JP6486349B2 - 薬物の送達 - Google Patents

Description

本発明は、脳への薬物の鼻腔内送達のための新たなシステムに関する。

脳の疾患の治療は、血液脳関門によって大幅に制限される。過去１０年間にわたり、薬物の鼻腔内投与は、非経口療法として関心を集めてきた。もともとは、うっ血、感染症、鼻炎や鼻ポリープの局所治療のための投与経路として見られてきたが、近年では様々な製品がさまざまな病気の全身治療のために市場に参入している。薬物の経鼻送達は、初回通過代謝と腸内での分解の回避、静脈内投与と平行して全身系への迅速な拡散を迅速に開始すること、非侵襲性に起因する患者のコンプライアンス、セルフメディケーションの容易さ、を含む、多くの利点を有する。

鼻孔(nasal passage)内には、２つの主要な吸収領域：
最大の表面積を有し、且つ血管新生された、呼吸ゾーンと、
嗅上皮と、
がある。前者においては(where)、有効成分は、傍細胞(パラ、para-)もしくは経細胞経路を介して上皮を通過することができる。後者（嗅上皮）は、鼻腔の全表面積のわずか３〜５％を構成し、従って、主として全身吸収に関与していないが、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接アクセスを可能にすることができ、嗅球のニューロンとシナプス接合部を貫通して(through to)、嗅覚ニューロンのプロセスを介して血液脳関門を迂回する。

克服すべき経鼻経路を介する投与に関連した物理的な欠点がある。これらには、粘液線毛クリアランス、鼻粘膜の酵素活性、ペプチダーゼ及び薬物代謝酵素が含まれる。加えて、分子量及び親油性は、吸収において役割を果たす。３００Ｄａ未満の分子量を有する低分子量分子は、急速に吸収される傾向があるのに対して、３００〜１０００Ｄａの分子の場合、脂溶性は重要な特性である。親油性分子は、自由に拡散するのに対し、親水性分子は、傍細胞経路を通過しなければならないと考えられている。１ｋＤａを超える分子量を有する分子は非常にゆっくりと吸収され、低い生物学的利用能を有する。これらの障壁は、吸収促進剤の同時投与(coadministration)により透過性を増大させるか、又は阻害剤を同時投与する(co-administering)ことにより、排泄／分解を減少させる、分子の物理化学的特性を変化させることによって対処することができる。現在開発中の吸収促進剤には、アルキルサッカライド（Ｉｎｔｒａｖａｉｌ（登録商標））、キトサン（ＣｈｉＳｙｓ(商標)）、低メチル化ペクチン（ＰｅｃＳｙｓ(商標)）及びポリエチレングリコール（３０％）が挙げられる。

一般により密着結合を開くことによって、又は細胞外マトリックス成分と相互作用することによって、傍細胞輸送を促進するため、キトサン及びその誘導体は、キトサンの十分に説明された(well documented)能力に起因する、吸収促進剤として、一般的に使用される。鼻用ベラパミル溶液と比較して、キトサンは、ウサギに経鼻投与された場合、ベラパミルの生物学的利用能を増加させる（Ａｂｄｅｌ Ｍｏｕｅｚ ｅｔ ａｌ； Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２０１３， ３０， ５９−６６）。加えて、キトサンで変性したポリ乳酸のナノ粒子が、鎮痛ペプチド神経毒をカプセル化するために使用されてきた。これらのキトサン変性ナノ粒子を鼻腔内投与したラットは、ポリ乳酸単独を担持した(loaded)ナノ粒子と比較して、中脳水道周囲灰白質において神経毒の増大した濃度を有していた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ； Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０１３， ３９， （１１）， １６１８−２４）。

内因性オピオイドペプチドのロイシン５−エンケファリンＬｅｕｃｉｎｅ５エンケファリン（ＬＥＮＫ）とメチオニン５−エンケファリン（ＭＥＮＫ）とは、主に、Ｎ末端のチロシンの開裂によって分解される。ポリカルボフィル−システイン（０．２５％）とグルタチオン（１％）の存在下では、ＬＥＮＫは、少ない劣化と、新たに切除したウシ鼻粘膜を縦断する(across)強化された輸送とを示した。吸収促進剤のグリココール酸ナトリウム、及びＬＥＮＫを同時投与したプロテアーゼ抑制剤のピューロマイシンは、鼻洗浄液の劣化を減少させた。しかしながら、賦形剤のこの組み合わせは、細胞漏出、及び従って毒性をもたらし得る。

キトサン製剤(formulations)はまた、ペプチドの分解を減少させることができる。例えば、キトサン−ＥＤＴＡ複合体(conjugate)は、ＬＥＮＫの劣化を低減することを示した（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎueｒｃｈ ｅｔ ａｌ； １９９７， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １４， ９１７−２２）。ＬＥＮＫはまた、トリメチルキトサンナノ粒子と一緒に経鼻投与し、ＬＥＮＫ単独と比較して、２つのマウス疼痛モデルにおいて増強された痛覚抑制を示した（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ； Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ ２０１３， ６１Ｃ， １８９−１９５）。

ＷＯ２００４／０２６９１２は、疎水性薬物を可溶化するために使用される多糖類について記載する。多糖類は、両親媒性であり、一般的に、以下のいずれかの誘導体から選択される： キトサン、デキストラン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、及びグアーガム。第４アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）、及び第４アンモニウムヘキサデシルグリコールキトサン（ＧＣＨＱ）は、可溶性(solubilising)多糖類として、この特許出願の実施例において使用される。

ＷＯ２００８／０１７８３９は、両親媒性炭水化物ポリマーから形成されたミセルクラスタ、及び疎水性薬物を配合する際のその使用について記載する。ＧＣＰＱは、具体的には、両親媒性炭水化物ポリマーとして例示されている。

ＵＳ８２７８２７７において、ＬＥＮＫの脂質エステルプロドラッグが形成され、ＧＣＰＱを含む組成物に添加される。組成物は、静脈内又は経口的に送達される。プロドラッグは、in vivoでＬＥＮＫに変換され、有意なＬＥＮＫ脳レベルをもたらすことが示された。しかしながら、これらの従来技術の特許公報のいずれも、それ自体が親水性薬物を含む製剤について議論しない。

発明の概要
本発明の第一の態様によれば、親水性薬物と両親媒性炭水化物とを有し、治療において使用するための組成物であって、当該組成物は、ヒト又は動物体に鼻腔内投与される、組成物が提供される。

本発明の第２の態様によれば、両親媒性炭水化物化合物と、親水性薬物と、１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、鼻腔内投与に適した医薬組成物が提供される。

両親媒性炭水化物化合物は、水性媒体中のナノ粒子に自己組織化することが可能である。

キトサン及びその誘導体は、鼻経路を介した薬物の送達について十分に説明されているにもかかわらず、ＧＣＰＱなどの自己組織化する両親媒性炭水化物による(with)経鼻送達は、報告されていない。酸性ｐＨで可溶性であるキトサンとは異なり、ＧＣＰＱは、中性ｐＨで自己組織化することが可能であり、このことは、経鼻送達のためのその親化合物にまさる利点を与える。我々は、キトサンへのパルミトイル鎖の付加が、このキトサン誘導体を自己組織化可能にし、薬物化合物とのより大きな関連を与え、及び従って送達を強化したと信じる。

