JP6470681B2 - 乳癌関連の疾患状態を決定する方法およびこの方法における使用のためのアレイ - Google Patents

Description

本発明は、乳癌関連の疾患状態を決定する方法、ならびにかかる方法における使用のためのアレイおよびキットを提供する。

乳癌は、最も頻繁に診断される癌であり、女性では癌死亡の第１位の原因であり、総癌症例の２３％および癌関連死亡の１４％を占める（非特許文献１）。伝統的な臨床病理パラメータ、例えば、組織学的グレード分け（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｄｉｎｇ）、腫瘍サイズ、年齢、リンパ節関与およびホルモン受容体状態が、処置を決定し、予後を推定するために使用される（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。最も一般に使用される予後因子の１つである組織学的グレード分けは、腫瘍の悪性度を反映する、腫瘍細胞の形態学的特徴および細胞学的特徴の顕微鏡的評価に基づいた、組み合わされたスコアである。この組み合わされたスコアは、次いで、乳癌腫瘍を階層化するために使用される；グレード１−成長が遅く高分化型、グレード２−中分化型、およびグレード３−高度に増殖性で低分化型（非特許文献３）。しかし、患者の予後判定のための組織グレード（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｅ）の臨床的価値は、腫瘍をグレード分けすることに関連する現在の課題を主に反映して、疑問視されてきた（非特許文献７；非特許文献８）。さらに、腫瘍の３０〜６０％は、非常に不均一な患者コホートを示すことが判明し、臨床的決定を行うためにあまり情報を提供しないことが証明されている、組織グレード２と分類される（非特許文献９）。明らかに、伝統的な臨床的実験室パラメータは、適切な予後判定およびリスク群識別のため、ならびに所与の処置が成功するかどうかを予測するためには、なおも不十分である。結果として、患者の中には、何の利益も提供しない治療によって、過剰処置される、過小処置されるまたは公正に処置される者が出る。従って、乳癌の生物学および腫瘍進行のより深い分子的理解が、予後判定および処置決定を個別化するための改善された方法と組み合わせて、予後アウトカムおよび結果として治療アウトカムをさらに前進させるために必要とされる（非特許文献１０）。

Ｊｅｍａｌら、２０１１ ＣｉｏｃｃａおよびＥｌｌｅｄｇｅ、２０００ ＥｌｓｔｏｎおよびＥｌｌｉｓ、１９９１ Ｈｏｎｄｅｒｍａｒｃｋら、２００８ Ｈｕｄｉｓ、２００７ Ｓｌａｍｏｎら、２００１ Ｆｒｉｅｒｓｏｎら、１９９５ Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９５ Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、２００６ Ｄｏｗｓｅｔｔら、２００７

今日まで、一式のゲノムの試みが、乳癌の型をサブグループ化するため（Ｉｖｓｈｉｎａら、２００６；Ｐｅｒｏｕら、２０００；Ｓｏｒｌｉｅら、２００１）ならびに乳癌の予後判定およびリスク層別化のため（Ｐａｉｋら、２００４；ｖａｎ‘ｔ Ｖｅｅｒら、２００２；ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら、２００２）の分子シグネチャーを生成してきた。他方、プロテオミクス的知見は、重要な発見の臨床診療への移転を加速すると見込まれてきた（Ｈａｎａｓｈ、２００３）。この文脈では、古典的質量分析（ＭＳ）ベースのプロテオミクスは、細胞株およびいくつかの組織サンプルを主に標的化する乳癌プロテオーム（Ｂｏｕｃｈａｌら、２００９；Ｇｅｉｇｅｒら、２０１０；Ｇｅｉｇｅｒら、２０１２；Ｇｏｎｇら、２００８；Ｋａｎｇら、２０１０；Ｓｔｒａｎｄｅら、２００９；Ｓｕｔｔｏｎら、２０１０）の価値ある目録を生成しており、より最近では、アフィニティプロテオミクスの試みが、乳癌診断のためおよび再発のリスクを予測するための、最初の多重化血清ポートレートをもたらした（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２００８；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２０１１）。しかし、最近の技術的進歩にもかかわらず、古典的プロテオミクス技術（ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＭａｎｎ、２００３）またはアフィニティプロテオミクス（ＢｏｒｒｅｂａｅｃｋおよびＷｉｎｇｒｅｎ、２０１１）のいずれかを使用して、高感度かつ再現性のある様式で、粗製プロテオーム、例えば組織抽出物の大きいコホートの詳細なタンパク質発現プロフィールを生成することは、依然として課題である。

これらの問題を解決するために、本発明者らは最近、アフィニティプロテオミクスおよびＭＳの最良の特徴を組み合わせた、グローバルプロテオーム調査（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｓｕｒｖｅｙ）（ＧＰＳ）技術プラットホーム（Ｗｉｎｇｒｅｎら、２００９）を開発した。ＧＰＳは、発見の試みに適しており、高感度かつ定量的な様式で粗製プロテオームを再現性良く解読する（Ｏｌｓｓｏｎら、２０１２；Ｏｌｓｓｏｎら、２０１１）。

この研究において、本発明者らは、ＧＰＳを使用して、腫瘍の進行を反映する、組織グレード分けされた乳癌組織の徹底的な分子組織ポートレートを描出した。この目的のために、本発明者らの知る限り、最大の非標識（ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの乳癌組織研究の１つを示す、５２の乳癌組織プロテオームをプロファイリングした。このタンパク質発現プロフィールは、直交法を使用して、首尾よく検証された。長期実施において、これらの組織バイオマーカーポートレートは、改善された分類および予後判定のための道を開くことができた。

従って、本発明の第１の態様は、乳癌関連の疾患状態を決定する方法を提供し、この方法は、下記工程：
ａ）試験されるサンプルを準備する工程；ならびに
ｂ）表１中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程、
を含み；
表１中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量が、乳癌関連の疾患状態を示す。従って、事実上、工程（ｂ）は、表１中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／もしくは量を使用して、またはその存在および／もしくは量に基づいて、乳癌関連の疾患状態を決定する工程（（ｂ）（ｉ））のさらなる工程を含む。

「乳癌関連の疾患状態」によって、本発明者らは、乳癌細胞の組織学的グレードおよび／または乳癌細胞を含む個体の無転移生存時間を意味する。

この乳癌関連の疾患状態は、（乳癌細胞の）組織学的グレードおよび／または（個体の）無転移生存時間であり得る。

「バイオマーカー」によって、本発明者らは、その測定が乳癌の予後判定において有用な情報を提供し得る、天然に存在する生物学的分子、またはその成分もしくは断片を意味する。例えば、バイオマーカーは、天然に存在するタンパク質もしくは炭水化物部分、または抗原性成分もしくはその断片であり得る。

好ましくは、試験されるサンプルは、哺乳動物から提供される。この哺乳動物は、任意の家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌまたはｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）であり得る。好ましくは、この哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマまたは霊長類である。最も好ましくは、この哺乳動物はヒトである。好ましくは、このサンプルは、乳癌細胞を含む、もしくは乳癌細胞からなる細胞もしくは組織サンプル（もしくはその派生物）であり、または乳癌細胞を含む、もしくは乳癌細胞からなる細胞もしくは組織サンプル由来のタンパク質もしくは核酸が等しく好ましい。好ましくは、試験サンプルおよび対照サンプルは、同じ種由来である。

乳癌関連の疾患状態が、乳癌細胞の組織学的グレードであるまたは乳癌細胞の組織学的グレードを含む場合、この方法は、下記工程：
ｃ）組織学的グレード１の乳癌細胞、組織学的グレード２の乳癌細胞および／もしくは組織学的グレード３の乳癌細胞を含む、または組織学的グレード１の乳癌細胞、組織学的グレード２の乳癌細胞および／もしくは組織学的グレード３の乳癌細胞からなる、１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備する工程；ならびに
ｄ）工程（ｂ）において測定された１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル（複数可）における存在および／もしくは量を測定することによって、対照サンプル（複数可）のバイオマーカーシグネチャーを決定する工程、
をさらに含み得；
工程（ｂ）において、１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／もしくは量が測定される下記事象：
ｉ）第１の組織学的グレードの乳癌細胞（存在する場合）を含む、もしくは第１の組織学的グレードの乳癌細胞（存在する場合）からなる対照サンプルにおける存在および／もしくは量に相当する事象；
ｉｉ）第２の組織学的グレードの乳癌細胞（存在する場合）を含む、もしくは第２の組織学的グレードの乳癌細胞（存在する場合）からなる対照サンプルにおける存在および／もしくは量とは異なる事象；ならびに／または
ｉｉｉ）第３の組織学的グレードの乳癌細胞（存在する場合）を含む、もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞（存在する場合）からなる対照サンプルにおける存在および／もしくは量とは異なる事象、
において、乳癌細胞の存在が同定される。

従って、第１の組織学的グレードがＥｌｓｔｏｎグレード１であった場合、第２および第３の組織学的グレード（存在する場合）は、Ｅｌｓｔｏｎグレード２およびＥｌｓｔｏｎグレード３である（または逆もまたしかり）。第１の組織学的グレードがＥｌｓｔｏｎグレード２であった場合、第２および第３の組織学的グレード（存在する場合）は、Ｅｌｓｔｏｎグレード１およびＥｌｓｔｏｎグレード３である（または逆もまたしかり）。第１の組織学的グレードがＥｌｓｔｏｎグレード３であった場合、第２および第３の組織学的グレード（存在する場合）は、Ｅｌｓｔｏｎグレード１およびＥｌｓｔｏｎグレード２である（または逆もまたしかり）。

「第１の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第１の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルにおける存在および／もしくは量に相当する」によって、本発明者らは、この存在およびもしくは量が、第１の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第１の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量と同一であること；または第２の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第２の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルおよび／もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量（もしくはそれを示す予め規定された参照値）に対してよりも、第１の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第１の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量と近いこと、を意味する。好ましくは、この存在および／もしくは量は、第１の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第１の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である。

「第３の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルにおける存在および／もしくは量とは異なる」によって、本発明者らは、この存在およびもしくは量が、第１の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第１の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量、または第２の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第２の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量、および／もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量（もしくはそれを示す予め規定された参照値）とは異なることを意味する。好ましくは、この存在および／もしくは量は、第２の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第２の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量、および／または第３の組織学的グレードの乳癌細胞を含む、もしくは第３の組織学的グレードの乳癌細胞からなる対照サンプルの存在および／もしくは量の４０％以下、例えば、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％もしくは０％以下である。

好ましくは、組織学的グレードの対照サンプルは、乳癌細胞の単一の組織学的グレードを含む、または乳癌細胞の単一の組織学的グレードからなる。好ましくは、工程（ｃ）は、下記：
ｉ）組織学的グレード１の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード１の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；組織学的グレード２の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード２の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；および組織学的グレード３の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード３の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；
ｉｉ）組織学的グレード１の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード１の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；および組織学的グレード２の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード２の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；
ｉｉｉ）組織学的グレード１の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード１の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；および組織学的グレード３の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード３の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；
ｉｖ）組織学的グレード２の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード２の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；および組織学的グレード３の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード３の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；
ｖ）組織学的グレード１の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード１の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；
ｖｉ）組織学的グレード２の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード２の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること；または
ｖｉｉ）組織学的グレード３の乳癌細胞を含む、もしくは組織学的グレード３の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の対照サンプルを準備すること
を含む、またはこれらからなる。

乳癌関連の疾患状態が、個体の無転移生存時間であるまたは個体の無転移生存時間を含む場合、この方法は、下記工程：
ｃ）１０年未満の無転移生存期間を有する個体由来の乳癌細胞を含む、もしくは１０年未満の無転移生存期間を有する個体由来の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の第１の対照サンプル；ならびに／または１０年以上の無転移生存期間を有する個体由来の乳癌細胞を含む、もしくは１０年以上の無転移生存期間を有する個体由来の乳癌細胞からなる１つもしくはそれ以上の第２の対照サンプルを準備する工程；ならびに
ｄ）工程（ｂ）において測定された１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル（複数可）における存在および／もしくは量を測定することによって、対照サンプル（複数可）のバイオマーカーシグネチャーを決定する工程、
をさらに含み得；
個体の無転移生存時間が、工程（ｂ）において測定された１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの存在および／もしくは量が、第１の対照サンプル（存在する場合）の存在および／もしくは量に相当する事象、ならびに／または第２の対照サンプル（存在する場合）の存在および／もしくは量とは異なる事象、において、１０年未満と同定され；
個体の無転移生存時間が、工程（ｂ）において測定された１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの存在および／もしくは量が、第１の対照サンプル（存在する場合）の存在および／もしくは量とは異なる事象、ならびに／または第２の対照サンプル（存在する場合）の存在および／もしくは量に相当する事象、において、１０年より長いと同定される。

「１つもしくはそれ以上の第１の対照サンプルの存在および／もしくは量に相当する」によって、本発明者らは、この存在およびもしくは量が、１つもしくはそれ以上の第１の対照サンプルの存在および／もしくは量と同一であること；または１つもしくはそれ以上の第２の対照サンプルの存在および／もしくは量（もしくはそれを示す予め規定された参照値）に対してよりも、１つもしくはそれ以上の第１の対照サンプルの存在および／もしくは量と近いこと、を意味する。好ましくは、この存在および／もしくは量は、第１の対照サンプルの存在および／もしくは量の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である。

「１つもしくはそれ以上の第２の対照サンプルの存在および／もしくは量とは異なる」によって、本発明者らは、この存在およびもしくは量が、第２の対照サンプルの存在および／もしくは量（もしくはそれを示す予め規定された参照値）とは異なることを意味する。好ましくは、この存在および／もしくは量は、第２の対照サンプルの存在および／もしくは量の４０％以下、例えば、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％もしくは０％以下である。

好ましくは、１つまたはそれ以上の第１のおよび／または第２の無転移生存時間の対照サンプルは、試験されるサンプルと同じ組織学的グレードである。

好ましくは、１つまたはそれ以上の対照サンプルは、試験される個体に対して年齢および／または性別が一致している。言い換えると、健康な個体は、試験される個体と、およそ同じ年齢（例えば５歳以内）および同じ性別である。

好ましくは、工程（ｂ）で測定された１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量は、所定の参照値に対して比較される。

従って、工程（ｂ）で測定された１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／もしくは量は、工程（ｄ）で測定された１つもしくはそれ以上のバイオマーカーの存在および／もしくは量または所定の参照値とは有意に異なる（即ち、統計的に異なる）ことが好ましい。例えば、添付の実施例で考察するように、試験サンプルおよび対照サンプルにおける、特定のバイオマーカーの存在および／または量間の有意な差異は、ｐ＜０．０５の場合（例えば、ｐ＜０．０４、ｐ＜０．０３、ｐ＜０．０２の場合、またはｐ＜０．０１の場合）の差異として分類され得る。

従って、本発明の第１の態様の方法は、乳癌細胞の組織学的グレードおよび個体の無転移生存時間を（同時発生的にまたは連続的にのいずれかで）決定することを含み得る、または決定することからなり得る。

好ましくは、工程（ｂ）は、表１中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば、表１中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８もしくは少なくとも７９のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／もしくは量を測定することを含む、もしくは測定することからなる。

