JP6536836B2 - カルス誘導剤及びカルス誘導方法 - Google Patents

Description

本発明は、カルス誘導剤及びカルス誘導方法に関する。

植物は分化全能性を持ち、高度に分化した体細胞からカルスを形成させることができ、また、カルスを一定条件下で培養すれば、不定胚や不定芽及び不定根の分化を経て、植物個体を再生させることができる。カルス培養は、１）無限増殖能を有する、２）カルスの細胞塊から様々な組織や個体へ分化させることができる、３）植物体では得にくい増殖細胞が均一かつ多量に得られる、４）細胞の質や量に季節変動がなく実験材料として適している、５）培地に加えた物質の植物に対する影響を直接に見ることができる、６）植物によってはカルスを経ることにより遺伝子の変異が誘発されやすく育種などに利用できる等の点で優れている。そのため、カルス培養は、有用物質の生産、新品種の開発、植物体への遺伝子導入及び形質転換体の再生、人工種子の生産等に広く利用されている。

カルスは、通常、植物ホルモンであるオーキシンとサイトカイニンを含む培地上で植物の組織切片を培養する方法で作製される（非特許文献１）。この方法は３０年以上前に確立しており、現在は遺伝子組み換え作物の作製にも欠かすことのできない技術である。その一方で植物種によって使用するオーキシンとサイトカイニンの種類や濃度比が異なるため、適切なカルス化条件を見つけ出す困難さが課題となっていた。

合成オーキシンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸が知られ、またこれらの類縁体である４−クロロフェノキシ酢酸について、セントポーリアの葉組織培養における外植体の置床からカルス形成、不定苗条及び不定根の形成までに要した日数が特定の濃度処理により短縮されたことが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、カルス化の効率が高いとはいえず、カルス化できる植物種も限られていた。

一方、１，４−二置換ピペラジン誘導体としては、特許文献１には、Ｎ−メチル−Ｎ’−フェニルアセチルピペラジン、Ｎ−ベンジル−Ｎ’−ベンゾイルピペラジン等が２色感熱記録材料における発色系に対する消色剤として有用であることが記載されている。

特許文献２には、ピペラジン環の１位及び４位以外にも置換基を有するピペラジン誘導体が抗炎症剤として有用であることが記載されている。

また、１，４−二置換ピペラジン誘導体の１種であるフィペキシド（fipexide; 1-[(p-chlorophenoxy)acetyl]-4-piperonylpiperazine、1-(4-chlorophenoxyacetyl)-4-(1,3-benzodioxole-5-ylmethyl)piperazine）は抗うつ薬として知られている。

更に、１−ピペロニルピペラジン（１−（３，４−メチレンジオキシベンジル）ピペラジン）及びその類縁体である多数の１−置換ピペラジン誘導体が製造原料等の目的で市販されている。

しかしながら、１，４−二置換ピペラジン誘導体及び１−置換ピペラジン誘導体がカルスを誘導させる作用を有することはこれまで報告されていない。

特公平６−６７６６８号公報 特表２００２−５０３２３９号公報

Skoog, F., and Miller, C.O. (1957). Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 54, 118-130. 箱崎 美義他、4-クロロフェノキシ酢酸がセントポーリアの葉外植片のカルス・不定苗条および不定根形式に及ぼす影響、明治大学科学技術研究所紀要 40, 1-7, 2001

本発明は、従来のカルス誘導剤とは異なる基本構造を有するカルス誘導剤、及び当該カルス誘導剤を用いるカルス誘導方法を提供することを目的とする。

本発明の要旨は以下のとおりである。

（１）次式（Ｉ）：

（式中、Ａｒ^１は、少なくとも、Ｃ_１−６−アルコキシ基及び置換又は非置換のメチレンジオキシ基から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたフェニル基であり；
Ａｒ^２は１〜３個のハロゲン原子で置換されたフェニル基であり；
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ、水素原子、置換又は非置換のＣ_１−３−アルキル基、シアノ基又はカルボキシル基であり；
Ｒ^１及びＲ^２は、共同してオキソ基を表してもよく；
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ、水素原子又はメチル基であり；
Ｒ^３とＲ^４、Ｒ^５とＲ^６、Ｒ^７とＲ^８、及び／又はＲ^９とＲ^１０は、共同してオキソ基を表してもよい。）
で示される化合物又はその塩を含有するカルス誘導剤。