さらにまた、ＧＣＰＱは、説明されたキトサン誘導体と同様に機能するとは、考えられない。キトサン（Ａｒｔｕｓｓｏｎ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ； １９９４． １１ １３５８−１３６１）及びトリメチルキトサン（Ｔｈａｎｏｕ， Ｍ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２０００， ６４， １５−２５）は、細胞間密着結合を開く。そして、キトサン及びトリメチルキトサンは、例え鼻腔内投与された場合でも、この機構を介して膜透過化及び親水性薬物吸収を促進すると考えられている（Ｋｕｍａｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１３， ６１， １８９−９５）。ＧＣＰＱ両親媒性物質などのような両親媒性自己組織化キトサンは、細胞間結合を開かない（Ｓｉｅｗ， Ａ．， ｅｔ ａｌ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， ２０１２， ９， １４−２８）。親水性薬物の送達を容易にする、ＧＣＰＱなどの両親媒性炭水化物化合物の能力は、予想外であった。

発明の詳細な説明
親水性とは、高い水溶性（＞１ｍｇ・ｍＬ^−１）を有する化合物を意味する。

本発明は、脳への親水性薬物の送達のために特に有用である。我々は、本発明に従って送達される薬物は、脳内で治療効果を有することが可能であることを示した。

親水性薬物は、好ましくはペプチドである。ペプチドは、多くの中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療のために多大な臨床的価値があり、そして好ましくは、従って、当該薬物は、ＣＮＳ活性薬物である。多くの既存のペプチド医薬は、経口投与後に効果がなくなり、又は上に詳述したように、主にそれらの親水性、サイズ、電荷及び胃腸管、鼻腔及び血液における急速な代謝分解に起因する、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができない。本発明は、脳に薬物を送達するために特に有用であるので、親水性薬物は、好ましくは、神経活性剤である。

内因性オピオイド神経ペプチド、好ましくニューロペンタペプチドは、特に本発明における使用のための薬物として好ましい。例としては、ＭＥＮＫとＬＥＮＫが含まれる。

薬物は、統合失調症、肥満症、疼痛、睡眠障害、精神疾患、神経変性状態、脳癌及び感染性疾患などの脳障害を治療するために使用することができる。

好適な薬物には、エンケファリン、ニューロペプチドＳ、ダラルギン、オレキシン、バソプレシン、レプチン、コレシストキニン、ダイノルフィン、デルトルフィンＩ、ニューロテンシン及びオキシトシンなどの神経ペプチドが含まれる。

両親媒性炭水化物の化合物は、典型的には、キトサン、デキストラン、アルギン酸、デンプン、グアーガム、及びこれらの誘導体から選択される。好ましくは、両親媒性化合物は、キトサン誘導体である。

本発明の好ましい一実施形態において、両親媒性炭水化物の化合物は、
式：

(式中、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であって、
aは、０．００〜０．９７０であり、
ｂは、０．０１〜０．９９０であり、
ｃは、０．０００〜０．９７０であり、
ｄは、０．０１〜０．９９０であり；及び
式中、
Ｘは、疎水性基であり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換もしくは無置換のアルキル基から選択され；
Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のエーテル基、又は置換もしくは無置換のアルケン基から選択され；
Ｒ_７は、存在又は不在であってもよく、存在する場合、無置換もしくは置換のアルキル基、無置換もしくは置換のアミン基、又は置換もしくは無置換のアミド基であり；
Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素、及び置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のエーテル基、又は置換もしくは無置換のアルケン基のいずれかから選択される）；
で表され、又は
その塩である。

上記一般式において、ａ、ｂ、ｃ、ｄの単位は任意の順序で配置されてもよいし、部分的に順序付けられた、又はランダムな順序付けであってよい。式中のアスタリスク＊は、継続的なポリマー鎖を示すために使用される。好ましい実施形態において、ｄ単位のモル比(proportion)は、０．０１より大きく、より好ましくは少なくとも０．１１０、より好ましくは少なくとも０．１２０であり、より好ましくは少なくとも０．１５０、又はいくつかの実施形態において、少なくとも０．１８である。一般に、ｄ単位のモル比は、０．５００以下であり、より好ましくは０．３５０以下である。

好ましくは、ｂ単位のモル比は、０．０１０〜０．８００であり、より好ましくは０．０５０〜０．６００である。

好ましくは、ｃ単位のモル比は、０．０２００〜０．８５０であり、より好ましくは０．０５〜０．５５０である。

好ましくは、ａ単位のモル比は、好ましくは０．１０〜０．７５であり、より好ましくは０．０５〜０．８５である。

上記の式から分かるように、ａ及びｃの単位は、任意には存在しなくてもよい。ｄ単位は、疎水性基で誘導体化された(derivatised)モノマー単位の第１の部分を提供する。ｂ単位は、モノマー単位の第２の部分を提供し、第４窒素基で誘導体化されている。存在する場合、ａ単位は、アミン基が、第１又は第２のグループとは別の方法で誘導体化されたモノマー単位の第３のグループを提供する。

存在する場合、ｃ単位は、アミン基が非誘導体化された(underivatised)モノマー単位の第４のグループを提供する。

本発明において、疎水性基Ｘは、置換又は無置換基から好ましくは選択される。置換又は無置換基(which)とは、
Ｃ_４−３０アルキル基等のアルキル基、
Ｃ_４−３０アルケニル基等のアルケニル基、
Ｃ_４−３０アルキニル基等のアルキニル基、
Ｃ_５−２０アリール基等のアリール基、
複数の(more than one)Ｃ_４−Ｃ_８環構造を有する多環式疎水性基、例えばステロール（例えばコレステロール）、
複数の(more than one)Ｃ_４−Ｃ_８ヘテロ原子環構造を有する多環式疎水性基、
ポリオキサブチレンポリマー等のポリオキサＣ_１−Ｃ_４アルキレン基、又は
疎水性ポリマー置換基、例えばポリ（乳酸）基、ポリ（ラクチド − コ − グリコリド）基、ポリ（グリコール酸）基、
である。Ｘ基は、直鎖、分岐鎖又は環状基であってもよい。Ｘ基のいずれかは、ｄ単位に直接結合されてもよく、又はアミン基、アシル基もしくはアミド基等の官能基を介して結合されてもよい。それにより、Ｘ’−環、Ｘ’−ＮＨ−、Ｘ’−ＣＯ環、Ｘ’ＣＯＮＨ−環として荒らされてもよい結合を形成する。ここで、Ｘ’は、上で定義されたのような疎水性基である。