従って、本発明の第１の態様は、乳癌細胞の組織学的グレードを決定する方法（即ち、組織学的グレードを決定するための乳癌サンプルのステージ分類）を含み得る、またはかかる方法からなり得、この方法は、下記工程：
ａ）試験されるサンプルを準備する工程；
ｂ）表１中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程；
を含み、
表１中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量が、乳癌細胞の組織学的グレードを示す。

「乳癌細胞の組織学的グレードを決定する」によって、本発明者らは、サンプルの乳癌細胞が、参照によって本明細書に組み入れるＥｌｓｔｏｎ，Ｃ．Ｗ．およびＥｌｌｉｓ，Ｉ．Ｏ．（１９９１）．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｉ．Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｄｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９、４０３〜４１０において規定されるように、組織学的グレード１（即ち、Ｅｌｓｔｏｎグレード１）、組織学的グレード２（即ち、Ｅｌｓｔｏｎグレード２）または組織学的グレード３（即ち、Ｅｌｓｔｏｎグレード３）とカテゴリー化されることを意味する。

この方法が、乳癌細胞の組織学的グレードを決定することを含む、または決定することからなる場合、工程（ｂ）は、表１Ａ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ａ中に規定される群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。好ましくは、工程（ｂ）は、表１Ｂ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｂ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または少なくとも３０のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。好ましくは、工程（ｂ）は、表１Ｃ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｃ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または少なくとも２８のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。あまり好ましくはないが、工程（ｂ）は、表１Ｄ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｄ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または少なくとも１０のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。またあまり好ましくはないが、工程（ｂ）は、表１Ｅ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｅ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８または少なくとも９のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。従って、工程（ｂ）は、表１中に規定される全てのバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。

従って、本発明の第１の態様は、個体の無転移生存時間を決定する方法を含み得る、またはかかる方法からなり得、下記工程：
ａ）試験されるサンプルを準備する工程；
ｂ）表１中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程、
を含み；
表１中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量が、個体の無転移生存時間を示す。

「個体の無転移生存時間を決定する」によって、本発明者らは、試験サンプルが取得される個体が、最初の診断から１０年未満または１０年より長い、のいずれかの無転移生存時間（無遠隔転移生存期間／ＤＭＦＳ）を有すると予後判定されることを意味する。

この方法が、個体の無転移生存時間を決定することを含む、または決定することからなる場合、工程（ｂ）は、表１Ａ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ａ中に規定される群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。好ましくは、工程（ｂ）は、表１Ｂ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｂ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または少なくとも３０のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。好ましくは、工程（ｂ）は、表１Ｄ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｄ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または少なくとも１０のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。好ましくは、工程（ｂ）は、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｄ中に規定されるものの全ての試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。

この方法が、個体の無転移生存時間を決定することを含む、または決定することからなる場合、あまり好ましくはないものの、工程（ｂ）は、表１Ｃ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｃ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または少なくとも２８のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。またあまり好ましくはないが、工程（ｂ）は、表１Ｅ中に規定される群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｅ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８または少なくとも９のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。またあまり好ましくはないが、工程（ｂ）は、表１Ｃおよび表１Ｅ中に規定される全てのバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。

従って、あまり好ましくはないものの、本発明の第１の態様の方法は、個体の無転移生存時間を決定することを含み得る、または決定することからなり得、工程（ｂ）は、表１中に規定される全てのバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。

従って、本発明の第１の態様に従う方法は、ＳＰＯＮ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＫＥＲＡ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＰＣＳ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＰＳ２７Ｌ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＤＰＹＳＬ３発現を測定することを含み得る。この方法は、ＥＲＰ４４発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＡＰＧＥＦ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＣＬＹ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＭＡ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＭＣＭ３発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＮＧＰＴＬ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＥＢＰ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＵＢＥ２Ｖ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＭＩＳ１８ＢＰ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＬＣＦ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＢＡＴ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＬＣ２５Ａ５発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＴＩＰ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＯＬＦＭＬ３発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＤ３Ｇ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＭＣＭ７発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＬＣ２５Ａ１１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＮＯＰ５６発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＲＰ８発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＬＴＭ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＴＳＮ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＥＣＨ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＲＥＬＰ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＡＲＳ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＰＳ２５発現を測定することを含み得る。この方法は、ＥＳＹＴ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＯＤＮ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＰＲＤ１Ｂ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＰＬＰ０Ｐ６発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＤ３００ＬＧ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＵＧＴ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＯＴＥＦ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＫＡＲＳ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＮＤＵＦＳ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＨＮＲＮＰＨ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＡＬＵ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＥＩＦ３Ｂ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＬＣ４Ａ１ＡＰ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＰＳ５発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＬＸＤＣ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＫＩＡＡ１３２４発現を測定することを含み得る。この方法は、ＭＲＣ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＰＲＤ１Ａ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＨＭＴ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＣＴ４発現を測定することを含み得る。この方法は、ＴＳＳＣ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＩＫＺＦ３発現を測定することを含み得る。この方法は、ＵＢＥ２Ｑ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＳＭＤ９発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＮＲＮＰ７０発現を測定することを含み得る。この方法は、ＲＡＬＢ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＣＯ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＭＹＯ１８Ａ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＱＡＲＳ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＡＢＰＣ４発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＣＧＢ１Ｄ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＦＫＰ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＬＣ３Ａ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＳＰＮ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＤ３８発現を測定することを含み得る。この方法は、ＭＸＲＡ５発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＤＫ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＳＴＣ２発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＴＳＣ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＮＯＰ５８発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＧＫ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＦＫＢＰ３発現を測定することを含み得る。この方法は、ＧＳＴＭ３発現を測定することを含み得る。この方法は、ＣＡＬＭＬ５発現を測定することを含み得る。この方法は、ＰＭＬ発現を測定することを含み得る。この方法は、ＡＤＡＭＴＳ４発現を測定することを含み得る。この方法は、ＴＨＢＳ１発現を測定することを含み得る。この方法は、ＦＮ１発現を測定することを含み得る。

１つの好ましい実施形態では、工程（ｂ）は、ＭＣＭ７、ＮＯＰ５６、ＭＣＭ３、ＰＡＢＰＣ４、ＭＸＲＡ５、ＳＴＣ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＡＮＧＰＴＬ２からなる群より選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。例えば、工程（ｂ）は、これらのバイオマーカーのうち２、３、４、５、６、７または８つの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。好ましくは、この実施形態では、乳癌関連の疾患状態は組織学的グレードである；しかし、あまり好ましくはないが、この乳癌関連の疾患状態は、無転移生存時間であるまたは無転移生存時間もまた含む。

別の好ましい実施形態では、工程（ｂ）は、ＯＬＦＭＬ３、ＳＰＯＮ１、ＰＯＤＮおよびＡＳＰＮからなる群より選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含む、または測定することからなる。例えば、工程（ｂ）は、これらのバイオマーカーのうち２、３または４つの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。好ましくは、この実施形態では、乳癌関連の疾患状態は組織学的グレードである；しかし、あまり好ましくはないが、この乳癌関連の疾患状態は、無転移生存時間であるまたは無転移生存時間もまた含む。

「発現」によって、本発明者らは、ｍＲＮＡまたはタンパク質などの遺伝子産物のレベルまたは量を意味する。

タンパク質および／または核酸の濃度を検出および／または測定する方法は、当業者に周知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

タンパク質の検出および／または測定のための好ましい方法には、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む、ウエスタンブロット、ノーザン−ウエスタンブロット、免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）、免疫沈降、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび他の免疫組織化学技術、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ（ＩＲＭＡ）および酵素抗体アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。例示的なサンドイッチアッセイは、参照によって本明細書に組み入れる米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号において、Ｄａｖｉｄらによって記載されている。スライド上の細胞の抗体染色が、当業者に周知のように、細胞学実験室診断試験において周知の方法で使用され得る。

典型的には、ＥＬＩＳＡは、通常は固相アッセイでの、着色反応産物を生じる酵素の使用を含む。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が、広く使用されてきた。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、第２の酵素系のための補酵素として直ちに作用するＮＡＤを生成するための基質としてＮＡＤＰを使用することである。大腸菌由来のピロホスファターゼは、この酵素は組織中には存在せず、安定でありかつ良好な反応色を生じるので、良好なコンジュゲートを提供する。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光系もまた使用され得る。

ビタミンビオチンとのコンジュゲート化は、高い特異性および親和性でビオチンが結合する酵素連結されたアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出できるので、頻繁に使用されている。

核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の検出および／または測定のための好ましい方法には、サザンブロット、ノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ（ｎａｎｏａｒｒａｙ）、マイクロアレイ、マクロアレイ（ｍａｃｒｏａｒｒａｙ）、オートラジオグラフィーおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。

本発明の第１の態様の１実施形態では、工程（ｂ）は、１つまたはそれ以上のバイオマーカー（複数可）をコードする核酸分子の発現を測定することを含む。この核酸分子は、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子であり得る。好ましくは、この核酸分子はｍＲＮＡ分子である。また好ましくは、この核酸分子はｃＤＮＡ分子である。

従って、工程（ｂ）において１つまたはそれ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィーおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションからなる群より選択される方法を使用して実行され得る。好ましくは、工程（ｂ）において１つまたはそれ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、ＤＮＡマイクロアレイを使用して決定される。従って、この方法は、各々が表１中に同定されるバイオマーカーのうち１つをコードする核酸分子に対して選択的に結合することが可能な１つまたはそれ以上の結合性部分を使用して、工程（ｂ）において１つまたはそれ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することを含み得る、または測定することからなり得る。

好ましくは、１つまたはそれ以上の結合性部分は各々、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡもしくはＰＭＯ（好ましくは、ＤＮＡ）などの核酸分子を含む、またはかかる核酸分子からなる。好ましくは、この１つまたはそれ以上の結合性部分は、５〜１００ヌクレオチド長である。より好ましくは、この１つまたはそれ以上の核酸分子は、１５〜３５ヌクレオチド長である。この結合性部分は、検出可能な部分を含み得る。

適切な結合剤（結合分子とも呼ばれる）は、以下に考察されるように、所与の核酸、タンパク質またはアミノ酸モチーフに結合するその能力に基づいて、ライブラリーから選択またはスクリーニングされ得る。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、工程（ｂ）は、１つもしくはそれ以上のバイオマーカー（複数可）のタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体の発現を測定することを含む。好ましくは、工程（ｂ）において１つまたはそれ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、各々が表１中に同定されるバイオマーカーのうち１つに対して選択的に結合することが可能な１つまたはそれ以上の結合性部分を使用して実行される。

この１つまたはそれ以上の結合性部分は、抗体もしくはその抗原結合性断片を含み得る、または抗体もしくはその抗原結合性断片からなり得る。

用語「抗体」には、任意の合成抗体、組換え抗体もしくは抗体ハイブリッド、例えば、限定ではないが、免疫グロブリン軽鎖および／もしくは重鎖の可変領域および／もしくは定常領域のファージディスプレイによって産生される単鎖抗体分子、または当業者に公知のイムノアッセイ形式において抗原に結合することが可能な他の免疫相互作用（ｉｍｍｕｎｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）分子が含まれる。本発明者らは、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）およびアプタマーなどの抗体様結合剤の使用もまた含む。

その特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般的総説は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２９３〜２９９中に見出される。

さらに、または代替的に、１つまたはそれ以上の第１の結合分子が、アプタマーであり得る（Ｃｏｌｌｅｔｔら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７：４〜１５を参照のこと）。

分子ライブラリー、例えば抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５２、６２４〜６２８；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２（３）：５８１〜９７）、ペプチドライブラリー（Ｓｍｉｔｈ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８（４７０５）：１３１５〜７）、発現されたｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｎｔｉら（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６（２）：４９７〜５０８）、アフィボディなどの抗体フレームワーク以外の足場上のライブラリー（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６５（９）：４１３４〜４０）またはアプタマーに基づくライブラリー（Ｋｅｎａｎら、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１８、２１７〜３１）が、所与のモチーフに対して特異的な結合分子が本発明の方法における使用のために選択される供給源として使用され得る。

この分子ライブラリーは、原核生物細胞（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前掲書中；Ｍａｒｋｓら、１９９１、前掲書中）もしくは真核生物細胞（Ｋｉｅｋｅら、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６（１０）：５６５１〜６）においてｉｎ ｖｉｖｏで発現され得、または細胞の関与なしにｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され得る（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４（１０）：４９３７〜４２；ＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（２４）：５１３２〜４；Ｎｅｍｏｔｏら、１９９７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、４１４（２）：４０５〜８）。

タンパク質ベースのライブラリーが使用される場合、潜在的な結合分子のライブラリーをコードする遺伝子は、ウイルス中にパッケージされる場合が多く、潜在的な結合分子は、ウイルスの表面にディスプレイされる（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、上記；Ｍａｒｋｓら、１９９１、上記；Ｓｍｉｔｈ、１９８５、上記）。

おそらく、最も一般的に使用されるディスプレイ系は、その表面上に抗体断片をディスプレイする糸状バクテリオファージであり、抗体断片は、このバクテリオファージのマイナーコートタンパク質との融合物として発現される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、上記；Ｍａｒｋｓら、１９９１、上記）。しかし、ディスプレイのための他の適切な系は、他のウイルス（ＥＰ ３９５７８）、細菌（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９、上記；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１（９）：８２５〜３２；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １２（７）：６１３〜２１）および酵母（Ｓｈｕｓｔａら、１９９９、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２（５）：９４９〜５６）を使用することを含む。

さらに、ディスプレイ系は、いわゆるリボソームディスプレイ系におけるそのコーディングｍＲＮＡに対するポリペプチド産物の連結（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、上記；ＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ、１９９７、上記；Ｎｅｍｏｔｏら、１９９７、上記）、または代替的に、コーディングＤＮＡに対するポリペプチド産物の連結（米国特許第５，８５６，０９０号およびＷＯ９８／３７１８６号を参照のこと）を利用して、開発されてきた。

抗体の可変重（Ｖ_Ｈ）ドメインおよび可変軽（Ｖ_Ｌ）ドメインは、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である、抗原認識に関与する。さらなる確認は、げっ歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。げっ歯類起源の可変ドメインは、得られた抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト起源の定常ドメインに融合され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１〜６８５５）。

抗原特異性は可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは無関係であることが、全てが１つまたはそれ以上の可変ドメインを含む抗体断片の細菌発現を含む実験から知られている。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８）；可撓性オリゴペプチドを介してＶ_ＨパートナードメインとＶ_Ｌパートナードメインとが連結された単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、５８７９）および単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４）が含まれる。その特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般的総説は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２９３〜２９９中に見出される。

この抗体または抗原結合性断片は、インタクトな抗体、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合したＦｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）_２断片）、単一可変ドメイン（例えば、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメイン）ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ、単一形式および二重形式［即ち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群より選択され得る。好ましくは、この抗体または抗原結合性断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。

１つまたはそれ以上の結合性部分は、代替的に、アフィボディもしくはアプタマーのような抗体様結合剤を含み得る、またはアフィボディもしくはアプタマーのような抗体様結合剤からなり得る。

「ｓｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、可撓性オリゴペプチドを介してＶ_ＨパートナードメインとＶ_Ｌパートナードメインとが連結された分子を意味する。

