JP6527149B2

JP6527149B2 - ベータ−サラセミアの処置のための方法及び医薬組成物

Info

Publication number: JP6527149B2
Application number: JP2016534904A
Authority: JP
Inventors: エルミーヌ，オリヴィエ; ギエム，フラヴィア; アルレ，ジャン−ブノワ; クルトワ，ジュヌヴィエーヴ
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Universite Paris 5 Rene Descartes; Fondation Imagine
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Universite Paris 5 Rene Descartes; Fondation Imagine
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2019-06-05
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: ES2739637T3; WO2015079031A1; US9861615B2; JP2017502929A; US20170020847A1; EP3074007A1; EP3074007B1

Description

発明の分野
本発明は、ベータ−サラセミアの処置のための方法及び医薬組成物に関する。

発明の背景
成体哺乳動物のＨｇは、（α／β）_２四量体ヘモグロビン（Ｈｂ）分子を一緒に形成する２本のαグロビン鎖と２本のβグロビン鎖を含む、多量体タンパク質である。ベータ−サラセミアは、ヘモグロビンのβ鎖の合成の定量的欠乏によって引き起こされる遺伝性血液障害の一群である。この障害を有する個体では、β−グロビン鎖の合成が減少しているか又は存在しない。この疾患の３つの主な形態が以下に記載される：β鎖が産生されない重症型β−サラセミア（β−ＴＭ又はβ^０−ＴＭ）、並びにβ鎖が産生されるが正常な量よりも少ない中間型β−サラセミア及び軽症型β−サラセミア。これらの状態は、重症貧血〜臨床的に無症状の個体に及ぶ異なる表現型を引き起こす。β−ＴＭを有する個体は、通常、人生の最初の２年以内に、重症貧血、成長不良及び幼年期の間の骨格異常を呈する。罹患した子供は、規則的な一生続く輸血を必要とするだろう。中間型β−サラセミアは、重症型β−サラセミアよりも重症度が低く、一時的な輸血を必要とし得る。輸血依存患者は、鉄過剰負荷を発症し、過剰な鉄を取り除くためにキレート療法を必要とするだろう。

重症型β−サラセミア（ＴＭ）を引き起こす分子欠陥についての幅広い知識にも関わらず、無効造血の原因となるメカニズムについてはあまり知られていない。無効造血は、多染性段階での加速された赤血球の分化、アポトーシス及び成熟停止によって特徴づけられる。それは、少なくとも部分的に、この疾患において観察される重度貧血を説明している。不適合グロビン鎖の沈殿と未結合鉄の蓄積の両方が酸化ストレスと続いて起こる溶血を導き得ると提唱されているが、アポトーシス及び成熟停止が誘導されるメカニズムは依然として不確かなままである。

本発明者等は、α鎖の細胞質蓄積及びそこから生じる不十分な反応のカスケードが最終的に貧血などのβ−ＴＭ症状を引き起すという結果を明らかにした。その発見は、シャペロンタンパク質ＨＳＰ７０及び赤血球成熟タンパク質ＧＡＴＡ−１の役割のさらなる解明に基づいている（https://ash.confex.com/ash/2012/webprogram/Paper48181.html）。本発明者等は、ＨＳＰ７０が赤芽球の細胞質と核の両方において重要な機能を有することを発見した。核におけるＨＳＰ７０の第一の機能は、ＧＡＴＡ−１タンパク質に結合し、そしてその切断及びタンパク質分解性の分解（プロテアーゼカスパーゼ−３による）を防止することである。したがって、ＨＳＰ７０は、ＧＡＴＡ−１の不活性化を防止し、そして赤血球成熟における重要な因子としてのその機能を保持する。ＨＳＰ７０の第二の機能は、細胞質においてαグロビンに結合し、そしてそのタンパク質鎖が正確にホールドされて四量体（α／β）_２Ｈｂを形成することができるように保証することである。通常、これらの機能の両方を実行するために細胞中に利用可能なＨＳＰ７０が十分にある。しかしながら、β−ＴＭ細胞では、ＨＳＰ７０は、細胞質中に蓄積する過剰な遊離α鎖によって独占されている。したがって、不均衡な量のＨＳＰ７０が細胞質中に隔離され、核においてＧＡＴＡ−１に結合しかつそれを保護するために利用可能なＨＳＰ７０が十分にない。保護されていないＧＡＴＡ−１は、タンパク質分解的に切断されて不活性化され、そして適切な赤血球成熟が起こらない。それどころか、活性なＧＡＴＡ−１の不在は、多染性段階での未成熟な赤血球の成熟停止及びアポトーシスを生じる。したがって、この一連の事象は、最初、ヘモグロビンβ鎖の欠如によって引き起こされ、最終的に赤血球産生の低下（又はなし）を生じ、貧血を引き起こす。

