JP6510233B2 - 微生物感染の治療 - Google Patents
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Description
本願は、微生物感染の治療における使用のための抗菌性組成物に関する。具体的には、本組成物は、細菌感染を治療するため、または細菌汚染の制御のために用いられてもよく、これによって抗生物質の使用を回避する。このような感染としては、乳腺炎、結核、嚢胞性線維症および他の肺感染、ならびに医学デバイスの上などの表面上にバイオフィルム形成を生じ得る汚染が挙げられる。しかし、本組成物は、ウイルス、酵母もしくは真菌の感染の治療のために、またはこのような生物体による汚染の制御のためにも適している。
乳腺炎は、雌ウシおよび他の乳産生動物の乳房の持続的な炎症状態である。乳腺炎は、米国において雌ウシでは最も一般的な疾患の1つであると共に、酪農業界では最も費用がかかるものでもある。乳腺炎は、通常は乳頭管中の細菌の侵襲に応答して、白血球が乳腺中に放出される時に生じる。乳腺炎を有する雌ウシからの乳汁は、体細胞数が高く、体細胞数が高くなるに従って、乳の質が低下する。
−本発明者らは、LP系によって、または他の手段によって生じる反応性酸素種(ROS)が、実際には、広範な病原性のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して、種々の培地中で、ならびに広範なpHおよび温度範囲にまたがって、濃度依存性の応答に基づいて殺菌性であることを示した(本発明の詳細な説明を参照のこと)。著者らは、ROSが、種々の表面上で、バイオフィルム中で増殖している細菌および真菌を完全に殺傷できることもまた示した。
−制御されたトライアルの一連の詳細では、この殺菌活性は、ROSの作用に起因して排他的であり得ること、およびROSは、これに関して、残留する過酸化水素が存在せず、なんら他の相乗効果的な剤、例えば、ラクトフェリン、四級アンモニウム化合物、脂肪酸などが存在しない場合に有効であることが示された(本発明の詳細な説明を参照のこと)。
−特定の状況で細菌の特定の集団を完全に殺傷するために必要なROSの濃度を、抗生物質および他の抗菌治療剤に用いられるのと同様の方式で、算出して用いて、正確な用量応答/最小阻害濃度の情報を得てもよい(本発明の詳細な説明を参照のこと)。
−ROS種のこれらの用量レベルでの投与を用いて、ウシの乳房および哺乳動物の肺から単離された細菌性病原体、種々の表面に付着されたバイオフィルムとして増殖している細菌性病原体;患者から単離された細菌性病原体;ならびに広範な抗生物質に耐性の細菌性病原体を含めて、広範なグラム陰性およびグラム陽性の細菌性病原体を完全に殺傷できる(本発明の詳細な説明を参照のこと)。
−ROS種の必要な殺菌性および治療性の濃度が、例えば、ウシの乳房中でLP系を用いて、治療の部位で生成され得ること、またはROS種は、感染の部位に対して外部で調製されて、なんら他の活性な成分なしに送達されて、細菌感染の首尾よい治療および排除を可能にし得ることもまた示された。従って、本発明の技術は、例えば、医療デバイスの表面上での細菌感染およびバイオフィルム増殖を制限する固有の方法を提供する。
本発明の第一の目的は、微生物感染の治療のための改善された組成物を提供することにある。さらなる目的は、細菌、ウイルス、真菌および酵母の増殖を遅くすることとは対照的に、殺傷できる組成物を提供することにある。なおさらなる目的は、抗生物質耐性の生物体を殺傷できる組成物を提供することにある。
さらなる目的は、抗生物質を使用することなく、臨床的および無症候性の乳腺炎の治療のための組成物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、治療の間に乳汁を廃棄することを必要としない乳腺炎の治療を提供することにある。