Ｘ基の好ましい例には、式
ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−、又は
ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、又は
アルケン酸 ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_ｑ−ＣＯ−ＮＨ、
で表されるものが挙げられる。式中、
ｎは、４〜３０であり、より好ましくは６〜２０であり、
ｐ及びｑは同一でも異なっていてもよく、４〜１６であり、より好ましくは４〜１４である。特に好ましいクラスのＸ置換基は、例えば、式 ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎＣＯ−ＮＨ−で表されるように（式中、ｎは２〜２８である）、アミド基を介してキトサンモノマー単位に結合される。アミド基の例は、キトサンのアミン基に、カルボン酸をカップリングすることによって製造される。好ましい例は、脂肪酸誘導体ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＯＨ、例えばカプリン酸（ｎ＝８）、ラウリン酸（ｎ＝１０）、ミリスチン酸（ｎ＝１２）、パルミチン酸（ｎ＝１４）、ステアリン酸（ｎ＝１６）又はアラキジン酸（ｎ＝１８）に基づくもの、である。

上記式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、好ましくは独立して、置換もしくは無置換のアルキル基、例えばＣ_１−１０アルキル基から選択される。Ｒ_１、Ｒ_２及び／又はＲ_３は、直鎖状又は分枝状であってもよい。好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、メチル、エチル又はプロピル基から選択される。

上記式中、Ｒ_８及びＲ_９は、好ましくは独立して、水素、及び置換もしくは無置換のアルキル基、例えばＣ_１−１０アルキル基から選択される。Ｒ_８及び／又はＲ_９は、直鎖状又は分枝状であってもよい。好ましくは、Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、メチル、エチル又はプロピル基から選択される。

上記式中、Ｃ６又は糖単位上に存在するＲ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、水素、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のエーテル基、又は置換もしくは無置換のアルケン基から選択される。好ましいＲ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０基は、１以上のヒドロキシル基、又は別の非イオン性親水性置換基で置換されている。Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０基の例は、以下の式：
−（ＣＨ_２）_ｐ−ＯＨ
(式中、ｐは１〜１０、好ましくは２〜４である)、又は
−（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＯＨ）_２
（式中、ｐは１〜１０である）、又は
−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｃ（ＣＨ_２−ＯＨ）_ｒ
(式中、ｐは１〜１０であり、ｒは３である)、又は
−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）_ｐ
(式中ｐは１〜３００である)、
で表される

Ｒ_７基は、一般式において存在しても又は不在であってもよい。不在の場合、Ｒ_７基は(it)、キトサン骨格のモノマー単位に直接結合される、第４アンモニウム官能基を提供する。Ｒ_７基が存在する場合、Ｒ_７基は、
例えば、式−（ＣＨ_２）_ｎ−で表されるような、無置換もしくは置換のアルキル基（例えば、Ｃ_１−１０アルキル基）、又は
式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−で表されるような、アミン基、又は
式−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−で表されるような、アミド基
であり得る。式中、ｎは１〜１０であり、好ましくは１〜４である。
Ｒ_７Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３置換基の好ましい一例は、例えば−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３において、アミド基を提供するｂ単位のアミン置換基に、ベタイン（−ＯＯＣ−ＣＨ_２−Ｎ−（ＣＨ_３）_３）をカップリングすることにより提供される。

示されるように、本明細書に記載される置換基のいくつかは、当業者に周知であるように、無置換、又は当業者に周知である、１以上の追加の置換基で置換されているかのいずれかであり得る。一般的な置換基の例としては、ハロ；ヒドロキシル；エーテル（例えば、Ｃ_１−７アルコキシ）；ホルミル；アシル（例えばＣ_１−７アルキルアシル、Ｃ_５−２０アリールアシル）；アシルハライド；カルボキシ；エステル；アシルオキシ；アミド；アシルアミド；チオアミド；テトラゾリル；アミノ；ニトロ；ニトロソ；アジド；シアノ；イソシアノ；シアナト；イソシアナト；チオシアノ；イソチオシアノ；スルフヒドリル；チオエーテル（例えば、Ｃ_１−７アルキルチオ）；スルホン酸；スルホネート；スルホン；スルホニルオキシ；スルフィニルオキシ；スルフアミノ（sulfamino）；スルホンアミノ（sulfonamino）；スルフィンアミノ（sulfinamino）；スルファミル；スルホンアミド；Ｃ_１−７アルキル（例えば、無置換Ｃ_１−７アルキル、Ｃ_１−７ハロアルキル、Ｃ_１−７ヒドロキシアルキル、Ｃ_１−７カルボキシアルキル、Ｃ_１−７アミノアルキル、Ｃ_５−２０アリールＣ_１−７アルキルなどを含む）；Ｃ_３−２０ヘテロシクリル；及びＣ_５−２０アリール（例えば、Ｃ_５−２０カルボアリール、Ｃ_５−２０ヘテロアリール、Ｃ_１−７アルキル−Ｃ_５−２０アリール及びＣ_５−２０ハロアリールを含む）が挙げられる。

本明細書で使用される用語「環構造」は、３〜１０個の共有結合した原子の、さらに好ましくは３〜８個の共有結合した原子の、さらにより好ましくは５〜６個の共有結合した原子の閉じた環に関連する。環は、脂環式環、又は芳香環であってもよい。本明細書で使用される用語「脂環式環」は、芳香環ではない環に関する。

本明細書で使用される用語「炭素環」は、環原子がすべて炭素原子である環に関する。

本明細書で使用される用語「炭素芳香環」は、環原子がすべて炭素原子である芳香環に関する。

本明細書で使用される用語「複素環」は、環原子の少なくとも１個が、多価の環ヘテロ原子であり、例えば、窒素、リン、ケイ素、酸素又は硫黄であって、但しより一般的には、窒素、酸素、又は硫黄である。好ましくは、複素環は１〜４個のヘテロ原子を有する。

上記の環は、「多環式基」の一部であってもよい。

好ましくは、両親媒性炭水化物化合物は、第４アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）である。

両親媒性炭水化物化合物は、トリポリリン酸などの他の作用物質(agents)の存在なしに水性媒体中での粒子へと自己組織化することが可能である。

本発明の組成物は、粒子凝集体を形成することができる。これらは、個々の両親媒性分子と親水性の薬物との集合体により形成され、１０ｎｍ〜２０μｍの平均粒子サイズを有する。

好ましくは、両親媒性炭水化物化合物は、親水性薬物をロードすることができるナノ粒子を形成する。炭水化物及び薬物の分散液(dispersion)が形成されてもよく、それは、透明又は半透明である。一般的に両親媒性化合物は、薬物と混合し、分散液は、混合物を撹拌すること(vortexing)、且つプローブ音波処理すること(probe sonicating)によって調製される。

平均粒子サイズは、顕微鏡により、又は光子相関分光法を用いて容易に決定することができ、濾過前に水性分散液中で都合よく決定される。より好ましくは、高分子ミセル凝集体は、最小平均粒子サイズ、少なくとも１０ｎｍ、より好ましくは少なくとも３０ｎｍ、及び最大平均粒子サイズ、好ましくは１０μｍ以下を有する。

典型的には、両親媒性炭水化物化合物と薬物との比率は、１：１０〜２０：１の範囲内である。好ましい範囲は、０．５：１〜１０：１であり、より好ましい比率は、重量比で１：１である。

