JP6494045B2 - 標的シーケンシングおよびuidフィルタリング - Google Patents
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Description
多くの最新次世代シーケンシング(NGS)技術では、逐次合成によるシーケンシング(sequencing by synthesis)(SBS)法の一形態を使用する。NGS技術には何百万というDNAテンプレートを大量に並列シーケンシングする能力がある。高いスループットを達成するために、何百万もの一本鎖テンプレートをチップ上にアレイ化し、各テンプレートの配列が独立して読まれる。第2世代のNGSプラットフォームでは、固形支持体上でDNAテンプレートをクローン増幅し、次にサイクルシーケンシングを行う。第3世代のNGSプラットフォームでは単分子PCRフリープロトコールおよびサイクルフリーケミストリーを使用する(Schadt et al., Hum Mol Genet, 19(R2):R227-40,(2010)(非特許文献1))。
一局面では、(a)標的特異的配列を含む第1のプライマーを使用して、試料から標的ポリヌクレオチドの第1の相補配列(CS)を作製する工程;(b)第1のプライマー結合配列(PBS)またはその一部分を含むアダプターを、第1のCSに付着させ、それにより、修飾相補配列(MCS)を形成する工程;(c)MCSにハイブリダイズした第2のプライマーを伸長させて、それにより第2のCSを形成する工程であって、第2のプライマーが、(i)標的特異的領域と、(ii)第2のPBSとを含む、工程;ならびに(d)第1のPBSおよび第2のPBSにそれぞれハイブリダイズする複数のプライマーを使用して、第2のCSを増幅する工程を含み、第1のプライマーまたは第2のプライマーがユニーク識別(UID)配列を含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作製する方法が提供される。
選択されるプライマーが、60℃〜68℃の融解温度、21〜32ヌクレオチドの長さ、それぞれの3'端にある最後の5つのヌクレオチド中に3つまたはそれ未満のピリミジン、GC 30%〜70%の配列リードを生成するプライマー、および225〜300ヌクレオチドの長さを持つ配列リードを生成するプライマーを含む、第1の段階;
選択されるプライマーが、伸長または増幅中に最も高い読み間違い数を生成する1つまたは複数のプライマー、1%超のプライマー二量体配列を含む複数の配列リードを生成するプライマー、ならびに伸長または増幅中の1%またはそれ以上の読み間違いおよび0.3%超のプライマー二量体配列を含む複数の配列リードを生成するプライマーを含まない、第2の段階;および
選択されるプライマーが、最も高い総配列リード数を生成するプライマーの1つまたは複数を含まない、第3の段階
を含む、方法が提供される。
除外されるプライマーが、60℃未満または68℃超の融解温度、21ヌクレオチド未満または32ヌクレオチド超の長さ、およびそれぞれの3'端にある最後の5つのヌクレオチド中に4つまたはそれ以上のピリミジン、30%未満のGC含量または70%超のGC含量を持つ配列リードを生成するプライマー、および225ヌクレオチド未満または300ヌクレオチド超の長さを持つ配列リードを生成するプライマーを含む、第1の段階;
除外されるプライマーが、伸長または増幅中に最も高い読み間違い数を生成する1つまたは複数のプライマー、1%超のプライマー二量体配列を含む複数の配列リードを生成するプライマー、ならびに伸長または増幅中の1%またはそれ以上の読み間違いおよび0.3%超のプライマー二量体配列を含む複数の配列リードを生成するプライマーを含む、第2の段階;および
除外されるプライマーが、最も高い総配列リード数を生成するプライマーの1つまたは複数を含む、第3の段階
を含む、方法が提供される。
[本発明1001]
(a)標的特異的配列を含む第1のプライマーを使用して、試料から標的ポリヌクレオチドの第1の相補配列(CS)を作製する工程;
(b)第1のプライマー結合配列(PBS)またはその一部分を含むアダプターを、該第1のCSに付着させ、それにより修飾相補配列(MCS)を形成する工程;
(c)該MCSにハイブリダイズした第2のプライマーを伸長させ、それにより第2のCSを形成する工程であって、該第2のプライマーが、
(i)標的特異的領域と、
(ii)第2のPBSと
を含む、工程;ならびに
(d)該第1のPBSおよび該第2のPBSにそれぞれハイブリダイズする複数のプライマーを使用して、該第2のCSを増幅する工程
を含み、
該第1のプライマーまたは該第2のプライマーがユニーク識別(UID)配列を含む、
ポリヌクレオチドのライブラリーを作製する方法。
[本発明1002]
(a)標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした、標的特異的な第1のプライマーを伸長させて、第1のCSを形成する工程;
(b)該第1のCSにアダプターを付着させて、MCSを形成する工程;
(c)該MCSにハイブリダイズした第2のプライマーを伸長させて、第2のCSを形成する工程;および
(d)該第2のCSを増幅する工程;
を含み、
工程(a)または(c)が指数関数的増幅を含まず、かつ
該第1のプライマーまたは該第2のプライマーがUIDを含む、
ポリヌクレオチドのライブラリーを作製する方法。
[本発明1003]
(a)標的ポリヌクレオチドから、第1のCSまたはその修飾型(MCS)を作製する工程;
(b)該第1のCSの配列を含むポリヌクレオチドから、第2のCSを作製する工程であって、該第2のCSが非指数関数的増幅反応によって作製される、工程;および
(c)該第2のCSを増幅する工程;
を含み、
該第1のCSまたは該第2のCSがUIDを含む、
ポリヌクレオチドのライブラリーを作製する方法。
[本発明1004]
(a)標的ポリヌクレオチドから作製された第1のCSまたはその修飾型(MCS)から、第2のCSを作製する工程であって、該第1のCS、該第2のCS、または該MCSがUIDを含み、かつ該第1のCSおよび該第2のCSがそれぞれ個別に、
(i)プライマー伸長反応、または
(ii)線形増幅反応
によって作製される、工程;
(b)該第2のCSを増幅する工程;
(c)増幅された該第2のCSの少なくとも1つをシーケンシングする工程;
(d)同じUIDを含有する、工程(c)からの少なくとも2つの配列を、アラインメントする工程;ならびに
(e)工程(d)に基づいて、該標的ポリヌクレオチド配列に正確に相当するコンセンサス配列を決定する工程
を含む、標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法。
[本発明1005]
前記第1のプライマーがユニバーサルライゲーション配列(ULS)を含む、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記第2のプライマーがユニバーサルプライミング配列(UPS)をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記アダプターが試料バーコード(SBC)配列をさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記MCSがアフィニティ分子または捕捉配列をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記UIDが、配列