発明の概要
本発明は、ベータ−サラセミアの処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。

発明の詳細な説明
本発明は、この欠陥プロセスに介入するように、かつβ−ＴＭに罹患している個体において赤血球成熟を促進又は回復するように設計された方法及び医薬組成物を提供する。β−ＴＭ赤血球ではβグロビンが形成されないので、本明細書に記載される方法及び組成物で処置された個体において産生される種類の赤血球は（α／γ）_２Ｈｂを含有すること、そして本発明がβ−ＴＭ細胞及びβ−ＴＭ個体において（α／γ）_２Ｈｂ赤血球の産生を増大させるための方法及び組成物を提供することに注目されたい。本方法は、細胞質へのＨＳＰ７０の核外輸送を防止することによってＧＡＴＡ−１の活性を維持することを包含する。したがって、本発明の目的は、ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法を提供することである。いくつかの実施態様において、防止することは、被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される。

本発明は、必要とする被験体におけるベータ−サラセミアを処置するための方法における使用のためのＸＰＯ１阻害剤に関する。

本発明は、ベータ−サラセミアに罹患している被験体における赤血球成熟を促進又は回復させるための方法における使用のためのＸＰＯ１阻害剤に関する。

本発明は、ベータ−サラセミアに罹患している被験体における（α／γ）_２Ｈｂ赤血球の産生を増大させるための方法における使用のためのＸＰＯ１阻害剤に関する。

本明細書において使用される場合、用語「ＸＰＯ１」は、当技術分野における一般的な意味を有し、エキスポーチン１タンパク質を指す。このタンパク質は、ロイシンリッチな核外輸送シグナル（ＮＥＳ）依存性タンパク質の輸送を媒介する。このタンパク質はまた、Chromosomal Region Maintenance 1（Ｃｒｍ１）とも呼ばれる。

本明細書において使用される場合、用語「ＸＰＯ１阻害剤」は、ＸＰＯ１の活性を低下又は遮断する任意の化合物又は処置を表す。この用語はまた、ＸＰＯ１発現の阻害剤も含む。

ＸＰＯ１阻害剤は、当技術分野において周知である。本発明の特定の実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、以下の刊行物：国際公開公報第２０１１１０９７９９号、国際公開公報第２０１２０９９８０７号、国際公開公報第２０１３０２００２４号、国際公開公報第２０１３０１９５４８号及び国際公開公報第２０１３０１９５６１号に開示されている低分子化合物から選択される。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、以下の化合物：

及びその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸エチルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸エチルエステル；（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸イソプロピルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸イソプロピルエステル；（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸tert−ブチルエステル；（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸tert−ブチルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−フェニル−アクリルアミド；（Ｅ）−Ｎ−（２−クロロ−フェニル）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリルアミド；（４−｛（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリロイルアミノ｝−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（４−メトキシ−フェニル）−アクリルアミド；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−アクリルアミド；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−アクリルアミド；（Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−フェニル）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリルアミド及び／又はその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、以下の化合物：

又はその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−ブロモ−２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；３−メチル−１−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（５−メチルイソオキサゾール−３−イル）ベンゼンスルホンアミド；１−（３−ベンゾイル−４−メチルチオフェン−２−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−（３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（ナフタレン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−シクロヘキシルフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−モルホリノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−クロロフェネチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（２−（チオフェン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（［３，４］メチレンジオキシベンジル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンアミドからなる群より選択される化合物及び／又はその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、以下の化合物：

からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、ＫＰＴ−３３０（Etchin J, Sanda T, Mansour MR, Kentsis A, Montero J, Le BT, Christie AL, McCauley D, Rodig SJ, Kauffman M, Shacham S, Stone R, Letai A, Kung AL, Thomas Look A. ＣＲＭ１（ＸＰＯ１）媒介核外輸送のＫＰＴ−３３０阻害剤は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の前臨床モデルにおいて選択的抗白血病活性を有する（KPT-330 inhibitor of CRM1 (XPO1)-mediated nuclear export has selective anti-leukaemic activity in preclinical models of T-cell acute lymphoblastic leukaemia and acute myeloid leukaemia）. Br J Haematol. 2013 Apr;161(1):117-27. doi: 10.1111/bjh.12231. Epub 2013 Feb 4）である。

いくつかの実施態様において、ＸＰＯ１阻害剤は、ＫＰＴ−２７６（Schmidt J, Braggio E, Kortuem KM, Egan JB, Zhu YX, Xin CS, Tiedemann RE, Palmer SE, Garbitt VM, McCauley D, Kauffman M, Shacham S, Chesi M, Bergsagel PL, Stewart AK. 多発性骨髄腫におけるゲノムワイド研究は、選択的核外輸送阻害剤ＫＰＴ−２７６を使用して立証される重要なターゲットとしてＸＰＯ１／ＣＲＭ１を特定する（Genome-wide studies in multiple myeloma identify XPO1/CRM1 as a critical target validated using the selective nuclear export inhibitor KPT-276）. Leukemia. 2013 Jun 11. doi: 10.1038/leu.2013.172.）である。

