JP6572268B2 - 重合反応のための合成核酸 - Google Patents
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Description
本発明は重合反応のための合成核酸に関する。
サーモサイクリングＤＮＡ増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または等温ＤＮＡ増幅反応、例えばループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）における反応開始前の非特異的プライマー伸長は特異的産物形成を抑制し、非特異的増幅および反応の再現不能性を招く。したがって、反応開始前にポリメラーゼの活性を阻止し、それによりプライマー伸長を抑制することが望ましい。これは、抗体（Ｋｅｌｌｏｇｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６（６）：１１３４−７（１９９４））、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、アプタマー（Ｄａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６４（２）：２６８−７８（１９９６））およびポリメラーゼの化学修飾（米国特許第６，１８３，９９８号）により達成されている。これらの技術のそれぞれは有効でありうるが、それらはそれぞれ、特有の欠点を有する。例えば、抗体の製造は動物系の使用を要し、アフィボディおよびアプタマーは分子変異体のライブラリーのスクリーニングを要し、化学修飾は、不活性化修飾を逆転させるための追加的な加熱インキュベーション工程を要する。ＤＮＡポリメラーゼに標的化されるホット・スタート・インヒビターを迅速かつ有効に製造するための一般化可能なアプローチを得ることが望ましいであろう。
Ｋｅｌｌｏｇｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６（６）：１１３４−７（１９９４）
Ｄａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６４（２）：２６８−７８（１９９６）
一般に、１つの態様においては、３’末端から伸長する二本鎖領域と、少なくとも１つのウラシルまたはイノシンを含有する５’一本鎖伸長を有する一本鎖領域とを形成しうる、３’末端および５’末端を有する合成一本鎖核酸、およびバッファーを含む調製物を提供する。合成一本鎖核酸の一例を図１に示す。
実施形態は以下の特徴の１以上を含みうる：前記の少なくとも１つの二本鎖領域は、例えば９０℃、８９℃、８８℃、８７℃、８６℃、８５℃、７５℃、６５℃、５５℃、４５℃または３５℃未満のような、増幅反応における標的ＤＮＡのＴｍより少なくとも１０℃低い融解温度（Ｔｍ）を有する；ウラシルまたはイノシンは、該５’一本鎖伸長において、３’末端から数えて４番目の位置に位置する；該合成核酸は複数の一本鎖領域を形成しうる；第２一本鎖領域はスペーサーである；第３一本鎖領域は該合成核酸内の内部位置で一本鎖ループを形成する；該バッファーはポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、またはプライマーの少なくとも１つを含有しうる；該スペーサーはヘキサ−エチレングリコール、３炭素の分子または１’，２’−ジデオキシリボースを含む；該合成核酸は３’末端の核酸配列内に誘導体ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド結合を含有し、ここで、該誘導体ヌクレオチドは、１以上の逆方向ヌクレオチド、ジ−デオキシヌクレオチドまたはアミノ修飾ヌクレオチドから選択されることが可能であり、例えば、該ヌクレオチド結合はホスホロチオアート結合でありうる。
１つの実施形態においては、該調製物は更に、１以上のポリメラーゼ、例えば１以上の熱安定性ポリメラーゼ、例えば少なくとも１つの古細菌ポリメラーゼ；細菌ポリメラーゼ、および／または野生型古細菌もしくは細菌ポリメラーゼの変異体を含む。該合成核酸および該ポリメラーゼは０．５：１〜１０：１のモル比で存在しうる。
一般に、１つの態様においては、野生型ポリメラーゼの変異体は配列番号２５に対して少なくとも９３％の配列同一性を含み、更に、配列番号２５における２７８、３０７および／または４０２に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの突然変異を含む。もう１つの態様においては、２７８、３０７および／または４０２における突然変異は、米国特許出願第１３／８２３，８１１号に記載されているＢｓｔポリメラーゼ変異体のいずれかに挿入されうる。