（２）前記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩がフィペキシド又はその塩である前記（１）に記載のカルス誘導剤。

（３）次式（Ｉ−１）：

（式中、Ａｒ^１、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は、前記（１）に記載の前記式（Ｉ）中の定義と同義であり、Ｒ^１１は水素原子、置換又は非置換のＣ_１−７−炭化水素基又はアミジノ基である。）
で示される化合物又はその塩、及び次式（Ｉ−２）：

（式中、Ａｒ^２は、前記（１）に記載の前記式（Ｉ）中の定義と同義である。）
で示される化合物又はその塩を含有するカルス誘導剤。

（４）前記式（Ｉ−１）で示される化合物又はその塩が１−ピペロニルピペラジン又はその塩であり、前記式（Ｉ−２）で示される化合物又はその塩が４−クロロフェノキシ酢酸又はその塩である前記（３）に記載のカルス誘導剤。

（５）植物体、植物細胞、植物組織片又は植物種子を、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のカルス誘導剤と接触させ、カルス化を誘導することを含むカルス誘導方法。

（６）植物体、植物細胞、植物組織片又は植物種子を、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のカルス誘導剤と接触させ、カルス化を誘導し、増殖することを含むカルス作製方法。

（７）前記（６）に記載の方法で作製されるカルス。

（８）アグロバクテリウム法による植物の形質転換方法において、カルス誘導培地として前記（１）〜（４）のいずれかに記載のカルス誘導剤を含有する培地を用いることを含む植物の形質転換方法。

本発明のカルス誘導剤は、従来のカルス誘導剤とは異なる基本構造を有する１，４−二置換ピペラジン誘導体又は１−置換ピペラジン誘導体を有効成分とするものであり、適用できる植物の範囲が広い。

図１はアラビドプシスを用いたフィペキシド（ＦＰＸ）のカルス誘導活性試験の結果を示す。 図２はフィペキシド処理（Ａ）及び非処理（Ｂ）における再分化の状態を示す。 図３はフィペキシド（ＦＰＸ）と従来法（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）／カイネチン）とのカルス誘導効率を比較した結果を示す。 図４はフィペキシド（ＦＰＸ）、４−クロロフェノキシ酢酸単剤（ＣＰＡ）、１−ピペロニルピペラジン（ＰＰＺ）単剤、及び４−クロロフェノキシ酢酸（ＣＰＡ）と１−ピペロニルピペラジン（ＰＰＺ）の併用の処理によるカルス誘導活性試験の結果を示す。 図５はイネ野生型日本晴種を用いたフィペキシド（ＦＰＸ）のカルス誘導活性試験の結果を示す。 図６はダイズ種子（鶴の子）、トマト種子（マイクロトム）及びキュウリ種子（夏すずみ）に対するフィペキシド（ＦＰＸ）のカルス誘導活性試験の結果を示す。 図７はポプラ野生型を用いたフィペキシド（ＦＰＸ）のカルス誘導活性試験の結果を示す。 図８はフィペキシドによるカルス誘導を利用したアグロバクテリウム法による植物の形質転換の結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、特定の置換ピペラジン骨格（１つの窒素原子がＡｒ^１−Ｃ（Ｒ^１）（Ｒ^２）−で置換されたピペラジン骨格）と、ベンゼン環が１〜３個のハロゲン原子で置換されたフェノキシアセチル基（−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−Ａｒ^２）を同一分子中に有する化合物を用いて、あるいは、前記置換ピペラジン骨格と、前記置換フェノキシアセチル基を、それぞれ別個の分子中に有する２種の化合物を併用して、カルスを誘導するためのカルス誘導剤及びカルス誘導方法に関するものである。

前記置換ピペラジン骨格を有する化合物とカルス誘導との関係についてはこれまで報告されていない。

前記式（Ｉ）及び（Ｉ−２）においてＡｒ^２で表される置換フェニル基における置換基としてのハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、ヨウ素原子が挙げられる。

ベンゼン環が１〜３個のハロゲン原子で置換されたフェノキシアセチル基（−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−Ａｒ^２）を有する化合物としては、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、４−クロロフェノキシ酢酸があり、これらは合成オーキシンとして知られている。

前記式（Ｉ）及び（Ｉ−１）においてＡｒ^１で表される置換フェニル基における置換基としてのＣ_１−６−アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基が挙げられ、置換メチレンジオキシ基としては、例えばジフルオロメチレンジオキシ基、ジクロロメチレンジオキシ基が挙げられる。