典型的には、両親媒性炭水化物化合物と薬物と医薬的に許容可能なキャリアの比率は、約１〜１００ｍｇ：５０ｍｇ：１ｇであってよい。

本発明の医薬組成物は、鼻腔内投与に適した液体の形態又は固体の形態であってもよい。

好適な毎日の用量は、年齢、体重、投与時間、等に基づき決定することができる。毎日の投与量は患者の状態及び体重、及び薬物の性質に依存して変化し得るが、典型的な鼻腔内投与量は、約０．１〜１２０ｍｇ／１人／１日、好ましくは０．５〜６０ｍｇ／１人／１日である。

本発明は、ここで、図１及び２を参照して以下の実施例により説明される。
図１は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）ラット炎症性疼痛モデルにおけるＧＣＰＱの非存在下及び存在下で鼻腔内ＬＥＮＫの効果を示すグラフである。 図２は、ラットＣＦＡ炎症性疼痛モデルにおいて、鼻腔内ＬＥＮＫＧＣＰＱ製剤の活性への中枢及び末梢機構の寄与の評価を示すグラフである。

実施例１
第４アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）の合成
グリコールキトサンの酸分解
グリコールキトサン（２Ｇ）を一定の撹拌下、室温で２０分間、塩酸（４Ｍ、１５０ｍＬ）に溶解した。溶液を５０℃で予熱した水浴中に置いた。８時間で反応を停止し、生成物を振とう水浴から除去した。分子量は、分解時間によって制御された。すなわち、酸分解時間を増加させると、得られるポリマーの分子量を減少させた。以前の研究は、１３，０００Ｄａの分子量が、約１０，０００Ｄａの出発分子量を有するグリコールキトサンの酸加水分解の８時間後に得られたことを示した。２４時間にわたる６回の交換と共に、脱イオン水（５Ｌ）に対して徹底的な透析により（Ｖｉｓｋｉｎｇシームレスセルロースチューブ、７，０００Ｄａの分子量カットオフ）、生成物を精製した。透析手順の最後における透析液（中性ｐＨ）を、その後、凍結乾燥し、生成粒は、クリーム色の脱脂綿(cotton-wool)状物質として回収した。分解(degradation)は、１．０６ｇ（すなわち、５３％）の分解(degraded)グリコールキトサンをもたらした。

分解グリコールキトサンのパルミトイル化
分解グリコールキトサン（５００ｍｇ）及び重炭酸ナトリウム（３７６ｍｇ、−０．０４５Ｍ）を、無水エタノール（２４ｍＬ）及び脱イオン水（７６ｍＬ）中の混合物に溶解した。このグリコールキトサン溶液に、２０分間かけて連続的に撹拌しながら、無水エタノール（１５０ｍＬ）に溶解したパルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＮＳ、７９２ｍｇ）の溶液を滴下した。次いで、混合物を７２時間撹拌した。エタノールの大部分を蒸発させること、及び３回残りの水相（１００ｍＬ）をジエチルエーテルで３回抽出すること（各回において、水性相の体積の２倍、即ち２００ｍＬを使用した）により生成物を単離した。２４時間にわたる６回の交換と共に、脱イオン水（５Ｌ）に対してポリマーの水性混合物を徹底的に透析した（Ｖｉｓｋｉｎｇシームレスセルロースチューブ、７，０００Ｄａの分子量カットオフ）。得られた生成物を、凍結乾燥して、白色脱脂綿(cotton-wool)状固体を得た。

パルミトイルグリコールキトサンの第４化(quaternisation)
パルミトイルグリコールキトサン（３００ｍｇ）を、室温で１２時間、一晩、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（２５ｍＬ）中に分散させた。水酸化ナトリウム（４０ｍｇ、０．０５７Ｍ水溶液として１モル）、ヨウ化メチル（１．０ｇ、０．４４ｍＬ）及びヨウ化ナトリウム（４５ｍｇ、エタノール溶液として、０．０５Ｍ）を添加し、反応物(reaction)を、窒素流れ下、３６℃で３時間、攪拌した。

第４アンモニウム生成物を、ジエチルエーテル（４００ｍＬ）で沈殿させ、濾過し、黄色い吸湿性固体を与えるために、多量のジエチルエーテル（３００ｍＬで２回）でさらに２回洗浄した。第４化した生成物を、水（１００ｍＬ）に溶解して、黄色の溶液を得た。２４時間にわたる６回の交換と共に、水（５Ｌ）に対して得られた溶液を徹底的に透析した。透析液は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−９６ Ｃｌ⁻を充填したカラム（１×６ｃｍ）を通過させた。カラムは、１ボリュームの樹脂（３０ｍＬ）で充填し、次いで、塩酸溶液（９０ｍＬ、１Ｍ）で、続いて脱イオン水（１０Ｌ）で洗浄して、中性ｐＨを得た。カラムからのクリアな溶出液を凍結乾燥して、透明な繊維状固体として第４アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）を得た。ＧＣＰＱの合成収率は、１５０〜１６０ｍｇ（すなわち、５０〜５３％）である。

ゲル浸透クロマトグラフィー及びマルチアングルレーザ光散乱（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）
ＧＣＰＱの分子量は、流量１ｍＬ・分^-1における酢酸塩緩衝液（０．３Ｍ ＣＨ_３ＣＯＯＮａ（無水）／０．２Ｍ ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ｐＨ値＝４．５）／ＨＰＬＣグレードのメタノール（３５：６５）の移動相を使用して、ＤＡＷＮ(登録商標)ＥＯＳ(商標)ＭＡＬＬＳ（λ＝６９０ｎｍ）、Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉屈折計（λ＝６９０ｎｍ）、及び準弾性光散乱検出器と光散乱検出器との両方（Wyatt Technology Corporation、ＵＳＡ）を装備したＧＰＣ−ＭＡＬＬＳにより決定した。Ｗａｔｅｒｓ ７１７ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを使用して、濾過したサンプル（０．２μｍ）を、ＰＯＬＹＳＥＰ ＴＭ−ＧＦＣ−Ｐ ４０００カラム（３００×７．８ｍｍ， Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ， ＵＫ）に取付けられたＰＯＬＹＳＥＰＴＭ−ＧＦＣ−Ｐガードカラム（３５×７．８ｍｍ， Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ， ＵＫ）内に、５ｍｇ・ｍＬ^−１のローディング濃度で注入した。Ｗｉｎｄｏｗｓのバージョン４．９０．０８ソフトウェア用のＡＳＴＲＡ（Wyatt Technology Corporation、ＵＳＡ）を用いて、データを処理した。ＧＣＰＱの比屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉屈折計（λ＝６９０ｎｍ）を用いて室温で（上記のような）溶媒中で測定した。０．１〜０．６ｍｇ・ｍＬ^−１の範囲の濾過したサンプル（０．２μｍ）は、０．３ｍＬ・分_−１のポンプ流量で注入システム（Wyatt Technology Corporation、ＵＳＡ）を用いてマニュアルで注入した。Ｗｉｎｄｏｗｓのバージョン４．９０．０８ソフトウェア）用のＡＳＴＲＡ（Wyatt Technology Corporation、ＵＳＡを用いて、データを処理した。

