属膜に励起光を照射することにより、金属膜の表面に局在プラズモンを効果的に誘起することができ、この局在プラズモンによる光電場増強効果を得ることができる。また、この光電場増強デバイス上に被検体を配して、該被検体が配置された領域に光が照射されることにより被検体から生じる光は光電場増強効果により増強されたものとなり、高感度に光を検出することが可能となる。 The photoelectric field enhancement device is provided with a metal film on a transparent fine concavo-convex structure, and the metal film itself is formed in an uneven shape. By irradiating this metal film with excitation light, the surface of the metal film is Localized plasmons can be induced effectively, and a photoelectric field enhancement effect by the localized plasmons can be obtained. In addition, by arranging a subject on the photoelectric field enhancement device and irradiating light on the region where the subject is arranged, the light generated from the subject is enhanced by the photoelectric field enhancement effect. It becomes possible to detect light with sensitivity.
特に、本発明の測定方法および装置においては、被検体から生じた光(検出光)を、透明基板の裏面側から検出するので、金属膜の表面において最大強度を有する増強光電場により増強された光を、被検体により遮蔽されることなく検出することができる。したがって良好なS/Nで光を測定することができる。 In particular, in the measurement method and apparatus of the present invention, the light (detection light) generated from the subject is detected from the back side of the transparent substrate, and thus is enhanced by the enhanced photoelectric field having the maximum intensity on the surface of the metal film. Light can be detected without being shielded by the subject. Therefore, light can be measured with good S / N.
以下、図面を参照して本発明の測定方法および測定装置の実施形態について説明する。なお、視認しやすくするため、図面中の各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。 Hereinafter, embodiments of a measurement method and a measurement apparatus of the present invention will be described with reference to the drawings. In addition, for easy visual recognition, the scale of each component in the drawings is appropriately changed from the actual one.
(第1の実施形態)
本発明の測定方法および装置の第1の実施形態として、ラマン分光法およびラマン分光装置100について説明する。図1は、第1の実施形態に係るラマン分光装置100の構成を示す概略図である。
(First embodiment)
As a first embodiment of the measurement method and apparatus of the present invention, a Raman spectroscopy and a
図1に示すように、ラマン分光装置100は、被検体Sを支持する光電場増強基板1と、光電場増強基板1の裏面側から被検体配置箇所へ励起光L1を照射する励起光照射部140と、被検体Sから発せられ光電場増強基板1の作用により増強されたラマン散乱光L2を、光電場増強基板1の裏面側から検出するための光検出部150とを備えている。
As shown in FIG. 1, the
まず、光電場増強基板1について説明する。図2Aは、光電場増強基板1を示す斜視図であり、図2Bは、図2Aに示した光電場増強基板1の側面の一部IIBの拡大図である。
First, the photoelectric
図2Aおよび図2Bに示すように、光電場増強基板1は、表面に微細凹凸構造22を備えた透明基板10と、その微細凹凸構造22の表面に形成された金属膜24とからなる。金属膜24が微細凹凸構造22に沿って形成されて金属の微細凹凸構造を構成するものとなり、表面に金属微細凹凸構造を備えた、局在プラズモン共鳴による光電増強効果を得ることが可能な光電場増強デバイスとして機能するものである。
As shown in FIGS. 2A and 2B, the photoelectric
この光電場増強基板1は、金属膜24が形成された微細凹凸構造22(金属微細凹凸構造)に照射された光(以下において、励起光とする。)により、局在プラズモン共鳴が誘起され、この局在プラズモン共鳴により金属膜24の表面に増強された光電場を生じさせるものである。
In this photoelectric
微細凹凸構造22は、この微細凹凸構造22の表面に沿って金属膜24が形成されて構成される金属微細構造の表面における凹凸の凸部の平均的な大きさおよび平均ピッチが励起光の波長より短いものとなる程度の微細な凹凸構造であるが、金属微細凹凸構造の表面に局在プラズモンを生じさせうるものであればよい。特には、微細凹凸構造22は、凸部頂点から隣接する凹部の底部までの平均深さが200nm以下、凹部を隔てた最隣接凸部の頂点同士の平均ピッチが200nm以下であることが望ましい。
In the fine concavo-
本実施の形態においては、透明基板10は、ガラス等からなる透明基板本体11と、本体11とは異なる材料からなり微細凹凸構造22を構成するベーマイト層(以下において、ベーマイト層22もしくは微細凹凸構造層22とする。)とからなる。
In the present embodiment, the
