JP6462100B2 - Rice bran enzyme treatment composition - Google Patents
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Description
本発明は、米糠を酵素処理して得られる組成物に関する。 The present invention relates to a composition obtained by enzymatic treatment of rice bran.
アンジオテンシン変換酵素（angiotensin converting enzyme、以下「ＡＣＥ」ともい
う）は、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する酵素である。アンジオテンシンＩＩは血管の収縮などにより血圧を上げる働きがある。ＡＣＥの働きを阻害すると、アンジオテンシンＩＩの生成が抑制され、ブラジキニンの分解抑制によるNO（一酸化窒素）増加により末梢血管を拡張し降圧作用を示すことが知られている。このため、ＡＣＥ阻害物質は、例えば血圧降下剤の有効成分として、あるいは血圧が高めの方に適した食品の関与成分として、用いられている。
Angiotensin converting enzyme (hereinafter also referred to as “ACE”) is an enzyme that converts angiotensin I into angiotensin II. Angiotensin II has a function of increasing blood pressure by contraction of blood vessels. When the action of ACE is inhibited, the production of angiotensin II is suppressed, and it is known that the peripheral blood vessels are dilated by increasing NO (nitrogen monoxide) due to suppression of the degradation of bradykinin and exhibit a hypotensive action. For this reason, the ACE inhibitor is used, for example, as an active ingredient of an antihypertensive agent or as an ingredient involved in food suitable for increasing blood pressure.
高血圧患者や血圧が高めのヒトが増加している昨今、安全で優れたＡＣＥ阻害を示す物質の需要はますます高まっており、研究開発も盛んに行われている。このような研究開発の一態様として、ＡＣＥ阻害を示すペプチドを探索することが行われている。例えば、特許文献１には、ゴマのサーモリシン（サーモライシンとも呼ばれる）による分解物から、ＡＣＥ阻害により血圧降下作用を有する３種のトリペプチドが見出されたことが記載されている。また例えば、特許文献２には、ブタ由来タンパク質のペプシンによる分解物から、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが見出されたことが記載されている。なお、サーモリシンのＣＡＳ．Ｎｏは9073-78-3である。また、EC番号（酵素番号、Enzyme Commission numbers）は、3.4.24.27である。
In recent years when hypertension patients and humans with high blood pressure are increasing, the demand for safe and excellent substances that exhibit ACE inhibition is increasing, and research and development are actively conducted. As one aspect of such research and development, searching for peptides showing ACE inhibition has been performed. For example,
このように、生物由来タンパク質素材を各種プロテアーゼで分解し、ＡＣＥ阻害活性を有する組成物やペプチドを探索する試みがなされているが、どの「タンパク質素材」を、どの「プロテアーゼ」で分解すれば、望ましいＡＣＥ阻害活性組成物又はペプチドを得られるのかは、全く予測がつかないため、実験でこれら「タンパク質素材」及び「プロテアーゼ」の組み合わせを一つ一つ試していくしか手がないのが現状である。 Thus, attempts have been made to decompose biological protein materials with various proteases and search for compositions and peptides having ACE inhibitory activity. However, if any “protein material” is decomposed with which “protease”, Since it is completely unpredictable whether a desirable ACE inhibitory active composition or peptide can be obtained, there is currently no choice but to try each combination of “protein material” and “protease” in an experiment. is there.
本発明は、安全で優れたＡＣＥ阻害を示す新規な物質又は組成物を見出すことを目的とする。 The present invention aims to find new substances or compositions that are safe and exhibit excellent ACE inhibition.
本発明者らは、米糠のサーモリシン処理物またはキモトリプシン処理物がＡＣＥ阻害を示すことを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。 The present inventors have found that a rice bran treated with thermolysin or a treated chymotrypsin exhibits ACE inhibition, and have made further improvements to complete the present invention.
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物。
項２．
ＡＣＥ阻害用組成物である、請求項１に記載の組成物。
項３．
血圧低下用組成物である、請求項１に記載の組成物。
項４．
米糠をサーモリシン又はキモトリプシンで処理して、ＡＣＥ阻害用組成物を製造する方法。
項５．
米糠をサーモリシン処理又はキモトリプシン処理して得られる、ＡＣＥ阻害用ペプチド。項６．
項１〜３の何れかに記載の組成物又は項５に記載のペプチドを含む医薬品、医薬部外品又は食品。
That is, the present invention includes, for example, the subject matters described in the following sections.
A composition for treating rice bran with thermolysin or chymotrypsin.
The composition according to
The composition according to
A method for producing a composition for ACE inhibition by treating rice bran with thermolysin or chymotrypsin.
Item 5.
An ACE-inhibiting peptide obtained by treating rice bran with thermolysin or chymotrypsin. Item 6.
Item 6. A pharmaceutical, quasi-drug or food containing the composition according to any one of
本発明に係る、米糠のサーモリシン処理組成物又はキモトリプシン処理組成物であれば、経口摂取することにより、好ましくＡＣＥ阻害効果（ひいては血圧低下効果）を得ることができる。米糠は長年食用として用いられてきた食材であり、安全性も高い。 The rice bran thermolysin treatment composition or chymotrypsin treatment composition according to the present invention can preferably have an ACE inhibitory effect (and thus a blood pressure lowering effect) when taken orally. Rice bran is a food that has been used for food for many years, and is also highly safe.