抗体全体ではなく抗体断片を使用することの利点は、数倍である。より小さなサイズの断片は、固形組織のよりよい透過などの、改善された薬理学的特性を導き得る。補体結合などの抗体全体のエフェクター機能は除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は全て、大腸菌において発現され大腸菌から分泌され得、従って、大量の前記断片の容易な産生を可能にする。

抗体全体およびＦ（ａｂ’）_２断片は、「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）_２断片が、２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は一価であり、ただ１つの抗原結合部位のみを有する。

この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。適切なモノクローナル抗体は、共に参照によって本明細書に組み入れる「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２）に開示される技術などの、公知の技術によって調製され得る。

潜在的な結合分子がライブラリーから選択される場合、規定されたモチーフを有する１つまたはそれ以上のセレクターペプチドが、通常使用される。結合分子との相互作用を可能にする、ペプチドまたは荷電、極性もしくは疎水性側鎖における可撓性を減少させる構造を提供するアミノ酸残基が、セレクターペプチドのためのモチーフの設計において使用され得る。例えば：
（ｉ）プロリンは、その側鎖がアルファ炭素および窒素の両方に結合している場合、ペプチド構造を安定化し得る；
（ｉｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有し、高度に疎水性であるが、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、これらもまた疎水性である；
（ｉｉｉ）リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有し、中性のｐＨで正に荷電するが、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性側鎖を有し、中性のｐＨで負に荷電する；
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミンは、中性のｐＨで中性であるが、水素結合に関与し得るアミド基を含む；
（ｖ）セリン、スレオニンおよびチロシン側鎖は、水素結合に関与し得るヒドロキシル基を含む。

典型的には、結合分子の選択は、結合分子の型に対応するスポットへの結合を分析するために、アレイ技術およびシステムの使用を含み得る。

従って、好ましくは、この抗体またはその断片は、モノクローナル抗体またはその断片である。好ましくは、この抗体または抗原結合性断片は、インタクトな抗体、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合したＦｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）_２断片）、単一可変ドメイン（例えば、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメイン）ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ、単一形式および二重形式［即ち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群より選択される。従って、この抗体または抗原結合性断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり得る。代替的に、この１つまたはそれ以上の結合性部分は、アフィボディもしくはアプタマーのような抗体様結合剤を含む、またはアフィボディもしくはアプタマーのような抗体様結合剤からなる。この１つまたはそれ以上の結合性部分は、検出可能な部分を含む。

「検出可能な部分」によって、本発明者らは、その存在および／または相対的量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）が直接的にまたは間接的にのいずれかで決定されるのを可能にする部分を含む。

適切な検出可能な部分は、当該分野で周知である。

例えば、この検出可能な部分は、特定の条件に曝露された場合に検出され得る、蛍光部分および／または発光部分および／または化学発光部分であり得る。かかる蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために特定の波長および強度での照射（即ち、光）に曝露される必要があり得、それにより、検出され得る特定の波長において検出可能な蛍光を発できるようになる。

代替的に、この検出可能な部分は、可視化および／または検出され得る検出可能な産物へと（好ましくは検出不能な）基質を変換することが可能な酵素であり得る。適切な酵素の例は、例えばＥＬＩＳＡアッセイに関して、以下により詳細に考察される。

従って、この検出可能な部分は：蛍光部分；発光部分；化学発光部分；放射性部分（例えば、放射性原子）；または酵素部分からなる群より選択され得る。好ましくは、この検出可能な部分は、放射性原子を含む、または放射性原子からなる。この放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびイットリウム−９０からなる群より選択され得る。

明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載される試験サンプルおよび／もしくは対照サンプルにおける１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、ならびに／または選択されたタンパク質を検出する際に使用するための抗体分子など）は、検出可能な部分が容易に検出可能であるために、適切な原子同位体を十分に有していなければならない。

代替的な好ましい実施形態では、結合性部分の検出可能な部分は、蛍光部分である。

放射性標識または他の標識は、本発明の方法のサンプル中に存在するバイオマーカーおよび／または本発明の結合性部分中に、公知の方法で取り込まれ得る。例えば、結合剤がポリペプチドである場合、この結合剤は、生合成され得るか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用した化学的アミノ酸合成によって合成され得る。標識、例えば^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、^１８６Ｒｈ、^１８８Ｒｈおよび^１１１Ｉｎは、例えば、結合性部分中のシステイン残基を介して付着され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して付着され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０、４９〜５７）は、^１２３Ｉを取り込むために使用され得る。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」、Ｊ−Ｆ Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。タンパク質に対して他の検出可能な部分（例えば、酵素部分、蛍光部分、発光部分、化学発光部分または放射性部分）をコンジュゲート化するための方法は、当該分野で周知である。

試験されるサンプル（複数可）中のバイオマーカーが、前記タンパク質の存在、量および／または位置を決定することを間接的に補助する部分で標識され得ることが、当業者に理解される。従って、この部分は、多成分の検出可能な部分のうちの１成分を構成し得る。例えば、試験されるサンプル（複数可）中のバイオマーカーは、検出可能な標識に融合または他の方法で連結されたストレプトアビジンを使用した引き続く検出を可能にするビオチンで標識され得る。

検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分および酵素部分からなる群より選択され得る。

従って、この検出可能な部分は、放射性原子を含み得る、または放射性原子からなり得る。この放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびイットリウム−９０からなる群より選択され得る。

あるいは、結合性部分の検出可能な部分は、蛍光部分であり得る。

本発明の第１の態様に従う方法では、工程（ａ）および／または工程（ｃ）で準備されるサンプルは、サンプル中に存在するいずれのバイオマーカーもビオチンで標識され得るように、それぞれ工程（ｂ）および／または工程（ｄ）の前に処理される。工程（ｂ）および／または工程（ｄ）は、ストレプトアビジンおよび検出可能な部分（例えば蛍光部分）を含む検出剤を使用して実行され得る。

従って、試験されるサンプル中の目的のタンパク質は、第１の結合剤（複数可）を使用して最初に単離および／または固定化され得、その後、前記バイオマーカーの存在および／または相対的量が、第２の結合剤（複数可）を使用して決定され得る。

一実施形態では、この第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合性断片；典型的には組換え抗体またはその断片である。簡便には、この抗体またはその断片は：ｓｃＦｖ；Ｆａｂ；免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群より選択される。適切な抗体および断片ならびにその作製方法は、上に詳細に記載される。

あるいは、この第２の結合剤は、抗体様結合剤、例えばアフィボディまたはアプタマーであり得る。

あるいは、試験されるサンプル中のタンパク質上の検出可能な部分が、特異的結合対のメンバー（例えば、ビオチン）を含む、またはかかるメンバーからなる場合、第２の結合剤は、特異的結合対の相補的メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含み得る、またはかかるメンバーからなり得る。

検出アッセイが使用される場合、検出可能な部分は：蛍光部分；発光部分；化学発光部分；放射性部分；酵素部分からなる群より選択されることが好ましい。本発明の方法における使用のために適切な検出可能な部分の例は、上記されている。

血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイには、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ（ＩＲＭＡ）および酵素抗体アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。例示的なサンドイッチアッセイは、参照によって本明細書に組み入れる米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号において、Ｄａｖｉｄらによって記載されている。スライド上の細胞の抗体染色が、当業者に周知のように、細胞学実験室診断試験において周知の方法で使用され得る。

従って、一実施形態では、このアッセイは、通常は固相アッセイでの、着色反応産物を生じる酵素の使用を典型的に含む、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が、広く使用されてきた。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、第２の酵素系のための補酵素として直ちに作用するＮＡＤを生成するための基質としてＮＡＤＰを使用することである。大腸菌由来のピロホスファターゼは、この酵素は組織中には存在せず、安定でありかつ良好な反応色を生じるので、良好なコンジュゲートを提供する。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光系もまた使用され得る。

ビタミンビオチンとのコンジュゲート化は、高い特異性および親和性でビオチンが結合する酵素連結されたアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出できるので、頻繁に使用されている。

代替的実施形態では、タンパク質検出に使用されるアッセイは、簡便には蛍光定量的アッセイである。従って、第２の結合剤の検出可能な部分は、Ａｌｅｘａフルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ−６４７）などの蛍光部分であり得る。

好ましくは、ＲＯＣ ＡＵＣ値によって決定されるこの方法の断定精度（ｐｒｅｄｉｃａｔｉｖｅ ａｃｃｕｒａｃｙ）は、少なくとも０．５０、例えば、少なくとも０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または少なくとも０．９９である。より好ましくは、ＲＯＣ ＡＵＣ値によって決定されるこの方法の断定精度は、少なくとも０．８０（最も好ましくは、１）である。

本発明の第１の態様の方法では、工程（ｂ）は、アレイ、例えばビーズベースのアレイまたは表面ベースのアレイを使用して実行され得る。好ましくは、このアレイは：マクロアレイ；マイクロアレイ；ナノアレイからなる群より選択される。

乳癌関連の疾患状態を決定するための方法は、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから入手可能なもの（例えば、ｅ１０７１ １．５−２４）などの、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して実行され得る。しかし、任意の他の適切な手段もまた使用され得る。ＳＶＭは、本明細書に規定される１つもしくはそれ以上の表１のバイオマーカーを含む、または１つもしくはそれ以上の表１のバイオマーカーからなるバイオマーカーシグネチャーのＲＯＣ ＡＵＣを決定するためにも使用され得る。

サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰のために使用される関連の教師あり学習法のセットである。各々２つのカテゴリーのうち１つに属すると示される訓練事例のセットを考慮して、ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、新たな事例が一方のカテゴリーに入るか他方のカテゴリーに入るかを予測するモデルを作り上げる。直感的に、ＳＶＭモデルは、別々のカテゴリーの事例が可能な限り広いクリアなギャップによって分割されるようにマップされた、空間における点としての事例の表示である。次いで、新たな事例は、同じ空間中にマップされ、新たな事例がギャップのどちらの側に位置するかに基づいて、一方のカテゴリーに属すると予測される。

より正式には、サポートベクターマシンは、高次元空間または無限次元空間中に超平面または超平面のセットを構築し、これは、分類、回帰または他の課題に使用され得る。直感的に、良好な分離は、任意のクラスの最も近い訓練データポイントに対して最大の距離（いわゆる機能的マージン）を有する超平面によって達成されるが、これは、一般に、マージンが大きくなるほど分類子の汎化誤差が低くなるからである。ＳＶＭに関するさらなる情報については、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ、１９９８、Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２：１２１〜１６７を参照のこと。

本発明の一実施形態では、ＳＶＭは、既知の薬剤のバイオマーカープロフィール（即ち、既知の組織学的グレードの乳癌細胞または既知の無遠隔転移生存期間を有する乳癌患者由来の乳癌細胞）を使用して、本発明の方法を実施する前に「訓練」される。かかる訓練サンプルを実施することによって、ＳＶＭは、どのバイオマーカープロフィールが特定の特徴と関連しているかを学習することが可能である。訓練プロセスが一旦完了すると、次いで、試験されるバイオマーカーサンプルが、特定の乳癌サンプル型（即ち、特定の乳癌関連の疾患状態）に由来するか否かのＳＶＭが可能である。

しかし、この訓練手順は、必要な訓練パラメータを用いてＳＶＭを予めプログラミングすることによって迂回され得る。例えば、特定の乳癌関連の疾患状態に属する細胞は、本明細書に詳述される値および／または調整パターンを使用し、表１中に列挙されたバイオマーカーの測定値に基づいて、表４中に詳述したＳＶＭアルゴリズムを使用して既知のＳＶＭパラメータに従って同定され得る。

適切なＳＶＭパラメータが、データの適切な選択（即ち、既知の組織学的グレードの細胞由来および／または既知の無転移生存時間を有する個体由来の細胞由来のバイオマーカー測定値）を用いてＳＶＭマシーンを訓練することによって、表１中に列挙されたバイオマーカーの任意の組み合わせについて決定され得ることが、当業者に理解される。

代替的に、表１のデータは、当該分野で公知の任意の他の適切な統計的方法、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）および他の多変量統計分析（例えば、変数減少（ｂａｃｋｗａｒｄ）ステップワイズロジスティック回帰モデル）に従って、特定の乳癌関連の疾患状態を決定するために使用され得る。多変量統計分析の総説については、例えば、参照によって本明細書に組み入れるＳｃｈｅｒｖｉｓｈ，Ｍａｒｋ Ｊ．（１９８７年１１月）．「Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２（４）：３９６〜４１３を参照のこと。

好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の精度、例えば、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の精度を有する。

好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の感度、例えば、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の感度を有する。

好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の特異性、例えば、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の特異性を有する。

「精度」によって、本発明者らは、方法の正確なアウトカムの割合を意味し、「感度」によって、本発明者らは、正確に陽性と分類される全ての陽性化学物質の割合を意味し、「特異性」によって、本発明者らは、正確に陰性と分類される全ての陰性化学物質の割合を意味する。

本発明の第１の態様の方法は、下記工程：
ｅ）先行する工程において決定された乳癌関連の疾患状態に基づいて、試験される個体に対して処置を施す工程、
をさらに含み得る。

従って、この方法は、乳癌の組織学的グレードに従っておよび／または予測された無転移生存時間に従って、患者を処置する工程を含む。例えば、より積極的な処置は、より高いグレードの乳癌に対して、および／または無転移生存時間が、相対的に低い（例えば、１０年未満）対相対的に高い（例えば、１０年より長い）と予測される場合に、提供され得る。適切な治療的アプローチは、その時点での支配的なガイダンスに従って、当業者によって決定され得、例えば、参照によって本明細書に組み入れるＮＩＣＥ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ８０「Ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌｏｃａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、（下記で入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｃｅ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｎｉｃｅｍｅｄｉａ／ｐｄｆ／ＣＧ８０ＮＩＣＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅ．ｐｄｆ）を参照のこと。

従って、本発明は、乳癌の処置における使用のための抗新生物剤を含み、ここで、投薬レジメンは、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。

本発明は、乳癌の処置における抗新生物剤の使用を含み、ここで、投薬レジメンは、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。

本発明は、乳癌を処置するための医薬の製造における、抗新生物剤の使用を含み、ここで、投薬レジメンは、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。

本発明は、十分な量の抗新生物剤を提供する工程を含む、乳癌を処置する方法を含み、ここで、乳癌を処置するのに十分な抗新生物剤の量は、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。

一実施形態では、この抗新生物剤は、アルキル化剤（ＡＴＣコードＬ０１ａ）、代謝拮抗剤（ＡＴＣコードＬ０１ｂ）、植物アルカロイドもしくは他の天然産物（ＡＴＣコードＬ０１ｃ）、細胞傷害性抗生物質もしくは関連の物質（ＡＴＣコードＬ０１ｄ）または他の抗新生物剤（ＡＴＣコードＬ０１ｘ）である。

従って、一実施形態では、この抗新生物剤は、ナイトロジェンマスタードアナログ（例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、イホスファミド、トロホスファミド、プレドニムスチンもしくはベンダムスチン）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、トレオスルファンもしくはマンノスルファン）、エチレンイミン（例えば、チオテパ、トリアジコンもしくはカルボコン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチン、ニムスチンもしくはラニムスチン）、エポキシド（例えば、エトグルシド）または別のアルキル化剤（ＡＴＣコードＬ０１ａｘ、例えば、ミトブロニトール、ピポブロマン、テモゾロミドもしくはダカルバジン）からなる群より選択されるアルキル化剤である。