Ａｒ^１で表される置換フェニル基としては、例えば３，４−メチレンジオキシフェニル基（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基）、２，３−メチレンジオキシフェニル基（１，３−ベンゾジオキソール−４−イル基）、３，４−（ジフルオロメチレンジオキシ）フェニル基（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基）、２，３−（ジフルオロメチレンジオキシ）フェニル基（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−４−イル基）、３，４−メチレンジオキシ−５−メトキシフェニル基（７−メトキシ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基）、３，４−ジメトキシフェニル基、３，４，５−トリメトキシフェニル基、好ましくは３，４−メチレンジオキシフェニル基（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基）が挙げられる。

前記式（Ｉ）及び（Ｉ−２）においてＡｒ^２で表される置換フェニル基としては、例えば４−クロロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、２，４，５−トリクロロフェニル基、好ましくは４−クロロフェニル基が挙げられる。

前記式（Ｉ）及び（Ｉ−１）においてＲ^１又はＲ^２で表されるＣ_１−３−アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基が挙げられ、これらのＣ_１−３−アルキル基は、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、ニトロ基等から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。Ｒ^１及びＲ^２は、共同してオキソ基を表してもよい。Ｒ^１及びＲ^２としては、水素原子が好ましい。

前記式（Ｉ）及び（Ｉ−１）におけるＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０としては、水素原子が好ましい。

前記式（Ｉ−１）においてＲ^１１で表されるＣ_１−７−炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基等のＣ_１−５−アルキル基；アリル基（２−プロペン−１−イル基）、２−メチル−２−プロペン−１−イル基等のＣ_２−５−アルケニル基；プロパルギル基（２−プロピン−１−イル基）等のＣ_２−５−アルキニル基；ベンジル基が挙げられ、これらのＣ_１−７−炭化水素基は、アミノ基、水酸基、シアノ基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、メトキシ基等から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。

前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、Ａｒ^１で表される置換フェニル基が３，４−メチレンジオキシフェニル基（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基）であり、Ａｒ^２で表される置換フェニル基が４−クロロフェニル基であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であるフィペキシドは、置換基が少なく、抗うつ薬として知られている市販の化合物であり、入手容易性の点で好ましい。

前記式（Ｉ−１）で示される化合物のうち、Ａｒ^１で表される置換フェニル基が３，４−メチレンジオキシフェニル基（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル基）であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１が水素原子である１−ピペロニルピペラジンは、置換基が少なく、市販の化合物であり、入手容易性の点で好ましい。

前記式（Ｉ）又は（Ｉ−１）で示される化合物の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。

前記式（Ｉ−２）で示される化合物の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リジン塩、アルギニン塩が挙げられる。

前記式（Ｉ）で示される化合物は、公知の方法、例えば特表２００２−５０３２３９号公報に記載の方法に従って、以下のようにして製造することができる。

（式中、Ａｒ^１、Ａｒ^２、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０は、前記と同義であり、Ｘ^１及びＸ^２はハロゲン原子（塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）である。）

前記式（Ｉ−１ａ）で示される化合物は、前記式（Ｉ−１）においてＲ^１１が水素原子である化合物に相当する。

前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。

また、前記式（Ｉ）、（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）で示される化合物のうち、多くの化合物は市販されているので、これらの市販品を本発明に用いることができる。

本発明の適用対象となる植物は、アラビドプシス（シロイヌナズナ）属植物、樹木（例えば、ポプラ、ユーカリ）、ナタネ、トマト、タバコ、ダイズ、ニンジン、メロン、リンゴ、キャッサバ、ウキクサ、ストライガ等の双子葉植物；イネ科植物（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ブラキポディウム）、ユリ科植物（例えば、タマネギ）等の単子葉植物が挙げられる。

培地に置床する植物体、植物細胞、植物組織片又は植物種子はカルス誘導可能なものであればどのようなものでもよい。植物組織としては、例えば茎頂、茎、葉、苗条、胚細胞、根が挙げられる。置床する植物体等は、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等で殺菌し、無菌状態にしておくことが望ましいが、無菌播種により育成した植物体等を用いる場合はその必要はない。