金属膜24は、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる金属からなるものであればよいが、例えば、Au、Ag、Cu、Al、Pt、およびこれらを主成分とする合金からなる群より選択される少なくとも1種の金属からなるものである。特には、AuあるいはAgが好ましい。
The
金属膜24の膜厚は、微細凹凸構造層22の表面に形成されたときに、金属微細凹凸構造として励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる凹凸形状を維持することができる程度の厚みであれば特に制限はないが、10〜100nmであることが好ましい。
When the
励起光照射部140は、励起光L1を射出する半導体レーザ141と、この半導体レーザ141から射出された光L1を基板1側へ反射するミラー142と、該ミラー142により反射された励起光L1を透過し、該励起光L1の照射により被検体Sから生じ増強されたラマン散乱光L2を含む基板1側からの光を光検出部150側へ反射するハーフミラー144と、ハーフミラー144を透過した励起光L1を光電場増強基板1の被検体Sが載置された領域に集光すると共に、被検体S側からの光を平行光化するレンズ146とを備えている。
The excitation
光検出部150は、ハーフミラー144により反射されてきた光のうち励起光L1を吸収し、それ以外の光を透過するノッチフィルタ151と、ノイズ光を除去するためのピンホール152を備えたピンホール板153と、被検体Sから発せられ、レンズ146およびノッチフィルタ151を透過した増強ラマン散乱光L2を、ピンホール152へ集光するためのレンズ154と、ピンホール152を通ったラマン散乱光を平行光化するレンズ156と、増強ラマン散乱光を検出する分光器158とを備えている。
The
次に、上述のラマン分光装置100を用いて、被検体Sのラマンスペクトルを測定するラマン分光方法について説明する。
Next, a Raman spectroscopy method for measuring the Raman spectrum of the subject S using the above-described
光照射部140の半導体レーザ141から励起光L1が射出され、励起光L1はミラー142で基板1側に反射され、ハーフミラー144を透過してレンズ146で集光されて、光電場増強基板1上の被検体Sが配置された箇所に照射される。
Excitation light L1 is emitted from the
励起光L1の照射により、光電場増強基板1の金属微細凹凸構造において局在プラズモン共鳴が誘起され、金属膜24表面に増強された光電場が生じる。この増強光電場により増強された、被検体Sから発せられたラマン散乱光L2は、レンズ146を透過して、ハーフミラー144で分光器158側に反射される。なお、このとき、光電場増強基板1で反射された励起光L1もハーフミラー144により反射されて分光器158側に反射されるが、励起光L1はノッチフィルタ151でカットされる。一方、励起光とは波長が異なる光はノッチフィルタ151を透過し、レンズ154で集光され、ピンホール152を通り、再度レンズ156により平行光化され、分光器158へ入射する。なお、ラマン分光装置においては、レーリー散乱光(あるいはミー散乱光)などは、その波長が励起光L1と同じであるため、ノッチフィルタ151でカットされ、分光器158へ入射することはない。ラマン散乱光L2は、分光器158に入射してラマンスペクトル測定がなされる。
Irradiation with the
本実施形態のラマン分光装置100は、光電場増強基板1を用いて構成されたものであり、効果的にラマン増強が行われているのでデータ信頼性が高く、データ再現性が良好な高精度のラマン分光測定を実施できる。光電場増強基板1は表面凹凸構造の面内均一性が高いので、同一試料に対して、光照射箇所を変えて測定を実施しても、再現性のよいデータが得られる。したがって、同一試料に対して、光照射箇所を変えて複数のデータを取り、データの信頼性を上げることも可能である。
The
本実施形態のラマン分光装置100のように、光電場増強基板1の裏面から検出する構成とすることにより、被検体が細胞のような大きなサンプルである場合に、金属膜と被検体との界面で最も強く生じる増強ラマン散乱光が被検体自身により遮蔽されることなく透明基板の裏面側から検出することができる。なお、本発明者らは、透明基板の裏面側から増強ラマン散乱光を金属膜による影響なく検出することができることを確認している(後記実施例参照。)。
By adopting a configuration in which detection is performed from the back surface of the photoelectric
上記実施形態において、励起光照射部140は光検出部150と共に、光電場増強基板1の裏面側に配置され、裏面側から励起光を照射する構成であるが、励起光照射部140は、光電場増強基板1の表面側(被検体配置面側)に配置し、表面側から励起光を照射する構成としてもよい。光電場増強基板の金属微細凹凸構造に対しては、表裏のいずれから励起光が入射されても同様に局在プラズモン共鳴を誘起することができ、光電場増強効果を得ることができる。
In the above-described embodiment, the excitation
また、上記実施形態において、光電場増強基板1の透明基板10における微細凹凸構造層22は、ベーマイトにより構成されるものとしたが、ベーマイト以外の透明な材料により構成されていてもよい。例えば、アルミニウム基体に対して、陽極酸化処理を施してその上層部に多数の微細孔を有する陽極酸化アルミナを作製し、陽極酸化されていないアルミニウム部分を除去した陽極酸化アルミナ層を微細凹凸構造層22とし、これをガラス等の透明基板本体11上に固定して透明基板10を構成することもできる。
Moreover, in the said embodiment, although the fine
また、微細凹凸構造は透明基板本体と異なる材料により構成されたもののみならず、透明基板本体の表面を加工することにより基板本体と同一の材料により構成されていてもよい。例えば、ガラス基板の表面をリソグラフィーとドライエッチング処理することにより、表面に微細凹凸構造を形成したものを透明基板として用いてもよい。 Further, the fine concavo-convex structure is not limited to one made of a material different from that of the transparent substrate body, but may be made of the same material as the substrate body by processing the surface of the transparent substrate body. For example, you may use as a transparent substrate what formed the fine concavo-convex structure on the surface by carrying out lithography and dry etching processing of the surface of a glass substrate.
