JP6473662B2 - イムノアッセイ法を用いた残留農薬検査のための前処理方法、及び残留農薬検査方法 - Google Patents
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Description
以下に説明する技術は上記知見に基づいて完成されたものであり、その目的の一つはポリフェノールを含む農作物に対する残留農薬検査のための前処理方法、及び前記農作物の残留農薬検査方法を提供することにある。
なお、以下に説明する実施形態においては、別に記載しない限り、以下の材料を用いる。アセタミプリドとしては、林純薬工業株式会社の52220を用いる。カテキンの粉末としては、和光純薬工業株式会社のコードNo.032−18231、カテキン混合物、緑茶由来を用いる。カゼインとしては、カゼインを含有するスキムミルクの粉末を用い、スキムミルクの粉末としては、和光純薬工業株式会社のコードNo.198−10605、スキムミルク粉末を用いる。
検体試料は、ポリフェノールを含む農作物として茶を用い、一般的に市販されている緑茶を用意した。茶の抽出方法は、まず、100℃で湯煎しながら、茶葉3gに100℃の沸騰水50mL加え、5分放置した。その後、湯煎から外し、室温で1時間静置した後、4℃で一晩静置した。このような抽出方法によって湯中に抽出される茶の成分には、カテキンやタンニンなどのポリフェノールが含まれるものと考えられる。5000gで5分間遠心分離し、上清を回収し、上清を茶の浸出液(以下、浸出液Aと称する)とした。
手順1−1.蒸留水を使用して、蒸留水中のアセタミプリドの濃度が0.1、1、10、100、1000ppbとなるように試料を調製した。
手順1−2.上記浸出液Aを使用して、浸出液A中のアセタミプリドの濃度が0.1、1、10、100、1000ppbとなるように試料を調製した。
手順1−3.上記手順1−1で調製したアセタミプリド濃度0.1、1、10、100、1000ppbの各試料と、蒸留水とをそれぞれ等量ずつ混合した後、5分ゆっくり振とうし、それぞれ試料1、2、3、4、5とした。この試料1〜5をエライザ測定のサンプル液とした。
手順1−4.上記手順1−2で調製したアセタミプリド濃度0.1、1、10、100、1000ppbの各試料と、蒸留水とをそれぞれ等量ずつ混合した後、5分ゆっくり振とうし、それぞれ試料6、7、8、9、10とした。この試料6〜10をエライザ測定のサンプル液とした。
手順1−5.上記手順1−1で調製したアセタミプリド濃度0.1、1、10、100、1000ppbの各試料と、4%スキムミルクとをそれぞれ等量ずつ混合した後、5分ゆっくり振とうし、それぞれ試料11、12、13、14、15とした。この試料11〜15をエライザ測定のサンプル液とした。
手順1−6.上記手順1−2で調製したアセタミプリド濃度0.1、1、10、100、1000ppbの各試料と、4%スキムミルクとをそれぞれ等量ずつ混合した後、5分ゆっくり振とうし、それぞれ試料16、17、18、19、20とした。この試料16〜20をエライザ測定のサンプル液とした。
手順1−7.また、アセタミプリドを含有しない試料も用意した。具体的には、蒸留水に、蒸留水又は4%スキムミルクをそれぞれ等量ずつ混合した後、5分ゆっくり振とうし、エライザ測定のサンプル液とした。さらに、浸出液Aに、蒸留水又は4%スキムミルクをそれぞれ等量ずつ混合した後、5分ゆっくり振とうし、エライザ測定のサンプル液とした。
手順1−8.上記手順1−3、上記手順1−4、上記手順1−5、上記手順1−6、上記手順1−7から得られたエライザ測定のサンプル液を対象にして、エライザ法(間接競合法)により吸光度を測定した。なお、エライザ法(間接競合法)については後から詳述する。
以下の手順2−1、手順2−2、手順2−3、手順2−4を順に行い、各試料を対象にして吸光度を測定した。
手順2−1.10%メタノール溶液を使用して、10%メタノール溶液中のカテキンの濃度が0、100、300、400、500、800、1000、3000μg/mLとなるように試料を調製した。
手順2−2.4%スキムミルク溶液を利用して、4%スキムミルク溶液中のアセタミプリドの濃度が0、50ppbとなるように試料を調製した。
手順2−3.蒸留水を利用して、蒸留水中のアセタミプリドの濃度が0、50ppbとなるように試料を調製した。