実施形態は該調製物の以下の特徴の１以上を含みうる：Ｓｓｏ７ｄのようなＤＮＡ結合ドメインとの変異体ポリメラーゼの融合；および／または２７８、３０７および／または４０２に対応する位置の１以上に、ヒスチジンではないアミノ酸を場合により有しうる変異体ポリメラーゼ；例えば、ここで、１以上の突然変異は、Ｈ２７８Ｑ、Ｈ３０７Ｒ、Ｈ４０２Ｑに対応する突然変異の群から選択されうる。
一般に、１つの態様においては、ポリメラーゼ伸長反応を抑制するための方法を提供し、該方法は、ポリメラーゼ、標的ＤＮＡおよびｄＮＴＰを含有する混合物に前記の調製物を加え、該標的ＤＮＡの伸長または増幅の前に一定時間にわたって、該合成核酸の二本鎖部分のＴｍより低い温度で該混合物を維持することを含む。
実施形態は以下の特徴の１以上を含みうる：前記の少なくとも１つの二本鎖領域は、例えば９０℃、８９℃、８８℃、８７℃、８６℃、８５℃、７５℃、６５℃、５５℃、４５℃または３５℃未満のような、増幅反応における標的ＤＮＡのＴｍより少なくとも１０℃低いＴｍを有する；ウラシルまたはイノシンは、該５’一本鎖伸長において、３’末端から数えて４番目の位置に位置する；該合成核酸は追加的な一本鎖核酸領域を含むことが可能であり、例えば、第２一本鎖領域はスペーサーである；ここで、例えば、該スペーサーはヘキサ−エチレングリコール、３炭素の分子または１’，２’−ジデオキシリボースを含むことが可能である；および／または第３一本鎖領域は該合成核酸内の内部位置で一本鎖ループを形成する。
１つの実施形態においては、該合成核酸は３’末端に少なくとも１つの誘導体ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド結合を含有し、ここで、そのような少なくとも１つの誘導体ヌクレオチドは、１以上の逆方向ヌクレオチド、ジ−デオキシヌクレオチドまたはアミノ修飾ヌクレオチドから選択されることが可能であり、例えば、そのような少なくとも１つのヌクレオチド結合はホスホロチオアート結合でありうる。
１つの実施形態においては、前記の１以上のポリメラーゼは、１以上の熱安定性ポリメラーゼ、例えば少なくとも１つの古細菌ポリメラーゼ；細菌ポリメラーゼ、および／または野生型古細菌もしくは細菌ポリメラーゼの変異体を含みうる。該合成核酸および該ポリメラーゼは０．５：１〜１０：１のモル比で存在しうる。
１つの実施形態においては、該反応温度を該合成核酸のＴｍより高くすることにより、ポリメラーゼ伸長反応の抑制を逆転させる追加的な工程が含まれうる。
ポリメラーゼ伸長反応を可逆的に抑制する合成核酸を記載する。これらの合成核酸は、好ましくは、二本鎖領域に隣接する５’一本鎖突出において少なくとも１つの非鎖塩基（例えば、ＵまたはＩ）を含有する。該二本鎖領域が一本鎖に変性したら、該合成核酸は、もはや、ポリメラーゼが基質ＤＮＡを複製するのを阻止しない。好ましくは、ポリメラーゼ活性の抑制は、ポリメラーゼ伸長反応に適した第２温度より少なくとも１０℃低い第１温度で生じる。ポリメラーゼ伸長反応はポリメラーゼによる第１一本鎖核酸の伸長を意味し、ここで、該伸長は、第１鎖に結合した第２核酸に相補的である。
１つの実施形態においては、合成核酸は、該二本鎖領域が所望の温度で融解するように操作され、そのような所望の温度は、重合伸長条件より約１５℃または１４℃または１３℃または１２℃または１１℃または１０℃または９℃または８℃低い温度でそれが融解するように選択される。ポリメラーゼ伸長条件は、例えば６５℃で生じる等温増幅、またはより高い温度、例えば約９５℃で生じるＰＣＲのようなサーモサイクリング増幅のための条件を含む。例えば、該合成核酸内の二本鎖領域は、−８０℃〜３７℃の範囲の特定の温度では無傷のままであるが、３７℃〜１００℃の範囲の特定の温度では変性するように設計されうる。該合成核酸のＴｍは、該二本鎖領域の配列または長さの変化、内部一本鎖領域の長さの変化、該二本鎖領域へのミスマッチまたは修飾塩基の付加、選択された塩型（例えば、マグネシウム）および濃度を有する重合反応バッファーにおける、より弱い塩基対形成特性を有するヌクレオチド組成（例えば、アデニン、チミンまたはウラシルに富む配列）またはイノシンもしくは非塩基部位、例えば１’，２’ジデオキシリボースを含有する配列の選択を含む１以上の要因により調節されうる。バッファーの一例として、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）が挙げられる。