なお、形成方法が容易であることから、微細凹凸構造22はベーマイトにより構成することが最も好ましい。
In addition, since the formation method is easy, it is most preferable that the fine concavo-
ここで、図3を用いて、本実施形態に係る光電場増強基板1の作製方法について説明する。図3は光電場増強基板1の各作製工程における断面図を示すものである。
Here, a manufacturing method of the photoelectric
まず板状の透明基板本体11を用意する。透明基板本体11は純水洗浄する。
その後、基板本体11の表面にスパッタ法によりアルミニウム20を数十nm程度成膜する。
その後、純水を沸騰させた中に、アルミニウム20付き透明基板本体11を浸水させ、数分(5分程度)後に取り出す。この煮沸処理(ベーマイト処理)により、アルミニウム20は透明化し、微細凹凸構造を構成するベーマイト層22となる。
このベーマイト層22上に金属膜24を蒸着させる。
以上の処理により光電場増強基板1を作製することができる。
First, a plate-shaped
Thereafter, the
Thereafter, the
A
The photoelectric
本実施形態のラマン分光装置100における光電場増強基板1の設計変更例について説明する。図4Aは、設計変更例の光電場増強基板2を示す斜視図であり、図4Bは、図4Aに示した光電場増強基板2の側面下部の一部IVBの拡大図である。
A design change example of the photoelectric
光電場増強基板2は、既述の光電場増強基板1の裏面側に、透明な第2の微細凹凸構造層28を備えたものである。
The photoelectric field enhancement substrate 2 includes a transparent second fine concavo-
この第2の微細凹凸構造層28は、透明基板10の表面側に設けられた第1の微細凹凸構造層22と同様であり、ベーマイト層により構成することができる。この裏面側の微細凹凸構造層28は、光が照射された際に反射防止膜として機能する。
The second fine concavo-
本実施形態の光電場増強基板2は、第1の実施形態光電場増強基板1の作製方法において、透明基板の表面のみならず裏面にもアルミニウムを成膜し、その後、煮沸処理することにより得ることができる。純水中での煮沸処理により表裏のアルミニウムがベーマイトとなり、表裏面に同様の微細凹凸構造22、28を有するものとすることができる。
The photoelectric field enhancing substrate 2 of the present embodiment is obtained by forming aluminum on the back surface as well as the back surface of the transparent substrate in the method for producing the photoelectric
本発明者は、例えば、透明基板(BK−7;コーニング社製Eagle2000)上に50nmのアルミニウムをスパッタ成膜した後に、5分間煮沸処理して形成されたベーマイト層を備えた基板に対してベーマイト層表面側から、表面に垂直な方向から光を入射した場合、波長650nmの光に対して0.1%程度の反射率が得られることを確認している。なお、この最も反射率の低くなる波長は、例えば、最初にスパッタ形成するアルミニウムの厚みを変化させることにより干渉を制御することで調整することができる。 The present inventor, for example, boehmite for a substrate having a boehmite layer formed by sputtering for 5 minutes after sputtering film formation of aluminum of 50 nm on a transparent substrate (BK-7; Corning Eagle 2000). It has been confirmed that when light is incident from the layer surface side in a direction perpendicular to the surface, a reflectivity of about 0.1% is obtained for light having a wavelength of 650 nm. Note that the wavelength with the lowest reflectance can be adjusted by controlling the interference by changing the thickness of the aluminum that is first formed by sputtering, for example.