「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。

本発明の好ましい実施態様において、前記の遺伝子発現の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。

本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとしたものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲットとされるｍＲＮＡに結合することによってその翻訳を直接遮断するように作用し、ひいてはタンパク質翻訳を防止又はｍＲＮＡ分解を増大し、したがってターゲットとされるタンパク質（すなわち、ＸＰＯ１）の細胞内レベル、ひいては活性を減少させるだろう。例えば、ターゲットタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写配列の固有の領域に相補的な少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、慣用のホスホジエステル技術によって合成され、例えば、静脈注射又は注入によって投与されることができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照のこと）。

また、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。遺伝子発現は、腫瘍、被験体又は細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起すベクター若しくは構築物と接触させることによって低下されることができ、それによって遺伝子発現が特異的に阻害される（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。配列が公知である遺伝子について適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002)； Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；並びに国際公開公報第０１／３６６４６号、第９９／３２６１９号及び第０１／６８８３６号を参照のこと）。

また、リボザイムも本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続く、エンドヌクレアーゼ的切断を包含する。そのため、ターゲットとされるｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効果的に触媒する改変ヘパリン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内において有用である。任意の潜在的ＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、最初に、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを典型的に含むターゲット分子のリボザイム切断部位を走査することによって同定される。同定した後、その切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列について、オリゴヌクレオチド配列を不適合にし得る予測構造的特徴（二次構造など）を評価することができる。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適合性を評価することもできる。

遺伝子発現の阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムは共に、公知の方法によって調製されることができる。これらは、例えば、固相ホスホアミダイト（phosphoramadite）化学合成によるなどの化学合成技術を含む。代替的に、アンチセンスＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写によって生成することができる。そのようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。細胞内安定性及び半減期を増大させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対して様々な修飾を導入することができる。可能な修飾は、限定されないが、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、又はオリゴヌクレオチド骨格内へのホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオアート若しくは２’−Ｏ−メチルの使用を含む。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターと組み合わせてインビボ送達され得る。その最も広い意味で、「ベクター」は、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の移送を容易にすることが可能な任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じるであろう分解度よりも少ない分解で細胞に核酸を輸送する。一般に、本発明において有用なベクターは、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌源に由来する他のビヒクルを含む。ウイルスベクターが好ましいタイプのベクターであり、そして、限定されないが、以下のウイルスからの核酸配列を含む：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス及びラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；並びにレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターを容易に採用することができる。

好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が関心のある遺伝子に置換された非細胞変性真核生物ウイルスをベースとする。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含み、その生活サイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを包含する。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療の治験に承認されている。最も有用なものは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することが可能であるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。そのような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率トランスダクションに対して一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み、プラスミドを用いたパッケージング細胞系のトランスフェクション、パッケージング細胞系による組み換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、及びウイルス粒子のターゲット細胞への感染の工程を含む）は、KRIEGLER（A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990) and in MURRY ("Methods in Molecular Biology, " vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）に提供される。

特定の用途のための好ましいウイルスは、すでに遺伝子治療においてヒトへの使用が認められている二本鎖ＤＮＡウイルスである、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように遺伝子操作されることができ、広範な細胞タイプ及び種に感染することが可能である。それは、さらに、熱及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系列の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに重感染阻害の欠如（したがって、複数系列のトランスダクションが可能）などの利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスをヒトの細胞ＤＮＡ中に部位特異的に組み入れることによって、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異誘発の可能性及び挿入された遺伝子発現の変動性を最小限に抑えることができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で、１００回を超える継代にわたって組織培養が追跡されており、このことはアデノ随伴ウイルスのゲノム組み入れが比較的安定な事象であることを暗示している。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外においても機能することができる。

他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 を参照のこと。ここ数年間、プラスミドベクターが、抗原をコードする遺伝子を細胞にインビボ送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。これらは、ウイルスベクターの多くが持つものと同じ安全上の懸念を有していないため、ＤＮＡワクチンに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合可能なプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動的にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されているプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用してカスタム設計され得る。プラスミドは、種々の非経口、粘膜及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下又は他の経路によって注射されることができる。それはまた、鼻腔内スプレー又は液滴、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して、表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドは、水溶液中に与えられるか、金粒子上に乾燥されるか、又は別のＤＮＡ送達系（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）及びマイクロカルセル化を含む）と組み合わせられ得る。