を含み、Nが任意の核酸残基である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記UIDが、配列
を含み、Nが任意の核酸残基でありかつWがアデニンまたはチミンである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記付着させることがライゲーションを含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記付着させることが増幅を含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
(a)標的ポリヌクレオチドから作製された第1のCSまたはその修飾型(MCS)から、第2のCSを作製する工程であって、該第1のCSおよび該第2のCSがそれぞれ個別に、
(i)プライマー伸長反応、または
(ii)線形増幅反応
によって作製される、工程;
(b)該第2のCSを増幅する工程;
(c)増幅された該第2のCSの少なくとも1つをシーケンシングする工程;
(d)少なくとも10%の配列同一性を含む、工程(c)からの少なくとも2つの配列を、アラインメントする工程;ならびに
(e)工程(d)に基づいて、該標的ポリヌクレオチド配列に正確に相当するコンセンサス配列を決定する工程
を含む、標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法。
[本発明1014]
(a)本発明1001〜1012のいずれかのライブラリーを作製する工程;
(b)該ライブラリーの少なくとも一部分をシーケンシングする工程;
(c)少なくとも10%の配列同一性を含む、工程(b)からの少なくとも2つの配列を、アラインメントする工程;および
(c)に基づいて、正確に標的ポリヌクレオチド配列に相当するコンセンサス配列を決定する工程
を含む、該標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法。
本明細書において使用する場合、増幅は、増幅反応を行うことを含む。プライマー伸長反応の産物は、プライマーの伸長中に生産されるテンプレートの相補鎖と共にプライマー配列を含みうる。いくつかの態様において、増幅反応は、それぞれがポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズする2つのプライマーの伸長を含む。ポリヌクレオチドの増幅は、当技術分野において公知の任意の手段によって行うことができる。ポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または等温DNA増幅によって増幅することができる。
本明細書に記載する方法は、シーケンシング用のポリヌクレオチドのライブラリーを作製するために使用することができる。試料中のポリヌクレオチドに関して決定される配列は、塩基コールにおいて高い精度および信頼度で決定することができる。本方法は、試料中に存在するDNA配列またはRNA配列を特異的にターゲティングし、ユニークにエンコードし、修飾し、増幅し、シーケンシングし、かつ/または定量することを含みうる。これらの方法は、シーケンシングまたは他の分子解析用のポリヌクレオチドアンプリコンのライブラリーをフォーマットする(format)ことができる配列の付加を可能にする。これらの方法によって作製されるシーケンシングライブラリーは、試料中の同じ初期RNAまたはDNA分子に由来する配列リードのビン化を可能にすることができるUIDを組み込みうる。これらの方法は、RNA分子またはDNA分子の集団に見いだされる観測された配列バリアントが真の多型または変異であるか、それとも観察された配列バリアントが増幅エラーまたは増幅バイアスなどの増幅アーチファクトによってもたらされたものであるかについての決定を下すことを可能にすることができる。本明細書に記載する方法のいずれにおいても、UIDは任意であると考えられる。したがって「UID」という叙述はいずれも、任意のUIDを指す。
解析すべきポリヌクレオチド標的のタイプに応じて、本方法は、逆転写(RT)またはプライマー伸長(PE)を用いることができる。プライマー伸長反応は、単一プライマー伸長工程であることができる。プライマー伸長反応は、1つまたは複数の個別プライマーの1回の伸長を含むことができる。プライマー伸長反応は、1工程での1つまたは複数の個別プライマーの伸長を含むことができる。いくつかの態様において、DNA標的に相補的なポリヌクレオチドは、プライマー伸長反応を行うことによって作製することができる。例えば、DNA標的に相補的なUIDタグ付きポリヌクレオチドは、プライマー伸長反応を行うことによって作製することができる。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばRNA標的に相補的なUIDタグ付きポリヌクレオチドは、逆転写反応を行うことによって作製することができる。標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばRNA標的に相補的なUIDタグ付きポリヌクレオチドは、逆転写反応によって作製することができる。標的ポリヌクレオチドには、試料中に最初に存在するポリヌクレオチドが含まれる。
本明細書に記載するプライマーを使用することで、当技術分野において公知の適切な試薬を使用してRNAポリヌクレオチドを逆転写することができる。RNAはmRNAを含むことができる。
本明細書に記載するプライマーを使用して、DNAポリヌクレオチドをプライマーにハイブリダイズさせ、当技術分野において公知の適切な試薬を使用してプライマー伸長(gPEまたはPE)を行うことができる。いくつかの態様において、プライマー伸長は、プライマーの1回の伸長を含む。いくつかの態様において、プライマー伸長はプライマーの複数回の伸長を含まない。いくつかの態様において、プライマー伸長は、プライマーの1回だけの伸長を含まない。いくつかの態様において、プライマー伸長は、プライマーの複数回の伸長を含む。いくつかの態様において、ある方法は、1つまたは複数のプライマー(PEプライマー)を使用して、標的ポリヌクレオチド相補配列、例えば第1の相補配列を形成するために、標的DNAポリヌクレオチド上でプライマー伸長を行う工程を含む。いくつかの態様において、PEプライマーは配列特異的プライマーを含む。いくつかの態様において、複数のPEプライマーは1つまたは複数の配列特異的プライマーを含む。いくつかの態様において、プライマー伸長反応は、標的ポリヌクレオチドを含有する試料からポリヌクレオチドのライブラリーを作製する最初の工程である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはPCRに付されない。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは指数関数的増幅に付されない。いくつかの態様において、指数関数的増幅は、プライマー伸長後の次の工程において行われない。いくつかの態様において、指数関数的増幅はプライマー伸長後の次の2工程において行われない。いくつかの態様において、指数関数的増幅はプライマー伸長後の次の3工程において行われない。いくつかの態様において、プライマー伸長工程で生産される標的ポリヌクレオチドの相補的ポリヌクレオチドは、この工程中にさらに増幅されることがない。いくつかの態様において、本方法は、1サイクルだけのプライマー伸長を含む。別の態様において、本方法は、標的DNA分子にハイブリダイズしたプライマーの繰り返しの伸長または線形増幅によって、複数コピーのDNA分子、例えばUIDを含有していてもよい標的ポリヌクレオチド相補配列を生産する工程を含む。