別の実施形態では、この抗新生物剤は、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセドもしくはプララトレキサート）、プリンアナログ（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビンもしくはネララビン）またはピリミジンアナログ（例えば、シタラビン、フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、ゲムシタビン、カペシタビン、アザシチジンもしくはデシタビン）からなる群より選択される代謝拮抗剤である。

なおさらなる実施形態では、この抗新生物剤は、ビンカアルカロイドもしくはビンカアルカロイドアナログ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンもしくはビンフルニン）、ポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドもしくはテニポシド）、コルヒチン誘導体（例えば、デメコルチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルもしくはパクリタキセルポリグルメクス）または別の植物アルカロイドもしくは天然産物（ＡＴＣコードＬ０１ｃｘ、例えば、トラベクテジン）からなる群より選択される植物アルカロイドまたは他の天然産物である。

一実施形態では、この抗新生物剤は、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、アントラサイクリンもしくは関連の物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピラルビシン、バルルビシン、アムルビシンもしくはピクサントロン）または別のもの（ＡＴＣコードＬ０１ｄｃ、例えば、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンもしくはイクサベピロン）からなる群より選択される細胞傷害性抗生物質または関連の物質である。

さらなる実施形態では、この抗新生物剤は、白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンもしくはポリプラチレン（ｐｏｌｙｐｌａｔｉｌｌｅｎ））、メチルヒドラジン（例えば、プロカルバジン）、モノクローナル抗体（例えば、エドレコロマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブもしくはオファツムマブ）、光線力学的療法／放射線療法で使用される増感剤（例えば、ポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸メチル、アミノレブリン酸、テモポルフィンもしくはエファプロキシラル）またはタンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、マスチニブもしくはトセラニブ）からなる群より選択される他の抗新生物剤である。

なおさらなる実施形態では、この抗新生物剤は、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ヒドロキシカルバミド、ロニダミン、ペントスタチン、ミルテホシン、マソプロコール、エストラムスチン、トレチノイン、ミトグアゾン、トポテカン、チアゾフリン、イリノテカン、アリトレチノイン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ベキサロテン、亜ヒ酸、デニロイキンジフチトクス、ボルテゾミブ、セレコキシブ、アナグレリド、オブリメルセン、シチマジーンセラデノベック、ボリノスタット、ロミデプシン、オマセタキシンメペサクシネートまたはエリブリンからなる群より選択される他の抗新生物剤である。

従って、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に従う方法における使用のためのアレイを提供し、このアレイは、本発明の第１の態様と関連して、上に規定した１つまたはそれ以上の第１の結合剤を含む。

このアレイ結合剤は、表１Ａ中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ａ中に規定される群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。好ましくは、このアレイ結合剤は、表１Ｂ中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｂ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは少なくとも３０のバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。好ましくは、このアレイ結合剤は、表１Ｃ中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｃ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは少なくとも２８のバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。好ましくは、このアレイ結合剤は、表１Ｄ中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｄ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは少なくとも１０のバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。好ましくは、このアレイ結合剤は、表１Ｅ中に規定される群から選択される１つもしくはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１Ｅ中に規定される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８もしくは少なくとも９のバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。

従って、このアレイ結合剤は、表１Ａ中に規定される全てのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。このアレイ結合剤は、表１Ｂ中に規定される全てのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。このアレイ結合剤は、表１Ｃ中に規定される全てのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。このアレイ結合剤は、表１Ｄ中に規定される全てのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。このアレイ結合剤は、表１Ｅ中に規定される全てのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含み得る、またはかかる結合剤からなり得る。好ましくは、このアレイ結合剤は、表１中に規定される全てのバイオマーカーに集合的に結合することが可能な結合剤を含む、またはかかる結合剤からなる。

アレイの第１の結合剤は、固定化され得る。

アレイ自体は、当該分野で周知である。典型的には、アレイは、固体支持体の表面上に形成された、各々が有限の面積を有する、間隔をあけた（即ち、別個の）領域（「スポット」）を有する、直線構造または２次元構造をなす。アレイは、各ビーズが、分子コードもしくは色コードによって同定され得る、または連続フローで同定され得る、ビーズ構造でもあり得る。分析はまた、各々が溶液から分子のクラスを吸着する一連のスポットをサンプルが通り過ぎる場合に、連続して実行され得る。この固体支持体は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。この固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、他の多孔性メンブレン、非多孔性メンブレン（例えば、とりわけ、プラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマー性ピンもしくは複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチドおよび他の適切な分子を固定化するのに適したならびに／もしくはイムノアッセイを実行するのに適した任意の他の表面の形態であり得る。結合プロセスは、当該分野で周知であり、タンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを固体支持体に架橋し、共有結合することまたは物理的に吸着することから一般になる。代替的に、アフィニティタグまたは類似の構築物を介したプローブのアフィニティカップリングが使用され得る。周知の技術、例えば接触印刷もしくは非接触印刷、マスキングまたはフォトリソグラフィーを使用することによって、各スポットの位置が規定され得る。総説については、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２、１３〜２９）およびＬａｌら（２００２、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １５；７（補遺１８）：Ｓ１４３〜９）を参照のこと。

典型的には、このアレイはマイクロアレイである。「マイクロアレイ」によって、本発明者らは、少なくとも約１００／ｃｍ^２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ^２の密度の別個の領域を有する領域のアレイの意味を含む。マイクロアレイ中の領域は、約１０〜２５０μｍの間の範囲の典型的な寸法、例えば直径を有し、アレイ中の他の領域からおよそ同じ距離だけ離れている。このアレイは、代替的には、マクロアレイまたはナノアレイであり得る。

適切な結合分子（上で考察した）が一旦同定および単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を使用して、アレイを製造できる；以下の実施例を参照のこと。

本発明の第３の態様は、乳癌関連の疾患状態を決定するための、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄおよび／または表１Ｅ中に規定される群より選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーの使用を提供する。

一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄおよび表１Ｅ中に規定される全てのバイオマーカーが、乳癌関連の疾患状態を決定するために集合的に使用される。

本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に従う方法における使用のための分析キットを提供し、この分析キットは：
Ａ）本発明の第２の態様に従うまたは本発明の第１の態様に規定されるアレイ；および
Ｂ）本発明の第１の態様に規定される方法を実行するための指示書（場合による）、
を含む。