手順2−4.上記手順2−1で調製した各試料と、上記手順2−2で調製した各試料とを等量ずつ混合した後、15分静置し、エライザ測定のサンプル液とした。また、上記手順2−1で調製した各試料と、上記手順2−3で調製した各試料とを等量ずつ混合した後、15分静置し、エライザ測定のサンプル液とした。これらのサンプル液を対象にして、エライザ法(間接競合法)により吸光度を測定した。なお、エライザ法(間接競合法)については後から詳述する。
図2(b)に示されるように、アセタミプリドを含有する試料の場合、スキムミルク処理を行わないと(図2(b)中の左側にあるグラフ参照。)、カテキン濃度0μg/mLに比べ、カテキン濃度が高くなるにしたがい、吸光度が大きく低下した。この吸光度の低下は、アセタミプリドを抗原とする抗原抗体反応の反応性が変化したことを意味する。アセタミプリドを含有する溶液では、カテキンの濃度が高くなるにしたがい抗原抗体反応の反応性が変化することから、カテキンが抗原抗体反応を妨害したと考えられた。一方、アセタミプリドを含有する試料の場合、スキムミルク処理を行うと(図2(b)中の右側にあるグラフ参照。)、カテキンの濃度が高くなっても、試料の吸光度はほとんど低下せず、カテキン濃度が0μg/mLのときの吸光度とほぼ同じ値を示した。このことは、スキムミルク処理を行えば、カテキン溶液の濃度が高くなっても、抗原抗体反応の反応性が変化しないことを意味する。すなわち、アセタミプリドを含有する溶液では、スキムミルク未処理の場合、夾雑成分であるカテキンにより抗原抗体反応の妨害が生じるが、スキムミルク処理を行うことにより、この抗原抗体反応の妨害が回避された。
以下の手順3−1、手順3−2、手順3−3、手順3−4、手順3−5、手順3−6、手順3−7、手順3−8、手順3−9、手順3−10を順に行い、各試料を対象にして吸光度を測定した。
手順3−1.まず、遠心ろ過デバイス(略称:マイクロセップ10K、製品名:マイクロセップ アドバンス 遠心ろ過デバイスマイクロセップ10K、製造元コード:MCP010C41、PALL Corporation製)に1000μg/mLのカテキン溶液4mLを添加した後、7500gで5分間遠心分離した。さらに、蒸留水4mlを添加した後、7500gで5分間遠心分離して洗浄を行い、遠心ろ過デバイスのプレトリートメントを行った(プレトリートメントを行った遠心ろ過デバイスを、以下、遠心ろ過デバイスPと称する)。このプレトリートメントは、次に続く手順の限外ろ過処理において、茶成分中のカテキン及びタンニンなどの夾雑成分が、遠心ろ過デバイスに吸着するのを防ぐために行った。
手順3−2.蒸留水、実施例1で抽出した茶の浸出液A、1000μg/mLカテキン溶液の各溶液に対して、蒸留水を等量ずつ混合し、混合液を作製し、それぞれ混合液B、混合液C、混合液Dとした。次に、この混合液B、C、Dに対して、遠心ろ過デバイスPを用いて限外ろ過の処理を行う場合と限外ろ過の処理を行わない場合に分けた。
手順3−3.蒸留水、実施例1で抽出した茶の浸出液A、1000μg/mLカテキン溶液の各溶液に対して、4%スキムミルク溶液を等量ずつ混合し、混合液を作製し、それぞれ混合液E、混合液F、混合液Gとした。次に、この混合液E、F、Gに対して、遠心ろ過デバイスPを用いて限外ろ過の処理を行う場合と限外ろ過の処理を行わない場合に分けた。
手順3−4.限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスPに、1mLの上記手順3−2で混合した混合液Bを添加した後、7500gで50分間遠心分離し、ろ液Hを取り出した。また、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスPに、1mLの上記手順3−2で混合した混合液Cを添加した後、7500gで50分間遠心分離し、ろ液Iを取り出した。また、同様に、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスPに、1mLの上記手順3−2で混合した混合液Dを添加した後、7500gで50分間遠心分離し、ろ液Jを取り出した。