本発明の１つの実施形態においては、ポリメラーゼ伸長反応の合成核酸可逆的インヒビターの設計は以下の特徴を含む。該合成核酸はＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡでありうる。それは２つの一本鎖から又は単一核酸（オリゴヌクレオチド）から形成されうるが、少なくとも１つの二本鎖領域および５’一本鎖突出を形成しうるものであるべきである。それは、場合により、複数の一本鎖領域および複数の二本鎖領域を含有しうる。該合成核酸がオリゴヌクレオチドである場合、それは、前記のとおり、反応温度より低い温度で、少なくとも１つの二本鎖領域を含有するようにフォールディングしうるものであるべきである。該オリゴヌクレオチドは８〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有しうる。該インヒビターにおけるいずれの二本鎖領域も、好ましくは、４〜３５ヌクレオチドの長さを有する。
該５’一本鎖突出は少なくとも４ヌクレオチド、好ましくは１００ヌクレオチド長未満、例えば４〜４０ヌクレオチド、例えば６〜１０ヌクレオチドであるべきであり、該二本鎖領域から数えて該突出の２位と１０位との間、例えば４位に位置する例えばＵまたはＩのような１以上の非鎖ヌクレオチドを含有するべきであり、ここで、そのような１以上の非鎖ヌクレオチドは１〜５個のウラシルまたは１〜５個のイノシンでありうる。例えば、表１に示されている配列は全て、可逆的結合性オリゴヌクレオチドとして有効であることが判明した。
また、合成核酸は、場合により、エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性であり及び／又はポリメラーゼにより伸長され得ない３’末端を有しうる。該オリゴヌクレオチドの３’末端は、修飾、例えばジデオキシヌクレオチド、スペーサー分子、逆方向塩基またはアミノ修飾ヌクレオチドにより、伸長から遮断されうる。該３’末端は、３’末端における又はその付近における１以上の塩基の間のホスホロチオアート結合の付加あるいは３’末端における逆方向塩基の使用により、エキソヌクレアーゼ分解に対して抵抗性にされうる。該オリゴヌクレオチドは、該内部配列内に複製不能塩基、例えば炭素スペーサー、１’，２’−ジデオキシリボース、非塩基部位またはチミン二量体を付加することにより、増幅不能にされうる。
表１は、本明細書に記載されているアッセイにおいて有効であることが判明した、ヘアピンを形成しうる合成核酸分子の具体例を示す。例示されている合成核酸分子はＴｎまたはＸｎ（ここで、Ｔ（４−ｇ）またはＸ（ｉ−４））のスペーサー、修飾塩基を含有する５’末端、Ｕ（ｉ−５）またはＩ（ｉ−３）を有し、該二本鎖領域から数えて４位にＵまたはＩを有する。該５’末端は、示されているとおり様々である。
本発明の１つの実施形態においては、１以上のポリメラーゼを該合成核酸に加える。該ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼ、例えば野生型または組換え古細菌ＤＮＡポリメラーゼまたは細菌ＤＮＡポリメラーゼまたはそれらの変異体（突然変異体）であることが可能であり、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばＳｓｏ７ｄ（米国特許第７，６６６，６４５号）に該ポリメラーゼまたはその変異体が融合していてもよい融合タンパク質を含みうる。ＤＮＡ結合ドメインへの融合（そのようなものが存在する場合）の前に配列番号２５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９５％または９８％のアミノ酸配列相同性または類似性を有する細菌ポリメラーゼの変異体が例示されている。追加的なＤＮＡ結合ドメインの存在には無関係に、該変異体は、好ましくは、配列番号２５における５２（Ｒではない）、２７８、３０７、４０２および／または５７８（Ｒではない）に対応する位置における１以上の変異、例えば、以下の突然変異の１以上を含む：Ｈ２７８Ｑ、Ｈ３０７Ｒ、Ｈ４０２Ｑ。追加的な突然変異は、場合により、ランダムまたは特異的な突然変異誘発の通常の方法により、該ポリメラーゼ内に導入されうる。
本明細書に記載されている増幅方法は、標準的なサーモサイクリングまたは等温増幅反応、例えばＰＣＲ増幅またはＬＡＭＰ（Ｇｉｌｌら，Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２７：２２４−４３（２００８）；Ｋｉｍら，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，３：２２７−３９（２０１１）；Ｎａｇａｍｉｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１６：２２３−９（２００２）；Ｎｏｔｏｍｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：Ｅ６３（２０００）；およびＮａｇａｍｉｎｅら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４７：１７４２−３（２００１））、ヘリカーゼ置換増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）および／または鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含む。本明細書に記載されている変異体ポリメラーゼは、本明細書に記載されている合成核酸を使用して又は使用しないで、増幅または配列決定反応において使用されうる。