(第2の実施形態)
本発明の測定方法および装置の第2の実施形態に係るラマン分光法およびラマン分光装置110について説明する。図5は、第2の実施形態に係るラマン分光装置110の構成を示す概略図である。
(Second Embodiment)
A Raman spectroscopy and
図5に示すように、ラマン分光装置110は、光電場増強基板1に代えてフローセル型の光電場増強試料セル3を備えた点で図1に示すラマン分光装置100と異なる。このようなフローセル型の光電場増強デバイスを備えることにより、被検体として液体試料を流下させつつラマン分光を測定することができる。ラマン分光装置100と同等の要素には同一符号を付し、詳細な説明は省略する。ラマン分光の測定方法についても第1の実施形態のラマン分光装置100を用いた測定方法と同様である。
As shown in FIG. 5, the
本実施形態のラマン分光装置110に備えられている光電場増強試料セル3について説明する。図6Aは、光電場増強試料セル3を示す平面図、図6Bは、図6Aに示した光電場増強試料セル3のVIB−VIB断面図である。
The photoelectric field enhancing
光電場増強試料セル3は、透明基板本体31とその表面に設けられた透明な微細凹凸構造32と、該微細凹凸構造32上に設けられた金属膜34とからなる光電場増強基板30と、その金属膜34上に液体試料を保持する液体試料保持部材35を備えている。
The photoelectric field
光電場増強基板30は、第1の実施形態の光電場増強基板1とほぼ同様の構成をしている。すなわち、微細凹凸構造32および金属膜34は、図2Bに示されている光電場増強基板1の微細凹凸構造22および金属膜24と同様であり、その構成物質および形成方法も同様である。
The photoelectric
液体試料保持部材35は、例えば、金属膜34上に液体試料を保持し、液体試料の流路36aを形成するスペーサ部36と、試料を注入する注入口(流入口)38aおよび流路36aを流下した液体試料を排出する排出口(流出口)38bを備えたガラス板などの透明な上板38とから構成することができる。
The liquid
本実施形態の光電場増強試料セル3は、光電場増強基板30を第1の実施形態の基板1と同様の方法で作製した後に、スペーサ部36および上板を接着することにより得ることができる。
The photoelectric field enhancing
なお、スペーサ部36と上板38は一体的に成型されてなるものであってもよい。あるいは、スペーサ部36は透明基板本体31と一体的に成型されてなるものであってもよい。
The
上記実施形態においては、流入口および流出口を備えた流路状の試料セル(フローセル)型の光電場増強デバイスについて説明したが、液体を流入出させることができるセルではなく、単に金属膜上に液体試料を保持するだけの光電場増強試料セルを備えた装置としてもよい。 In the above-described embodiment, the flow-channel sample cell (flow cell) type photoelectric field enhancement device having an inlet and an outlet has been described. It is good also as an apparatus provided with the photoelectric field enhancement sample cell which only hold | maintains a liquid sample.
また、光電場増強基板30の金属膜34が設けられている領域の裏面には、既述の光電場増強基板2と同様に、反射防止膜として機能する第2の透明な微細凹凸構造層を備えていてもよい。
In addition, on the back surface of the region where the
液体試料を流下させつつラマン散乱光を測定する際には、液体試料のラマン散乱光に対する透過率および吸収率が、液体試料の移動に伴い変動してしまう恐れがあることから、本実施形態のように基板30の裏面側からラマン散乱光を検出する構成とすることにより、従来の試料側(金属膜表面側)からラマン散乱光を検出する場合と比較して、液体試料の移動に伴う変動の影響を抑制することができ、好ましい。
When measuring the Raman scattered light while flowing down the liquid sample, the transmittance and the absorption rate of the liquid sample with respect to the Raman scattered light may change with the movement of the liquid sample. Thus, by adopting a configuration in which Raman scattered light is detected from the back side of the
(第3の実施形態)
本発明の測定方法および装置の第3の実施形態に係るラマン分光法およびラマン分光装置120について説明する。図7は、第3の実施形態に係るラマン分光装置120の構成を示す概略図である。
(Third embodiment)
A Raman spectroscopy and
図7に示すように、ラマン分光装置120は、第2の実施形態のラマン分光装置110において、さらに金属膜面側に第2の光検出部150’を備えてなるものである。
As shown in FIG. 7, the
第2の光検出部150’は、被検体Sから発せられた光を集光する集光レンズ146’と、集光レンズ146’を透過した光を直角方向に反射するミラー142’と、励起光L1を吸収し、それ以外の光を透過するノッチフィルタ151’と、ノイズ光を除去するためのピンホール152’を備えたピンホール板153’と、被検体Sから発せられ、レンズ146’およびノッチフィルタ151’を透過した増強ラマン散乱光L2を、ピンホール152’へ集光するためのレンズ154’と、ピンホール152を通ったラマン散乱光を平行光化するレンズ156’と、増強ラマン散乱光を検出する分光器158’とを備えている。