^１Ｈ ＮＭＲ
^１Ｈ ＮＭＲ実験は、Ｄ_２Ｏ中の酸分解キトサン（１０ｍｇ・ｍＬ^−１）及びＣＨ_３ＯＤ中のＧＣＰＱ溶液（１０ｍｇ・ｍＬ^−１）についてＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ ４００ ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｃｏｖｅｎｔｒｙ， Ｕ．Ｋ．）で実施した。温度４５〜５０℃で、分析を行った。パルミトイル化のレベルは、パルミトイルメチルプロトン（δ＝０．８９ｐｐｍ）と糖プロトン（δ＝３．５〜４．５ｐｐｍ）との比率を比較することによって計算した。第４化のレベルは、第４アンモニウム（δ＝３．４５ｐｐｍ）と糖プロトンとの比率を比較することによって計算した。

自己組織化ポリマーナノ粒子の調製
自己組織化ポリマーの両親媒性物質は、注射ＢＰ用の水(B. Braun Melsungen AG, Germany)（１．５ｍＬ）中のＧＣＰＱ（４５ｍｇ）を撹拌すること（vortexing）(WhirliMixer， Fisherbrand)により、その後、氷上で１０分間、その最大出力の３０％に設定した装置を用いて、分散液をプローブ音波処理すること（Ｑｓｏｎｉｃａ）により、調製された。粒子サイズは、６３３ｎｍの波長で、２５℃で、光子相関分光法（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＫ）により測定された。データ解析のＣＯＮＴＩＮ法を用いてデータを分析した。粒子サイズを測定した前のポリマー分散液は、室温（２５℃）で１５分間放置された。クリアな分散液は、その後、シリンジろ過された（０．４５μｍ、３３ｍｍのＭｉｌｌｅｘ ＧＰシリンジ駆動フィルターユニット、水溶液の滅菌用のＰＥＳ膜）。濾過された溶液は、その後、上記のように再び測定した。測定は三重に行った。

ナノ粒子の形態学的検査は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により調べた。濾過されていない溶液の液滴が、Ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティングされたグリッド（Ｆ１９６１１００ ３．０５ｍｍ、３００メッシュ、Ｔａｂ Ｌａｂｓ Ｌｔｄ， ＵＫ）上に配置された。過剰なサンプルは、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１で濾過して除き(off)、そして１％水性酢酸ウラニルでネガティブ染色した。イメージングは、ＦＥＩ ＣＭ１２０ ＢｉｏＴｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、ＵＳＡ）を用いて行なった。デジタル画像は、ＡＭＴデジタルカメラを使用して撮影した。（濾過されていない）ポリマーナノ粒子は、球状の形態を示した。

経鼻投与用（薬物を有する）自己組織化ポリマーナノ粒子の調製
ＬＥＮＫ（３０ｍｇ・ｍＬ^−１）を有するＧＣＰＱ分散液（３０ｍｇ・ｍＬ^−１）は、注射ＢＰ用の水(B. Braun Melsungen AG, Germany)中の懸濁液を５分間、撹拌すること（vortexing）(WhirliMixer， Fisherbrand)により、調製された。その後、氷上で１０分間、その最大出力の３０％に設定した装置を用いて、プローブ音波処理する（Ｑｓｏｎｉｃａ）前に、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ＝５．８に調整した。製剤(formulations)は、冷蔵庫で一晩放置された。粒子サイズは、６３３ｎｍの波長で、２５℃で、光子相関分光法（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＫ）により測定された。データ解析のＣＯＮＴＩＮ法を用いてデータを分析した。粒子サイズを測定した前のＬＥＮＫを有するポリマー分散液は、室温（２５℃）で１５分間放置された。ナノ粒子の形態学的検査は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により調べた。濾過されていない溶液の液滴が、Ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティングされたグリッド（Ｆ１９６１１００ ３．０５ｍｍ、３００メッシュ、Ｔａｂ Ｌａｂｓ Ｌｔｄ， ＵＫ）上に配置された。過剰なサンプルは、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１で濾過して除き(off)、そして１％水性酢酸ウラニルでネガティブ染色した。イメージングは、ＦＥＩ ＣＭ１２０ ＢｉｏＴｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、ＵＳＡ）を用いて行なった。デジタル画像は、ＡＭＴデジタルカメラを使用して撮影した。（濾過されていない）ポリマーナノ粒子は、球状の形態を示した。

ペプチド薬物をロードされたポリマーの分析
ＬＥＮＫの定量は、可変波長ＵＶ検出器と、Ｃ１８ガードカラムを有するＯＮＹＸモノリシックＣ１８カラム（５μｍ、４．６ｍｍ×１０ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、 ＵＫ）を備えた、バイナリポンプ（１２２０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＶＬ）からなるＡｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで行った。移動相は、８２％の水：１８％のアセトニトリル：０．０２％のトリフルオロ酢酸から構成された。サンプル溶出は、２１４ｎｍのＵＶ吸収波長、１．０ｍＬ・分^−１、３０℃でモニターした。保持時間は、ＬＥＮＫの場合６．６分であり、最低検出限界は、１μｇ・ｍＬ^−１であった。

鼻腔内投与用のペプチド薬物をロードされたポリマー分散液についての結果
薬物−ポリマー分散液は、透明又は半透明の製剤として提示され、２０ｎｍ及び５００ｎｍの粒子サイズの２つの集団から構成されていた。薬物含量は、初期量の８０％において分析した。

in vivo研究 鼻腔内投与薬力学−動物、
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）を、２０〜２２℃及び湿度５０〜６０％に維持された空調ユニット内のケージ当たり４頭ずつ収容した。標準的なげっ歯類固形飼料及び水を自由にアクセスさせた。０７．００ｈに点灯する照明は１２時間サイクルで制御した。動物は、実験前に７日間馴化し、試験前に１時間処置室に順応した。すべてのプロトコルは、英国内務省の認可の下で行われ、地元の倫理委員会によって承認された。

製剤
ラットに、注射用水（０．０５ｍＬ）、水中の鼻腔内ＬＥＮＫ塩酸塩３０ｍｇ・ｍＬ^−１（７．５ｍｇ・ｋｇ^−１、ｐＨ＝５．８、５０μＬ）、ＬＥＮＫ塩酸塩３０ｍｇ・ｍＬ^−１（ＬＥＮＫ塩酸塩３０ｍｇ・ｍＬ^−１）とＧＣＰＱ（３０ｍｇ・ｍＬ^−１）とから構成される水中のＧＣＰＱ−ＬＥＮＫを、鼻腔内投与した。製剤の鼻腔内体積は、ラット１頭当たり最大６０μＬに設定した。投与体積は、ＬＥＮＫの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）定量化と、各動物の体重とに基づいて調整した。最大体積は、プラセボ（水のｐＨ＝５．８）を受けるラットのために投与された。動物を短時間イソフルランで麻酔し、ＰＥ１０チューブ（１５ｍｍ）に取り付けられた、インスリン注射器を用いて製剤を鼻腔内投与した。チューブは、鼻孔の一方に挿入した。