手順3−5.限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスPに、1mLの上記手順3−3で混合した混合液Eを添加した後、7500gで50分間遠心分離し、ろ液Kを取り出した。また、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスPに、1mLの上記手順3−3で混合した混合液Fを添加した後、7500gで50分間遠心分離し、ろ液Lを取り出した。また、同様に、限外ろ過処理を行う場合には、ろ過デバイスPに、1mLの上記手順3−3で混合した混合液Gを添加した後、7500gで50分間遠心分離し、ろ液Mを取り出した。
手順3−6.上記手順3−2で混合した混合液Bを利用して、混合液B中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料50とした。また、上記手順3−2で混合した混合液Cを利用して、混合液C中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料54とした。また、同様に、上記手順3−2で混合した混合液Dを利用して、混合液D中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料58とした。これらの試料50、54、58をエライザ測定のサンプル液とした。
手順3−7.上記手順3−3で混合した混合液Eを利用して、混合液E中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料52とした。また、上記手順3−3で混合した混合液Fを利用して、混合液F中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料56とした。また、同様に、上記手順3−3で混合した混合液Gを利用して、混合液G中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料60とした。これらの試料52、56、60をエライザ測定のサンプル液とした。
手順3−8.上記手順3−4で限外ろ過処理をしたろ液Hを利用して、ろ液H中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料51とした。また、上記手順3−4で限外ろ過処理をしたろ液Iを利用して、ろ液I中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料55とした。また、同様に、上記手順3−4で限外ろ過処理をしたろ液Jを利用して、ろ液J中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料59とした。これらの試料51、55、59をエライザ測定のサンプル液とした。
手順3−9.上記手順3−5で限外ろ過処理をしたろ液Kを利用して、ろ液K中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料53とした。また、上記手順3−5で限外ろ過処理をしたろ液Lを利用して、ろ液L中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料57とした。また、同様に、上記手順3−5で限外ろ過処理をしたろ液Mを利用して、ろ液M中のアセタミプリドの濃度が50ppbとなるように試料を調製し、試料61とした。これらの試料53、57、61をエライザ測定のサンプル液とした。
手順3−10.上記手順3−6、上記手順3−7、上記手順3−8、上記手順3−9、から得られたエライザ測定のサンプル液を対象にして、エライザ法(間接競合法)により吸光度を測定した。なお、エライザ法(間接競合法)については後から詳述する。
図3の結果について、スキムミルク処理と限外ろ過処理とをともに行わなかった場合、スキムミルク処理を行わずに限外ろ過処理を行った場合、スキムミルク処理を行った後に限外ろ過処理を行わなかった場合、及び、スキムミルク処理を行った後に限外ろ過処理を行った場合、をそれぞれ、条件1、条件2、条件3、条件4と称して、以下に説明する。
本実施形態で用いたエライザ法(間接競合法)の手順について以下に記載する。手順4−1、手順4−2、手順4−3、手順4−4、手順4−5、手順4−6、手順4−7を順に行い、エライザ法(間接競合法)によるサンプル液の測定を行った。
手順4−1.アセタミプリド−BSA溶液を0.01μg/mLの濃度で55mM、NaHCO3(pH9)に溶解した。この溶液を溶液4−1とした。なお、アセタミプリド−BSA溶液の作製方法については後から詳述する。