The second
本実施形態のラマン分光装置120を用いて、被検体Sのラマンスペクトルを測定するラマン分光方法について説明する。
A Raman spectroscopy method for measuring the Raman spectrum of the subject S using the
光照射部140の半導体レーザ141から励起光L1が射出され、励起光L1はミラー142で基板30側に反射され、ハーフミラー144を透過してレンズ146で集光されて、光電場増強基板30の被検体である液体試料Sと接触している金属膜34に照射される。
Excitation light L1 is emitted from the
励起光L1の照射により、光電場増強基板30の金属微細凹凸構造において局在プラズモン共鳴が誘起され、金属膜34表面に増強された光電場が生じる。この増強光電場により増強された、被検体Sから発せられたラマン散乱光L2は、基板30の裏面側からレンズ146を透過して、ハーフミラー144で分光器158側に反射されると共に、金属膜の表面側から被検体Sを透過して、さらにレンズ146’を透過して、ミラー142’で分光器158’側に反射される。なお、このとき、光電場増強基板30で反射された励起光L1もハーフミラー144により反射されて分光器158側に反射されるが、励起光L1はノッチフィルタ151でカットされる。一方、励起光とは波長が異なる光はノッチフィルタ151を透過し、レンズ154で集光され、ピンホール152を通り、再度レンズ156により平行光化され、分光器158へ入射する。同様に、光電場増強基板30を透過した励起光L1もレンズ146’を透過してミラー142’により反射された分光器158’側に反射されるが、励起光L1はノッチフィルタ151’でカットされる。一方、励起光とは波長が異なる光はノッチフィルタ151’を透過し、レンズ154’で集光され、ピンホール152’を通り、再度レンズ156’により平行光化され、分光器158’へ入射する。
Irradiation with the excitation light L1 induces localized plasmon resonance in the fine metal concavo-convex structure of the photoelectric
本実施形態のように、光電場増強デバイスの透明基板の表面側および裏面側の両方に光検出部150、150’を備えると、2つの分光器158および158’で取得した信号を図示しないデータ処理部において加算することにより、より検出感度を向上させることができる。
If the
上記各実施形態のラマン分光装置および方法は、いずれも、表面に透明な凹凸構造を備えた透明基板の該表面に金属膜を備えてなる光電場増強基板1、2、あるいは30を用い、その金属微細凹凸構造上に被検体を配置し、該被検体の配置箇所に対して励起光を照射し、その励起光の照射により被検体から生じた光を透明基板の裏面側から検出するようにしているので、被検体の種類や大きさに拘わらず、金属微細凹凸構造表面で最も強く生じる光電場増強効果による増強されたラマン散乱光(検出光)を検出することができる。
Each of the Raman spectroscopic apparatuses and methods of the above embodiments uses a photoelectric
本発明の測定方法および装置の実施形態として、上記においてはラマン分光法およびラマン分光装置について説明したが、本発明の測定方法および装置は、プラズモン増強蛍光検出法および蛍光検出装置に適用することもできる。蛍光検出装置において、上述の光電場増強基板1、2あるいは光電場増強試料セル3を用い、金属膜上に被検体を載置し、この被検体側もしくは透明基板側から励起光を照射することにより、裏面側から増強された蛍光を検出することができる。
As an embodiment of the measurement method and apparatus of the present invention, the Raman spectroscopy and the Raman spectroscopy apparatus have been described above. However, the measurement method and apparatus of the present invention may be applied to a plasmon enhanced fluorescence detection method and a fluorescence detection apparatus. it can. In the fluorescence detection apparatus, using the photoelectric
さらには、ラマン散乱光、蛍光の測定のみならず、励起光の照射を受けた被検体から生じるレーリー散乱光、ミー散乱光、あるいは第2高調波などの測定方法および装置においても、上述の光電場増強基板1、2あるいは光電場増強試料セル3を用い、金属膜上に被検体を載置し、この被検体側もしくは透明基板側から励起光を照射することにより、局在プラズモン共鳴に伴う増強された光電場を生じさせることができ、増強された光を検出することができる。
Furthermore, not only the measurement of Raman scattered light and fluorescence, but also the measuring method and apparatus described above such as Rayleigh scattered light, Mie scattered light, or second harmonic generated from a subject that has been irradiated with excitation light. By using the field-enhancing