第1の相補配列などの標的ポリヌクレオチド相補配列を作製した後、ポリヌクレオチドアダプター配列を第1の相補配列に付加することができる。アダプター配列が付加されていて、UIDを含有していてもよい、第1の相補配列などの標的ポリヌクレオチド相補配列は、修飾相補配列(MCS)であることができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドアダプター配列は、標的ポリヌクレオチド相補配列の作製に続く次の工程において、UIDを含有していてもよい第1の相補配列などの標的ポリヌクレオチド相補配列に付加することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドアダプター配列は、UIDを含有する標的ポリヌクレオチド相補配列の作製に続く第2の工程において、UIDを含有していてもよい第1の相補配列などの標的ポリヌクレオチド相補配列に付加することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドアダプター配列は、UIDを含有する標的ポリヌクレオチド相補配列の作製に続く第3の工程において、UIDを含有していてもよい第1の相補配列などの標的ポリヌクレオチド相補配列に付加することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドアダプター配列はUIDを含有しない。
いくつかの態様において、ある方法はさらに、任意で、アダプタータグ付きポリヌクレオチド、例えばUIDを含有していてもよい修飾相補配列の1つまたは複数を、精製する工程を含む。いくつかの態様において、複数の標的ポリヌクレオチド相補配列、例えば第1の相補配列に付加されるアダプターは、アフィニティタグを含む。アフィニティタグは結合パートナーに結合させることができ、結合パートナーに結合しない分子(例えばアフィニティタグを持たない分子)は洗い流すか、またはアフィニティタグ付き分子を、アフィニティタグを持たない分子から単離することができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは、第2の分子の特異的に結合する第1の分子であることができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは既知のヌクレオチド配列であることができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは、化学的部分であることができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは、ビオチンまたはストレプトアビジンであることができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは、抗体などのペプチドまたはタンパク質であることができる。したがってアダプターは、タンパク質-核酸複合体を含むことができる。当技術分野において公知の任意のアフィニティタグを使用することができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは、アダプター修飾(例えば連結または増幅)された標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばUIDを含有していてもよい修飾相補配列を、1つまたは複数の他のポリヌクレオチドから精製するために使用することができる。アフィニティタグに結合する1つまたは複数の固定化ポリヌクレオチド、化学分子、またはタンパク質性分子を含有する支持体または表面を使用することができる。例えば、アダプター標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばUIDを含有していてもよい修飾相補配列を、アダプター修飾標的ポリヌクレオチド相補配列のビオチンをストレプトアビジン部分を含む表面または基材に結合させることによって、1つまたは複数の他のポリヌクレオチドから精製するために、アフィニティタグを使用することができる。本明細書において使用する場合、固定化は、1つまたは複数の共有結合または非共有結合による固形支持体への直接的または間接的付着を含む。いくつかの態様において、固定化は、ハイブリダイゼーションによる固形支持体への直接的または間接的付着を含む。いくつかの態様では、アダプター標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばUIDを含有していてもよい修飾相補配列を、関心対象ではない1つまたは複数のポリヌクレオチド配列、例えば非標的ポリヌクレオチドから精製するために、アフィニティタグを使用することができる。いくつかの態様では、アダプター標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばUIDを含有していてもよい修飾相補配列を、先行する反応または方法工程において使用された1つまたは複数のプライマーから精製するために、アフィニティタグを使用することができる。いくつかの態様では、アダプター標的ポリヌクレオチド相補配列、例えばUIDを含有していてもよい修飾相補配列を、先行する反応または方法工程において使用された1つまたは複数のプライマーから、または関心対象ではない1つまたは複数のポリヌクレオチド配列、例えば非標的ポリヌクレオチドから精製するために、アフィニティタグを使用することができる。いくつかの態様において、アフィニティタグは、記載する方法では使用されない。例えばいくつかの態様において、アダプターはアフィニティタグを含まない。例えばいくつかの態様において、アフィニティタグは、標的分子がRNAである場合には、記載の方法において使用されない。
ある方法はさらに、プライマー伸長または線形プライマー伸長(線形増幅ともいう)の2回目の単一ラウンドを行う工程を含むことができる。いくつかの態様において、線形伸長/増幅に使用される1つまたは複数のプライマーは、逆転写工程またはプライマー伸長工程において使用した1つまたは複数のRTプライマーまたはPEプライマーから、1つまたは複数の独立した反応に分離される。このようにしてプライマー対を分離することにより、不要なプライマー相互作用を低減することができる。本明細書において使用する場合、線形増幅または線形プライマー伸長とは、産物コピー数の非指数関数的拡大のプロセスを指す。いくつかの態様では、線形増幅の各サイクル中に、テンプレート鎖だけが複製される。いくつかの態様では、線形増幅中に、プライマー伸長物そのものはコピーされない。2つのプライマーを使用する代わりに対でない単一プライマーを使用した場合、その結果は、PCRの場合のような両鎖の指数関数的増殖ではなく、伸長産物コピー数の線形的増殖である。