本発明の別の目的は、多数の他の細菌の感染の治療である。抗生物質の薬物送達および耐性は、嚢胞性線維症(CF)および結核(TB)の両方の治療において大きな問題である。抗生物質耐性は、標的部位、すなわち、肺に達する薬物の阻害性に満たない濃度の結果として生じる場合が多い。慢性感染は、この状況から生じる場合が多く、患者の健康に重篤な影響を与える。肺の成分の理想的な送達は、直接の肺への、噴霧スプレーとしてである。これは、この成分が正確な部位で、および正確な濃度で生物体と直接相互作用するという利点を有する。これが経口的にまたは血流を通じて投与される場合、同じ効果を得るには、より大きい濃度が必要である。抗生物質を用いる場合、これは、用いられる薬物をより大きい濃度にし、薬物の耐性または反応の機会を増大する。本発明の系の成分は、哺乳動物の系では天然には存在しない(または通常は飼料中で用いられる)ので、それに対する反応は、薬物反応が一般的である抗生物質での治療に有利である可能性は極めて低い。CFを有する患者では、膜中で水の調節ができないせいで、天然のレベルのチオシアン酸塩は肺中で低下し、臓器中の天然に見出されるラクトペルオキシダーゼ系の有効性は低下する。CFと診断された人で予防的に作用し得るか、または肺感染を既に発症した患者を治療するために用いられ得る反応性酸素種の外因性の添加。このような噴霧されたスプレーは、体腔が環境に対して開口されていてリスクがある手技の間の感染、特に抗生物質耐性の細菌株による感染を最小限にするために病院で用いられる可能性がある。
この技術の適切な標的である他の感染とは、火傷または開放傷の結果として被る感染である。現在の抗生物質治療の投与計画を上回る、記載された系を用いることの利点は、薬物の反応、安全性、有効性および耐性に関してCFまたはTBを治療するのに上記される利点と同様であろう。本発明者らは、反応性酸素種が、バイオフィルムのベースの細胞(固体層に付着された細胞)の治療に有効であることを示した。これは、TB/CF患者の肺で、および開口の創傷または火傷において、最も注目される細菌の表現型である。この表現型は、広範な抗生物質に対して細菌に対する一般化された耐性を付与する(「Antibiotic resistance of bacteria in biofilms」,Stewart & Costerton,2001,The Lancet,358,135−138)。
反応性酸素種、例えば、ハロペルオキシダーゼベースの系によって生成されるものの使用はまた、移植された医療用デバイス上での細菌感染の治療および予防に多数の利点を保持するであろう。感染(強固なバイオフィルムの形態)は、カテーテルなどの種々のデバイスで極めて一般的である。種々の酵素で含浸されるかまたはコーティングされたデバイスは、血中に天然に存在する基質と反応し得る。
本発明の別の目的は、多重の目的の生成物のための一般化され、安全な、抗菌の洗浄液としての使用のための組成物を提供することにある。提唱された系は、表面、パイプ、ビールのライン、調理設備などから細菌を洗浄/除去するのに有効であろう。
感染は、酵母、真菌増殖および細菌の結果として生じ得る。従って、抗微生物活性(抗生物質の場合など、抗菌活性とは対照的)を発揮できる治療的な投与計画が大きな利点である。この目的を達成するために、反応性酸素種(次亜ヨウ素酸)の抗菌活性を、注の2つの真菌株に対して試験した(下の実施例18)。真菌のCandida株は典型的には、日和見の病原体と記載される。それらは、種々の皮膚の病態、例えば、外陰膣炎および尿路感染を生じ得る。それらは、HIV患者および他の免疫無防備状態の患者で蔓延している。Saccharomyces cerevesiae(一般に、酵母、パン酵母として知られる)は、食品中で重要な生物体である。これはまた、飲料業でも大きな問題となり、ビールのラインでみられる典型的な生物体であり、飲料を損なう原因である。従って、本発明の抗菌性反応性酸素種は、真菌感染を治療もしくは制御するため、または表面を清浄にして真菌汚染を根絶させるための、良好な治療候補である。
抗菌性組成物は、150mgのヨウ化カリウム、4mgのラクトペルオキシダーゼ(≧80単位/mg)、および2mgのグルコースオキシダーゼ(約200単位/mg)の7mlの滅菌水への添加によって、生成した。この実施形態は、「KI用量150(KI−Dose−150)」と呼ばれる。同様に、組成物を、150mgのチオシアン酸カリウムを用いて調製し、「チオ用量150(Thio−Dose−150)」と呼ぶ。これらの相互作用の抗菌性の特性を、二重の希釈の96ウェルプレート増殖アッセイベースの方法を用いて試験した。本組成物のアリコートを、107−8個の細菌細胞を含有する150μlの増殖培地(1〜2%グルコースが存在する)に添加して、300μlの最終容積にした。