本発明のカルス誘導剤は、前記有効成分に加えて、公知の製剤用添加剤を含むことができる。公知の製剤用添加剤としては、賦形剤、乳化剤、湿潤剤等が挙げられる。また、本発明のカルス誘導剤の形態は特に限定されず、当業界で利用可能な形態であればいかなる形態であってもよい。例えば、乳剤、液剤、油剤、水溶液、水和剤、フロアブル、粉剤、微粒剤、粒剤、エアゾール又はペースト剤等の形態とすることができる。

本発明のカルス誘導方法及びカルス作製法における植物体等と本発明のカルス誘導剤とを接触させる方法については特に制限はなく、植物の種類、対象器官、カルス誘導剤の剤形等に応じて、浸漬、塗布、散布、培地への添加等を適宜選択することができるが、好ましくは、植物体等を本発明のカルス誘導剤を含有する培地で培養することにより行う。

使用するカルス誘導培地は、（ｉ）前記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、又は（ii）前記式（Ｉ−１）で示される化合物又はその塩、及び前記式（Ｉ−２）で示される化合物又はその塩を含み、カルスを誘導できるものであれば特に限定されない。

前記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の培地中の濃度は特に限定されないが、通常５〜２００μＭ、好ましくは１５〜６０μＭである。

前記式（Ｉ−１）で示される化合物又はその塩と前記式（Ｉ−２）で示される化合物又はその塩を併用する場合、前記式（Ｉ−１）で示される化合物又はその塩の培地中の濃度は特に限定されないが、通常０.０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜６０μＭであり、前記式（Ｉ−２）で示される化合物又はその塩の培地中の濃度は特に限定されないが、通常０.０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜６０μＭである。

前記化合物以外の成分は、糖類、ゲル化剤、無機塩類などカルス誘導に一般的に用いられるものでよい。また、本発明の効果を損なわない範囲で、植物ホルモンを培地に添加してもよい。

培養は無菌条件下で行うことが好ましい。培養時の温度は２０〜２５℃とすることが好ましく、光条件は恒常的光照射から恒常的暗所条件の間とすることが好ましい。通常、培養から２〜４週間でカルスの誘導が認められる。

以上のようにして、誘導されたカルスを増殖するには、例えば、１ヶ月おきに、新鮮な上記カルス誘導培地（アガロース固形ＭＳ培地又は液体ＭＳ培地。各々０．９％シュークロースを含む）に交換すればよい。

増殖されたカルスを再分化するには、例えば、オーキシン（インドール酢酸）０．１５ｍｇ／Ｌ、サイトカイニン（Ｎ６−２−イソペンテニルアデニン）０．５ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（アガロース０．９％、シュークロース１．５％）にカルスを移植し、約２〜４週間後にシュート（不定芽）を生成させる。

本発明にしたがって得られたカルスは遺伝子組み換え作物の作製に利用することもできる。例えば、アグロバクテリウムに感染した細胞からカルスを作製するか、あるいはカルス細胞に導入したいプラスミドを有するアグロバクテリウムをカルスに感染させた後、プラスミドが染色体に挿入された細胞を分離し、これを再分化させて植物個体を再生すると、導入遺伝子を安定的に遺伝する遺伝子組み換え作物が得られる。

本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１４−１１７８３２の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）アラビドプシスを用いたフィペキシド活性試験
（１）フィペキシド処理によるアラビドプシス（Columbia）の形態観察
フィペキシドを０、１５、３０又は４５μＭ添加した１／２ＭＳ培地にアラビドプシス（Columbia）の野生型種子を播種し、形態観察を行った。

フィペキシド処理により１５μＭの低濃度では主に根、４５μＭの高濃度では茎頂の部分がカルス化する形態が見られた（図１）。高濃度では根のカルス化が抑制されていることから、茎頂と比較して根の方がフィペキシドに対する感受性が高く、細胞分裂が阻害されていると考えられた。

（２）フィペキシド処理によるカルス誘導及び再分化
アラビドプシス（Columbia）の根器官を切断後、フィペキシドを４５μＭ添加した１／２ＭＳ培地中で２週間処理してカルスを誘導させた後、再分化培地（オーキシン／サイトカイニン）中で培養したところ、再分化が認められた（図２Ａ）。