ある方法はさらに、指数関数的増幅反応を行う工程を含むことができる。いくつかの態様において、ある方法はさらに、PCRを行う工程を含むことができる。例えば指数関数的増幅反応には、複数のフォワード/リバースプライマーおよびリバースプライマーを用いることができる。いくつかの態様において、指数関数的増幅反応は、2つまたはそれ以上の指数関数的増幅を含むことができる。いくつかの態様において、第1のPCR反応および/または第2のPCR反応には、複数のフォワード/リバースプライマーおよび複数のリバースプライマーを用いることができる。複数のフォワード/リバースプライマーの第1のプライマーおよび/または第2のプライマーは、DNA分子またはcDNA分子などのテンプレートポリヌクレオチドに相補的な領域を含有するフォワード/リバースプライマーであることができる。いくつかの態様において、複数のフォワード/リバースプライマーは、1つまたは複数のフォワード/リバースプライマーを含み、それら複数のフォワード/リバースプライマー中のフォワード/リバースプライマーのそれぞれは、ユニバーサルプライマー結合部位などの1つまたは複数の上流または下流プライマー結合部位に相補的な領域を含む。
本明細書に記載する方法または方法工程の1つまたは複数を行った後、作製されたポリヌクレオチドのライブラリーをシーケンシングすることができる。
本明細書に記載する方法は、シーケンシングのための1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドのライブラリーを作製するために使用することができる。標的ポリヌクレオチドには、増幅反応の産物ではない任意の関心対象のポリヌクレオチドが含まれる。例えば、標的ポリヌクレオチドには、生物学的試料中のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば標的ポリヌクレオチドには、PCR反応の産物は含まれない。例えば標的ポリヌクレオチドは、増幅反応の産物を生成させるために使用されるポリヌクレオチドを含みうるが、増幅産物そのものは含まない。例えば標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプライマー伸長反応に付すことができる関心対象のポリヌクレオチドを含む。例えば標的ポリヌクレオチドはRNAまたはDNAを含む。いくつかの態様において、標的RNAポリヌクレオチドはmRNAである。いくつかの態様において、標的RNAポリヌクレオチドはポリアデニル化されている。いくつかの態様において、RNAポリヌクレオチドはポリアデニル化されていない。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはDNAポリヌクレオチドである。DNAポリヌクレオチドはゲノムDNAであってもよい。DNAポリヌクレオチドはエクソン、イントロン、非翻訳領域、またはそれらの任意の組合せを含みうる。
いくつかの態様において、ある方法はさらに、ある疾患、障害、症状および/または状態を、対象において診断し、予後判定し、監視し、処置し、改善し、かつ/または防止する工程を含むことができる。いくつかの態様において、ある方法はさらに、標的ポリヌクレオチドの有無またはレベルに基づいて、ある疾患、障害、症状および/または状態を、対象において診断し、予後判定し、監視し、処置し、改善し、かつ/または防止する工程を含むことができる。いくつかの態様において、ある方法はさらに、1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの有無またはレベルに基づいて、ある疾患、障害、症状および/または状態を、対象において診断し、予後判定し、監視し、処置し、改善し、かつ/または防止する工程を含むことができる。
本明細書において使用する場合、試料は、標的ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含有する生物学的な、環境的な、医学的な、または患者の、供給源または試料を含む。本明細書に記載する方法では、ポリヌクレオチドを含有する任意の生物学的試料を使用することができる。例えば試料は、RNAまたはDNAを含有する対象由来の生物学的試料であることができる。ポリヌクレオチドは生物学的試料から抽出するか、またはポリヌクレオチドの抽出を行わずに試料を直接、本方法に付すことができる。試料は抽出または単離されたDNAまたはRNAであることができる。試料は、生物学的標本から抽出された全RNAもしくはDNA、cDNAライブラリー、ウイルスDNA、またはゲノムDNAであることもできる。一態様において、ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質および非テンプレート核酸などといったさまざまな他の成分を含有する生物学的試料から単離される。核酸テンプレート分子は、任意の細胞材料から得るか、動物、植物、細菌、真菌、または他の任意の細胞性生物から得ることができる。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは単一の細胞から得られる。ポリヌクレオチドは、生物から直接得るか、生物から得られた生物学的試料から得ることができる。任意の組織標本または体液標本を、本発明において使用するための核酸の供給源として使用してよい。ポリヌクレオチドは、初代細胞培養または細胞株などの培養細胞から単離することもできる。テンプレート核酸の取得源となる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染している場合もある。
いくつかの態様において、試料は全血である。いくつかの態様において、全血試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージは、精製ポリヌクレオチド試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージに等しい。いくつかの態様において、全血試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージは、精製ポリヌクレオチド試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージより約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%未満低いか、または最大で10%低いに過ぎない。いくつかの態様において、全血試料から観察されるオンターゲット特異性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察されるオンターゲット特異性に等しい。いくつかの態様において、全血試料から観察されるオンターゲット特異性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察されるオンターゲット特異性より約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%未満低いか、または最大で10%低いに過ぎない。いくつかの態様において、全血試料から観察される被覆度均一性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察される被覆度均一性に等しい。いくつかの態様において、全血試料から観察される被覆度均一性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察される被覆度の均一性より約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%未満低いか、または最大で10%低いに過ぎない。