本組成物の濃度を、150μlの混合物を取り出し、150μlの同一の増殖培地を含有している次のウェルに移すことによって二倍に希釈して、ROS生成成分をなくす。この培地の光学密度を、595nmで24時間測定した。細菌を完全に阻害するのに必要な濃度は、24時間後に培地中の増殖の可視徴候を生じない、使用される組成物の最低濃度であった。対照は、組成物の補充のないか、または成分の1つを本組成物から除去したウェルを含む。この方法を用いて、本組成物の抗菌性の能力を、種々の微生物、特にEscherichia coli、Staphylococcus aureus、Psuedomonas aeruginosa、Burkholderia cepaciae、Streptococcus dysglactiae、Streptococcus uberis、非溶血性大腸菌に対して決定した。これらの生物体は、多数の感染、特にウシ乳腺炎、嚢胞性線維症肺感染、皮膚感染、火傷感染などの原因因子として記載されることが多く、従って、本組成物が治療に用いられる種々の生物体に相当する。本組成物に対する生物体の相対的な感染しやすさは、表1に記載しており(比は、増殖がまだ記録されない本組成物の最低の希釈を示し、例えば、1:800ならば、増殖培地800μlごとに1μlの組成物と等価まで希釈された組成物を有した)、増殖を阻害した組成物の最低濃度である。24時間の経過にわたって生成された、抗菌性の反応性酸素種(ROS)の推定レベルもまた示す(下記の実施例19も参照のこと)。
ラクトペルオキシダーゼ系が、その静菌性または阻害性の質に関して考察された。実施例1に記載のプロトコールは、大規模の容積で行った(KI−Dose−150またはThio−Dose−150の最初の500μlのアリコートを、試験生物体を含む10mlの増殖培地に添加して、二倍希釈した)。インキュベーションの48時間後、この系の殺菌性の質を、寒天プレートに対する接種ブロスの継代培養によって検討した。本組成物は、新鮮な寒天プレートへの継代培養の24時間後に(すなわち、抗菌組成物に対する暴露72時間後)、細胞のわずか0.0001%以下しか、回復可能でなかった場合に、ある特定の濃度である細菌株に対して殺菌性であるとみなされた。本組成物は、感染治療について達成可能な濃度で試験した各々の株に対して殺菌性であった(阻害が示された最低希釈は、上の表1に示す)。
過酸化水素供給源の選択は、LP系に、そしてまた、ROSに基づいて殺菌性の濃度で抗菌性組成物を生成する能力にも影響することが示され得る。栄養ブロスのアリコート(20ml)に、E.coli ATCC 25922の108個の細胞を摂取し、150μlの接種されたブロスを、96ウェルの増殖プレート中のウェルに添加した。これを繰り返して、接種されたブロスにはさらに、LP(37.5μlの4mg/ml溶液)およびKI(75μlの40mg/ml溶液)をこの培地に補充した。
−40μlのH2O2を含有する5mlの水(30%(w/v))
−50mgの過炭酸ナトリウムを含有する5mlの水
−5mlのグルコース(20%)+47μlのグルコースオキシダーゼ(2.5mg/ml、200単位/mg)
乳(10ml)を、E.coliに接種して、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヨウ化カリウムおよびβ−ガラクトシダーゼを、本発明の抗菌性組成物を生成するための機構として補充した。3.75mg/Lのグルコースオキシダーゼ(約200単位/mg)、12mg/Lのラクトペルオキシダーゼ(≧80単位/mg)、120mg/Lのヨウ化カリウム/チオシアン酸塩、および400mlの/Lβ−ガラクトシダーゼ(≧2,600単位/ml)≧の濃度が、抗菌活性を観察するのに十分であった。最適化濃度では、これらの混合物は、最大108細胞/mlのE.coliまで致死性と証明された(新鮮な寒天プレートへの溶液の継代培養で得られた細胞が、回復可能ではなかった)。
野外試験を、補充されたグルコースベースの酵素系を用いて行って、反応性酸素種を生成し、このようなアプローチが抗菌剤を生じる有効性を評価した。多数の雌ウシ(8)を、供給された系によって2日間、1日に2回治療した。これらの雌ウシは、それらの体細胞数で顕著な減少があった(5日後に50%の領域で、表3を参照、A農場およびB農場、続いて、B農場ではさらに5日後同様の減少があり、これはその後のデータが利用可能であった)、細菌の負荷を測定するというプロキシ法。これによって、β−ガラクトシダーゼを使用することなく、抗菌性種を生成するのにおけるラクトペルオキシダーゼ系の有効性であって、殺菌性の種の生成のために実現可能な供給源であることを保証する有効性が示された。