以下、本発明の測定装置の第1の実施形態であるラマン分光装置に備えられている光電場増強基板1の具体的な作製例および測定用サンプルを用いてラマン分光測定を行った結果を説明する。
Hereinafter, a specific example of production of the photoelectric
「光電場増強基板の作製方法」
透明基板本体11として、ガラス基板(BK−7;コーニング社製Eagle2000)を用いた。
純水で超音波洗浄(45kHz、3分)による基板洗浄を行った。
洗浄後の基板11にスパッタ装置(キャノンアネルバ社製)を用いてアルミニウム20を50nm積層した。なお、表面形状測定器(TENCOR社製)を用いて、アルミニウム厚みを測定し、厚みは50nm(±10%)であることを確認した。
次に、容器の中に純水を用意して、ホットプレート上に載置して、純水を沸騰させた。
沸騰水の中にアルミニウム20付きガラス基板11を浸水させて、5分間経過後に取り出した。この際、基板11を沸騰水に浸水させて1−2分程度でアルミニウムが透明化したことを確認した。この煮沸処理(ベーマイト処理)により、アルミニウム20はベーマイト層22となった。
最後に、ベーマイト層22の表面に金属膜24としてAuを40nm程度蒸着した。
"Method for producing photoelectric field enhancement substrate"
As the
The substrate was cleaned with pure water by ultrasonic cleaning (45 kHz, 3 minutes).
Next, pure water was prepared in a container and placed on a hot plate to boil the pure water.
The
Finally, Au was deposited as a
「ラマン散乱光の測定」
上記方法で作製した光電場増強基板上に被検体として色素(ローダミン6G)を固定した測定サンプルを用い、基板の表裏からラマン散乱光を測定した。
"Measurement of Raman scattered light"
Using a measurement sample in which a dye (rhodamine 6G) was fixed as an analyte on the photoelectric field enhancement substrate produced by the above method, Raman scattered light was measured from the front and back of the substrate.
(測定サンプルの作製方法)
まず、図8を参照して測定サンプルの作製方法を説明する。
(Measurement sample preparation method)
First, a method for producing a measurement sample will be described with reference to FIG.
上記光電場増強基板1の作製方法において、透明な微細凹凸構造層上に金属膜を蒸着形成する際に、透明基板の周縁にマスクをし、蒸着後にマスクを除去して作製した光電場増強基板を用いた。したがって、測定サンプル用の光電場増強基板において、マスクされていた領域には金属膜が形成されていない。
In the method for producing the photoelectric
まず、図8左図に示すように、光電場増強基板1の、金膜24が形成されている領域および形成されていない領域に色素(ローダミンR6G)を含む溶液(R6G/エタノール:10mM)40を滴下した。
First, as shown in the left diagram of FIG. 8, a solution (R6G / ethanol: 10 mM) 40 containing a dye (rhodamine R6G) in the region where the
その後乾燥させることにより、図8右図に示すように、光電場増強基板1上の、金属膜24が形成されている領域および形成されていない領域に色素41が固着した測定サンプルを得た。
Thereafter, drying was performed to obtain a measurement sample in which the
(ラマン散乱光の測定方法)
この測定サンプルについて、図9に示す、ベーマイト表面側B_a、金膜表面側Au_a、金膜裏面側Au_b、金膜上の色素表面側SAu_a、金膜上の色素裏面側SAu_b、ベーマイト上の色素表面側S_a、ベーマイト上の色素裏面側S_bの計7つの測定箇所に対し、励起光を照射してそれぞれラマン散乱光を測定した。
(Measurement method of Raman scattered light)
For this measurement sample, boehmite surface side B_a, gold film surface side Au_a, gold film back surface side Au_b, dye surface side SAu_a on gold film, dye back surface side SAu_b on gold film, and dye surface on boehmite shown in FIG. Excitation light was irradiated to a total of seven measurement locations on the side S_a and the dye back side S_b on the boehmite, and Raman scattered light was measured.