完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を誘導した慢性炎症性疼痛
ラットは、２５Ｇ針を有するガラス製ハミルトンシリンジを使用して、１００μＬのＣＦＡ（８５％パラフィン油と１５％マンニドモノオレエートとにおいて懸濁され、加熱滅菌した結核菌 １ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を足底内注射を受けた。ＣＦＡは、後肢の浮腫を引き起こし、機械的過敏症は、ＣＦＡの注射後２４時間を評価した。

機械的過敏症の測定
機械的過敏性を評価した。ラットを個別に透明なプラスチックケージ内の上昇したプラスチック製のメッシュ（０．５ｃｍ^２穿孔(perforations)）上に置いた。評価チャンバまで２回の慣らし(habituations)が、異なる２日において、それぞれ少なくとも５分間行われた。機械的過敏症は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛（Ugo Basile、スイス）の適用に対する感受性によって評価した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（１．４、２、４、６、８、１０、１５、２６ｇ）昇順に注射された足の足底表面に対して垂直に提示され、フィラメントのわずかな曲がりを起こすのに十分な力で、５秒間この位置に保持した。陽性反応は、後足の突然の引っ込みを含めた。又は、足が急激に引込められたならば、又は毛髪の適用時にそこで尻込みしたならば、応答が認められました。一度、ポジティブな引っ込め応答が確立されたら、足は再試験された。足は何の応答が発生しなくなるまで、次の降順のｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛で始めた。応答を誘発するのに必要な力の最小量は、足引っ込め（ｇ）として記録した。機械的アロディニアは、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛適用に対する、引込め(withdrawal)閾値の有意な減少と定義した。２６ｇの毛を、テストの上限カットオフとして選択した。

機械的アロディニアに対する製剤効果を試験するため、ＣＦＡ注射後閾値２４時間についてラットを評価した。その後、その閾値に従って、それらラット(they)をランダム化し、製剤を投与した。ラットは、処置を知らされていない観察者によって評価された。

鎮痛製剤に対する中枢の(central)貢献と周辺の(peripheral)寄与
製剤の中枢及び末梢機構の寄与を評価するため、非選択的オピオイド拮抗剤、ナロキソン塩酸塩（１５ｍｇ・ｍＬ^−１、７．３ｍｇ・ｋｇ^−１ ９０μＬ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、英国）と末梢制限されているナロキソンのナロキソンメチオジド第４アンモニウム塩（２０ｍｇ・ｍＬ^−１、１０ｍｇ・ｋｇ^−１、９０μＬ、Ｓｉｇｍａ）とを皮下投与した。これらの拮抗剤は、鼻用製剤で併用(concomitantly)投与された。

統計分析
結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．(標準誤差)として示す。データは、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのポストホックテストに続いて二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて行った。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。

薬力学結果
図１は、ラットＣＦＡ炎症性疼痛モデルにおけるＧＣＰＱの非存在下及び存在下で鼻腔内ＬＥＮＫの効果を示す（平均±ＳＥＭ ｎ＝６； Ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉのポストホックテストに続いて反復測定による２要因ＡＮＯＶＡ）。図１において、アスタリスク＊は、賦形剤(vehicle)と治療群との間における統計的に有意な差を表し、シャープ記号＃は、ＬＥＮＫ単独とＬＥＮＫ−ＧＣＰＱとの間における統計的に有意な差を表す。

１００μＬ ＣＦＡを、左後肢の足底表面に注射した。炎症は２４時間発展させた。動物は、賦形剤（水、５０μＬ／ラット）、ＬＥＮＫ ７．５ｍｇ・ｋｇ^−１（ｐＨ＝５．８、５０μＬ）、ＬＥＮＫ−ＧＣＰＱ（７．５ｍｇ・ｋｇ^−１ ＬＥＮＫ及び７．５ｍｇ・ｋｇ^−１ ＧＣＰＱ、ｐＨ＝５．８、５０μＬ）の鼻腔内投与を受ける前に、ポストＣＦＡベースラインにおいて無作為抽出した(randomised)。
ＧＣＰＱ１９０８２０１３ＬＧ（モル％ パルミトイル化＝１３％、モル％ 第４アンモニウム基＝９．１％、分子量＝２２ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３１）。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛（１．４、２、４、６，８，１０，１５，２６ｇ）に対する足引っ込めは、評価のアップダウン法を用いて２０分、４０分、１、２、３、４時間、評価した。

プレＣＦＡベースライン足引っ込め力は、２４．４±４ｇであった。ポストＣＦＡ（２４時間）ベースラインは、３．３±１．３ｇであった。統計的な差は、測定した時点のいずれにおいても（２０、４０分、１、１．５、２、３、及び４時間）、ＬＥＮＫ溶液（３０ｍｇ・ｍＬ^−１）と賦形剤コントロールとの間に観察されなかった。ＬＥＮＫ−ＧＣＰＱ（３０ｍｇ・ｍＬ^−１ ＬＥＮＫ）製剤は、賦形剤コントロール及びＬＥＮＫ溶液と比較して、最大４時間、痛覚(nociception)を大幅に逆転させた。

作用の中枢及び末梢機構の寄与を評価するために、非特異的オピオイド拮抗剤ナロキソン及びその末梢に制限された第４アンモニウム塩、ナロキソンメチオイド（ｍｅｔｈｉｏｉｄｅ）が、使用された。

図２は、ＣＦＡ炎症性疼痛ラットの鼻腔内ＬＥＮＫＧＣＰＱ製剤の作用の中枢及び末梢機構の寄与の評価を示す（平均±ＳＥＭ ｎ＝６、Ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉのポストホックテストに続いて反復測定による２要因ＡＮＯＶＡ）。この図において、アスタリスク＊は、賦形剤と治療群との間における統計的に有意な差を表す。賦形剤(vehicle)と治療群との間における統計的に有意な差を表し、シャープ記号＃は、ＬＥＮＫ単独とＬＥＮＫ−ＧＣＰＱとの間における統計的に有意な差を表す。

１００μＬ ＣＦＡを、左後肢の足底表面に注射した。炎症は２４時間発展させた。動物は、賦形剤（水、５０μＬ／ラット）、ＬＥＮＫ ７．５ｍｇ・ｋｇ^−１（ｐＨ＝５．８、５０μＬ）又はＬＥＮＫ−ＧＣＰＱ（７．５ｍｇ・ｋｇ^−１ ＬＥＮＫ及び７．５ｍｇ・ｋｇ^−１ ＧＣＰＱ、ｐＨ＝５．８、５０μＬ）の鼻腔内投与を受ける前に、ポストＣＦＡベースラインにおいて無作為抽出した(randomised)。
ＧＣＰＱ２５０９２０１３ＬＧ（モル％ パルミトイル化＝１５．５％、モル％ 第４アンモニウム基＝８．７％、分子量＝２０ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０６１）。それに付随して(concomitantly)皮下注射も投与した。賦形剤（注射用水、９０μＬ）、オピオイド拮抗剤ナロキソン（Ｎａｌ ７．３ｍｇ・ｋｇ^−１ 皮下、９０μＬ）又は末梢制限されたオピオイド拮抗剤ナロキソンメチオジド（ＮＭ、１０ｍｇ・ｋｇ^−１、皮下 ９０μＬ）。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛（１．４、２、４、６，８，１０，１５，２６ｇ）に対する足引っ込めは、評価のアップダウン法を用いて２０分、４０分、１、２、及び３時間、評価した。