提唱された組成物がバイオフィルムベースの細菌性細胞を根絶する能力を決定するためのトライアルを行った。これは、2つの培養技術を用いて行った。E.coliの連続培養を、ケモスタットを用いて樹立した。この系は、オペレーターが生物体の増殖速度を制御することを可能にするように設計される。ほとんどの感染は、細胞の増殖を遅らせる結果として生じる(栄養利用性の制限に起因する)。この表現型は、抗菌剤に対する細胞の耐性に対して影響を有し、宿主環境のなかでより現実的である。これに加えて、これらの培養物を用いて、Modified Robbins Deviceでバイオフィルムを増殖し、ここでは、細胞を、ポリウレタン切り取り試片の表面上に結合させて増殖させた。これらの細胞は、乳腺炎、CF/TB肺、創傷、火傷における、および医療デバイスにおける典型的な感染において注目されるバイオフィルム細胞の表現型を共有しており、かつ同様の形式で応答して、抗菌性試験の実現可能なモデルを提供する。
KI−Dose−150組成物に対する多数のP.aeruginosa株の感受性の強さを、実施例1に記載の方法を用いて試験した。これらの株は、嚢胞性線維症に関連する肺感染を治療するために典型的に用いられる種々の重要な抗生物質に対して耐性の増大を示すので、目的の株であり、肺感染を示している嚢胞性線維症患者の喀痰から回収された。相対的な感受性の大きさを表4に記載する。表4から証明されるとおり、P.aeruginosaの抗生物質耐性株は、KI−Dose−150に対してもはや耐性ではなく、これによって、この系は、肺に送達された時に、このような感染を治療するのに有効であることを示している。「S」は、感受性(sensitive)を示し、「R」は、抵抗性(resistant)または耐性の増大を示す。
抗生物質による呼吸器系の感染の治療は、典型的に、経口または静脈内の薬物を用いて送達される。噴霧型の抗生物質を用いてまた、血液から肺胞を通過する感染部位への薬物の移動が劣ることに対抗してもよい。提唱された抗菌性組成物の種々の実施形態を、AeroNebネブライザー(Aerogen Ltd.から無料提供)を用いて噴霧した。過酸化水素/グルコース/グルコースオキシダーゼ/ラクトペルオキシダーゼ(lactoperpoxidase)/ヨウ化物/またはチオシアン酸塩の溶液を、ネブライザーを一回通過させるか、または一緒に混合して、ネブライザーを通過させ、そのエラロゾルを、無菌の25ml容器中に収集した。噴霧型の抗菌力を、マルチウェルのプレートベースのアッセイで二倍希釈を用いて、非噴霧型(実施例1に記載)と比較した。提唱された組成物は、噴霧されなかった溶液と比較した場合、なんら活性の低下を示さなかった。さらに、抗菌性種を生成するために用いられ得る酵素系は噴霧による影響を受けなかったことが実証された。
ラクトフェリンは、特にバイオフィルムに対する抗菌性特性を働かせるために特徴付けられた哺乳動物タンパク質である。従って、ラクトフェリンは、感染モデルにおいてバイオフィルム産生を標的および破壊し得る良好な能力の化合物であって、本発明の抗菌性組成物などの系と相乗的に作用し得る化合物である。KI−Dose−150およびThio−Dose−150の関連の抗菌性能力を、種々の濃度のラクトフェリンの有無の両方において、実施例1に記載のように試験した。チオシアン酸モデルに対する補充されたラクトフェリンの存在は、既に存在する抗菌性の特性を増強しなかった(チオシアン酸に対するラクトフェリンの比は、1:1、1:2、1:4であった)。これによって、ラクトフェリンの存在は有意な濃度で、抗菌性種を生じるラクトフェリン−チオシアン酸塩モデルの作用を阻害しないことが示唆される。浮遊性の細胞が用いられ、強化された抗菌性効果が、実際の感染の治療に関して確認される可能性が生じた。