典型的には、ＸＰＯ１阻害剤は、被験体に治療有効量で投与される。

上に記載したような本発明のＸＰＯ１阻害剤の「治療有効量」とは、十分な化合物の量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の総一日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の被験体に対する具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物、被験体の年齢、体重、総合的な健康状態、性別及び食事；投与の期間、投与の経路及び用いられる具体的な化合物の排泄速度；処置の持続期間；用いられる具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知の類似の要因を含む種々の要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始すること、そして所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分に当技術分野の技能の範囲内である。しかしながら、製品の一日用量は、成人一人当たり０．０１〜１，０００mg/日の広い範囲にわたって変化し得る。好ましくは、組成物は、処置されるべき被験体への用量の対症調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの有効成分、好ましくは１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。薬物の有効量は、通常、一日当たり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、とりわけ一日当たり約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の用量レベルで供給される。

本発明のＸＰＯ１阻害剤は、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により徐放性マトリックス（生分解性ポリマーなど）と組み合わせられて、治療組成物を形成し得る。

「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて、哺乳動物、とりわけヒトへ投与されたときに、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応を生じることのない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤助剤を指す。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分（単独又は別の有効成分との組み合わせ）は、単位投与剤形で、慣用の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトへ投与されることができる。好適な単位投与剤形は、経口経路剤形（錠剤、ゲルカプセル剤、粉剤、顆粒剤及び経口の懸濁剤又は液剤など）、舌下及びバッカル投与剤形、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与剤形並びに直腸投与剤形を含む。ガレヌス適用（galenic adaptation）は、小腸又は結腸中への特定の送達のために行われ得る。

好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張の無菌の食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）であるか、又は乾燥とりわけ凍結乾燥組成物（場合によって滅菌水又は生理食塩水を添加して、注射液剤の構成を可能にする）であり得る。

注射使用に好適な薬学的剤形は、無菌の水性液剤又は分散剤；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射液剤又は分散剤の即時調製物用の無菌の粉剤を含む。全ての場合に、その剤形は、無菌でなければならず、かつ容易な注射性能が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。

本発明のＸＰＯ１阻害剤を遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中に調製されることができる。また、分散剤を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中に並びに油中に調製することができる。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止する防腐剤を含有する。

本発明のＸＰＯ１阻害剤は、中性又は塩形態で組成物へと製剤化されることができる。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、これは無機酸（例えば、塩酸又はリン酸など）又はそのような有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような）と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄など）及びそのような有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような）から誘導することができる。

担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持されることができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（antifusoluble agent）、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによって達成することができる。

無菌の注射液剤は、上に挙げた様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要量の活性ポリペプチドを組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、様々な滅菌有効成分を、基礎となる分散媒体と上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する無菌の媒体に組み込むことによって調製される。無菌の注射液剤の調製用の無菌の粉剤の場合、好ましい調製方法は、有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から得る、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

製剤化後に、液剤は、投薬製剤と適合する手法でかつ治療的に有効であるような量で投与されるだろう。製剤は、上に記載した種類の注射液剤などの種々の投薬剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤なども採用することができる。

水性液剤での非経口投与のために、例えば、溶液を必要であれば好適に緩衝化すべきであり、そして液体希釈剤を最初に十分な食塩水又はグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水性液剤は、とりわけ、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に好適である。これに関して、採用することができる無菌の水性媒体は、本開示に照らして、当業者に公知であろう。例えば、一回用量を、１mlの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に加えるか又は提案された注入部位に注射することができる。処置される被験体の状態に応じて、用量のいくらかの変動が必ず起こるだろう。いずれの場合においても、投与責任者が個々の被験体に適切な用量を決定するだろう。

本発明のＸＰＯ１阻害剤は、一用量当たり、約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０又はさらに約１０ミリグラム前後を含むように治療混合物内に製剤化され得る。また、複数回用量を投与することもできる。

静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明のＸＰＯ１阻害剤に加え、他の薬学的に許容し得る剤形は、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固形剤；リポソーム製剤；持続放出カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の剤形を含む。

本発明のさらなる目的は、ベータ−サラセミアの処置に好適な薬物をスクリーニングするための方法であって、ｉ）候補化合物を準備する工程、ｉｉ）ＸＰＯ１活性又は発現を阻害する能力について候補化合物を試験する工程、及びｉｉｉ）ＸＰＯ１活性又は発現を阻害することが可能な候補化合物を選択する工程からなる工程を含む方法に関する。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