手順4−2.マイクロプレート(製品名:F96 MaxiSorp Nunc−Immuno Plate、カタログ番号442404、Thermo Scientific製)の各ウェルに、100μLずつ溶液4−1を添加した。4℃で1晩静置し、アセタミプリド−BSAをマイクロプレートに固相化した。1晩静置後の溶液を溶液4−2とした。
手順4−3.各ウィル内の溶液4−2を除き、0.01%Tween−20を含む洗浄液(略称:PBS、製品名:リン酸緩衝生理食塩水)で5回洗浄した。その後、ブロッキング液(略称:SB、製品名:Starting Block T20(PBS)Blocking Buffer、カタログ番号37539、Thermo Scientific製))を各ウェルに300μL添加して、室温で30分間静置した。静置後の溶液を溶液4−3とした。
手順4−4.各ウェル内の溶液4−3を除き、上述の実施例1〜3におけるエライザ測定のサンプル液を50μLと、ブロッキング液で2μg/mLに希釈した抗アセタミプリドモノクローナル抗体を50μLと、を添加し、カバー用フィルムを貼り、2時間室温で静置した。静置後の溶液を溶液4−4とした。
手順4−5.各ウェル内の溶液4−4を除き、洗浄液で5回洗浄後、ブロッキング液で10000倍希釈した2次抗体(製品名:ECL Anti−mouse IgG Horseradish Peroxidase linked whole antibody(from sheep)、カタログ番号NA931V、GE Healthcare Life Sciences製)を100μL添加し、1時間室温で静置した。静置後の溶液を溶液4−5とした。
手順4−6.各ウェル内の溶液4−5を除き、洗浄液で5回洗浄後、発色基質(略称:TMB、製品名:Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate、商品コード53−00−01、KPL製)を100μL添加し、暗所で30分静置した。静置後の溶液を溶液4−6とした。
手順4−7.溶液4−6に対して、反応停止液(製品名:TMBストップソリューション、商品コード50−85−05、KPL製)を100μL添加し、プレートリーダーを用いて吸光度(450nm)を測定した。
エライザ法(間接競合法)で用いたアセタミプリド−BSA溶液の作製方法について以下に記載する。このアセタミプリド−BSA溶液は、エライザ法(間接競合法)で使用されるマイクロプレートの固相化のために用いられた。手順5−1、手順5−2、手順5−3、手順5−4を順に行い、アセタミプリド−BSA溶液を作製した。
手順5−1.アセタミプリドにカルボキシル基を導入した誘導体をジメチルスルホキシド(略称:DMSO)に20mg/mLの濃度で溶解した。この溶液を溶液5−1とした。
手順5−2.溶液5−1の液を200μLと、DMSOで調製した80mMの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(略称:EDC)を100μLと、DMSOで調製した80mMのN−ヒドロキシスクシンイミド(略称:NHS)を100μLと、を添加した。1.5時間室温でゆっくり撹拌し、溶液5−2とした。
手順5−3.150mM塩化ナトリウムを含む0.1Mのホウ酸緩衝液(略称:BB)(pH8.0)に溶解した10mg/mLのウシ血清アルブミン(略称:BSA)0.5mLに溶液5−2を200μLゆっくり添加し、室温で1晩ゆっくり撹拌した。この溶液を溶液5−3とする。
手順5−4.溶液5−3を遠心ろ過デバイス(略称:マイクロセップ10K、製品名:マイクロセップ アドバンス 遠心ろ過デバイスマイクロセップ10K、製造元コード:MCP010C41、PALL Corporation製)と10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)(略称:PB)を用いて限外ろ過により精製し、アセタミプリド−BSA溶液とした。
上記の結果を、図4の模式図を用いて以下に説明する。