いくつかの態様において、試料はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である。いくつかの態様において、FFPE試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージは、精製ポリヌクレオチド試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージに等しい。いくつかの態様において、FFPE試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージは、精製ポリヌクレオチド試料から作製される10個またはそれ以上のUIDを含有するアンプリコンのパーセンテージより約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%未満低いか、または最大で10%低いに過ぎない。いくつかの態様において、FFPE試料から観察されるオンターゲット特異性は精製ポリヌクレオチド試料から観察されるオンターゲット特異性に等しい。いくつかの態様において、FFPE試料から観察されるオンターゲット特異性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察されるオンターゲット特異性より約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%未満低いか、または最大で10%低いに過ぎない。いくつかの態様において、FFPE試料から観察される被覆度均一性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察される被覆度均一性に等しい。いくつかの態様において、FFPE試料から観察される被覆度均一性は、精製ポリヌクレオチド試料から観察される被覆度均一性より約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%未満低いか、または最大で10%低いに過ぎない。
本明細書において開示するライブラリーは、さまざまな応用において使用することができる。本明細書において使用する場合、ライブラリーは複数の分子を含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは複数のプライマーを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは複数のRTプライマーを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは複数のPEプライマーを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは複数の線形プライマー伸長(LPE)プライマーを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは複数のアダプターを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、線形増幅などの非指数関数的増幅のための複数のプライマーを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、PCRなどの指数関数的増幅のための複数のプライマーを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、シーケンシングのための複数のポリヌクレオチドを含む。例えばライブラリーは、シーケンシング応用に使用することができるだろう。いくつかの態様において、ライブラリーは、1つまたは複数のポリヌクレオチド、アンプリコン、またはアンプリコンセット由来の複数の配列リードを含む。ライブラリーは保存して、解析用の試料を作製するために複数回使用することができる。いくつかの応用として、例えば多型のジェノタイピング、RNAプロセシングの研究、および本明細書において提供する方法に従ってシーケンシングを行うための代表クローンの選択が挙げられる。シーケンシング用もしくは増幅用のプライマーまたはライブラリーなどの複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーを作製することができ、複数のポリヌクレオチドが、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、または900個のUIDまたはユニークポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、50,000,000、100,000,000個、またはそれ以上のユニークポリヌクレオチドを含み、各ユニークポリヌクレオチドはUIDを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのライブラリーは複数のアンプリコンセットを含み、各アンプリコンセットは同じUIDを持つ複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、40、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000個、またはそれ以上のアンプリコンを含み、1つまたは複数のアンプリコン中の各ポリヌクレオチドは、同じUIDを持つ複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000個、またはそれ以上のアンプリコンセットを含み、各アンプリコンセットは同じUIDを持つ複数のポリヌクレオチドまたはアンプリコンを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000個、またはそれ以上のポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットを含み、各ポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットは、同じテンプレート配列またはその一部分を持つ複数のポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000個、またはそれ以上のポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットを含み、各ポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットは、増幅エラーもしくはシーケンシングエラーまたは増幅バイアスもしくはシーケンシングバイアスを原因とする1塩基またはそれ以上によって1つまたは複数の他のポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットとは異なっているテンプレート配列またはその一部分を含む複数のポリヌクレオチド、アンプリコンまたはアンプリコンセットを含む。