先に示したようにＬＥＮＫ−ＧＣＰＱ製剤は、アンタゴニストの非存在下で、測定した全ての時点で（２０、４０分、１、２、３時間）抗侵害受容性であった。ナロキソンＬＥＮＫ−ＧＣＰＱの存在下では、抗侵害受容は、２時間まで完全に廃止された。３時間の時点において、抗侵害受容は、おそらくナロキソンの短い半減期に起因して戻った。これとは対照的に、末梢制限されている拮抗剤、ナロキソンメチオジド、ＬＥＮＫ−ＧＣＰＱの存在下で、抗侵害受容は、全く影響を受けなかった。したがって、ＬＥＮＫ ＧＣＰＱの痛覚抑制に関与する末梢機構が存在しないことを示す。

実施例２−本発明と従来技術との比較
メソッド
トリメチルキトサン合成２段階反応（従来技術）
Ｓｉｅｖａｌ， Ａ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＮＭＲ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ， １９９８． ３６（２−３）： ｐ． １５７−１６５によって報告されたのと本質的に同じ方法を用いて、二段階合成を行った。簡潔には、２ｇのキトサン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を、還流下で６０℃において安定化した油浴中で、３つ首フラスコ中の１−メチル−２−ピロリジノン８０ｍＬの中に懸濁させた。ヨウ化ナトリウム（４．８ｇ）を１１ｍＬのＮａＯＨ（１５％、３．８４Ｍ）に溶解し、キトサンに添加した。システムは、ヨウ化メチル（１１．５ｍＬ）の添加前に、窒素で空気をパージし、１時間反応させた。生成物をエタノールで沈殿させ、その後、遠心分離（６℃で２０００ｒｐｍ、３分間）によって単離した。生成物を真空フィルターに置き、それが全く乾燥するまで、すべてのエタノールを除去するため、エーテル（３００ｍＬ合計）で２回洗浄した。次いで、生成物をエーテルの大部分を除去するためにキャップされていない６０℃で３０分間、攪拌したＮＭＰ（８０ｍＬ）に再懸濁した。その後、４．８ｇのヨウ化ナトリウム及び１５％ＮａＯＨ溶液の１１ｍＬ、及びヨウ化メチル７ｍＬを添加し、反応物を３０分還流下で撹拌した。ヨウ化メチル（５ｍＬ）及び０．６ｇのＮａＯＨペレットのさらなる添加が、反応物に加えられた、反応はさらに９０分間続いた。反応混合物を前のようにエタノールで沈殿させ、単離するために遠心分離し、エタノールを除去し、生成物をエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。生成物を乾燥させるために一晩放置し、ＮａＣｌ（４０ｍＬ、１０％）に再懸濁した。次いでこれを透析し、凍結乾燥した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ＡＶ４００ ＭＨｚの分光計を用いて８０℃で、Ｄ_２Ｏ中で測定した。

ＴＭＣの合成一段階反応
上記Ｓｉｅｖａｌらによって報告されたのと本質的に同じ方法を用いて、一段階合成を行った。簡潔には、２ｇのキトサン、４．８ｇのヨウ化ナトリウムを、還流下で６０℃において安定化した油浴中で、３つ首フラスコ中のＮＭＰ ８０ｍＬの中に懸濁させた(３時間)。１１ｍＬのＮａＯＨ（１５％、３．８４Ｍ、２．８ｇ／１８．６ｍＬ）を溶解後、１１．５ｍＬのヨウ化メチルが添加された。反応物を１時間撹拌した。生成物をエタノールで沈殿させ、その後、遠心分離（６℃で２０００ｒｐｍ、３分間）によって単離した。材料を４０ｍＬの水に溶解し、エタノール２５０ｍＬ中１Ｍ ＨＣｌをそれに添加し、一晩撹拌した。生成物を遠心分離（６℃で２０００ｒｐｍ、３分間）、ペレットをエタノールで２回洗浄し、遠心分離により単離した。生成物を真空フィルターに置き、エーテル（３００ｍＬ合計）で２回洗浄した。半乾燥生成物を水に再懸濁し、６回の交換と共に、２４時間透析した。生成物を凍結乾燥させた。

^１Ｈ ＮＭＲ
^１Ｈ ＮＭＲ実験は、Ｄ_２Ｏ中の酸ＴＭＣ(10mg/mL)についてＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ ４００ ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｃｏｖｅｎｔｒｙ， Ｕ．Ｋ．）で実施した。水のピークの抑制と共に温度８０℃で、分析を行った。メチル化の程度を百分率として計算した。

［（ＣＨ_３）_３］は、３．３ｐｐｍにおけるトリメチルアミノ基の化学シフトの積分であり、［Ｈ］は４．７〜５．７ｐｐｍにおける^１Ｈピークの積分である（Ｐｏｌｎｏｋ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｑｕａｔｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｒｂｅｉｔｓｇｅｍｅｉｎｓｃｈａｆｔ ｆｕeｒ Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ ｅ．Ｖ， ２００４． ５７（１）： ｐ． ７７−８３．）。

ＴＭＣ粒子（４０％メチル化）
ＴＭＣをロードした（ｌａｄｅｄ）粒子は、Ｋｕｍａｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｌｏａｄｅｄ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｎｏｓｅ ｔｏ ｂｒａｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１３． ６１Ｃ： ｐ． １８９−１９５のように調製した。１２ｍＬの水中２４ｍｇのＴＭＣ（４０％）と１３８ｍｇのＬＥＮＫベース。１６Ｇニードルを通して、７．３ｍＬ ＴＰＰ（０．６ｍｇ／ｍＬ）を、攪拌されたＴＭＣに落とした。製剤を一晩撹拌した。ナノ粒子は、遠心分離によってペレット化した（１２０００×ｇ、８℃で３０分）。上清をＬＥＮＫ含量について分析した。ペレットを、０．３ｍＬの注射用水に再懸濁した（９．６ｍｇ／０．３ｍＬ＝３２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６）。粒子サイズは、６３３ｎｍの波長で、２５℃で、光子相関分光法（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＫ）により測定された。データ解析のＣＯＮＴＩＮ法を用いてデータを分析した。ナノ粒子の形態学的検査は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により調べた。濾過されていない溶液の液滴が、Ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティングされたグリッド（Ｆ１９６１１００ ３．０５ｍｍ、３００メッシュ、Ｔａｂ Ｌａｂｓ Ｌｔｄ， ＵＫ）上に配置された。過剰なサンプルは、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１で濾過して除き(off)、そして１％水性酢酸ウラニルでネガティブ染色した。イメージングは、ＦＥ１ （Ｅｘ． Ｐｈｉｌｉｐｓ） ＣＭ１２０ ＢｉｏＴｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の下で行なった。デジタル画像は、ＡＭＴデジタルカメラを使用して撮影した。（濾過されていない）ポリマーナノ粒子は、球状の形態を示した。