ＣＤ３６＋赤血球前駆体中のＸＰＯ１遺伝子の発現（イムノブロット）Ｎ＝核、Ｃ＝細胞質。ＣＤ３６＋培養の３日目〜６日目。ＣＤ３６＋赤血球前駆体中のＸＰＯ１遺伝子（及びＨＳＰ７０）の発現（蛍光顕微鏡法）。ＫＰＴは、ＣＤ３６＋培養培地中、正常濃度のエリスロポエチン（ＥＰＯ）で、３３nM、１００nM、３３３nM及び１０００nMの濃度に希釈した場合に、培養６日目（Ｄ６）の臍帯血からのＣＤ３６＋赤血球前駆細胞に対して、処置の２０時間まで無毒である。２０時間のＥＰＯ飢餓は、８０％の細胞死を生じる。ＥＰＯ飢餓の間の１００nM、３３３nMのＫＰＴによるＣＤ３６＋Ｄ６の処置は、ＫＰＴ処置の非存在下と比較して、細胞死をそれぞれ４９％及び３９％減少させる。ＫＰＴは、ＥＰＯ飢餓の条件で、処置の２０時間後、臍帯血からのＣＤ３６＋Ｄ６においてＨＳＰ７０の核内保持を誘導する。ベータ−サラセミアＣＤ３６＋Ｄ８細胞では、ＫＰＴは、１００nMでの処置の７２時間後に、未処置細胞と比較してＨＳＰ７０の核内局在化を誘導する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の５日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、４８時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）のフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、処置の９６時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の５日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、４８時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）のフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、処置の９６時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の５日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、４８時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）のフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、処置の９６時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の５日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、４８時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）のフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、処置の９６時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の５日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、４８時間〜９６時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）のフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、処置の９６時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間及び７２時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の６日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についてのＭＦＩのフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置における、胎児ヘモグロビンに陽性の小さな生存ＣＤ３６＋細胞数のフローサイトメトリー解析。ｅ）異なる条件のＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMに対する、処置の４８時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間及び７２時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の６日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についてのＭＦＩのフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置における、胎児ヘモグロビンに陽性の小さな生存ＣＤ３６＋細胞数のフローサイトメトリー解析。ｅ）異なる条件のＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMに対する、処置の４８時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間及び７２時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の６日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についてのＭＦＩのフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置における、胎児ヘモグロビンに陽性の小さな生存ＣＤ３６＋細胞数のフローサイトメトリー解析。ｅ）異なる条件のＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMに対する、処置の４８時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間及び７２時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の６日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についてのＭＦＩのフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置における、胎児ヘモグロビンに陽性の小さな生存ＣＤ３６＋細胞数のフローサイトメトリー解析。ｅ）異なる条件のＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMに対する、処置の４８時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間及び７２時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の６日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についてのＭＦＩのフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置における、胎児ヘモグロビンに陽性の小さな生存ＣＤ３６＋細胞数のフローサイトメトリー解析。ｅ）異なる条件のＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMに対する、処置の４８時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。重症型ベータサラセミア患者からの循環ＣＤ３４＋細胞に由来するＣＤ３６＋細胞を、ＫＰＴ分子（ＫＰＴ０＝ＤＭＳＯ、ＫＰＴ１００＝１００nM、ＫＰＴ１０００＝１０００nM）で処置し又は処置せずに、処置の２４時間、４８時間及び７２時間で解析した。処置の０日目は、ＣＤ３６＋培養の６日目に対応する。ａ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の増殖。ｂ）異なる条件のＫＰＴ処置に対する、２４時間〜７２時間のＣＤ３６＋細胞の細胞死。ｃ）異なる条件のＫＰＴ処置における、ＣＤ３６＋細胞中のＢａｎｄ３タンパク質についてのＭＦＩのフローサイトメトリー解析。ｄ）異なる条件のＫＰＴ処置における、胎児ヘモグロビンに陽性の小さな生存ＣＤ３６＋細胞数のフローサイトメトリー解析。ｅ）異なる条件のＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMに対する、処置の４８時間における未成熟、多染性細胞及び好酸球＋網状赤血球のＭＧＧカウント、並びにｅ）成熟指数に対応する。処置の２４時間での図８と同じ実験からのＣＤ３６＋細胞。異なる処置条件：ＫＰＴ０（ａ）、ＫＰＴ１００nM（ｂ）及びＫＰＴ１０００nM（ｃ）に対する、解析した全細胞集団でゲーティングした核（黒色）中又は細胞質（灰色）中に局在するＨＳＰ７０を含有する細胞のパーセント。ｄ）３種の処置条件に対するＨＳＰ７０の細胞質／核比。ｅ）ＧＡＴＡ１転写因子蛍光についての平均強度及び標準偏差。処置の２４時間での図８と同じ実験からのＣＤ３６＋細胞。異なる処置条件：ＫＰＴ０（ａ）、ＫＰＴ１００nM（ｂ）及びＫＰＴ１０００nM（ｃ）に対する、解析した全細胞集団でゲーティングした核（黒色）中又は細胞質（灰色）中に局在するＨＳＰ７０を含有する細胞のパーセント。ｄ）３種の処置条件に対するＨＳＰ７０の細胞質／核比。ｅ）ＧＡＴＡ１転写因子蛍光についての平均強度及び標準偏差。処置の２４時間での図８と同じ実験からのＣＤ３６＋細胞。異なる処置条件：ＫＰＴ０（ａ）、ＫＰＴ１００nM（ｂ）及びＫＰＴ１０００nM（ｃ）に対する、解析した全細胞集団でゲーティングした核（黒色）中又は細胞質（灰色）中に局在するＨＳＰ７０を含有する細胞のパーセント。ｄ）３種の処置条件に対するＨＳＰ７０の細胞質／核比。ｅ）ＧＡＴＡ１転写因子蛍光についての平均強度及び標準偏差。処置の２４時間での図８と同じ実験からのＣＤ３６＋細胞。異なる処置条件：ＫＰＴ０（ａ）、ＫＰＴ１００nM（ｂ）及びＫＰＴ１０００nM（ｃ）に対する、解析した全細胞集団でゲーティングした核（黒色）中又は細胞質（灰色）中に局在するＨＳＰ７０を含有する細胞のパーセント。ｄ）３種の処置条件に対するＨＳＰ７０の細胞質／核比。ｅ）ＧＡＴＡ１転写因子蛍光についての平均強度及び標準偏差。処置の２４時間での図８と同じ実験からのＣＤ３６＋細胞。異なる処置条件：ＫＰＴ０（ａ）、ＫＰＴ１００nM（ｂ）及びＫＰＴ１０００nM（ｃ）に対する、解析した全細胞集団でゲーティングした核（黒色）中又は細胞質（灰色）中に局在するＨＳＰ７０を含有する細胞のパーセント。ｄ）３種の処置条件に対するＨＳＰ７０の細胞質／核比。ｅ）ＧＡＴＡ１転写因子蛍光についての平均強度及び標準偏差。