本明細書において開示する方法の1つまたは複数の反応を行う工程は、1つまたは複数のプライマーの使用を含むことができる。本明細書において使用する場合、プライマーは、テンプレートポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするのに十分な相補性を有する二本鎖、一本鎖、または部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む。テンプレートポリヌクレオチドに結合する前は、プライマーは一本鎖DNAであることができる。いくつかの態様では、プライマーは最初は二本鎖配列を含む。プライマー部位は、テンプレートのうちプライマーがハイブリダイズする領域を含む。いくつかの態様において、プライマーは、鋳型指示核酸合成の開始点として作用する能力を有する。例えばプライマーは、4つの異なるヌクレオチドと重合剤または酵素、例えばDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼまたは逆転写酵素を加えると、鋳型指示核酸合成を開始させることができる。プライマー対は、2つのプライマー、すなわち、テンプレート配列の5'端とハイブリダイズする5'上流領域を持つ第1のプライマーと、テンプレート配列の3'端の相補鎖とハイブリダイズする3'下流領域を持つ第2のプライマーとを含む。いくつかの態様において、プライマーは、標的特異的配列およびUID配列を含む。いくつかの態様において、プライマーはバーコード配列を含む。いくつかの態様において、プライマーはUID配列を含む。いくつかの態様において、プライマーは試料バーコード配列を含む。いくつかの態様において、プライマーはユニバーサルプライミング配列を含む。いくつかの態様において、プライマーはPCRプライミング配列を含む。いくつかの態様において、プライマーは、ポリヌクレオチドの増幅を開始させるために使用されるPCRプライミング配列を含む(Dieffenbach, PCR Primer: A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press, ニューヨーク(2003))。ユニバーサルプライマー結合部位またはユニバーサルプライマー結合配列は、ポリペプチドおよび/またはアンプリコンへのユニバーサルプライマーの付着を可能にする。ユニバーサルプライマーは当技術分野において周知であり、例えば-47F(M13F)、アルファMF、AOX3'、AOX5'、BGHr、CMV-30、CMV-50、CVMf、LACrmt、ラムダgt10F、ラムダgt10R、ラムダgt11F、ラムダgt11R、M13 rev、M13Forward(-20)、M13Reverse、male、p10SEQPpQE、pA-120、pet4、pGAP Forward、pGLRVpr3、pGLpr2R、pKLAC14、pQEFS、pQERS、pucU1、pucU2、reversA、seqIREStam、seqIRESzpet、seqori、seqPCR、seqpIRES-、seqpIRES+、seqpSecTag、seqpSecTag+、seqretro+PSI、SP6、T3-prom、T7-prom、およびT7-termInvが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において使用する場合、付着とは、共有結合的相互作用および非共有結合的相互作用の両方またはどちらか一方を指すことができる。ユニバーサルプライマー結合部位へのユニバーサルプライマーの付着は、ポリヌクレオチドおよび/またはアンプリコンの増幅、検出、および/またはシーケンシングに使用することができる。ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のヌクレオチドまたは塩基対を含みうる。別の例において、ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、または10000個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。いくつかの態様において、ユニバーサルプライマー結合部位は、1〜10、10〜20、10〜30または10〜100個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。いくつかの態様において、ユニバーサルプライマー結合部位は、約1〜90、1〜80、1〜70、1〜60、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜10、2〜90、2〜80、2〜70、2〜60、2〜50、2〜40、2〜30、2〜20、2〜10、1〜900、1〜800、1〜700、1〜600、1〜500、1〜400、1〜300、1〜200、1〜100、2〜900、2〜800、2〜700、2〜600、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、5〜90、5〜80、5〜70、5〜60、5〜50、5〜40、5〜30、5〜20、5〜10、10〜90、10〜80、10〜70、10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜20、10〜10、5〜900、5〜800、5〜700、5〜600、5〜500、5〜400、5〜300、5〜200、5〜100、10〜900、10〜800、10〜700、10〜600、10〜500、10〜400、10〜300、10〜200、10〜100、25〜900、25〜800、25〜700、25〜600、25〜500、25〜400、25〜300、25〜200、25〜100、100〜1000、100〜900、100〜800、100〜700、100〜600、100〜500、100〜400、100〜300、100〜200、200〜1000、200〜900、200〜800、200〜700、200〜600、200〜500、200〜400、200〜300、300〜1000、300〜900、300〜800、300〜700、300〜600、300〜500、300〜400、400〜1000、400〜900、400〜800、400〜700、400〜600、400〜500、500〜1000、500〜900、500〜800、500〜700、500〜600、600〜1000、600〜900、600〜800、600〜700、700〜1000、700〜900、700〜800、800〜1000、800〜900、または900〜1000個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、60℃〜68℃の融解温度範囲を持つプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、21〜32ヌクレオチドの長さを持つプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、3'端にある最後の5つのヌクレオチド中に4つまたはそれ以上のピリミジンを含有しないプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、30%〜70%のGC含量を含有するアンプリコンが生成するように設計されたプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、225〜300塩基対の長さを持つアンプリコンが生成するように設計されたプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、初回RT/PE工程または線形伸長/増幅工程中の読み間違い数(ミスプライミングが引き起こすもの)が最も高いプライマーを除外した初期パネル由来のプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、二量体に広く認められるプライマーを除外した初期パネル由来のプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に使用されるプライマーパネルは、ある標的に関して最も高い総リード数の1つまたは複数を生じる原因となるプライマー(過剰増幅因子(over-amplifier))を除外した初期パネル由来のプライマーを含むか、またはそのようなプライマーからなる。記載の方法において使用するためのプライマーパネルの作成には、上記の測定規準の任意の1つまたは任意の組合せを使用することができる。