アセタミプリド−BSA溶液により、アセタミプリド―タンパク、すなわち、農薬―タンパクを固相化したエライザのプレートを用いる。このプレートに農薬のアセタミプリド、及び、抗農薬抗体である抗アセタミプリドモノクローナル抗体、又は、茶の浸出液Aを添加する。茶の浸出液Aを添加しない場合、抗アセタミプリドモノクローナル抗体は、抗原であるアセタミプリドと結合し、抗原抗体反応を生じる。一方、茶の浸出液Aを添加する場合、茶の浸出液A中のカテキン等の夾雑成分が、抗アセタミプリドモノクローナル抗体や農薬―タンパクなどに付着する等により、抗原抗体反応を妨害する。しかし、スキムミルクを添加する処理を行うと、スキムミルクがカテキンなどの夾雑成分を捕捉することにより、夾雑成分による抗原抗体反応の妨害を回避することができる。このことから、茶抽出液中の残留農薬を定量する前にスキムミルク処理を行わなかった場合、夾雑成分による抗原抗体反応の妨害により正確な残留農薬の定量ができないが、スキムミルク処理を行うことにより、夾雑成分による抗原抗体反応の妨害が回避し、正確な定量が実現可能となる。つまり、ポリフェノールを含む農作物から抽出された抽出液中の農薬を定量する場合、スキムミルク処理を施してから吸光度を測定すれば、農薬が既知の試料も同様のスキムミルク処理を施してから作成された検量線に基づいて、農薬を定量することができる。
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の具体的な一実施形態に限定されず、この他にも種々の形態で実施することができる。
また、農薬として、アセタミプリドの例を示したが、残留農薬はこれに限定されるものではなく、イムノアッセイ法を用いて検査される農薬であればよい。イムノアッセイ法で用いられる農薬の例としては、例えば、アゾキシストロビン、エマメクチン、フェニトロチオン、イソキサチオン、マラチオン、トリフルミゾール、クロロフェナピル、イプロジオン、カルバリル、イソプロチオラン、ミクロブタニル、フルトラニル、ビテルタノール、ボスカリド、トルクロホスメチル、フィプロニル、クロラントラニリブロール、ピリダリル、メパニピリム、クレソキシムメチル、スピノサド、フルフェノクスロン、ブプロフェジン、ジペルメトリン、フェンバレレート、プロシミドン、メチダチオン、クロルピリホス、及び、ホスチアゼートなどが挙げられる。また、残留農薬は、水溶性の農薬及び脂溶性の農薬が挙げられる。水溶性の農薬の例としては、例えばネオニコチノイド系の農薬などが挙げられる。ネオニコチノイド系の農薬の例としては、例えばアセタミプリド、チアクロプリド、イミダクロプリド、チアメトキサム、クロチアニジン、ジノテフラン、ニテンピラムなどが挙げられる。
上記実施例では、4%のスキムミルクを用いたが、1%−20%に調製されてもよく、特に1%−10%であってもよい。カゼインは0.3%−7%で使用してもよい。
Claims (9)
- ポリフェノールを含む農作物に付着又は浸透した残留農薬を対象とする残留農薬検査として、前記農作物から抽出された抽出液に対して、前記抽出液中に含まれる前記残留農薬を抗原とする抗原抗体反応を利用して前記残留農薬を定量するに当たって、当該定量を実施する前に前記抽出液に対して実施されるイムノアッセイ法を用いた残留農薬検査のための前処理方法であって、
前記抽出液にカゼインを混合処理する前処理方法。 - 前記ポリフェノールは、カテキン及びタンニンのいずれか一方又は両方である
請求項1に記載の前処理方法。 - 前記カゼインは、スキムミルク由来のカゼインである
請求項1又は請求項2に記載の前処理方法。 - 前記残留農薬は、水溶性の農薬である
請求項1−請求項3のいずれか一項に記載の前処理方法。 - 前記水溶性の農薬は、ネオニコチノイド系の農薬である
請求項4に記載の前処理方法。 - 前記ネオニコチノイド系の農薬は、アセタミプリド、チアクロプリド、イミダクロプリド、チアメトキサム、クロチアニジン、ジノテフラン、ニテンピラムである
請求項5に記載の前処理方法。 - 前記ポリフェノールを含む農作物は、茶である
請求項1−請求項6のいずれか一項に記載の前処理方法。 - ポリフェノールを含む農作物に付着又は浸透した残留農薬を対象とする残留農薬検査として、前記農作物から抽出された抽出液に対して、前記抽出液中に含まれる前記残留農薬を抗原とする抗原抗体反応を利用した定量方法で前記残留農薬を定量する残留農薬検査方法であり、
前記定量を実施する前に、前記抽出液にカゼインを混合処理する
残留農薬検査方法。 - 前記定量方法は、エライザ法(間接競合法)、エライザ法(直接競合法)、イムノクロマト法、及び、表面プラズモン共鳴法のうちいずれか1つである
請求項8に記載の残留農薬検査方法。
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