実施例１：
背景
ＸＰＯ１の化学阻害剤であるレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）が赤血球前駆体細胞中のＨＳＰ７０の核内保持を誘導することを本発明者等の研究室が公表した（Ribeil et al., Nature 2007）。この観察は、ＸＰＯ１が赤血球前駆体中のＨＳＰ７０タンパク質の核外輸送に関与し得ることを示唆している。

赤血球前駆体の細胞分化の間、ＨＳＰ７０タンパク質の核蓄積が不可欠である。実際に、核において、ＨＳＰ７０は、カスパーゼ−３分解からＧＡＴＡ１転写因子を保護する。

赤血球生成不能の２種の病理：骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及びベータ−サラセミアの症例で、赤血球前駆細胞中のＨＳＰ７０の核内局在化の欠乏を評価した（Frisan et al. Blood 2012, Arlet et al 未公開データ）。したがって、本発明者等は、ＸＰＯ１によって誘導されたＨＳＰ７０の核外輸送を抑制することで、赤血球前駆体細胞中のＨＳＰ７０タンパク質の核内局在化を回復させ、それゆえ赤血球前駆体の分化を改善することが関心事となるであろうことを提案する。

ＫＰＴ−３３０（Selinexor*）は、ＸＰＯ１の最初の選択的阻害剤であり、Karyopharmによって製造される。ヒト患者でのインビトロ解析及び安全性研究は、その分子の良好な耐容性を示した。

本発明者等は、ベータ−サラセミア及びＭＤＳ赤血球前駆体細胞の両方におけるＫＰＴ分子（インビトロ試験に好適なＫＰＴ−２５１）の効果を評価することを提案する。

材料及び方法
材料
Obstetrics Unit of Hopital Necker-Enfants Maladesから、母親のインフォームドコンセントを得た後に正常満期産からの臍帯血単位を得た。臍帯血から単離された７日間のＩＬ−６＋ＩＬ３＋ＳＣＦで培養したＣＤ３４前駆細胞から生成された、ＣＤ３６＋赤血球前駆細胞（Miltenyi CD34 Progenitor Cell Isolation Kit）を、１５％ＢＩＴ９５００（Stem Cell Technologies）を補充したＩＭＤＭ（Gibco cell culture）中、ＩＬ３＋ＳＣＦ＋Ｅｐｏの存在下で培養した。

イムノブロット解析
別個の細胞質フラクションと核タンパク質フラクションを、ＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬（Thermo Scientific）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、赤血球前駆細胞から抽出した。

核又は細胞質抽出物のタンパク質４０μgを１４％アクリルアミドゲル上で分離し、イムノブロッティングによって解析した。抗原を、SuperSignal West Dura（Thermo Scientific）を使用した化学発光法によって可視化した。

試薬
使用される抗体は、抗ＨＤＡＣマウスクローン３Ｆ３＃０５−８１４（Millipore）、抗ＨＳＰ７０ウサギＡＤＩＳＰＡ８１２（Enzo lifesciences）、及び抗ＣＲＭ１（ＸＰＯ１）ウサギ＃ＳＴ１１００（Calbiochem）である。