いくつかの態様において、SBCまたはUIDなどのバーコードは、それぞれ4〜36ヌクレオチド、または6〜30ヌクレオチド、または8〜20ヌクレオチドの範囲内の長さを有することができる。ある特定の局面において、セット内のバーコードの融解温度は互いに10℃以内、互いに5℃以内、または互いに2℃以内である。別の局面において、バーコードは、最小クロスハイブリダイゼーションセット(minimally cross-hybridizing set)のメンバーである。例えば、そのようなセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で他のどのメンバーの相補鎖とも安定な二重結合を形成することができない程度に、そのセットの他のどのメンバーとも十分に相違しうる。いくつかの態様において、最小クロスハイブリダイゼーションセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、他のどのメンバーのヌクレオチド配列とも、少なくとも2つのヌクレオチドは異なる。バーコード技術はWinzeler et al.(1999)Science 285:901; Brenner(2000)Genome Biol.1:1 Kumar et al.(2001)Nature Rev. 2:302; Giaever et al.(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:793; Eason et al.(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:11046;およびBrenner(2004)Genome Biol. 5:240に記載されている。
本明細書において開示する方法およびキットは1つまたは複数の酵素を含みうる。酵素の例として、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および制限ヌクレアーゼが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において開示する方法およびキットは、1つまたは複数の試薬の使用を含みうる。試薬の例としては、PCR試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、アフィニティ捕捉試薬、ビーズなどの固形支持体、核酸精製および/または単離用の試薬が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
当業者には理解されるとおり、本明細書に記載する方法および情報は、全部または一部を、公知のコンピュータ可読媒体上のコンピュータ実行可能命令として実装することができる。例えば本明細書に記載する方法はハードウェアに実装することができる。あるいは、本方法を、例えば1つまたは複数のメモリまたは他のコンピュータ可読媒体に格納してソフトウェアに実装し、1つまたは複数のプロセッサで実装することができる。公知のとおり、プロセッサは1つまたは複数のコントローラー、計算ユニットおよび/またはコンピュータシステムの他のユニットと関係づけるか、所望に応じてファームウェアに埋め込むことができる。ソフトウェアに実装する場合は、やはり公知であるとおり、RAM、ROM、フラッシュメモリ、磁気ディスク、レーザーディスク、または他の記憶媒体などといった任意のコンピュータ可読メモリにルーチンを格納することができる。また、このソフトウェアは、任意の送信方法によって、例えば電話線、インターネット、ワイヤレス接続などといった通信チャネルを介して、またはコンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブなどの可搬型媒体を介して、コンピューティングデバイスに送信することができる。
本開示の方法において有用なキットは、本明細書に記載する方法のいずれかにおいて有用な構成要素、例えば核酸増幅用のプライマー、遺伝子変動を検出するためまたは他のマーカー検出のためのハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素、適切な標識で標識されていてもよい核酸プローブ、アレル特異的オリゴヌクレオチド、本明細書に記載する本開示の核酸によってコードされている改変ポリペプチドに結合する抗体、または本明細書に記載する本開示の核酸によってコードされている野生型ポリペプチドに結合する抗体、遺伝子変動またはそのフラグメントを増幅するための手段、本明細書に記載する遺伝子変動を含む核酸の核酸配列を解析するための手段、遺伝子変動によってコードされているポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子変動と関連する核酸を解析するための手段などを含む。本キットは、例えば必要な緩衝液、核酸を増幅するための核酸プライマー、固形支持体、ならびに上述のプライマーおよび必要な酵素(例えばDNAポリメラーゼ)を使用して増幅されたフラグメントのアレル特異的検出のための試薬、例えば本明細書に記載するもののいずれかを含むことができる。加えて、キットは、本開示の方法と組合せて使用されるアッセイ法のための試薬、例えばある疾患またはある状態に関する他のスクリーニングアッセイ法で使用するための試薬を提供することができる。
cDNA合成
1ngから1000ngまでのRNAを、5pmolの各プライマー(記載の順にそれぞれSEQ ID NO:3〜7)を含有する以下のプライマーミックス5μlと混和した。
3μlのcDNAを、2μlの10μM P7/C7アダプター、1μl T4 DNAリガーゼ(Enzymatics,マサチューセッツ州)、2μlのラピッド(rapid)リガーゼ緩衝液、および2μlのヌクレアーゼフリーdH2Oと混和した。反応を室温で1時間インキュベートした。次に、反応を65℃で10分インキュベートすることによって熱失活させてから、Ampure XP(Beckman Coulter Genomics,マサチューセッツ州ダンバーズ)で精製した。
アダプターが連結されたDNA 10μlを、8.4μlのdH2O、0.3μlの10mM dNTPs、5μlのPhusion HF緩衝液、0.3μl PhusionホットスタートIIポリメラーゼ(Thermo Fischer,イリノイ州シカゴ)および体積1μl中の以下のプライマー各0.5pmolに加えた。
5μlの精製プライマー伸長産物を、10μlの5×Phusionホットスタート緩衝液、0.6μlの10mM dNTP、2μlの12.5μM C5 PCRプライマー
、2μlの12.5μM C7 PCRプライマー
、29.8μlのdH2O、および0.6uμlのPhusionホットスタートIIポリメラーゼと混和した。その反応を98℃で1分インキュベートしてから、98℃で10秒、60℃で20秒、および72℃で30秒を25サイクル行った。
PCR産物をアガロースゲル上で分離した。ゲルバンドを切り出し、Qiagen Mineluteゲル精製キットで精製した。精製された試料をAgilent Tapestation解析によって解析し、希釈し、Illumina MiSeqプラットフォームでのシーケンシングに先だって、ライブラリーバンド定量(library band quant)によってプールした。
ゲノムプライマー伸長