ウシ乳腺炎の治療のために設計された抗生物質療法は、乳房の炎症を誘導する場合が多く、動物の体細胞数の増大をもたらす。これは、販売される乳の価格が体細胞数の低さに依存するという点で不利である。多数の薬物が典型的には、抗菌性療法の乳房内注入に起因して増大する炎症に反撃するために追加され得る。プレドニゾン(またはその活性型、プレドニゾロン)は、望ましくない免疫応答を最小化するために用いられるグルココルチコイドステロイドである。10〜20mgの投薬量が、体細胞数の増大を停止するための抗生物質ベースの乳房内注入と組み合わせて投与される場合が多い。プレドニゾンまたはプレドニゾロンのいずれかの有無において、提唱されたラクトペルオキシダーゼ系(KI−Dose−150)の用量を用いるインビトロの実験系は、組成物の抗菌性能力の減少をなんら生じなかった。これによって、いずれかの薬物の典型的な用量の使用は、本発明の組成物が乳房(または他の環境)で細菌を根絶する能力を妨害せず、体細胞数の増大を最小化することを補助することが示される。
酵素系が、連続的に抗菌性種を生成する能力を、抗菌性組成物含有溶液への細菌培養物の反復接種によって決定した。LB増殖培地の10ml容積に、グルコースオキシダーゼ(15μlの2.5mg/ml、200単位/mg)、β−ガラクトシダーゼ(30μl、10mg/ml、48,000単位/mg)、ラクトペルオキシダーゼ(20μl、4mg/ml、80単位/mg)ヨウ化カリウム(30μl、40mg/ml)を補充して、最終濃度は2%ラクトースとした。約108cfuのE.coli ATCC 25922を添加して、その混合物を1晩、37℃でインキュベートした。24時間後、新鮮な栄養寒天プレートに回収可能な細胞はなかった。次いで、約108cfuのE.coli ATCC 25922細胞のさらなる接種をこの容積に加えて、その混合物を再度、一晩インキュベートさせた。同様に、細菌を含むブロスの引き続く接種(1日間隔で10回接種)は、細菌細胞の増殖も回復も生じなかった。この結果、抗菌性反応性種の濃度は、有意な期間にわたって殺菌性レベルを有意に上回って保持されることが示される。
種々の系によって生成される組成物の力価に対する基質選択の効果は、様々な阻害増殖アッセイを用いて決定され、まず、ここでは、H2O2の濃度(グルコースおよびグルコースオキシダーゼの酵素的反応によって生成される)は、一定であって、選択された基質の濃度が変更された。第二に、基質の濃度が一定に維持され、H2O2レベルが変化されたアッセイを使用した。
E.coli(50μlの一晩培養物)を、5μlのグルコースオキシダーゼ(2.5mg/ml)および10μlのLP(4mg/ml)を含有するMueller Hintonブロスに添加した。これを、96ウェルプレートの列にアリコートした(150μl)。等容積(150μl)のヨウ化カリウムまたはチオシアン酸カリウム(両方とも40mg/ml)のいずれかを、最初のウェルに添加した。このサンプルを、ウェル11に関しては二倍希釈し、ウェル12は対照として残した。このプレートを37℃で一晩インキュベートして、光学密度を、全体を通して測定した。
E.coli(200μlの一晩培養物)を、20mlのMueller Hintonブロス(既に、40μlのLP(4mg/ml)および60μlのヨウ化カリウムまたはチオシアン酸カリウム(40mg/ml)のいずれかを含有している)に添加した。これを、96ウェルプレートにアリコートした(150μl)。H2O2生成系のサンプル(2mlの20%グルコースであって、10μlグルコースオキシダーゼ、2.5mg/mlを含有)を、最初のウェルに添加し、二倍希釈して、ウェル12は対照として残した。
ブロス中の細菌細胞を阻害/殺傷するのにおける使用のための本発明の抗菌種の適切な濃度をオペレーターが決定することを可能にするプロトコールを作成した。このプロトコールは、実施例1に記載の96ウェルプレートで用いられるのと同様に、成分の2倍希釈に基づく。細菌培養物(107cfu/ml)を樹立して、試験管にアリコートする(15mlの試験管に5mlを添加し、必要な酸素について十分な隙間を確保し、ここで第一の試験管は2倍の容積10mlを含む。このブロスは、酵素を用いてH2O2を生成する場合、十分な適切な糖、例えば、グルコースを、グルコースオキシダーゼを用いる場合、含まなければならず、これは、典型的には、1〜2%が十分である)。