ラマン散乱光は、顕微ラマン分光装置(Raman5)を用いて検出した。例えば、金膜上の色素表面側の測定とは、金膜上の色素表面側から励起光を照射し、該金膜上の色素表面側からラマン散乱光を検出したものである。励起光としては、ピーク波長785nmのレーザ光を用い、倍率20倍で観測した。 The Raman scattered light was detected using a micro Raman spectroscope (Raman 5). For example, the measurement on the dye surface side on the gold film means that the excitation light is irradiated from the dye surface side on the gold film and the Raman scattered light is detected from the dye surface side on the gold film. As the excitation light, laser light having a peak wavelength of 785 nm was used and observed at a magnification of 20 times.
(測定結果)
図10は、顕微ラマン分光装置により検出された各箇所からのラマンシフトスペクトル分布を示すグラフである。
(Measurement result)
FIG. 10 is a graph showing the Raman shift spectrum distribution from each part detected by the micro Raman spectroscope.
ベーマイト表面側B_a、ベーマイト上に固着された色素表面側S_aおよび裏面側S_bからの検出では、ラマン散乱光による信号はほとんど検出されなかった。このように、金膜が備えられていない部分における信号は表裏共に極めて低いことが分かる。 In detection from the boehmite surface side B_a, the dye surface side S_a fixed on the boehmite, and the back surface side S_b, signals due to Raman scattered light were hardly detected. Thus, it can be seen that the signal in the portion where the gold film is not provided is extremely low on both sides.
また、金膜上に色素が固着された箇所については、表面側SAu_aからの検出および裏面側SAu_bからの検出についていずれも高い強度のスペクトルが得られたが、いずれもバックグランドが高い。図中において、バックグランドと考えられる部分を破線で示している。このバックグラウンドを差し引いた信号が純粋なラマンシフト信号であると考えられる。ラマンシフト信号自体は、金膜上に色素表裏側SAu_a、SAu_bでほぼ同様箇所に同等の強度で検出された。 In addition, for the portion where the dye was fixed on the gold film, a high-intensity spectrum was obtained for both detection from the front surface side SAu_a and detection from the back surface side SAu_b, but both had high background. In the figure, a portion considered to be the background is indicated by a broken line. A signal obtained by subtracting this background is considered to be a pure Raman shift signal. The Raman shift signal itself was detected on the gold film with the same intensity at substantially the same location on the dye front and back sides SAu_a and SAu_b.
従来、ラマン測定において、基板の裏面側からラマン信号を検出した例は皆無であり、本発明者は、本発明の光電場増強デバイスを用いた上記のラマン測定により、基板の裏面側からラマン信号を検出することができることを見出した。 Conventionally, in Raman measurement, there is no example of detecting a Raman signal from the back side of the substrate, and the present inventor has found that the Raman signal is detected from the back side of the substrate by the above Raman measurement using the photoelectric field enhancement device of the present invention. Found that can be detected.
この測定結果から、金属微細凹凸構造に照射された光により生じる局在プラズモンにより増強された光電場が試料と相互作用を生じ、またさらに金属微細凹凸構造とラマン散乱光による何らかの相互作用により、裏面側からも表面側と同等程度の信号を得ることができたものと本発明者は推測している。 From this measurement result, the photoelectric field enhanced by the localized plasmon generated by the light irradiated to the metal fine concavo-convex structure interacts with the sample, and further, due to some interaction with the metal fine concavo-convex structure and Raman scattered light, the back surface The inventor presumes that the same level of signal was obtained from the side as well as the surface side.
本実施例においては、測定用サンプルにおいて被検体として乾燥して固着させた色素を用いており、被検体の厚みが非常に薄いものであったため、金膜上の色素表裏側での信号強度はほぼ同等であったが、細胞のような1μmオーダーの厚みを有する試料についてのラマン分光を行う場合などは、増強効果の高い金膜と試料との界面近傍における信号を裏面側から検出した方が有利であると考えられる。 In this example, the dye used as a specimen in the measurement sample was dried and fixed, and the specimen was very thin, so the signal intensity on the front and back sides of the dye on the gold film was Although it was almost the same, when performing Raman spectroscopy on a sample such as a cell with a thickness of the order of 1 μm, it is better to detect the signal near the interface between the gold film and the sample with a high enhancement effect from the back side. It is considered advantageous.