患者血液から抽出した4μgのヒトゲノムDNAを、0.6μlの10mM dNTP、1μlのBST 2.0ポリメラーゼ(New England Biolabs,マサチューセッツ州イプスウィッチ)、5μlの10×等温増幅緩衝液(NEB)、および以下の配列を含む1μlの0.5μM CS-30プライマーと混和した。
溶出したプライマー伸長反応20μlを、1.5μlの5μM P7/C7アダプター(上述のトップ鎖1本とボトム鎖1本とが正しいバーコード対形成でアニールしている二重鎖)、1μlのT4 DNAリガーゼ、6μlの5×ラピッドリガーゼ緩衝液(New England Biolabs,マサチューセッツ州イプスウィッチ)および1.5μlのヌクレアーゼフリーdH2Oと混和した。反応を室温で1時間インキュベートした。次に、反応を68℃で10分インキュベートすることによって熱失活させた。次に反応をAmpure XP(Beckman)で精製した。
180μlのmy One C1 SAビーズ(Dynal, Lifetech)を1mlの1×B&Wで洗浄した。ビーズをさらに2回、各200μlの1×B&W洗浄液で洗浄した。Ampure精製アダプターライゲーションの総溶出体積は65μlであった。等体積(65μl)の2×B&Wを加え、さらに100uμlの1×B&Wを加えて、結合反応1回につき230μlの総体積にした。反応を振とうインキュベーター上に20分置いた。試料結合後に、ビーズを200μlのNSXで洗浄し、液体を除去した。
ビーズ混合物を、21.1μlのdH2O、0.6μlの10mM dNTP、6μlのPhusion HF緩衝液、0.3μl PhusionホットスタートIIポリメラーゼ(Thermo Fischer,イリノイ州シカゴ)および体積2μl中の以下のプライマー各0.5pmolに再懸濁した。
5μlの精製プライマー伸長産物を、10μlの5×Phusionホットスタート緩衝液(HF)、0.6μlの10mM dNTP、2μlの12.5μM C5 PCRプライマー
、2μlの12.5μM C7 PCRプライマー
、29.8μlのdH2O、および0.6μlのPhusionホットスタートIIポリメラーゼと混和した。
その反応を98℃で1分インキュベートしてから、98℃で10秒、60℃で20秒、および72℃で30秒を25サイクル行った。
記載する標的シーケンシング法において使用するためのプライマーパネルを作製するために、増幅された標的の安定性およびロバストネスを評価した。加えて、配列精度および被覆度の均一性を評価して、プライマーパネルを作製しかつアッセイパフォーマンスを改良した。
記載する標的シーケンシング法において使用するためのプライマーパネルを作製するために、増幅された標的の安定性およびロバストネスを、アンプリコンのGC含量%および使用したプライマーの融解温度との比較で評価した。ある特定プライマーについて生成したリード数を、プライマーパフォーマンスの測定規準として使用した。加えて、プライマーパネルを作製し、アッセイパフォーマンスを改良するために、配列精度および被覆度の均一性を評価した。低パフォーマー(poor performer)(リード数が最も少ないもの)の大半は、TM<60℃の線形伸長/増幅プライマーであり、ATリッチアンプリコンに由来した。低パフォーマーの第2のクラスターは、GCパーセンテージが高いアンプリコンおよび高い融解温度を有するプライマーで構成されていた。これらの実験および解析の結果として、アンプリコンおよびプライマーについて、いくつかの基準を作製した。第1に、使用されるプライマーの融解温度範囲は60℃〜68℃にあるべきである。第2に、プライマーは、21〜32ヌクレオチドの長さを有することができる。第3に、プライマーは、3'端にある最後の5つのヌクレオチド内に4つまたはそれ以上のピリミジンを含有すべきでない。第4に、アンプリコンは30%〜70%のGC含量を含有すべきである。最後に、アンプリコンの長さは225〜300塩基対長であるべきである。
記載する標的シーケンシング法において使用するための反応条件を改良するために、増幅された標的の安定性およびロバストネスを評価した。加えて、配列精度および被覆度の均一性を評価して、反応条件を改良しかつアッセイパフォーマンスを改良した。
試料中に存在するDNA配列またはRNA配列を特異的にターゲティングし、増幅し、シーケンシングし、かつ/または定量するために、本明細書に記載する方法を使用した。これらの方法により、シーケンシングまたは他の分子解析用の標的とした配列をフォーマットすることになる追加配列の付加が可能になった。同じRNA分子または同じDNA分子に由来するリードをビン化することを可能にするユニーク識別配列(UID)を付加することで、ある特定の配列多型がRNA分子またはDNA分子の集団内に見いだされるものかそれとも増幅アーチファクトに起因したものであるかについての決定を下すことを可能にするために、本方法を使用した。RNAまたはDNAをテンプレート/出発材料として使用した。試料は任意の生物またはウイルスから得ることができる。さまざまなシーケンシングデバイスおよび他の分子解析デバイス用の標的とした分子をフォーマットするために、本方法を使用した。
、およびリン酸化された5'端を持つ配列既知のユニバーサルタグ(P7フォワードプライマー:P7fと命名)で構成された。UIDは、任意のRNA分子またはDNA分子に単分子バーコードを付加するために使用し、配列解析段階では、生物学的試料における絶対出発分子数を同定し、標的のコンセンサス配列をデコンボリュートし、全てのPCRエラーまたはシーケンシングエラーを除去し、それゆえにシーケンシング精度を高めるために使用した。数多くの異なる遺伝子を捕捉するために、オリゴの対応する遺伝子特異的部分が捕捉すべき各標的に対する相補鎖である数多くのそのようなオリゴで構成されるプールを使用した。
Claims (8)
- (a)標的特異的配列を含む第1のプライマーを使用して、試料から標的ポリヌクレオチドの第1の相補配列(CS)を作製する工程;
(b)第1のプライマー結合配列(PBS)またはその一部分を含むアダプターを、該第1のCSに付着させ、それにより修飾相補配列(MCS)を形成する工程;
(c)該MCSにハイブリダイズした第2のプライマーを伸長させ、それにより第2のCSを形成する工程であって、該第2のプライマーが、
(i)標的特異的領域と、
(ii)第2のPBSと
を含む、工程;ならびに
(d)該第1のPBSおよび該第2のPBSにそれぞれハイブリダイズする複数のプライマーを使用して、該第2のCSを増幅する工程
を含み、
該第1のプライマーまたは該第2のプライマーがユニーク識別(UID)配列を含む、
ポリヌクレオチドのライブラリーを作製する方法。 - 前記第1のプライマーがユニバーサルライゲーション配列(ULS)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のプライマーがユニバーサルプライミング配列(UPS)をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記アダプターが試料バーコード(SBC)配列をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記付着させることがライゲーションを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MCSがアフィニティ分子または捕捉配列をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
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