蛍光顕微鏡法のための細胞透過処理及び標識
５．１０^４個の細胞をスライド上にスピンオンし、アセトン固定し、冷１×ＰＢＳ１％ＢＳＡで３０分間水和し、ホルムアルデヒド（Sigma）で１５分間、次いで、メタノール（Prolabo）で１０分間、室温で処理した。次いで、細胞を、４℃で、１×ＰＢＳ０，２％triton X100（Sigma）で１０分間透過処理し、洗浄し、そして１０％ＢＳＡ中で３０分間インキュベートした。次いで、これらを、１×ＰＢＳ１％ＢＳＡ０，１％tween（Sigma）で希釈した抗体で連続してインキュベートした。核をＤＡＰＩで染色し、スライドを共焦点レーザ顕微鏡（LSM 700 Carl Zeiss）で調べた。

結果：
本発明者等は、臍帯血からのＣＤ３６＋赤血球前駆細胞中のＸＰＯ１タンパク質の発現をイムノブロット（図１）及び蛍光顕微鏡法（図２）によって調査した。図１では、培養の３日目（Ｄ３）〜６日目（Ｄ６）で、ＸＰＯ１タンパク質は、大部分がＣＤ３６＋赤血球前駆細胞の細胞質（Ｃ）中に存在し、核（Ｎ）分画においてはより程度が少ない。図２では、イムノブロッティングによって観察されたＸＰＯ１タンパク質の発現が、Ｅｐｏ中の培養の６日目に、透過処理したＣＤ３６＋赤血球前駆細胞上で共焦点顕微鏡によって確認される。ここで、本発明者等は、ＣＤ３６＋赤血球前駆細胞中のＸＰＯ１（ベータインポーチンファミリーの核外輸送タンパク質）の発現を初めて報告する。

実施例２：
図６及び図７のデータは、ベータ−サラセミア患者からのＣＤ３６＋細胞での２種の異なる実験のものである。図８のデータは、図７の実験からの細胞で遂行された。ベータ−サラセミア赤芽球を、重症型ベータ−サラセミア（β^０−ＴＭ）を有する成人患者からの末梢血循環ＣＤ３４＋細胞からインビトロで生成した。この研究は、本発明者等の機関の倫理委員会の承認を得て、ヘルシンキ宣言（Helsinky Declaration）に従って遂行した。

１０００nMのＫＰＴによる処置は、患者細胞が対照条件において高い増殖率を有する実験においてのみ、ＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMと比較して減少した増殖を示す（図６ａ及び図７ａ）。１０００nMのＫＰＴによる処置は、ＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nMと比較して細胞毒性をわずかに示す（図６ｂ、図７ｂ）。

インビトロで、成熟は、ベータ−サラセミア赤血球前駆細胞において、多染性段階で停止する。ベータ−サラセミア細胞における成熟停止を定量化するために、本発明者等は、（スライド当たりの好酸性細胞＋網状赤血球）数＊１００をスライド当たりの多染性細胞数で割った末期成熟指数を使用する（Arlet Jb et al. Nature oct 2014）。本発明者等は、ベータ−サラセミア細胞の成熟指数が、対照条件ＫＰＴ０と比較して、１００nM及び１０００nMのＫＰＴ処置で増加することを示す（図６ｄ、６ｅ、図７ｅ及び７ｆ）。

フローサイトメトリー解析は、ＣＤ３６＋ベータ−サラセミア細胞の培養培地中の１００nM又は１０００nMのＫＰＴの存在は、処置の９６時間（図６ｃ）及び処置の７２時間（図７ｃ）で、末期の赤血球分化のマーカーであるＢａｎｄ３タンパク質標識の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を増加させることを示す（Hu J et al. Blood apr 2013）。

ベータ−サラセミア患者では、ベータ鎖合成の欠如は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ：２本のアルファ及び２本のガンマサブユニットからなる）を産生する細胞の割合の増加によって補償され、わずかに生存している成熟赤芽球はＨｂＦ細胞である。ここで、本発明者等は、１０００nMのＫＰＴによる処置の７２時間後に、ＨｂＦ陽性の割合は、小さな生存細胞の割合の中で、ＫＰＴ０及びＫＰＴ１００nM条件と比較してより高いことを観察する。

Amnis Technologyは、事前に標識した多数の細胞中の蛍光局在化を解析することができる。ここで、本発明者等は、ＫＰＴ０、１００nM及び１０００nM条件に対する、核中又は細胞質中のＨＳＰ７０標識に陽性の細胞のパーセントを示す（図８）。本発明者等は、核中のＨＳＰ７０に陽性の細胞のフラクションが、ＫＰＴ０（図８ａ）と比較して、ＫＰＴ１００nM及び１０００nM条件（図８ｂ及び８ｃ）で増加することを観察することができる。