抗菌剤の阻害性の殺生物性濃度を生じるのに必要な酵素系における各々の成分の下限を決定した(例えば、表1および表5)。各々の成分に関してこれらの下限を確立するため、各々についての最小阻害濃度を、実施例1に記載の方式と同様の方式で、96ウェルプレートでの二倍希釈を用いて算出するが、ここでは、選り抜きの成分の濃度は、増殖に対する影響が示されなくなるまで低下される。120mg/LのKI、320単位LPを充填された10mlのLBブロス増殖培地(2%グルコース含有)では、1mlあたり少なくとも0.5単位のグルコースオキシダーゼが、過酸化水素を生成するために必要である。これより下の濃度では、殺菌性濃度での反応性酸素種のさらなる生成を提供するために生成されている過酸化水素が不十分であった。同様に、グルコースレベルの低下によって、代償するためにグルコースオキシダーゼレベルの増大が必要となる;1%グルコースは、1単位/mlを必要としたが、0.5%グルコースは、2単位/mlの活性グルコースオキシダーゼを必要とした。グルコースレベルおよびグルコースオキシダーゼレベルが十分である溶液中では、必要なヨウ化物(またはチオシアン酸塩)基質のレベルは、約0.5mMであった。これより下のレベルでは、有効な殺菌性の活性を生じるために生成される反応性酸素種は不十分であった。必要な濃度で、反応性酸素種を生成する反応に必要なLPのレベルは、0.15単位活性/mlで決定した(1mM KIが存在)。これより下のレベルでは、ほとんど抗菌性の活性は生じなかった。乳腺炎の治療的な治療のために適切な本発明のこの実施形態はまた、乳内に存在するラクトースをグルコースに変換するβ−ガラクトシダーゼを含んでいた。この酵素の必要なレベルのインビトロの実験は、乳中で(5%ラクトース)、1mMのK、0.75単位/mlのグルコースオキシダーゼ活性/ml(これより下のレベルは、酵素経路の「ボトルネック」を生じ、これによって、生成されている反応性酸素種は不十分になる)、および1mlあたりに存在する1単位のラクトペルオキシダーゼ活性で行った。β−ガラクトシダーゼの必要な活性は、約1.5単位活性/mlで1ay。β−ガラクトシダーゼ活性は、これより下のレベルで、細菌の増殖の阻害も、細菌細胞の殺傷も生じず、細菌増殖を生じた。
本発明の組成物の抗菌性反応性酸素種を、それを感染の部位に添加する前に生成することが可能である。これは、必要な酵素成分の混合によって達成され得、これによって、得られた反応性酸素種(ROS;ヒポチオシアン酸、次亜ヨウ素酸、または次亜塩素酸塩(hypochlorate))が治療部位の外側で生成されることが、確実にされる。これに加えて、カタラーゼ(これは、過酸化水素と反応して、酸素ガスおよび水を生成する)の添加によって反応物が除去できた後、過剰な過酸化水素が残っていた。これによって、潜在的に不利な過酸化水素分子なしで、選り抜きのROSを送達する極めて安全な方法が証明され得る。
事前活性化された系のさらなる例は、以下のとおり使用した:0.85MのH2O2に加えて、なにもなしか、または2.5MのNaCl/5μlクロロペルオキシダーゼ(約10,000単位/ml)を含有する溶液(4mlの容積)をインキュベートさせた。次いで、その溶液を分けて、カタラーゼ処理する(50μlの4mg/ml、>1,000単位/mg)かまたは、カタラーゼ処理しなかった。次いで、溶液の相対的な抗菌性特性を、E.coli補充ブロスを用いて実施例1に記載などのプロトコールを用いて試験した。細菌の阻害は、過酸化水素のみ、過酸化水素+クロロペルオキシダーゼ/NaCl、およびカタラーゼ処理された過酸化水素+クロロペルオキシダーゼ/NaClサンプルについて>1:640希釈で注目された。しかし、カタラーゼ処理された過酸化水素サンプルについては、阻害は気づかれなかった。この結果、反応性酸素種の力価を低下することなく、カタラーゼ治療によって過剰の過酸化水素を除去することができることが示唆される。この溶液は、より長期間インキュベートすることが可能であり、その後(72時間)、その結果が繰り返された。これによって、この形態のROSは、比較的安定であり、かつ使用に先立って調製できることが示唆される。