ＴＭＣ粒子（１５％メチル化）
ＴＭＣをロードした（ｌａｄｅｄ）粒子は、Ｋｕｍａｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｌｏａｄｅｄ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｎｏｓｅ ｔｏ ｂｒａｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１３． ６１Ｃ： ｐ． １８９−１９５のように調製した。１４．５ｍＬの水中２９ｍｇのＴＭＣ（１５％）と１２５ｍｇのＬＥＮＫベース。１６Ｇニードルを通して、８．７８ｍＬ ＴＰＰ（０．６ｍｇ／ｍＬ）を、攪拌ＴＭＣに落とした。ナノ粒子は、遠心分離によってペレット化した（１２０００×ｇ、８℃で３０分）。製剤を一晩撹拌した。上清をＬＥＮＫ含量について分析した（ＨＰＬＣ）。ペレットを、０．３ｍＬの注射用水に再懸濁した（６．１ｍｇ／０．３ｍＬ＝２０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＯＨでｐＨ４〜ｐＨ５に調節した）。ナノ粒子サイズ及び形態は、上記のように分析した。

自己組織化ポリマーナノ粒子の調製
ＬＥＮＫ（３０ｍｇ／ｍＬ）を有するポリマー分散液（３０ｍｇ／ｍＬ）を、実施例１に従って調製した。

薬力学
鼻投与及び機械的過敏性は、前のように評価した。

鼻腔内投与のためのペプチド薬物をロードしたポリマー分散液についての結果
薬物−ポリマー分散液は、わずかな乳白色の懸濁液、２４〜４０％ローディング効率を示した。４０％メチル化キトサン及び１５％のメチル化キトサンの場合、それぞれｚ平均８５５．２±１９．８５ｎｍ及び６０１．６±８９．２ｎｍ、それぞれ多分散性指数＝０．２９２及び０．６５９。

足引込め力の測定
１００μＬ ＣＦＡを、左後肢の足底表面に注射した。炎症は２４時間発展させた。動物は、賦形剤（水、５０μＬ／ラット）、ＬＥＮＫ：ＧＣＰＱ ７．５ｍｇ／ｋｇ ＬＥＮＫ：７．５ｍｇ／ｋｇ ＧＣＰＱ（ｐＨ５．８、５０μＬ）、トリメチルキトサン（ＴＭＣ，１５％メチル化）当量線量(equivalent dose)５ｍｇ／ｋｇ、ＴＭＣ（４０％メチル化、当量ＬＥＮＫ線量 ７．５ｍｇ／ｋｇ）、ＧＣＰＱ（バッチ＃０９０６２０１４ＡＩ、パルミトイル化の程度＝２１．５４モル％、第４化の程度＝１２．０８モル％、Ｍｗ １６．２ｋＤａ、Ｍｎ １５．９ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ １．０１８）の鼻腔内投与を受ける前に、ポストＣＦＡベースラインにおいて無作為抽出した(randomised)。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛（１．４、２、４、６，８，１０，１５，２６ｇ）に対する足引っ込めは、評価のアップダウン法を用いて３０分、１、１．５、２、３及び４時間、評価した。

薬力学結果
プレＣＦＡベースライン足引っ込め力は、２４．６±３．７ｇであった。ポストＣＦＡ（２４時間）ベースラインは、４．８±１．３ｇであった。統計的な差は、測定した時点のいずれにおいても（３０分、１、１．５、２、３及び４時間）、ＲＭＣ１５％と賦形剤コントロールとの間に観察されなかった。ＬＥＮＫ−ＧＣＰＱ（３０ｍｇ／ｍＬ ＬＥＮＫ）製剤は、賦形剤コントロールと比較して、最大３時間、痛覚を大幅に逆転させた。鼻腔内ＴＭＣ ＬＥＮＫと比較したとき、鼻腔内ＬＥＮＫ ＧＣＰＱは、優れた抗侵害受容薬であった。

次の表は、ラットにおけるＣＦＡ炎症性疼痛における鼻腔内ＬＥＮＫ ＧＣＰＱとＴＭＣ ＬＥＮＫとを対比させた効果を示す。値はｇで与えられた足引っ込め力である。

キー
平均±ＳＥＭ ｎ＝６。Ｇａｍｅｓ Ｈｏｗｅｌｌのポストホックテストに続いて反復測定による２要因ＡＮＯＶＡ。
＊＝ 賦形剤と治療との間の統計的に有意な差
＃＝ 治療とＬＥＮＫ ＧＣＰＱとの間の統計的に有意な差

Claims (8)

1. 親水性神経活性ペプチド薬物と両親媒性炭水化物化合物とを含み、疼痛の治療において使用するための組成物であって、
   当該組成物は、ヒト又は動物体に鼻腔内投与され、
   前記両親媒性炭水化物化合物は、一般式：
   

   

   （式中、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であって、
   ａは、０．００〜０．９７０であり、
   ｂは、０．０１〜０．９９０であり、
   ｃは、０．０００〜０．９７０であり、
   ｄは、０．０１〜０．９９０であり；及び
   式中、
   Ｘは、疎水性基であり；
   Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換もしくは無置換のアルキル基から選択され；
   Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のエーテル基、又は置換もしくは無置換のアルケン基から選択され；
   Ｒ_７は、存在又は不在であってもよく、存在する場合、無置換もしくは置換のアルキル基、無置換もしくは置換のアミン基、又は置換もしくは無置換のアミド基であり；
   Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素、及び置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のエーテル基、又は置換もしくは無置換のアルケン基のいずれかから選択される）；
   で表され、又はその塩であり、
   前記両親媒性炭水化物化合物は、１０ｎｍ〜２０μｍの平均粒子サイズを有する粒子へと、水性媒体中で自己組織化することが可能である、
   組成物。
2. 前記両親媒性炭水化物化合物は、水性媒体中で自己組織化することが可能であるナノ粒子の形態である、請求項１に記載の組成物。
3. ヒト又は動物体の脳への薬物の送達において使用するための、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記薬物はエンケファリン、好ましくはロイシン^［５］−エンケファリンである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
5. １０ｎｍ〜２０μｍの平均粒子サイズを有する高分子凝集体の形態である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記両親媒性化合物は、第４アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）である、請求項１に記載の組成物。
7. 当該組成物中の両親媒性化合物と薬物との比率は、０．５：１〜１０：１の範囲である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物と、１以上の医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、鼻腔内投与に適した医薬組成物。

Images