この観察はまた、ＫＰＴ０（図８ｄ）と比較して、ＫＰＴ１００nM及び１０００nM条件におけるＨＳＰ７０の細胞質／核フラクションの減少によっても証明される。

末期の赤血球分化の間、活性化カスパーゼ３による切断からＧＡＴＡ１転写因子を保護するためにＨＳＰ７０の核内移行が必要である。ベータ−サラセミア赤血球前駆細胞では、ＨＳＰ７０は、過剰なアルファグロビン鎖によって細胞質中に隔離される（Arlet Jb et al. Nature oct 2014）。したがって、ＧＡＴＡ１が切断され、この結果、赤血球前駆細胞の成熟停止及びアポトーシスが生じる。ここで、本発明者等は、核内ＨＳＰ７０を有する細胞のフラクションの増加がＧＡＴＡ１標識の平均蛍光強度の増加と同時に起こることを示す。

まとめると、これらのデータは、ベータ−サラセミア患者からのＣＤ３６＋細胞のＫＰＴ（ＸＰＯ１エキスポーチンの特異的阻害剤）によるインビトロ処置が、わずかな細胞毒性を示すこと、そして赤血球前駆細胞の核からのＨＳＰ７０輸送を抑制することによって末期の赤血球分化を改善することができることを示す。このＨＳＰ７０の核内移行は、ＧＡＴＡ１赤血球転写因子を切断から保護することと関連する。

参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関わる分野の最先端を記載している。これらの参考文献の開示は、参照によって本開示に組み入れられる。

Claims

ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、以下の化合物：

及びその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸エチルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸エチルエステル；（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸イソプロピルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸イソプロピルエステル；（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸tert−ブチルエステル；（Ｚ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリル酸tert−ブチルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−フェニル−アクリルアミド；（Ｅ）−Ｎ−（２−クロロ−フェニル）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリルアミド；（４−｛（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリロイルアミノ｝−フェニル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（４−メトキシ−フェニル）−アクリルアミド；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−アクリルアミド；（Ｅ）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−アクリルアミド；（Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−フェニル）−３−［３−（３−クロロ−フェニル）−［１，２，４］−トリアゾール−１−イル］−アクリルアミド及びその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、以下の化合物：

及びその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−ブロモ−２，５−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；３−メチル−１−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（５−メチルイソオキサゾール−３−イル）ベンゼンスルホンアミド；１−（３−ベンゾイル−４−メチルチオフェン−２−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−（３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−（４−クロロフェニル）チアゾール−２−イル）−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（３，４−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（ナフタレン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−シクロヘキシルフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（２−ベンゾイルフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−モルホリノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（４−クロロフェネチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（２−（チオフェン−２−イル）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；１−（［３，４］メチレンジオキシベンジル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンアミドからなる群より選択される化合物及びその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、以下の化合物：

からなる群より選択される、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、以下の式：

を有するＫＰＴ−３３０である、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＧＡＴＡ−１のタンパク質分解性不活性化を防止することによって重症型β−サラセミア（β−ＴＭ）に罹患している被験体における赤血球成熟を回復又は増大させる方法に用いられる医薬組成物であって、防止することが被験体にＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を投与することによって達成される方法に用いられるための医薬組成物であって、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含み、
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物が、以下の式：

を有するＫＰＴ−２７６である、ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物を有効成分として含む医薬組成物。
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物がＸＰＯ１阻害剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
必要とする被験体におけるベータ−サラセミアを処置する方法に用いられる医薬組成物であって、被験体に治療有効量のＸＰＯ１阻害剤を投与することを含む方法に用いられるための医薬組成物であって、請求項８に記載のＸＰＯ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物。
ベータ−サラセミアに罹患している被験体における赤血球成熟を促進又は回復させるための方法に用いられる医薬組成物であって、被験体に治療有効量のＸＰＯ１阻害剤を投与することを含む方法に用いられるための医薬組成物であって、請求項８に記載のＸＰＯ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物。
ベータ−サラセミアに罹患している被験体における（α／γ）_２Ｈｂ赤血球の産生を増大させるための方法に用いられる医薬組成物であって、被験体に治療有効量のＸＰＯ１阻害剤を投与することを含む方法に用いられるための医薬組成物であって、請求項８に記載のＸＰＯ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物。
ＸＰＯ１核内輸送体を阻害する化合物又はＸＰＯ１阻害剤が、ＸＰＯ１発現の阻害剤である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
遺伝子発現の阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである、請求項１２に記載の医薬組成物。
ベータ−サラセミアの処置に好適な薬物をスクリーニングするためのインビトロの方法であって、ｉ）候補化合物を準備する工程、ｉｉ）ＸＰＯ１活性又は発現を阻害する能力について候補化合物を試験する工程、及びｉｉｉ）ＸＰＯ１活性又は発現を阻害することが可能な候補化合物を選択する工程からなる工程を含む方法。