一方、アラビドプシス（Columbia）の根器官を切断後、カルスを誘導させずに、そのまま前記再分化培地中で培養したところ、再分化は認められなかった（図２Ｂ）。

（３）フィペキシドと従来法との比較
アラビドプシスにおけるカルス誘導において、最適化されたオーキシン／サイトカイニン濃度条件下（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸２．２６μＭ／カイネチン０．４６５μＭ）でのカルス誘導と、フィペキシド４５μＭによるカルス誘導を比較したところ、フィペキシドは、最適化されたオーキシン／サイトカイニン濃度条件下でのカルス誘導効率よりも、高頻度でカルス誘導を引き起こすことがわかった。恒常的光照射条件において、８７日間培養した胚軸の状態を図３に示す。

（４）フィペキシドの推定代謝産物４−クロロフェノキシ酢酸及び１−ピペロニルピペラジンの機能解析
フィペキシドは４−クロロフェノキシ酢酸と１−ピペロニルピペラジンがアミド結合した化合物であり、植物体中で非酵素的に加水分解されることが予想された。そこで４−クロロフェノキシ酢酸と１−ピペロニルピペラジンによる単剤処理又は併用処理を試みた。

４−クロロフェノキシ酢酸と１−ピペロニルピペラジンを０、５、１５、３０、４５、６０μＭで単独あるいは同時にそれぞれ添加した１／２ＭＳ培地上に７日間弱光発芽させたアラビドプシス（Columbia）の胚軸を切り置き、形態観察を行った。

その結果、フィペキシド処理と同様に４−クロロフェノキシ酢酸処理でカルス誘導活性が認められた。この結果は、４−クロロフェノキシ酢酸の構造がカルス形成に重要な役割を持っていることが考察された。

一方、１−ピペロニルピペラジン単剤で処理した場合には、側根の数と長さの増大、葉面積の拡大が観察されたが、カルス誘導活性は認められなかった。

更に４−クロロフェノキシ酢酸と１−ピペロニルピペラジンを共に、アラビドプシス胚軸に処理した場合は４−クロロフェノキシ酢酸単剤よりもカルス増殖速度が速い傾向が観察された。これらの結果は、４−クロロフェノキシ酢酸によるカルス誘導は１−ピペロニルピペラジンによる細胞伸長活性によって相加的に促進されていると考察された。

結果を図４に示す。

（実施例２）他の植物におけるフィペキシド活性試験
アラビドプシス発芽条件と同様に、滅菌種子を用いた条件において、フィペキシド培地で培養した結果、イネ発芽種子、ユーカリ発芽種子、ダイズ種子（鶴の子）、トマト種子（マイクロトム）、キュウリ種子（夏すずみ）において、カルス誘導を認めた。

イネ野生型日本晴種の種子発芽３０日目の状態を図５に示す。フィペキシド濃度４５μＭでカルス化する形態が見られた。

ダイズ種子（鶴の子）、トマト種子（マイクロトム）及びキュウリ種子（夏すずみ）に対するフィペキシド（ＦＰＸ）のカルス誘導活性試験の結果を図６に示す。

アラビドプシス植物体条件と同様に、ポプラ茎及びポプラ根を、フィペキシド培地で培養した結果、ポプラ茎及びポプラ根において、カルス誘導を認めた。

誘導されたカルスを再分化培地（オーキシン（インドール酢酸）０．１５ｍｇ／Ｌ、サイトカイニン（Ｎ６−２−イソペンテニルアデニン）０．５ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（アガロース０．９％、シュークロース１．５％）、又は３−インドール酪酸（ＩＢＡ）０．１ｍｇ／Ｌ、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）０．２ｍｇ／Ｌを含む１／２ＭＳ培地（Phytoagar（植物用アガロース）０．９％、シュークロース０．２％））中で培養したところ、再分化が認められた。

ポプラ野生型の無菌茎（胚軸ではない）及び根器官の器官切片切断後フィペキシド存在下３０日目の状態を図７中央、その後再分化培地に置換後３０日後の状態を図７右に示す。

（実施例３）フィペキシドによるカルス誘導を利用した形質転換
ポプラにおける通常のカルス化誘導条件で、オーキシン／サイトカイニンに換えて、フィペキシドを用いて、カルス誘導を行って、アグロバクテリウムを感染させたカルスが形質転換されているかを確認した。

アグロバクテリウムのバイナリーベクターとしては、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳ（Kubo M. et al., Genes & Dev., 19, 1855-1860, 2005）（株式会社インプランタイノベーションズ、製品コード：ＩＮ３−ＶＥＣ１７）に感染を確認するためＧＵＳ遺伝子をＧＡＴＥＷＡＹシステムを利用して導入したものを用いた。