野生型Ｂｓｔポリメラーゼのアミノ酸配列
本明細書中で引用されている全ての参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする。
ＰＣＲサイクリング前にポリメラーゼ活性の抑制を測定するためのアッセイ
後続のＰＣＲアッセイにおいて用いられる温度より低い温度でポリメラーゼ活性の抑制を測定した。
後続のＰＣＲアッセイにおいて用いられる温度より低い温度でポリメラーゼ活性の抑制を測定した。
該アッセイは、以下のとおりに行った。
２ｋｂ ラムダ（Ｌａｍｂｄａ）ＤＮＡアンプリコンを産生するＰＣＲのためにプライマーを作製した。また、該リバースプライマーの３’末端は、ラムダＤＮＡにアニールして偽プライミング部位を生成して非特異的な７３７ｂｐのアンプリコンを与えうる８個のヌクレオチドを含有していた。
該ＰＣＲアッセイは、高レベルのヒトゲノムＤＮＡの存在下で行った。該反応混合物を該熱安定性ポリメラーゼと共にＰＣＲサイクリングの前に２５℃で１５分間インキュベートした。これらの条件は、非特異的産物を形成する多数の機会をもたらした。増幅前にポリメラーゼ活性を抑制する核酸組成物の存在は、非特異的産物を最小限度で伴って又は全く伴わないで２ｋｂのアンプリコンを得るために必要であった。該反応混合物は氷上に配置され、以下の試薬を含有していた：テルモポール（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ）バッファー、０．４ｐｇ／μｌ ラムダＤＮＡ、２．０ｎｇ／μｌ ジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）ゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰおよび０．２μＭ プライマー。
フォワードプライマー，Ｌ３０３５０Ｆ：５’ＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣ３’（配列番号１）。
リバースプライマー，Ｌ２ｋｂａｌｔ４ｒｖ：５’ＧＧＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＣＧＣＡＴＣＣＣ３’（配列番号２）。
０．２５μｌ〜０．５０μｌの２．０単位／μｌ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を該核酸組成物の存在下または非存在下（図２を参照されたい）、０．２５μｌまたは５０μｌの該反応混合物に加え、ＰＣＲ装置に移し、２５℃で１５〜３０分間のサイクル、ついで９８℃で１０秒間、４５℃で２０秒間、７２℃で６０秒間、７２℃で４分間の３５回のサイクルに付した。ＰＣＲサイクルにより産生されＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。
可逆的抑制性合成核酸の非存在下では、該ポリメラーゼは、予想される２ｋｂのラムダアンプリコンを産生しなかった。７３７ｂｐのアンプリコンを含む非特異的産物が観察された。オリゴヌクレオチドインヒビターの存在下では、確固たる収率の、予想される２ｋｂのラムダアンプリコンが、非特異的産物を最低限度で伴って又は全く伴うことなく産生された。
Claims (27)
- 熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、
３’末端および５’末端を有し、ヘアピン構造を形成する合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドはヘアピン構造を形成したときに３’末端から開始する二本鎖領域と５’一本鎖ＤＮＡ突出部を有し、該５’一本鎖ＤＮＡ突出部の一本鎖部分は、３’末端と対を形成している塩基に隣接する塩基から数えて４番目の位置にウラシル又はイノシンを含み、
調製物が２５℃の温度であるときにおいて該ポリメラーゼを阻害し、７２℃以上の温度において該ポリメラーゼを阻害しない、オリゴヌクレオチド、
およびバッファーを含む調製物。 - さらにプライマーを含み、少なくとも１つの二本鎖領域が、増幅反応におけるプライマーの融解温度より少なくとも１０℃低い融解温度を有する、請求項１記載の調製物。
- 少なくとも１つの二本鎖領域が、９０℃未満の融解温度を有する、請求項１または請求項２記載の調製物。
- 合成核酸が、複数の一本鎖領域を形成しうる、請求項１〜３のいずれか１項記載の調製物。
- 第２一本鎖領域が、スペーサーである、請求項４記載の調製物。