この分析キットは、本発明の第１の態様に規定される１つまたはそれ以上の対照サンプルを含み得る。

本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な例は、以下の図面を参照して、本明細書に記載される：

ペプチドおよびタンパク質の統計を示す図である。（Ａ）サンプル当たりの同定された独自のペプチド配列の総数（ＦＤＲ ０．０１、Ｍａｓｃｏｔ＋Ｘ！Ｔａｎｄｅｍを使用）。（Ｂ）サンプル当たりの同定されたアセンブルされたタンパク質群の総数（ＦＤＲ ０．０１、タンパク質レベルで設定、Ｍａｓｃｏｔ＋Ｘ！Ｔａｎｄｅｍを使用）。（Ｃ）研究全体で２１４０のタンパク質群の総タンパク質カバー度を生じる、タンパク質群当たりの独自のペプチドの数（ＦＤＲ ０．０１、タンパク質レベルで設定、Ｍａｓｃｏｔ＋Ｘ！Ｔａｎｄｅｍを使用）（複製、プール実施および臨床的パラメータを欠くサンプルを含む、全てのサンプルおよび実施に基づくデータ）。（Ｄ）ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ（バージョン２０１１−０８ Ｅｎｓ６２、ヒト）に対する、定量されたペプチドの評価（Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＬＣ−ＭＳソフトウェア、Ｍａｓｃｏｔスコア付けされたペプチドに限定、ＦＤＲ ０．０１を使用）。さらに、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓに存在しないペプチドについて、対応するタンパク質が報告されているかどうかを評価するために、第２の比較を実行した。複数のタンパク質アクセッションの場合、全てを評価した。（Ｅ）ペプチド長の比較。（Ｆ）ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓで観察されたペプチド頻度。 図１−１の続き。 図１−２の続き。 図１−３の続き。 代表的サンプル（サンプル７２６７）および参照（プール）サンプルについて、組み合わされたデータおよび個々の混合物の両方について示された、ＧＰＳセットアップ全体（即ち、捕捉＋ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の再現性を示す図である。データポイントを含める（プロットする）ために、タンパク質を、全ての三連の実施において定量しなければならなかった（正規化存在量＞０）。かかる要件を、パネルＡ〜Ｅにおいてプロットした全てのデータに使用した。（Ａ）組み合わされた全てのデータについて示される（１２６４のタンパク質に基づく）。（Ｂ）ＣＩＭＳ−ミックス１について示される（３１５のタンパク質に基づく）（Ｃ）ＣＩＭＳ−ミックス２について示される（６６１のタンパク質に基づく）（Ｄ）ＣＩＭＳ−ミックス３について示される（４５２のタンパク質に基づく）（Ｅ）ＣＩＭＳ−ミックス４について示される（３７０のタンパク質に基づく）。 図２−１の続き。 図２−２の続き。 組織グレード、エストロゲン受容体状態およびＨＥＲ２状態に基づいて、有意に示差的に発現されたタンパク質を示す図である。示差的に発現された分析物が、ヒートマップ中に示される（赤−上方調節された、緑−下方調節された）。（Ａ）組織グレード１、組織グレード２および組織グレード３のサンプルのＰＣＡプロットおよび関連したヒートマップ（分散０．２、ｐ値＜０．０１、ｑ値＜０．２５でフィルタリングしたデータ）。さらに、ＳＶＭを用いた１つ抜き（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ ｏｕｔ）交差検証アプローチからの結果を、ＲＯＣ面積値で示した。（Ｂ）ＥＲ陽性サンプルおよびＥＲ陰性サンプルのＰＣＡプロットおよび関連したヒートマップ（分散０．２、ｐ値＜０．０１、ｑ値＜０．３２でフィルタリングしたデータ）。さらに、１つ抜き交差検証アプローチからの結果を、ＲＯＣ曲線で示した。（Ｃ）ＨＥＲ２陽性サンプルおよびＨＥＲ２陰性サンプルのＰＣＡプロットおよび関連したヒートマップ（分散０．２、ｐ値＜０．０１、ｑ値＜０．９でフィルタリングしたデータ）。１つ抜き交差検証アプローチからの結果を、ＲＯＣ曲線で示した。 図３−１の続き。 図３−２の続き。 図３−２の続き。 図３−３の続き。 図３−４の続き。 図３−５の続き。 図３−６の続き。 ＩＰＡを使用した、３つの組織グレード分けされた腫瘍型間で示差的に発現された分析物の生物学的関連性を示す図である。（Ａ）その細胞局在にマップされた、３つの腫瘍コホート間で有意に示差的に発現されたタンパク質と同定された４９のタンパク質。赤色が上方調節を示し、緑色が下方調節を示す、着色ｌｏｇ_２比（中央値グレード３／中央値グレード１）。腫瘍発生に対する既知の関連を有するタンパク質が示されている。 ＩＰＡを使用した、３つの組織グレード分けされた腫瘍型間で示差的に発現された分析物の生物学的関連性を示す図である。（Ｂ）ＤＮＡの複製、組換え、細胞周期およびフリーラジカル消去に関連することが見出された、最初に報告されたネットワーク。 ＩＰＡを使用した、３つの組織グレード分けされた腫瘍型間で示差的に発現された分析物の生物学的関連性を示す図である。（Ｃ）遺伝子発現、感染疾患および癌に関連することが見出された、２番目に報告されたネットワーク。 直交法を使用したタンパク質発現プロフィールの検証を示す図である。この目的のために、１４１１の組織学的グレード分けされた腫瘍サンプル由来のデータに基づくｍＲＮＡ発現プロフィールを使用した。組織グレード１、２および３の間で示差的に発現された４９のタンパク質のうち４２は、ＧＯＢＯデータベース中に首尾よくマップされた（Ｇｅｎｅ Ｅｎｔｒｅｚ ＩＤを使用）。（Ａ）１５（合計１６のうち）の分析物がＧＯＢＯツールでマップできた、組織グレード３の腫瘍において減少したタンパク質発現（組織グレード１と比較した中央値比）を示すことが見出されたタンパク質についてのｍＲＮＡ発現プロフィール。さらに、異なる遺伝子セットモジュール発現パターンに対する、１５の遺伝子の相関が示される。灰色の点は、実際の相関値を示す。 直交法を使用したタンパク質発現プロフィールの検証を示す図である。この目的のために、１４１１の組織学的グレード分けされた腫瘍サンプル由来のデータに基づくｍＲＮＡ発現プロフィールを使用した。組織グレード１、２および３の間で示差的に発現された４９のタンパク質のうち４２は、ＧＯＢＯデータベース中に首尾よくマップされた（Ｇｅｎｅ Ｅｎｔｒｅｚ ＩＤを使用）。（Ｂ）２７（合計３３のうち）がＧＯＢＯツールでマップできた、組織グレード３の腫瘍において増加した発現（組織グレード１と比較）を示すことが見出されたタンパク質についてのｍＲＮＡ発現プロフィール。さらに、異なる遺伝子セットモジュール発現パターンに対する、２７の遺伝子の相関が示される。灰色の点は、実際の相関値を示す。 表１のバイオマーカーの変動する長さおよび組み合わせの例示的なバイオマーカーシグネチャーのｋａｐｌａｎ ｍｅｉｅｒ分析を示す図である。 この研究で使用したワークフローの模式的概観を示す図である。（Ａ）腫瘍サンプル調製ならびに（Ｂ）ＣＩＭＳ−抗体を使用したペプチド捕捉、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの実施スケジュールおよびデータ分析。１つのＣＩＭＳ−バインダーミックス由来の全ての溶出物の分析を、次のＣＩＭＳ−バインダーミックス由来の溶出物に進む前に終了させた。結果として、全てのＣＩＭＳ−バインダーミックス分析は、プールされたサンプル由来の溶出物の分析で始まり、組織学的グレードに従ってランダムな配列で個々のサンプルの半分で続けた。ミックスの途中で、別のプールサンプルを注入し、次いで残りのサンプルを注入し、最後に第３のプールサンプルで終了した。完了後、次のＣＩＭＳ−バインダーミックス由来の溶出物の分析を開始した。バインダーミックス２とバインダーミックス３との間で、ブランクビーズの２回の注入を実施した。ブランクビーズは、付着した抗体を含まないので、磁気ビーズに結合するバックグラウンドペプチドのみが溶出するはずである。データを、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥおよびＰｒｏｇｅｎｉｓｉｓで分析して、ペプチドおよびタンパク質の同定および定量を得た。 Ｖｅｎｎ図として示される、ＧＰＳセットアップ全体（即ち、捕捉＋ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の同定再現性を示す図である。（Ａ）サンプル７２６７についての複製捕捉実施間のペプチドの重複（全て独自の配列）。サンプル７２６７（上の図）および個々のミックス（より小さい４つのＶｅｎｎ図）の総カバー度についての統計が示される。Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥ（即ち、ＭａｓｃｏｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍスコア付けされたペプチド）から生成されたデータ。（Ｂ）プールサンプルについての複製捕捉実施間のペプチドの重複（全て独自の配列）。総体（上の図）および個々のミックスの両方についての統計が示される。Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥ（即ち、ＭａｓｃｏｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍスコア付けされたペプチド）から生成されたデータ。 定量されたタンパク質のｌｏｇ２ ＭＳ強度の分布を示す図である。（Ａ）１３６４のタンパク質についてプロットされた中央値正規化存在量（臨床的記録を有する５０のサンプルに基づく）（０の中央値ｌｏｇ２強度値を有する２４のタンパク質は排除した）。棒は、淡黄色（低いＭＳ強度）から暗赤色（高いＭＳ強度）の範囲で、ＭＳ強度に従って着色される。 定量されたタンパク質のｌｏｇ２ ＭＳ強度の分布を示す図である。（Ｂ）選択されたタンパク質カテゴリーについてのＧＯ生物学的プロセスに基づくｌｏｇ２ ＭＳ強度値の分布。分析物を、Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）Ｔｅｒｍ Ｍａｐｐｅｒツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｏ．ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＧＯＴｅｒｍＭａｐｐｅｒ）を使用して主要な生物学的プロセスによってグループ分けした。 組織学的グレード３の腫瘍において最高の発現を示す、３つの組織学的グレード間で示差的に発現されたタンパク質のうち８つについての個々の強度ボックスプロットを示す図である。 図Ｓ４−１の続き。 組織学的グレード１の腫瘍において最高の発現を示す、３つの組織学的グレード間で示差的に発現されたタンパク質のうち８つについての個々の強度ボックスプロットを示す図である。 図Ｓ５−１の続き。 組織学的グレード間の拡張された比較を示す図である。（Ａ）組織グレード２（Ｈ２）と組織グレード１（Ｈ１）との間、組織グレード３（Ｈ３）と組織グレード１（Ｈ１）との間、および組織グレード３（Ｈ３）と組織グレード２（Ｈ２）との間の、ｌｏｇ２倍の変化。上位４９の示された分析物は、３つのグレード間で示差的に発現されると同定されたタンパク質シグネチャーである。従って、全ての比較が計算され、示されている。下位４７の分析物は、これらのグレードのうち２つの間でのＳＶＭ計算から導出されるが、第３のグレードは除外される。この計算は、３つ全ての比較について行われ、有意な分析物のリストが、結果として編集された。行列色図形を、Ｍａｔｒｉｘ２ｐｎｇ（ＰａｖｌｉｄｉｓおよびＮｏｂｌｅ、２００３）を使用して生成した。 組織学的グレード間の拡張された比較を示す図である。（Ｂ）２群比較からのＳＶＭ計算から導出したＲＯＣ ＡＵＣ値。フィルタリングしていないデータ（データセット全体）およびフィルタリングしたデータ（分散０．２およびｐ値＜０．０１）に由来する両方のＲＯＣ ＡＵＣ値を列挙している。 組織学的グレード間の拡張された比較を示す図である。（Ｃ）組織学的グレード１および組織学的グレード３のヒートマップ（分散０．２、ｐ値＜０．０１、ｑ値＜０．２５でフィルタリングしたデータ）。示差的に発現された分析物がヒートマップ中に示され、赤色は上方調節を示し、緑色は下方調節を示す。（Ｄ）組織学的グレード１と組織学的グレード３との間で示差的に発現された５０のタンパク質（図Ｓ８Ｃ）を使用した、組織学的グレード１、組織学的グレード２および組織学的グレード３のＰＣＡプロット。 組織学的グレード間の拡張された比較を示す図である。（Ｄ）組織学的グレード１と組織学的グレード３との間で示差的に発現された５０のタンパク質（図Ｓ８Ｃ）を使用した、組織学的グレード１、組織学的グレード２および組織学的グレード３のＰＣＡプロット。 ＥＲ状態比較またはＨＥＲ２／ｎｅｕ状態比較において示差的に発現されると同定されたタンパク質のサブセットについて示された個々の強度ボックスプロットを示す図である。（Ａ）ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍との間で示差的に発現された分析物。 ＥＲ状態比較またはＨＥＲ２／ｎｅｕ状態比較において示差的に発現されると同定されたタンパク質のサブセットについて示された個々の強度ボックスプロットを示す図である。（Ｂ）ＨＥＲ２陰性腫瘍とＨＥＲ２陽性腫瘍との間で示差的に発現された分析物。 Ｋｉ６７陽性（２５％カットオフ）およびＫｉ６７陰性のステージ分類された腫瘍の評価を示す図である。示差的に発現された分析物がヒートマップ中に示され、赤色は上方調節を示し、緑色は下方調節を示す。（Ａ）Ｋｉ６７陽性およびＫｉ６７陰性のステージ分類された腫瘍のＰＣＡプロット。対応する分析物およびサンプルのヒートマップ（分散０．２、ｐ値＜０．０１、ｑ値＜０．２７でフィルタリングしたデータ）。 図Ｓ８Ａ−１の続き。 Ｋｉ６７陽性（２５％カットオフ）およびＫｉ６７陰性のステージ分類された腫瘍の評価を示す図である。示差的に発現された分析物がヒートマップ中に示され、赤色は上方調節を示し、緑色は下方調節を示す。（Ｂ）ＳＶＭを用いた１つ抜き交差検証アプローチからの結果を、ＲＯＣ曲線で示した。 組織学的グレードまたはＥＲ状態を反映する、示差的に発現された分析物についての、ＩＰＡを使用した転写因子関連ネットワーク分析を示す図である。分子をつなぐ線は、分子の関連性を示し、矢印のスタイルは、特異的分子の関連性および相互作用の方向性を示す。（Ａ）多群組織学的グレード比較で同定された４９のタンパク質を、インプットとして使用した。測定された分析物を色コード化するために使用される、組織学的グレード３対組織学的グレード１についての中央値のＬｏｇ_２比。赤色は上方調節を示す。緑色は下方調節を示す。 組織学的グレードまたはＥＲ状態を反映する、示差的に発現された分析物についての、ＩＰＡを使用した転写因子関連ネットワーク分析を示す図である。分子をつなぐ線は、分子の関連性を示し、矢印のスタイルは、特異的分子の関連性および相互作用の方向性を示す。（Ｂ）ＥＲ状態比較で同定された３９のタンパク質を、インプットとして使用した。測定された分析物を色コード化するために使用される、中央値のＬｏｇ_２比。ＥＲ陰性サンプルにおいて、赤色は上方調節を示し、緑色は下方調節を示す。 組織グレード間で有意に異なるタンパク質発現を示すことが見出された分析物のサブセットについて例示された、１４１１の組織学的グレード分けされた腫瘍サンプル由来のデータに基づく個々のｍＲＮＡ発現プロフィールを示す図である。（Ａ〜Ｅ）組織グレード３の腫瘍において増加した発現を示すことが見出された５つのタンパク質についてのｍＲＮＡ発現レベル。（Ｆ〜Ｊ）組織グレード３の腫瘍において減少した発現を示すことが見出された５つのタンパク質についてのｍＲＮＡ発現レベル。 図Ｓ１０−１の続き。 図Ｓ１０−２の続き。 図Ｓ１０−３の続き。 図Ｓ１０−４の続き。 １６２０のＥＲ状態が規定された乳房腫瘍サンプル由来のデータに基づくｍＲＮＡ発現プロフィールを示す図である。示差的に発現された３９のタンパク質のうち３２が、ｇｅｎｅ ｅｎｔｒｅｚ ＩＤを使用して、ＧＯＢＯデータベース中に首尾よくマップされた。（Ａ）ＥＲ陽性腫瘍において増加したタンパク質発現を示すことが見出された１０のタンパク質についてのｍＲＮＡ発現プロフィール。さらに、異なる遺伝子セットモジュール発現パターンに対する１０の遺伝子の相関が示される。灰色の点は、実際の相関値を示す。（Ｂ）ＥＲ陽性腫瘍において減少した発現を示すことが見出されたタンパク質についてのｍＲＮＡ発現プロフィール。さらに、異なる遺伝子セットモジュール発現パターンに対する２２の遺伝子の相関が示される。灰色の点は、実際の相関値を示す。（Ｃ〜Ｄ）ＥＲ陽性腫瘍において増加した発現を示すことが見出された２つのタンパク質について例示された個々のｍＲＮＡ発現プロフィール。（Ｅ〜Ｆ）ＥＲ陽性腫瘍において減少した発現を示すことが見出された２つのタンパク質について例示された個々のｍＲＮＡ発現プロフィール。 図Ｓ１１−１の続き。 図Ｓ１１−２の続き。 図Ｓ１１−３の続き。 ＨＥＲ２／ｎｅｕ比較において有意に示差的なタンパク質発現を示すことが見出された３つの分析物について例示された、ＧＯＢＯデータベースツールを使用してマップされた個々のｍＲＮＡ発現プロフィールを示す図である。１８８１の入手可能な腫瘍サンプルに基づくデータ。（Ａ）ＨＥＲ２／ｎｅｕ、（Ｂ）Ｓ１００Ａ９（Ｃ）ＧＲＢ７。上記３つの分析物に加えて、第４のタンパク質（アクセッションＰ２２３９２）を試験してマップした。しかし、Ｇｅｎｅ Ｅｎｔｒｅｚ ＩＤ ４８３１または６５４３６４のいずれかを使用したＧＯＢＯデータベースツールからのエラーメッセージに起因して、データは欠けている。 図Ｓ１２−１の続き。 １０年のエンドポイントとしてＤＭＦＳを使用したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を示す図である。組織学的グレードを差別化している４９のタンパク質のうち４２は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ（スイスプロットＩＤに変換した後）を使用して、遺伝子発現データベースに首尾よくマップされた。これらの分析物を、（観察されたタンパク質発現レベルについて組織学的グレード３のサンプルと組織学的グレード１のサンプルとの間の比率を使用して、上方調節または下方調節に基づいて）２つの群に分割したところ、１５の下方調節された分析物および２７の上方調節された分析物が得られた。次いで、これら２つの群を使用して、遺伝子発現データセットを使用して無遠隔転移生存期間（ＤＭＦＳ）の潜在的なリスクを評価した。組織学的グレード分けされた腫瘍（ｎ＝１３７９）について１０年のエンドポイントとしてＤＭＦＳを使用したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を、遺伝子発現データを３つの分位に層別化することによって実行した。さらに、単一遺伝子（下方調節されたもの２つおよび上方調節されたもの２つ）に基づく１０年のエンドポイントとしてＤＭＦＳを使用した４つの個々のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を生成し、ＧＯＢＯツールを使用して類似の様式で示した。 図Ｓ１３−１の続き。 ここでは６つのグレード１のサンプル、９つのグレード２のサンプルおよび６つのグレード９のサンプルを含む乳癌組織サンプルを、５２サンプルの同じ元のコホートから選択したことを示す図である。これらのサンプルを、溶液中で消化（トリプシン処理）し、選択的モニタリング反応（ＳＲＭ）セットアップ（確立された質量分析ベースのアプローチ）を使用して分析した。バイオマーカーの示されたリスト由来の８つのタンパク質に対応する９つのペプチドを標的化し、定量した。サンプルを三連で実施した。データを、Ａｎｕｂｉｓを使用して分析し、その後Ｐ値フィルタリング（ｐ＜０．０１）およびｑ値フィルタリング（ｑ＜０．１１）を行った。このデータは、乳癌組織サンプルが、マーカーの短縮されたリストを使用してグレードに従って差別化できたことを示している。 ここではグレード１、２および３にわたって広がる４７のサンプル（技術的複製による）を含む乳癌組織サンプルを、５２サンプルの同じ元のコホートから選択したことを示す図である。これらのサンプルを、ゲル中で消化（トリプシン処理）し、選択的モニタリング反応（ＳＲＭ）セットアップ（確立された質量分析ベースのアプローチ）を使用して分析した。バイオマーカーの示されたリスト由来の４つのタンパク質に対応する８つのペプチドを標的化し、定量した。サンプルを三連で実施した。データを、Ａｎｕｂｉｓを使用して分析し、その後Ｐ値フィルタリング（ｐ＜０．０１）およびｑ値フィルタリング（ｑ＜０．００９）を行った。このデータは、乳癌組織サンプルが、マーカーの短縮されたリストを使用してグレードに従って差別化できたことを示した。 図８−１の続き。

導入
乳癌患者における腫瘍の進行および予後は、現在の臨床的パラメータおよび実験室パラメータを使用して評価することが困難であり、候補の多重組織バイオマーカーシグネチャーは存在しない。この満たされていない臨床的要求を解決するための試みにおいて、本発明者らは、グローバルプロテオーム調査と呼ばれる最近開発されたプロテオミクス的発見ツールを適用した。従って、９抗体のみに基づくアフィニティプロテオミクスおよび非標識ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを組み合わせることによって、本発明者らは、最大の乳癌組織プロテオミクス研究のうち１つを示す５２の乳癌組織サンプルをプロファイリングし、１３８８のタンパク質を示す詳細に定量されたプロテオミクスマップを首尾よく生成した。この結果は、本発明者らが、腫瘍の進行を反映する組織グレード分けされた乳癌腫瘍の徹底的な分子ポートレートを解読したことを示した。より詳細には、高い精度で組織グレード１〜３の乳癌腫瘍を識別する４９個の構成部分を持つ組織バイオマーカーシグネチャー（ｐ＜０．０１の場合）および７９個の構成部分を持つ組織バイオマーカー（ｐ＜０．０２の場合）シグネチャーを規定した。高度に生物学的に関連するタンパク質を同定し、示差的に発現されたタンパク質は、腫瘍進行のために腫瘍微小環境を再構築することに関する現在の仮説を支持した。さらに、無遠隔転移生存期間のリスクを推定するためのマーカーを使用することもまた、実証された。さらに、それぞれＥＲ状態、ＨＥＲ２状態およびＫｉ６７状態を反映する乳癌関連のバイオマーカーシグネチャーを描写した。これらのバイオマーカーシグネチャーを、それぞれ独立した方法（ｍＲＮＡプロファイリング）および患者コホートを使用して裏付けた。総合すると、これらの分子ポートレートは、乳癌の改善された分類および予後判定を提供する。

実験手順
臨床的サンプル
この研究は、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎにおける地域倫理審査委員会によって承認された。５２人の乳癌患者を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＳＵＳ、Ｌｕｎｄ）から採用した。全ての臨床的記録は、組織サンプルのうち５０についてアクセス可能であった。これらのサンプルを、組織グレード１（ｎ＝９）、組織グレード２（ｎ＝１７）および組織グレード３（ｎ＝２４）に基づいて下位分割した。

トリプシン消化したヒト乳癌組織サンプルの調製
タンパク質を、５２の乳癌組織片から抽出し、引き続いて還元し、アルキル化し、トリプシン消化し、最後に、さらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。さらに、参照サンプルとして使用したプールされたサンプルを、全ての消化したサンプル由来の５μｌアリコートを合わせることによって生成し、さらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。サンプル調製についての詳細は、補足的実験手順に提供される。

ＣＩＭＳ−ｓｃＦｖ抗体の産生および磁気ビーズに対するカップリング
６つの短いＣ末端アミノ酸ペプチドモチーフに対する９つのＣＩＭＳ ｓｃＦｖ抗体（表Ｓ２）を、大腸菌培養物中で産生し、Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。次に、精製された抗体を、磁気ビーズにカップリングした。ｓｃＦｖの産生およびカップリングについての詳細は、補足的実験手順に提供される。