形質転換プロトコールを以下に示す。
１．ポット内で育てた無菌培養ポプラ（Populus tremula x tremuloides T89）幼個体から、茎サンプル（５ｍｍ長）を切り出した。
２．アグロバクテリウムと共培養した（３日間、暗所、２２℃）。
３．アグロバクテリウムを洗浄後、ＭＳ１培地あるいは改変ＭＳ１培地（３−インドール酪酸（ＩＢＡ）と６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の代わりに３０μＭフィペキシドを含む）の上に置床し２５℃で培養した。
４．（４週間目、通常ＭＳ１培地ではカルスができていないのに対してフィペキシドを含む改変ＭＳ１培地ではカルスが旺盛にできていることを確認した。）
５．カルス誘導培養２ヶ月後のカルス２３個体を９０％（ｗ／ｗ）アセトンにて−３０℃一晩固定の後、サンプルを５０ｍＭ ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）で２回洗浄後、ＧＵＳ基質液中、３７℃で１５分インキュベートして染色した。

その結果、全個体でＧＵＳ活性が確認された。結果を図８に示す。

ＭＳ１培地、改変ＭＳ１培地及びＧＵＳ基質液の組成を以下に示す。
［ＭＳ１培地組成（１Ｌ中）］
４．４ｇ Murashige & Skoog salt
２０ｇ シュークロース
０．２ｍｇ ＢＡＰ
０．１ｍｇ ＩＢＡ
０．０１ｍｇ ＴＤＺ（Thidiazuron）
ｐＨ５．６
［改変ＭＳ１培地組成（１Ｌ中）］
４．４ｇ Murashige & Skoog salt
２０ｇ シュークロース
３０μＭ フィペキシド
ｐＨ５．６
［ＧＵＳ基質液組成（１Ｌ中）］
１ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ
５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．０）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１ｍＭ Potassium ferricyanide
１ｍＭ Potassium ferrocyanide

以上のことから、フィペキシドによるカルス誘導はアグロバクテリウム法による植物の形質転換方法にも適用可能であることがわかった。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (7)

1. 次式（Ｉ）：
   

   

   （式中、Ａｒ¹は、少なくとも、Ｃ_1-6−アルコキシ基及び置換又は非置換のメチレンジオキシ基から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたフェニル基であり；
   Ａｒ²は１〜３個のハロゲン原子で置換されたフェニル基であり；
   Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ、水素原子、置換又は非置換のＣ_1-3−アルキル基、シアノ基又はカルボキシル基であり；
   Ｒ¹及びＲ²は、共同してオキソ基を表してもよく；
   Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、それぞれ、水素原子又はメチル基であり；
   Ｒ³とＲ⁴、Ｒ⁵とＲ⁶、Ｒ⁷とＲ⁸、及び／又はＲ⁹とＲ¹⁰は、共同してオキソ基を表してもよい。）
   で示される化合物又はその塩を含有するカルス誘導剤。
2. 前記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩がフィペキシド又はその塩である請求項１記載のカルス誘導剤。
3. 次式（Ｉ−１）：
   

   

   （式中、Ａｒ¹、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、請求項１記載の前記式（Ｉ）中の定義と同義であり、Ｒ¹¹は水素原子、置換又は非置換のＣ_1-7−炭化水素基又はアミジノ基である。）
   で示される化合物又はその塩、及び次式（Ｉ−２）：
   

   

   （式中、Ａｒ²は、請求項１記載の前記式（Ｉ）中の定義と同義である。）
   で示される化合物又はその塩を含有するカルス誘導剤。
4. 前記式（Ｉ−１）で示される化合物又はその塩が１−ピペロニルピペラジン又はその塩であり、前記式（Ｉ−２）で示される化合物又はその塩が４−クロロフェノキシ酢酸又はその塩である請求項３記載のカルス誘導剤。
5. 植物体、植物細胞、植物組織片又は植物種子を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のカルス誘導剤と接触させ、カルス化を誘導することを含むカルス誘導方法。
6. 植物体、植物細胞、植物組織片又は植物種子を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のカルス誘導剤と接触させ、カルス化を誘導し、増殖することを含むカルス作製方法。
7. アグロバクテリウム法による植物の形質転換方法において、カルス誘導培地として請求項１〜４のいずれか１項に記載のカルス誘導剤を含有する培地を用いることを含む植物の形質転換方法。

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