このような、基板の裏面側からのラマン信号の検出は、基板本体および微細凹凸構造が共に透明な透明基板を備えた光電場増強デバイスを用いた測定方法および装置により初めて達成することができたものである。従来の不透明な基板上に凹凸が備えられた構造や、透明基板上に凹凸が不透明な材料で形成されている構造の光電場増強基板を用いた測定方法および装置では、ラマン散乱光を基板の裏面側から検出することは困難である。 Such detection of the Raman signal from the back side of the substrate could be achieved for the first time by a measurement method and apparatus using a photoelectric field enhancement device provided with a transparent substrate in which both the substrate body and the fine concavo-convex structure are transparent. Is. In a conventional measuring method and apparatus using a photoelectric field enhancing substrate having a structure with an uneven surface on an opaque substrate or a structure having an uneven surface on a transparent substrate, Raman scattered light is emitted from the substrate. It is difficult to detect from the back side.
従来は、金属凹凸構造の表面に生じた増強された光電場により増強されたラマン散乱光を、基板の裏面側から検出できるとは考えられていなかったため、そもそも基板および凹凸構造を透明な材料により構成するという発想自体がなく、基板本体および微細凹凸構造全体を透明な材料から構成した増強ラマンデバイス(光電場増強基板)は皆無であった。 Conventionally, it was not thought that Raman scattered light enhanced by the enhanced photoelectric field generated on the surface of the metal concavo-convex structure could be detected from the back side of the substrate, so the substrate and the concavo-convex structure were originally made of a transparent material. There was no idea of constructing itself, and there was no enhanced Raman device (photoelectric field enhancing substrate) in which the substrate body and the entire fine concavo-convex structure were composed of a transparent material.
なお、ラマン分光の測定のみならず、蛍光、第2高調波、ミー散乱、レーリー散乱の測定においても同様に、光電場増強基板の透明基板裏面側から光を検出する構成とすることにより、金属膜表面で被検体から生じ、増強された光を被検体により遮蔽されることなく検出することができるため、高い信号強度で測定が可能となる。 In addition, not only in the measurement of Raman spectroscopy but also in the measurement of fluorescence, second harmonic, Mie scattering, and Rayleigh scattering, it is possible to detect the metal from the transparent substrate rear surface side of the photoelectric field enhancement substrate, so that the metal Since the enhanced light generated from the subject on the surface of the film can be detected without being shielded by the subject, the measurement can be performed with high signal intensity.
1、2 光電場増強基板(光電場増強デバイス)
3 光電場増強試料セル(光電場増強デバイス)
10 透明基板
11、31 透明基板本体
20 アルミニウム
22、32 微細凹凸構造(ベーマイト層)
24、34 金属膜
100、110、120 ラマン分光装置
140 励起光照射部
150 光検出部
1, 2 Photoelectric field enhancement substrate (photoelectric field enhancement device)
3 Photoelectric field enhancement sample cell (photoelectric field enhancement device)
10
24, 34
Claims (9)
該光電場増強デバイスの前記金属膜上に被検体を配置し、
前記光電場増強デバイスの前記被検体の配置箇所に対して励起光を照射し、
該励起光の照射により前記被検体から生じたラマン散乱光を、前記透明基板の裏面側から検出することを特徴とする測定方法。 Using a photoelectric field enhancement device provided with a transparent substrate having a transparent fine concavo-convex structure made of boehmite on the surface and a metal film formed on the surface of the fine concavo-convex structure on the surface,
An object is disposed on the metal film of the photoelectric field enhancing device,
Irradiating excitation light to the location of the subject of the photoelectric field enhancement device,
A measurement method comprising detecting Raman scattered light generated from the subject by irradiation of the excitation light from the back side of the transparent substrate.
該光電場増強デバイスの前記被検体の配置箇所に対して励起光を照射する励起光照射部と、
前記光電場増強デバイスの裏面側に配置され、前記励起光の照射により前記被検体から生じたラマン散乱光を、前記透明基板の裏面側から検出する光検出部とを備え、
前記透明基板が、透明基板本体と、該透明基板本体の表面に備えられた前記微細凹凸構造を構成する、ベーマイトからなる微細凹凸構造層とからなるものであることを特徴とする測定装置。 A photoelectric field comprising a transparent substrate having a transparent fine concavo-convex structure on the surface and a metal film formed on the surface of the fine concavo-convex structure on the surface, and an analyte is disposed on the surface side where the metal film is formed An enhancement device;
An excitation light irradiating unit that irradiates excitation light to an arrangement location of the subject of the photoelectric field enhancement device;
A light detection unit that is disposed on the back side of the photoelectric field enhancement device and detects Raman scattered light generated from the subject by irradiation of the excitation light from the back side of the transparent substrate;
The measurement apparatus, wherein the transparent substrate comprises a transparent substrate main body and a fine concavo-convex structure layer made of boehmite that constitutes the fine concavo-convex structure provided on the surface of the transparent substrate main body .
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