実施例1に記載のプロトコールを用いて、ヨウ化物およびラクトペルオキシダーゼを欠いているバージョンである「KI−Dose−150」、同様に、グルコースオキシダーゼを欠いているバージョンを試験した。3つ全てを、Candida glabrata、Candida krusei、Candida tropicalis、Candida albicansおよびSaccharomyces cerevesiaeに対して試験した。プロトコールは、実施例1に記載の方法を用いて2%グルコースを各々が補充された、それぞれ、栄養ブロスおよびLBブロス中で、Candida株およびSaccharomyces株について行った。結果を表5に示す。表5から、全ての株が、「KI−Dose−150」の作用によって阻害されること、および反応性酸素種がこのように抗菌性であって、かつ抗菌性なだけではないことが明らかである。本組成物のこれらの希釈で生成される過酸化水素のレベルは、試験された株に対してそれ自体非阻害性であった。
実施例3に示される結果によって、H2O2の3つの重大なレベルがあることが示される。これらのレベルは、図7に図示されるような、模式的なモデルを用いて記述され得る。第一に、より高いH2O2の閾値レベルであって、それ以上では、細菌増殖の阻害が増殖培地中のH2O2の濃度の直接の結果として生じる、H2O2のレベルがある。これは、抗菌性組成物の作用の好ましい機構ではない。なぜなら、H2O2は宿主細胞に対して毒性であり、例えば、哺乳動物の組織損傷に関連していたからである。
基質の抗菌性反応性酸素種(ROS)への変換は、変換の間、および例えば、24時間後に関連の基質濃度の直接測定によって評価した。種々の抗菌性反応性酸素種は比較的短い寿命であるが、用いられる基質次第で可変性の半減期を有し、そのため直接の滴定は有用ではなかった。例えば、チオシアン酸塩濃縮物は、1×(1.36mM)および5×(6.8mM)レベルで、グルコース、ラクトペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼを含有する溶液中でのインキュベーションの前後に比較した。これらを、以下のように比色定量アッセイを用いて、チオシアン酸レベルの標準的な濃度曲線と比較した(0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、および5×の濃度):五グラムの塩化第二鉄を、50mlの水中に懸濁した。溶解されていない塩化第二鉄を、遠心分離によって取り除き、約30mlの塩化第二鉄溶液を残した。キュベットに、150μlの鉄の溶液を添加し、続いて700μlの水を添加した。10×のチオシアン酸を、各々のキュベットに添加した(200μl、160μl、100μl、40μl、20μl、10μl、5μl、25μl(1:10)、12.5μl(1:10)、0μl)。キュベット中の最終容積は、水の添加によって1,050μlにされた。このサンプルについて、50μlの以前にインキュベートされた1×または5×の希釈物を添加し、これに150μlの水を加えた。光学密度は、460nmで記録し、その濃度を次に、標準曲線を用いて算出した。得られた標準曲線は、>0.99というr2値を有し(図8を参照のこと)、これによって、これが、未知の濃度のチオシアン酸を決定するという正確な方法であったことが示される。
インビボで反応性酸素種の潜在的な治療用量を達成する能力を、ここでも乳モデルを用いて検討した。乳房内注入方法を用いて、実施例4の記載された原型[150mgのKI、4mgのラクトペルオキシダーゼ(320単位)、2mgのグルコースオキシダーゼ(400単位)、およびβ−ガラクトシダーゼ、(1,350単位)]を雌ウシの乳房に導入した。これを、動物の搾乳後に行った。次の搾乳の際に、乳のサンプルを得た。乳のアリコート(10ml)を、約107cfu/mlの細菌株(E.coli、P.aeruginosa、またはS.dysgalactiae)でスパイクして、振盪しながら37℃で一晩インキュベートさせた。全体の生菌数カウントを、寒天プレートを用いて行った。乳は、この株に対して完全に阻害性だった。これによって、これらの乳腺炎原因生物体を殺傷するのに十分な濃度で、乳中の反応性酸素種の存在が示される。これは治療剤としての技術を示すのに重要であり、これに加えて、反応性酸素種が比較的寿命が短いせいで、濃度は乳房自体でより高くなる可能性が高く、さらに治療の有効性が増大する。
1〜100,000単位の活性のグルコースオキシダーゼ、1〜100,000単位の活性のラクトペルオキシダーゼ、および0.1〜10,000mgのチオシアン酸/ヨウ化物、および0.01〜100,000単位の活性のβ−ガラクトシダーゼを含有する溶液は、動物の乳房への乳房内注入として投与されるのに適切である。