- 第３一本鎖領域が、合成核酸内の内部位置で一本鎖ループを形成する、請求項４又は５記載の調製物。
- ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、またはプライマーの少なくとも１つを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の調製物。
- スペーサーが、ヘキサ−エチレングリコールまたは１’，２’−ジデオキシリボースを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の調製物。
- 合成核酸が、３’末端の配列内に少なくとも１つの誘導体ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド結合を含有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の調製物。
- 少なくとも１つの誘導体ヌクレオチドが、１以上の逆方向ヌクレオチド、ジ−デオキシヌクレオチドまたはアミノ修飾ヌクレオチドから選択される、請求項９記載の調製物。
- 少なくとも１つのヌクレオチド結合が、ホスホロチオアート結合である、請求項１〜９のいずれか１項記載の調製物。
- 合成核酸および熱安定性ポリメラーゼが、０．５：１〜１０：１のモル比で存在する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の調製物。
- 野生型ポリメラーゼの変異体を更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の調製物。
- 野生型ポリメラーゼの変異体が、配列番号２５に対して少なくとも９３％の配列同一性を含み、更に、配列番号２５における２７８、３０７および／または４０２に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの突然変異を含む、野生型ポリメラーゼの変異体である請求項１３記載の調製物。
- 野生型ポリメラーゼの変異体が、ＤＮＡ結合ドメインに融合している、請求項１４記載の調製物。
- 野生型ポリメラーゼの変異体のＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ７ｄである、請求項１４又は１５記載の調製物。
- 野生型ポリメラーゼの変異体における、２７８、３０７および／または４０２に対応する位置の１以上におけるアミノ酸が、ヒスチジンではなく、場合により、ＤＮＡ結合タンパク質に融合していてもよい、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の調製物。
- 野生型ポリメラーゼの変異体が、Ｈ２７８Ｑ、Ｈ３０７Ｒ、Ｈ４０２Ｑに対応する突然変異の群から選択される１以上の突然変異を更に含み、場合により、ＤＮＡ結合タンパク質に融合していてもよい、請求項１４〜１７のいずれか１項記載の調製物。
- （ａ）少なくとも１つのポリメラーゼ、標的ＤＮＡおよびｄＮＴＰを含有する混合物に、請求項１〜１３のいずれか１項記載の調製物を加え、
（ｂ）標的ＤＮＡの伸長または増幅の前に、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの二本鎖部分の融解温度より低い温度で混合物を維持することを含む、ポリメラーゼ伸長反応を抑制する方法であって、
ウラシルまたはイノシンが、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’一本鎖ＤＮＡ突出部において、３’末端と対形成している塩基に隣接する塩基から数えて４番目の位置に位置する、方法。 - 合成核酸の二本鎖部分の融解温度が、９０℃未満である、請求項１９記載の方法。
- 合成核酸が、複数の一本鎖領域を形成しうる、請求項１９または２０記載の方法。
- 第２一本鎖領域が、スペーサーである、請求項２１記載の方法。
- 第３一本鎖領域が、合成核酸内の内部位置でループを形成する、請求項２１又は２２記載の方法。
- スペーサーが、ヘキサ−エチレングリコールまたは１’，２’−ジデオキシリボースを含む、請求項２２記載の方法。
- ３’末端が、誘導体ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド結合を含有する、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の方法。
- 誘導体ヌクレオチドが、１以上の逆方向ヌクレオチド、ジ−デオキシヌクレオチドまたはアミノ修飾ヌクレオチドから選択される、請求項２５記載の方法。
- ヌクレオチド結合が、ホスホロチオアート結合である、請求項２５記載の方法。
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