非標識定量ＧＰＳ実験
抗体コンジュゲート化ビーズの４つの異なるプール（ＣＩＭＳ−バインダーミックス１〜４と呼ばれる）を、等量の２つまたは３つの異なるバインダーを混合することによって作製した（表Ｓ２）。これらの抗体ミックスを、トリプシンサンプルに曝露させ、洗浄し、最後に、捕捉されたペプチドを溶出するために酢酸と共にインキュベートした。次いで、この溶出物を、さらなる清浄化なしにＭＳ分析に直接使用した。完全な研究を、６．５日間の４ブロック（１つのＣＩＭＳ−バインダーミックス／ブロック）に分割した２６日間のＭＳ器具使用時間を使用して実施した。全てのサンプルを、ＣＩＭＳ−バインダーミックス１つ当たり１回、個々に分析した。さらに、選択されたサンプルの三連捕捉を、連続ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実施として、各ブロック内で実行した。参照サンプルを、４つのブロック内および４つのブロック間で、経時的に繰り返し分析した（図Ｓ１）。合計２３８のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実施を実行し、ペプチド捕捉および関連する質量分析的分析についての全ての詳細は、補足的実験手順に提供される。

タンパク質の同定および定量
生成されたデータを、２つのソフトウェアパッケージＰｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥ（Ｈａｋｋｉｎｅｎら、２００９）およびＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＬＣ−ＭＳ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、ＵＫ）によって分析した。検索を、ペプチド同定を生成するための同定されたリバースヒットの数に基づいて推定された０．０１の偽発見率（ＦＤＲ）で、フォワードコンバインドおよびリバースコンバインドデータベース（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、２０１１年８月、合計７１３２４のデータベースエントリーを生じる）に対して実行した。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ−ＬＣ−ＭＳソフトウェア（ｖ４．０）を、特徴のアラインメント、同定（Ｍａｓｃｏｔ）および定量的値の生成のために使用した。検索パラメータおよびデータ処理に関する詳細は、補足的実験手順に提供される。

統計学的分析およびバイオインフォマティクス分析
Ｑｌｕｃｏｒｅ Ｏｍｉｃｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｖ（２．２）（Ｑｌｕｃｏｒｅ ＡＢ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、有意に上方調節または下方調節されたタンパク質（ｐ＜０．０１）を同定するために使用した。ｑ値を、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの方法（ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５）に基づいて生成した。主成分分析（ＰＣＡ）プロットおよびヒートマップを、Ｑｌｕｃｏｒｅで生成した。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、１つ抜き交差検証手順を使用してサンプルを分類するために使用された学習方法であり（ＣｏｒｔｅｓおよびＶａｐｎｉｋ、１９９５）、分析を、フィルタリングしていないデータおよびｐ値フィルタリングしたデータの両方について実行した。ＳＶＭ決定値および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して構築された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（Ｌａｓｋｏら、２００５）を、分類子の性能の測定値として使用した。さらに、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（ｖ １１９０４３１２、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を、タンパク質局在、潜在的なネットワーク相互作用、転写因子会合、および腫瘍発生との関連などの情報を抽出するために、有意に示差的に発現されたタンパク質に対して使用した。実験的に導出されたタンパク質シグネチャーを、組織グレード１、２および３、ＥＲ状態またはＨＥＲ２状態などの臨床的パラメータを有する乳癌組織についての公開された遺伝子発現データの大きいコホートに対して、ＧＯＢＯ検索ツール（Ｒｉｎｇｎｅｒら、２０１１）を使用して、ｍＲＮＡレベルで最後に検証した。

補足的実験手順
トリプシン消化したヒト乳癌組織サンプルの調製
タンパク質を、乳癌組織片から抽出し、使用まで−８０℃で貯蔵した。簡潔に述べると、組織片（約５０ｍｇ／サンプル）を、２回の振盪ラウンド間に液体窒素中での急速冷却を用いて２×３０秒間にわたりシェイカー中にボム（ｂｏｍｂ）を固定させることによって、液体窒素で予め冷却したＴｅｆｌｏｎ容器中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織粉末を、８Ｍ尿素、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ酢酸マグネシウムおよび４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液（ｐＨ８．５）中に収集した（２ｍｇ組織／３０μｌ緩衝液）。チューブを短時間ボルテックスし、５分毎にサンプルの短時間のボルテックスを行って氷上で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新たなチューブに移し、その後２回目の遠心分離を行った。緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して０．１５Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に交換し、その後、タンパク質濃度を、Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｃｒｏ Ｌｏｗｒｙ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して決定した。最後に、サンプルをアリコート化し、さらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。このタンパク質抽出物を解凍し、還元し、アルキル化し、トリプシン消化した。最初に、ＳＤＳおよびＴＣＥＰ−ＨＣｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を、それぞれ０．０２％（ｗ／ｖ）および５ｍＭになるように添加し、サンプルを、５６℃で６０分間還元した。このサンプルを、室温に冷却し、その後、ヨードアセトアミドを１０ｍＭになるように添加し、次いで、室温で３０分間アルキル化した。次に、配列決定グレードの改変トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を、タンパク質１ｍｇ当たり２０μｇで、３７℃で１６時間添加した。完全な消化を確実にするために、第２のアリコートのトリプシン（タンパク質１ｍｇ当たり１０μｇ）を添加し、チューブを、３７℃でさらに３時間インキュベートした。最後に、消化されたサンプルをアリコート化し、さらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。さらに、全ての消化されたサンプル由来の５μｌアリコートを含むサンプルを合わせることによって生成される別々のプールされたサンプルを調製し、さらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。潜在的な暫定的プロテオームカバー度を増加させるために、限定された臨床データが手元の表Ｓ１にある２つのサンプルを、個々におよびプールされたサンプル中に含めて、さらに分析した。

ＣＩＭＳ−ｓｃＦｖ抗体の産生および磁気ビーズに対するカップリング
９つのＣＩＭＳ ｓｃＦｖ抗体（６つの短いＣ末端アミノ酸ペプチドモチーフ（Ｍ−１、Ｍ−１５、Ｍ−３１、Ｍ−３２、Ｍ−３３およびＭ−３４と呼ばれる）に対する、クローン１−Ｂ０３、１５−Ａ０６、１７−Ｃ０８、１７−Ｅ０２、３１−００１−Ｄ０１、３２−３Ａ−Ｇ０３、３３−３Ｃ−Ａ０９、３３−３Ｄ−Ｆ０６および３４−３Ａ−Ｄ１０）を、ｎ−ＣｏＤｅＲ（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、２０００）ライブラリーから選択したが、これらは、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎの厚意により提供されたものである（表Ｓ２）。これらのＣＩＭＳ抗体のうち６つについての特異性および解離定数（低いμＭ範囲）が、最近決定された（Ｏｌｓｓｏｎら、２０１１）。これらの抗体を、１００ｍｌの大腸菌培養物中で産生し、Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でのアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。結合した分子を、２５０ｍＭイミダゾールで溶出させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して７２時間透析し、使用まで＋４℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって決定した。ｓｃＦｖ抗体の完全性および純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でＰｒｏｔｅｉｎ ８０チップを実施することによって確認した。精製されたｓｃＦｖを、以前に記載されたように（Ｏｌｓｓｏｎら、２０１１）、磁気ビーズ（Ｍ−２７０カルボン酸活性化型、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ）に個々にカップリングさせた。簡潔に述べると、１８０〜２５０μｇの精製されたｓｃＦｖのバッチを、約９ｍｇ（３００μｌ）の磁気ビーズに共有結合によりカップリングさせ（ＥＤＣ−ＮＨＳ化学）、さらなる使用までＰＢＳ中０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０中で４℃で貯蔵した。さらに、ブランクビーズ（即ち、カップリングプロトコルを用いるがｓｃＦｖを添加することなしに生成されたビーズ）のバッチを生成した。

非標識定量ＧＰＳ実験
コンジュゲート化ビーズの４つの異なるプール（ＣＩＭＳ−バインダーミックス１〜４と指定される）を、以下に従って、等量の２つまたは３つの異なるバインダーを混合することによって作製した：ミックス１（ＣＩＭＳ−３３−３Ｄ−Ｆ０６およびＣＩＭＳ−３３−３Ｃ−Ａ０９）、ミックス２（ＣＩＭＳ−１７−Ｃ０８およびＣＩＭＳ−１７−Ｅ０２）、ミックス３（ＣＩＭＳ−１５−Ａ０６およびＣＩＭＳ−３４−３Ａ−Ｄ１０）ならびにミックス４（ＣＩＭＳ−１−Ｂ０３、ＣＩＭＳ−３２−３Ａ−Ｇ０３およびＣＩＭＳ−３１−００１−Ｄ０１）（表Ｓ２）。各捕捉について、５０μｌのプールされたビーズ溶液を使用し、ｓｃＦｖ−ビーズは決して再使用しなかった。これらのビーズを、３５０μｌ ＰＢＳで予め洗浄し、その後、３５μｌ（ＰＢＳで希釈、および１ｍＭの最終濃度になるまでのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の添加）の最終容量中でのトリプシンサンプル消化に曝露させ、次いで、穏やかに混合しながらビーズと共に２０分間インキュベートした。次に、チューブを磁石上に配置し、上清を除去し、ビーズを１００μｌおよび９０μｌのＰＢＳでそれぞれ洗浄した（これらのビーズを、各洗浄工程間に新たなチューブに移し、合計洗浄時間は５分間であった）。最後に、捕捉されたペプチドを溶出させるために、これらのビーズを、９．５μｌの５％（ｖ／ｖ）酢酸溶液と共に２分間インキュベートした。次いで、この溶出物を、さらなる清浄化なしに質量分析に直接使用した。

Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ ２ＤＴＭ ｐｌｕｓ ＨＰＬＣシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）と連動したＥＳＩ−ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、全てのサンプルについて使用した。自動サンプラーが、ＧＰＳ生成された溶出物６μｌを注入した。ブランクＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実施を、各分析されたサンプル間で使用した。ペプチドを、プレカラム（ＰｅｐＭａｐ １００、Ｃ１８、５μｍ、５ｍｍ×０．３ｍｍ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上に１５μｌ／分の一定の流速でロードした。引き続いて、これらのペプチドを、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ Ｃ１８−ＡＱ樹脂（３μｍ Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ，ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が社内で詰められた１０μｍ融解石英エミッター、７５μｍ×１６ｃｍ（ＰｉｃｏＴｉｐＴＭ Ｅｍｉｔｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で分離した。ペプチドを、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む水中、３％（ｖ／ｖ）から３５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの３５分間の直線勾配で、３００ｎｌ／分の流速を用いて溶出した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ（ｍ／ｚ ４００から２０００）とＬＴＱ−ＭＳ／ＭＳ獲得との間を自動的に切り替えるようにデータ依存的様式で作動させた。４つのＭＳ／ＭＳスペクトルを、内部較正のためにロックマスオプション（ｌｏｃｋ ｍａｓｓ ｏｐｔｉｏｎ）（ｍ／ｚ ４４５．１２００２５）を使用して６０，０００ＦＷＨＭノミナル解像度設定において獲得した、各ＦＴ−ＭＳスキャン当たりの線形イオントラップにおいて獲得した。動的排除リストを、２０秒間の反復持続時間および１２０秒間の最大保持期間を有する２つの反復カウントを使用して、５００のエントリーに制限した。前駆体イオン電荷状態スクリーニングは、少なくとも２つの電荷を有するイオンについて選択し、未決定の電荷状態を有するイオンを棄却することが可能であった。正規化された衝突エネルギーを３５％に設定し、１回のマイクロスキャンを、各スペクトルについて獲得した。全てのサンプルを、ＣＩＭＳ−バインダーミックス１つ当たり１回、個々に分析した。さらに、プールされたサンプルの三連捕捉（この研究中の全てのサンプルに基づく）を、各ＣＩＭＳ−バインダーミックスについて実行し、より長い期間にわたるＭＳ分析のために区分けした（バインダーミックス１つ当たり、ＬＣ−ＭＳ配列実施順序の開始時、中間時および終了時）（図Ｓ１）。これは、ＣＩＭＳ−バインダーミックス１および４について可能であった。しかし、ＣＩＭＳ−バインダー−ミックス２および３の両方についての配列実施における半分以上で、分析的ＬＣカラムが取り換えられる必要があり（２回）、新たに取り換えられたカラム上で予定された最後のプール実施を実施することを決定して、いくつか（１１それぞれ９サンプル）がプール実施後に分析されるという結果を生じた。さらに、三連捕捉を、各ＣＩＭＳ−バインダーミックスについてサンプル（７２６７，８６１３）に対して実行した。ブランクビーズ、即ち、いずれのコンジュゲート化した抗体も有さないビーズを、潜在的なビーズバックグラウンド結合ペプチドを評価するために、プールされた消化物に曝露させた。２つのブランクビーズの「捕捉」から同定されたバックグラウンド結合ペプチドの少ない数に基づいて、全ての生成されたデータを、特記しない限り、フィルタリングしないままにした。

タンパク質の同定および定量
生成されたデータを、ＭａｓｃｏｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍの両方を使用して同定を生成するためにＰｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥを使用して最初に分析した。簡潔に述べると、全てのファイルを処理し、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ（ｖ ２．１７）プラットホームを使用してｍｚＭＬおよびｍｇｆ形式に変換し、以下の検索パラメータを、ＭａｓｃｏｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍに使用した：酵素：トリプシン；切断ミス（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）１；固定改変（ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：カルバミドメチル（Ｃ）；可変改変（ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：メチオニン酸化（Ｏ）。さらに、可変Ｎ−アセチルは、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ｔａｎｄｅｍ／）において検索が実行されるのを可能にした。３ｐｐｍのペプチド質量許容差および０．５Ｄａの断片質量許容差を使用し、検索を、フォワードコンバインドおよびリバースコンバインドデータベース（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、２０１１年８月、合計７１３２４のデータベースエントリーを生じる）に対して実行した。ＭａｓｃｏｔおよびＸ！Ｔａｎｄｅｍの両方ならびに結果として組み合わせにおける自動データベース検索（０．０１の偽発見率（ＦＤＲ）を用いる）を、ペプチド同定を生成するために使用した（同定されたリバースヒットの数に基づいて推定した）。Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥを使用して各サンプルについてタンパク質同定を生成する場合、タンパク質レベルに対して０．０１のＦＤＲを適用した。全ての生データは、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥ内に記憶される。

分析の時点では、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥは、定量的非標識プラグイン分析モジュールを提供しなかったので（開発が進行中）、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ−ＬＣ−ＭＳソフトウェア（ｖ４．０）を、全ての定量的値を生成するために使用した。簡潔に述べると、生データファイルを、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ−ＬＣ−ＭＳソフトウェアを使用する前にＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄソフトウェアパッケージを使用して、ｍｚＸＭＬに変換した。デフォルト設定および最小インプットと共に、内蔵式特徴発見ツール、Ｍａｓｃｏｔ検索ツールおよび合わせ画分（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）ツール（ＣＩＭＳ−バインダー−ミックス１、２、３および４）を使用した。最適な特徴アラインメントのために、それぞれＣＩＭＳ−バインダーミックスについてのプールされたサンプルの最初の注入実施（図Ｓ１）を、途中のプール実施が参照アラインメントファイルとして使用されるＣＩＭＳ−ミックス３実施を除き、参照アラインメントファイルとして使用した。ＣＩＭＳ−バインダーミックス１および２についての保持時間１０〜５０分間の間、ならびにＣＩＭＳ−バインダーミックス３および４についての１０〜４９分間の間の、アラインされ検出された特徴を、定量のために含めた。生成された正規化存在量値を抽出し、統計学的分析およびバイオインフォマティクス分析に使用した。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアの制限に起因して、同定は、Ｍａｓｃｏｔ検索のみに限定され、これは、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ ＳＥからＸ！Ｔａｎｄｅｍ生成された同定を、下流の定量的分析に含めなかったことを意味している。上記と同じデータベース（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、２０１１年８月、フォワードコンバインドおよびリバースコンバインドデータベース）および検索パラメータを使用し、０．０１のカットオフＦＤＲ値を適用した。