Claims (18)
- 反応性酸素種または前記反応性種を生成可能な成分を含有する殺菌用組成物であって、前記反応性酸素種は、次亜ヨウ素酸(IO−)であり、前記反応性酸素種を生成可能な成分は、
(i)ラクトペルオキシダーゼ、
(ii)ヨウ化カリウムまたはヨウ化ナトリウム、および
(iii)過酸化水素または過酸化水素の供給源であり、
前記組成物は、24時間の間、前記反応性酸素種を1リットルあたり少なくとも0.4ミリモルのレベルに維持可能であり、
前記組成物は、任意にその溶液として提供され、
前記組成物は、ウシ乳腺炎の治療方法において使用するために、乳房内注入送達デバイス中に提供される、殺菌用組成物。 - 24時間の間、前記反応性酸素種を1リットルあたり少なくとも0.5ミリモルのレベルに維持可能である、請求項1に記載の組成物。
- 前記(iii)過酸化水素または過酸化水素の供給源が、過酸化水素である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記過酸化水素の供給源が、クエン酸および過酸化水素化物類を含む群から選択される過酸化水素放出化合物である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記過酸化水素の供給源が、糖と、前記糖の適切な酸化還元酵素である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記酸化還元酵素が、ガラクトースオキシダーゼおよび/またはグルコースオキシダーゼである、請求項5に記載の組成物。
- 遊離単糖をさらに含有する、請求項6に記載の組成物。
- 過酸化水素の供給源を生成するために、二糖と、前記二糖類の対応するグリコシド加水分解酵素とをさらに含有する、請求項5〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記グリコシド加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、前記二糖がラクトースである、請求項8に記載の組成物。
- グリコシド加水分解酵素および/または酸化還元酵素が感染部位に存在する糖との反応に使用される、請求項8または9に記載の組成物。
- 過酸化水素の追加の供給源が、ポリオール(糖アルコール)とその関連のオキシダーゼ酵素である、請求項5に記載の組成物。
- 前記ポリオールがグリセロールであり、その関連のオキシダーゼ酵素がグリセロールオキシダーゼであるか、あるいは、前記ポリオールがマンニトールであり、その関連のオキシダーゼ酵素がマンニトールオキシダーゼである、請求項11に記載の組成物。
- 前記過酸化水素の供給源が、L−アミノ酸とL−アミノ酸オキシダーゼ、またはキサンチンもしくはヒポキサンチンとキサンチンオキシダーゼである、請求項1または2記載の組成物。
- ラクトフェリンまたはグルココルチコイドを付加的に含有する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記グルココルチコイドが、プレドニゾロンまたはプレドニゾンである、請求項14に記載の組成物。
- 反応性酸素種または前記反応性種を生成可能な成分を含有する殺菌用組成物であって、前記反応性酸素種は、次亜ヨウ素酸(IO−)であり、前記反応性酸素種を生成可能な成分は、
(i)ラクトペルオキシダーゼ、
(ii)ヨウ化カリウムまたはヨウ化ナトリウム、および
(iii)過酸化水素または過酸化水素の供給源であり、
前記組成物は、24時間の間、前記反応性酸素種を1リットルあたり少なくとも0.4ミリモルのレベルに維持可能であり、
前記組成物は、任意にその溶液として提供される、殺菌用組成物を填薬された乳房内注入送達デバイス。 - 前記溶液が、エマルジョンとして調製される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 過剰の過酸化水素を除去するためのカタラーゼをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
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