結果
この研究では、５２の粗製乳癌組織抽出物のセミグローバルタンパク質発現プロフィール（同定および定量）を、ＧＰＳを使用して解読した。組織グレード、ならびに他の重要な臨床的実験室パラメータ、例えばエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＨＥＲ２およびＫｉ−６７を反映する組織バイオマーカーシグネチャーを描写した。実験設計を概説するワークフロー全体を、図Ｓ１に示す。

タンパク質カバー度、ダイナミックレンジおよびアッセイ性能
ＧＰＳを使用して、合計２，１４０のタンパク質群を同定した（図１Ａ〜Ｃ）。この同定再現性は高く、５４．７％のペプチド重複を生じた（図Ｓ２Ａ）。比較して、プロジェクト全体を通じて反復して分析された参照サンプルは、４３．９％のペプチド同定重複を示した（図Ｓ２Ｂ）。同定されたタンパク質のうち、合計で１３８８が首尾よく定量され（図Ｓ３）、疾患関連マーカーについての検索において引き続いて使用した。７２６７サンプルについての定量のための総中央値ＣＶ値は、１０．８％であることが見出されたが（図２Ａ）、参照サンプルについての対応する総中央値ＣＶ値は２２．８％であった（図２Ａ）。注目すべきことに、６１のタンパク質に対応する、定量されたペプチドの約３８％（８３３ペプチド）が、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔａｌｓにおいて以前に報告されておらず（図１Ｄ）、これは、実質的な新規カバー度を示す。これは、検出されたペプチドの顕著な部分が、以前に報告されたものよりも短い、９アミノ酸対１１アミノ酸の中央値長さであるという事実（図１Ｅ）によって、さらに強調された。

全ての定量されたタンパク質について測定されたｌｏｇ_２−ＭＳ強度正規化存在量の分布を評価したところ、約１０^６のダイナミックレンジが示された（図Ｓ３Ａ）。ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓで頻繁に報告されたものから稀にしか報告されないものまでの範囲のペプチドが容易に検出されたという事実（図１Ｆ）によって、ＧＰＳアッセイによって生成された徹底的なカバー度がさらに示された。検出されたタンパク質を、次いで、主要な生物学的プロセスによってグループ分けしたところ、いくつかの群に分布することが見出された（図Ｓ３Ｂ）。興味深いことに、翻訳などのプロセスでグループ分けされたタンパク質（例えば、６０Ｓリボソームタンパク質）は、予測され得るように、有糸分裂などに関与する他のタンパク質（例えば、ＣＤＫ１）よりも高い全体的存在量を示すことが見出された。総合すると、このデータは、再現性のある様式で新規かつ深いカバー度を提供するＧＰＳの能力を示した。

組織グレードを反映するタンパク質発現プロフィール
最初に、本発明者らは、組織グレードを反映する組織バイオマーカーシグネチャーが解読できるかどうかを試験した。多変量分析（３群比較）を使用して、グレード１、グレード２およびグレード３のコホート間で有意に（ｐ＜０．０１、ｑ値＜０．２５）示差的に発現された４９のタンパク質を同定した。このシグネチャーに基づいて、ＰＣＡプロットは、組織グレード１および組織グレード３の腫瘍は良好に分離できたが、組織グレード２の腫瘍は、より不均一であるように見え、他の両方の群に広がっていたことを示した（図３Ａ）。漸増する組織グレードと共に上方調節された分析物および下方調節された分析物の両方のパターンが観察できた。例えば、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）、ミニ染色体維持複合体成分３（ＭＣＭ３）、ＤＮＡ複製ライセンス化因子ＭＣＭ７、ＡＴＰクエン酸シンターゼ（ＡＣＬＹ）、ポリアデニル酸結合タンパク質４（ＰＡＢＰＣ４）および６−ホスホフルクトキナーゼＣ型（ＰＦＫＰ）が、上方調節された組織マーカーの中にあった（図３Ａおよび図Ｓ４）。対照的に、ケラトカン（ＫＥＲＡ）、スポンジン（ＳＰＯＮ１）、アスポリン（ＡＳＰＢ）、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１（ＡＥＢＰ１）、キマーゼ（ＣＭＡ１）およびオルファクトメジン様タンパク質３（ＯＬＦＭＬ３）などの分析物は、下方調節された分析物、即ち、組織グレード１の腫瘍においてより高い発現レベルを示した分析物の中にあった（図３Ａおよび図Ｓ５）。

次いで、本発明者らは、４９のｐ値フィルタリングした（ｐ＜０．０１）バイオマーカーのリストが、組織グレードに基づいて組織を分類するために使用できるかどうかを試験した。この目的のために、本発明者らは、ＳＶＭを用いて１つ抜き交差検証を実施し、全てのサンプルについて決定値を収集した。次いで、この予測値を使用してＲＯＣ曲線を構築し、ＡＵＣ値を計算した（図３Ａ）。これらの結果は、組織グレードの腫瘍下位群が十分に分離できることを示したが（ＡＵＣ＝０．７５〜０．９３）、グレード２は再びより不均一に見えた。

次に、本発明者らは、多変量アプローチの代わりに２群比較を使用することの影響を調査して、示差的に発現されたマーカーを規定した（図Ｓ６）。予測され得るように、このデータは、個々の組織的下位群の分類が、ＡＵＣ値（ＡＵＣ＝０．９１〜０．９２）によって判断されるように改善されたことを示した。組織グレード１対組織グレード３に焦点を当てて、５０の有意に（ｐ＜０．０１）示差的に発現された分析物を描写し、そのうち３１が、以前の４９のバイオマーカーシグネチャーと重複した（図３および図Ｓ６Ｃを参照のこと）。組織グレード２を、グレード１対グレード３の凍結５０バイオマーカー比較上にマップした場合、これは、再び不均一な特徴を示し、両方のコホートに広がっていた（図３Ａおよび図Ｓ６Ｄを参照のこと）。

ＥＲ状態の影響
２４の組織グレード３の腫瘍のうち１４がＥＲ陰性と分類され、１７のＥＲ陰性サンプルのうち１４が実際にはグレード３腫瘍であったので、本発明者らは、発現プロフィールに対するＥＲ状態の直接的な影響を調査した。この仮説を検定するために、腫瘍を、ＥＲ陽性サンプル（ｎ＝３３）のみを使用して再試験した。多変量アプローチを採用すると、結果は、１８の有意に示差的に発現されたタンパク質（ｐ＜０．０１、ｑ値＜０．５１）が正確に示され、組織グレード１の組織対組織グレード３の組織が良好に分類できた（０．９のＡＵＣ値、データ示さず）ことを示した。著しいことに、１８の分析物のうち１６（例えば、ＡＳＰＮ、ＳＰＯＮ１、ＫＥＲＡ、ＡＣＬＹ、ＡＰＣＳおよびＰＡＢＰＣ４）は、元々解読された４９のバイオマーカーシグネチャーと重複することが見出された（図３Ａ）。従って、このデータは、４９のバイオマーカーシグネチャーが組織グレードを反映するという観察をさらに支持した。

さらに、本発明者らは、ＥＲ関連組織バイオマーカーシグネチャーが未解明であり得るかどうかも試験した。結果は、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性の乳癌組織が良好に分類できたこと（ＡＵＣ＝０．８２）（図３Ｂ）、および３９の示差的に発現された分析物（ｐ＜０．０１、ｑ値＜０．３２）が同定された（例えば、ＧＲＥＢ１、図３Ｂおよび図Ｓ７Ａ）を示した。従って、このデータは、ＥＲ関連組織バイオマーカーシグネチャーが検出されていたことを示した。

ＨＥＲ２／ｎｅｕ状態およびＫｉ６７状態を反映するタンパク質発現プロフィール
１つ抜き交差検証を使用してＨＥＲ２／ｎｅｕ状態に基づいて５２の乳癌組織抽出物を比較した場合、データは、２つのコホートが識別できたこと（ＡＵＣ＝０．９８）、および５つの示差的に発現されたマーカー（ｐ＜０．０１、ｑ値＜０．９）が同定されたこと（図３Ｃ）を示した。最も重要なことに、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）が、上方調節されたタンパク質の中に見出された（図３Ｃおよび図Ｓ７Ｂ）。

さらに、類似の様式で、Ｋｉ６７状態を反映する組織タンパク質シグネチャー（Ｋｉ６７陽性癌の核の２５％をカットオフとして使用した場合）もまた解読できた。合計で４５のタンパク質が、示差的に発現されることが見出された（ｐ＜０．０１、ｑ値＜０．２７）（図Ｓ８Ａ）。このデータは、Ｋｉ６７陽性腫瘍対Ｋｉ６７陰性腫瘍が分離できたことを実証した（ＡＵＣ＝０．８４）（図Ｓ８Ｂ）。従って、この結果は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ状態およびＫｉ６７状態の両方を反映するタンパク質発現プロフィールが正確に示されていたことを示した。

生物学的関連性
組織グレード１〜３を差別化する４９の組織バイオマーカーシグネチャーの生物学的関連性を、次いで試験した。この目的のために、各個々のタンパク質の細胞局在を、ＩＰＡソフトウェアを使用してマップし（図４Ａ）、ネットワーク関連の機能および潜在的な関連性を調査した（図４Ｂ〜４Ｃ）。細胞局在を反映する、主に下方調節されたタンパク質（細胞外マトリックス（ＥＣＭ））および上方調節された分析物（細胞膜、細胞質および核）のパターンが明らかになった。より重要なことに、上位ランクのネットワークは、ＤＮＡの複製、組換えおよび修復、細胞周期ならびにフリーラジカル消去と関連していることが見出され、２番目に高いランクのネットワークは、遺伝子発現、感染疾患および癌と関連していた。注目すべきことに、上位１位のネットワーク内のいくつかのタンパク質は、ＮＦ−ｋＢおよびＶＥＧＦと直接的または間接的に関連していた（図４Ｂ）。さらに、ＥＣＭタンパク質の大部分は、２番目のネットワーク内に正確に示され、いくつかのタンパク質は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦβ１）と直接的または間接的に関連していた（図４Ｃ）。従って、この結果は、組織グレードを反映する生物学的に高度に関連する組織バイオマーカーが同定されていたことを示した。

さらに、４９の組織バイオマーカーシグネチャーと転写因子ネットワークとの間の関連性もまた、ＩＰＡを使用して評価した（図Ｓ９）。注目すべきことに、ＲｂおよびＥ２Ｆ２が、上位の関連する転写レギュレーターの中に見出された（図Ｓ９Ａ）。比較して、組織バイオマーカーシグネチャーがＥＲ陽性腫瘍対ＥＲ陰性腫瘍を差別化する場合、エストロゲン受容体２（ＥＳＲ２）およびプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）が、上位の関連するレギュレーターの中に見出された（図Ｓ９Ｂ）。

候補乳癌進行シグネチャーの検証
組織グレード１〜３を識別化する４９の組織バイオマーカーシグネチャーを検証するための試みにおいて、データを、公に入手可能な直交乳癌ｍＲＮＡプロファイリングデータセットと比較した。検証コホートは１，８８１のサンプルから作成され、そのうち１，４１１には、グレード１（ｎ＝２３９）、グレード２（ｎ＝６７７）およびグレード３（ｎ＝４９５）を含む組織グレードを割り当てた。４９の組織バイオマーカーのうち４２は、ｇｅｎｅ ｅｎｔｒｅｚ ＩＤを使用して遺伝子発現データベースにマップでき、検証試験において引き続いてこれを使用した。

次いで、４２の組織マーカーを、グレード３対グレード１について観察された下方調節された（１５の分析物）または上方調節された（２７の分析物）タンパク質発現プロフィールに基づいて２つの群に分割し、対応するｍＲＮＡ発現プロフィールと比較した（図５）。下方調節されたタンパク質（例えば、ＳＰＯＮ１およびＫＥＲＡ）（図５Ａ、図Ｓ５、図Ｓ１０Ｉおよび図Ｓ１１Ｊ）および上方調節されたタンパク質（例えば、ＣＤＫ１およびＭＣＭ３）（図５Ｂ、図Ｓ４、図Ｓ１０Ａおよび図Ｓ１０Ｂ）の両方のタンパク質発現プロフィールを、ｍＲＮＡ発現レベルで良好に裏付けることが見出された。興味深いことに、上方調節されたマーカーは、チェックポイントおよびＭ期の遺伝子モジュールに対する高い相関を有するｍＲＮＡプロフィールを示すことが見出され（図５Ａ）、下方調節されたマーカーの群は、間質遺伝子セットモジュールに対する高い相関を有するｍＲＮＡプロフィールを示した（図５Ｂ）。

ＥＲ関連およびＨＥＲ２関連の組織バイオマーカーシグネチャーの検証
次いで、類似の様式で、上記と同じ公に入手可能な直交乳癌ｍＲＮＡプロファイリングデータセットを使用して、ＥＲ状態（図３Ｂ）およびＨＥＲ２状態（図３Ｃ）を反映する組織バイオマーカーシグネチャーを検証するための試みを行った。

ＥＲの場合、検証セットは、３９５のＥＲ陰性サンプルおよび１２２５のＥＲ陰性サンプルを含む、ＥＲ状態が割り当てられた１，６２０のサンプルで作成された。３９の組織バイオマーカーのうち３２が、遺伝子発現データベースにマップでき、検証において引き続いてこれを使用した。次いで、これら３２のマーカーを、観察されたタンパク質発現プロフィールに基づいて２つの群（１０の上方調節されたものおよび２２の下方調節されたもの）に分割し、対応するｍＲＮＡ発現プロフィールと比較した（図Ｓ１１）。いくつかの例外はあるが（例えば、補体Ｃ３、図Ｓ１１Ｆおよび図Ｓ７Ａ）、観察されたタンパク質発現プロフィールを、対応するｍＲＮＡ発現プロフィールで良好に裏付けた（図３Ｂ、図Ｓ７Ａおよび図Ｓ１１を参照のこと）。この文脈では、ＥＲ陽性腫瘍における上方調節されたタンパク質の群は、ステロイド応答遺伝子モジュールに対する高い相関を有するｍＲＮＡプロフィールを示すことが見出され、下方調節されたタンパク質の群は、免疫応答および基底の遺伝子セットモジュールに対する高い相関を有するｍＲＮＡプロフィールを示すことが見出されたことに留意するのが興味深かった（図Ｓ１１Ａ〜Ｓ１１Ｂ）。

ＨＥＲ２についての検証セットは、ＨＥＲ２陽性（ｎ＝１５２）、基底（ｎ＝３５７）、管腔−Ａ（ｎ＝４８３）、管腔−Ｂ（ｎ＝２８９）、正常様（ｎ＝２５７）および未分類（ｎ＝３４４）に分割される、１，８８１のサンプルから作成された。５つの組織マーカーのうち３つは、検証データセットにマップでき、引き続く評価においてこれを使用した（図Ｓ１２）。この結果は、タンパク質発現プロフィールと遺伝子発現プロフィールとが良好に相関したことを示し（図３Ｃ、図Ｓ７Ｂおよび図Ｓ１２を参照のこと）、観察をさらに検証した。

無遠隔転移生存期間を評価する
最後に、本発明者らは、組織グレードを反映する４９の組織バイオマーカーシグネチャーが、再び同じ公に入手可能な遺伝子発現データセットを使用して無遠隔転移生存期間（ＤＭＦＳ）のリスクを評価するためにも使用できるかどうかを試験した。４９の組織バイオマーカーのうち４２は、１０年のエンドポイント生存期間データを有する１３７９のサンプルにマップできた。これらのマーカーを、グレード３対グレード１における下方調節された（ｎ＝１５）マーカーおよび上方調節された（ｎ＝２７）マーカーを反映する２つの群に分割し、次いで、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を、これらの分析物の発現レベルに基づいて３つの分位（低い、中間および高い）中に遺伝子発現データを層別化することによって、１０年のエンドポイントでＤＭＦＳを用いて実行した（図Ｓ１３）。このデータは、特に、下方調節された分析物（主にＥＣＭ関連分析物）のコホートが、ＤＭＦＳのリスクを予測したことを示した。実際、これは、単一の下方調節された（例えば、ＫＥＲＡおよびＯＬＦＭ３）バイオマーカーまたは上方調節された（例えば、ＣＤＫ１）バイオマーカーを標的化することによって達成できた。

考察
この研究において、本発明者らは、乳癌におけるオーダーメイド医療に向けて次の一歩を踏み出す、乳癌における腫瘍進行を反映する最初の徹底的な多重化組織バイオマーカーシグネチャーを解読した。この成果は、本発明者らの最近の社内開発されたＧＰＳ技術を使用して達成された（Ｏｌｓｓｏｎら、２０１２；Ｏｌｓｓｏｎら、２０１１；Ｗｉｎｇｒｅｎら、２００９）。従って、９抗体のみに基づくアフィニティプロテオミクスおよび非標識ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを組み合わせることによって、本発明者らは、最大の乳癌組織プロテオーム研究のうち１つを示す５２の乳癌組織サンプルをプロファイリングし、１３８８のタンパク質を反映する詳細に定量されたプロテオミクスマップを首尾よく生成した。

より詳細には、高い特異性および感度で組織グレード１〜３の乳癌腫瘍を差別化する最初の４９個の構成部分を持つ組織バイオマーカーシグネチャーを描写した。このリストは、ｐ値基準をｐ＜０．０２に設定して、７９の示差的に発現されたマーカーに拡張できるが、ここでは、上位４９の分析物（ｐ＜０．０１）に対して考察を集中させた。分子プロフィールまたはタンパク質フィンガープリントは、グレード１の腫瘍およびグレード３の腫瘍はよりはっきりと異なるが、グレード２の腫瘍はより不均一であるという現在の見解を支持した（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、２００６）。シグネチャーを調査する場合、乳癌に関連することが既知の先験的な公知のマーカーおよび新規の候補バイオマーカーを同定した。技術的観点から、この新規のカバー度は、定量されたペプチドの大部分（約３８％）が、ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓデータベースにおいて以前に報告されていないという事実によって反映された（Ｄｅｕｔｓｃｈら、２００８）。ＧＰＳセットアップによって提供されるこの新規カバー度もまた、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓプロジェクトに対してこれら４９の分析物を検索した場合に明らかになった（Ｕｈｌｅｎら、２０１０）。Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓプロジェクトは、非重複ヒトプロテオームの５０％よりも多くを現在カバーしているが、４９の示差的に発現されたタンパク質のうち１３については、抗体も組織学染色も全く報告されていない。

ＥＲ状態単独は、乳房腫瘍における遺伝子の１０％よりも多くの発現に影響を与えることが示されており、生存期間に対して影響を有すると一般に考えられている。ＥＲ陰性乳癌は一般に、より高悪性度であり、抗エストロゲンベースの治療は効果がないので、さらなる標的化治療が緊急に必要とされている（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００３）。本発明者らは、適切な特異性および感度でＥＲ陽性腫瘍およびＥＲ陰性腫瘍を差別化することが可能な３９のタンパク質シグネチャーを同定した。興味深いことに、３９のマーカーのうち１１は、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓプロジェクトによって未だカバーされておらず、ＧＰＳ技術によって提供される新規カバー度を再び概説する（Ｕｈｌｅｎら、２０１０）。３９のマーカーのうちの１つであるＧＲＥＢ１は、内分泌治療に対する応答のための候補臨床マーカーおよび潜在的な治療標的として示唆されてきた（Ｈｎａｔｙｓｚｙｎら、２０１０；Ｒａｅら、２００５）。ＧＲＥＢ１は、エストロゲン刺激された細胞増殖を媒介するエストロゲン調節される遺伝子であり、ＥＲ陽性乳癌細胞および正常乳房組織では発現されるが、ＥＲ陰性サンプルでは発現されないことが最近報告されており、ＥＲの代理マーカーとしてのその潜在性を概説している（Ｈｎａｔｙｓｚｙｎら、２０１０）。ＧＰＳで生成されたタンパク質プロフィールは、この意見をさらに支持した（図Ｓ７Ａ）。

さらに、臨床的に規定されたＨＥＲ２陽性サンプルおよびＨＥＲ２陰性サンプルを識別することが可能な５つのタンパク質シグネチャーを解読した（図３Ｃ）。実際、低い存在量の受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２タンパク質）を同定し、定量したところ、示差的に発現されたマーカーの１つであることが見出された。従って、臨床的設定においてＧＰＳを使用してＨＥＲ２を測定することの潜在性は、現在使用されている古典的免疫組織化学または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ベースの検出システムに対する補完として想定され得る。最近の研究により、５つのＨＥＲ２ベースの試験のうち１つが不正確な結果を生じ得ることが示された（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００９）。さらに、Ｓ１００−Ａ９および増殖因子受容体結合タンパク質７（ＧＲＢ７）もまた、ＨＥＲ２陽性の規定されたサンプルの大部分において、増加した発現を示すことが見出された（図Ｓ７Ｂ）。高いＧＲＢ７発現は、高いＨＥＲ２発現と関連することが最近報告されており、減少した生存期間を有する乳癌患者のサブセットを規定するために使用された（Ｎａｄｌｅｒら、２０１０）。Ｓ１００遺伝子ファミリーは、低分子量カルシウム結合タンパク質をコードし、特定のＳ１００メンバーは、癌の進行、転移と関連しており、乳癌を有する患者における薬物耐性の予測マーカーとしての潜在性を有する（ＭｃＫｉｅｒｎａｎら、２０１１；Ｙａｎｇら、２０１１）。

最も重要なことに、組織グレードを反映するバイオマーカーシグネチャーだけでなく、ＥＲ状態およびＨＥＲ２状態を反映するバイオマーカーシグネチャーもまた、ＧＯＢＯツールを使用して独立データセットおよび直交法（ｍＲＮＡ発現レベル）を使用して、検証された（Ｒｉｎｇｎｅｒら、２０１１）。上方調節されたタンパク質および下方調節されたタンパク質の群を、既知の遺伝子セットモジュールに対する相関に基づいて評価したが、それは、これが重要な個々の遺伝子ではなく、遺伝子シグネチャーによって捕捉される機能的プロセスであることが多いからである（Ｗｉｒａｐａｔｉら、２００８）。間質、チェックポイントおよびステロイド応答についての遺伝子セットモジュールに対する有意な相関は、特に注目に値した（図５および図Ｓ１１）。さらに、組織学的な誘導されたタンパク質分析物を使用し、エンドポイントとしてＤＭＦＳを評価する場合、データは、特に下方調節されたＥＣＭタンパク質を使用した場合に、より悪い臨床アウトカムを明らかに示した。従って、独立したｍＲＮＡ検証は、報告された候補バイオマーカーシグネチャーおよび将来の乳房組織腫瘍分類におけるその潜在性に対する強力な支持を付け加えた。

総合すると、本発明者らは、臨床的プロテオミクス発見プロファイリングの試みに対する、本発明者らが最近開発したＧＰＳ技術プラットホームの適用可能性を実証した。組織グレード、即ち腫瘍の進行ならびに他の重要な臨床実験室パラメータ、例えばＥＲ状態、ＨＥＲ２状態およびＫｉ６７状態を反映する組織バイオマーカーシグネチャーが、この研究で報告されている；これらの新規組織バイオマーカーポートレートは、乳癌の分類および予後判定の改善を可能にする。

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Claims (9)

1. 下記工程：
   ａ）試験されるサンプルを準備する工程；ならびに
   ｂ）ＳＰＯＮ１、ＡＰＣＳ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＲＰＳ２７Ｌ、ＤＰＹＳＬ３、ＥＲＰ４４、ＲＡＰＧＥＦ１、ＡＣＬＹ、ＣＭＡ１、ＭＣＭ３、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＥＢＰ１、ＵＢＥ２Ｖ２、ＭＩＳ１８ＢＰ１、ＣＬＣＦ１、ＡＢＡＴ、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＴＩＰ１、ＯＬＦＭＬ３、ＣＤ３Ｇ、ＭＣＭ７、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＮＯＰ５６、ＲＲＰ８、ＳＬＴＭ、ＴＳＮ、ＥＣＨ１、ＰＲＥＬＰ、ＳＡＲＳ、ＲＰＳ２５、ＥＳＹＴ１、ＰＯＤＮ、ＲＰＲＤ１Ｂ、ＲＰＬＰ０Ｐ６、ＣＤ３００ＬＧ、ＳＵＧＴ１、ＰＯＴＥＦ、ＫＡＲＳ、ＮＤＵＦＳ２、ＨＮＲＮＰＨ２、ＣＡＬＵ、ＥＩＦ３Ｂ、ＳＬＣ４Ａ１ＡＰ、ＲＰＳ５、ＰＬＸＤＣ２、ＫＩＡＡ１３２４、ＭＲＣ１、ＲＰＲＤ１Ａ、ＳＨＭＴ２、ＣＣＴ４、ＴＳＳＣ１、ＩＫＺＦ３、ＵＢＥ２Ｑ１、ＰＳＭＤ９、ＳＮＲＮＰ７０、ＲＡＬＢ、ＡＣＯ２、ＭＹＯ１８Ａ、ＱＡＲＳおよびＫＥＲＡからなる群から選択される２つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量を測定することによって、試験サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程、
   を含み；
   ここで、工程（ｂ）で規定される群から選択される２つまたはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／または量が、乳癌関連の疾患状態を示し、
   ここで、乳癌関連の疾患状態は、乳癌細胞の組織学的グレードであり、
   ここで、工程（ｂ）で測定される２つまたはそれ以上のバイオマーカーは、ＳＰＯＮ１およびＫＥＲＡを含む、
   乳癌関連の疾患状態を決定する方法であって、下記工程：
   ｃ）組織学的グレード１の乳癌細胞を含むまたは組織学的グレード１の乳癌細胞からなる第１の対照サンプル、組織学的グレード２の乳癌細胞を含むまたは組織学的グレード２の乳癌細胞からなる第２の対照サンプルおよび組織学的グレード３の乳癌細胞を含むまたは組織学的グレード３の乳癌細胞からなる第３の対照サンプルを準備する工程；ならびに
   ｄ）工程（ｂ）において測定された、２つもしくはそれ以上のバイオマーカーの対照サンプルにおける存在および／もしくは量を測定することによって、対照サンプルのバイオマーカーシグネチャーを決定する工程、
   をさらに含み；
   工程（ｂ）において測定された、２つもしくはそれ以上のバイオマーカーの試験サンプルにおける存在および／もしくは量が：
   ｉ）第１の対照サンプルにおける存在および／もしくは量に相当する場合；
   ｉｉ）第２の対照サンプルにおける存在および／もしくは量とは異なる場合；ならびに／または
   ｉｉｉ）第３の対照サンプルにおける存在および／もしくは量とは異なる場合、
   乳癌細胞の存在が同定される、方法。
2. 工程（ｂ）が、２つまたはそれ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｂ）において２つまたはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することが、各々が表１中に同定されるバイオマーカーのうち１つをコードする核酸分子に対して選択的に結合することが可能な２つまたはそれ以上の結合性部分を使用して実行される、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程（ｂ）が、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. ２つまたはそれ以上の結合性部分が、検出可能な部分を含む、請求項４に記載の方法。
6. ＲＯＣ ＡＵＣ値によって決定される方法の断定精度（ｐｒｅｄｉｃａｔｉｖｅ ａｃｃｕｒａｃｙ）が、少なくとも０．５０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ＲＯＣ ＡＵＣ値によって決定される方法の断定精度が、少なくとも０．８０である、請求項６に記載の方法。
8. 工程（ｂ）が、アレイを使用して実行される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. インビトロで乳癌関連の疾患状態を決定するための、ＳＰＯＮ１、ＡＰＣＳ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＲＰＳ２７Ｌ、ＤＰＹＳＬ３、ＥＲＰ４４、ＲＡＰＧＥＦ１、ＡＣＬＹ、ＣＭＡ１、ＭＣＭ３、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＥＢＰ１、ＵＢＥ２Ｖ２、ＭＩＳ１８ＢＰ１、ＣＬＣＦ１、ＡＢＡＴ、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＴＩＰ１、ＯＬＦＭＬ３、ＣＤ３Ｇ、ＭＣＭ７、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＮＯＰ５６、ＲＲＰ８、ＳＬＴＭ、ＴＳＮ、ＥＣＨ１、ＰＲＥＬＰ、ＳＡＲＳ、ＲＰＳ２５、ＥＳＹＴ１、ＰＯＤＮ、ＲＰＲＤ１Ｂ、ＲＰＬＰ０Ｐ６、ＣＤ３００ＬＧ、ＳＵＧＴ１、ＰＯＴＥＦ、ＫＡＲＳ、ＮＤＵＦＳ２、ＨＮＲＮＰＨ２、ＣＡＬＵ、ＥＩＦ３Ｂ、ＳＬＣ４Ａ１ＡＰ、ＲＰＳ５、ＰＬＸＤＣ２、ＫＩＡＡ１３２４、ＭＲＣ１、ＲＰＲＤ１Ａ、ＳＨＭＴ２、ＣＣＴ４、ＴＳＳＣ１、ＩＫＺＦ３、ＵＢＥ２Ｑ１、ＰＳＭＤ９、ＳＮＲＮＰ７０、ＲＡＬＢ、ＡＣＯ２、ＭＹＯ１８Ａ、ＱＡＲＳおよびＫＥＲＡからなる群から選択される２つまたはそれ以上のバイオマーカーの使用であって、
   ここで、乳癌関連の疾患状態は、乳癌細胞の組織学的グレードであり、
   ここで、２つまたはそれ以上のバイオマーカーは、ＳＰＯＮ１およびＫＥＲＡを含む、使用。