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
本発明は、米糠のサーモリシン処理組成物又はキモトリプシン処理組成物に係る。 The present invention relates to a thermolysin treatment composition or a chymotrypsin treatment composition for rice bran.
本発明に用いる米糠は、特に限定されないが、脱脂米糠であることが好ましい。また、圧搾により脱脂された脱脂米糠（圧搾脱脂米糠）であることが好ましい。特に、搗精後に得られた米糠（生米糠）を加熱することでリパーゼを失活させ、さらに圧搾処理することで得られる圧搾脱脂米糠が好ましい。また、脂質含量が５〜２０質量％の脱脂米糠を用いるのが好ましい。この範囲の脂質含量の脱脂米糠が、圧搾脱脂（特にリパーゼ失活処理後の圧搾脱脂）により好ましく得られる。 The rice bran used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a defatted rice bran. Moreover, it is preferable that it is the defatted rice bran (pressed defatted rice bran) degreased by pressing. In particular, a pressed defatted rice bran obtained by heating a rice bran (raw rice bran) obtained after milling to deactivate the lipase and further pressing the rice bran is preferable. Moreover, it is preferable to use defatted rice bran having a lipid content of 5 to 20% by mass. A defatted rice bran having a lipid content within this range is preferably obtained by pressing and degreasing (particularly, pressing and degreasing after lipase deactivation).
リパーゼ失活処理は、１８〜２０質量％程度の脂質を含有する米糠（生米糠）の酸化劣化を防ぐ目的で行われる。通常、生米糠を７０〜１３０℃程度で加熱焙煎することにより行われる。圧搾処理は、公知の圧搾法、例えば加熱焙煎処理され１００〜１１５℃程度になった米糠を低温連続圧搾機（例えば（株）テクノシグマ社より販売されているミラクルチャンバー）により圧搾することで行う。圧搾は、圧搾後の脱脂米糠中の脂質が５〜２０重量％程度となるまで行うことが好ましい。また、リパーゼ失活処理前の米糠や搾油後の脱脂米糠の水分含量を低減させる等の目的で乾燥処理を行っても良い。更に、特に圧搾処理にて得られた脱脂米糠は、さらに公知の方法により粉砕、分級し、粉末状とすることが好ましい。この際、粉末の平均粒子径は、５〜２００μｍが好ましく、１０〜１５０μｍがより好ましく、４０〜１００μｍが最も好ましい。なお、脱脂米糠中の脂質含量は、上述の通り５〜２０重量％が好ましく、７〜１５重量％がより好ましい。なお、市販されている、上記のような脱脂米糠を購入して用いることもできる。このような市販脱脂米糠としては、例えばハイブレフ（サンブラン株式会社製）を挙げることができる。 The lipase deactivation treatment is performed for the purpose of preventing oxidative degradation of rice bran (raw rice bran) containing about 18 to 20% by mass of lipid. Usually, it is performed by heating and roasting raw rice bran at about 70 to 130 ° C. The pressing process is performed by pressing a rice bran that has been heated and roasted to about 100 to 115 ° C. with a low-temperature continuous pressing machine (for example, a miracle chamber sold by Techno-Sigma Co., Ltd.). Do. The pressing is preferably performed until the lipid in the defatted rice bran after pressing is about 5 to 20% by weight. Moreover, you may perform a drying process for the purpose of reducing the water content of the rice bran before lipase inactivation processing, and the defatted rice bran after oil extraction. Furthermore, it is preferable that the defatted rice bran obtained by the pressing treatment is further pulverized and classified by a known method to form a powder. At this time, the average particle size of the powder is preferably 5 to 200 μm, more preferably 10 to 150 μm, and most preferably 40 to 100 μm. In addition, as above-mentioned, 5-20 weight% is preferable and, as for the lipid content in defatted rice bran, 7-15 weight% is more preferable. It is also possible to purchase and use commercially available defatted rice bran as described above. Examples of such commercially available defatted rice bran include Hiblev (manufactured by Sun Blanc Co., Ltd.).
本発明に用いるサーモリシンは公知の酵素であり、EC番号は3.4.24.27である。サーモ
リシンは、例えば、市販品を購入して用いることができる。例えば株式会社ペプチド研究所や和光純薬工業株式会社等から購入することができる。
The thermolysin used in the present invention is a known enzyme and has an EC number of 3.4.24.27. Thermolysin can be purchased and used, for example. For example, it can be purchased from Peptide Institute, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
本発明に用いるキモトリプシンは公知の酵素であり、EC番号はEC.3.4.21.1・EC.3.4.21.2である。キモトリプシンは、例えば、市販品を購入して用いることができる。例えば東京化成工業株式会社やロシュ・ダイアグノスティックス株式会社等から購入することができる。 Chymotrypsin used in the present invention is a known enzyme, and EC numbers are EC.3.4.21.1 and EC.3.4.21.2. Chymotrypsin can be purchased and used, for example. For example, it can be purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. or Roche Diagnostics Co., Ltd.
本発明のサーモリシン処理組成物を得るためのサーモリシン処理条件については、サーモリシンの活性が得られる限り特に制限はされず、適宜設定することができる。例えば、米糠及びサーモリシンを水に混合したうえ、３７℃前後で穏やかに撹拌しながら１０〜３０時間程度反応させることで処理を行うことができる。なお、当該処理後、サーモリシンを失活させてもよい。サーモリシンの失活処理は、例えば加熱（例えば１００℃、１０〜２０分程度の処理）等により行うことが出来る。なお、処理後にろ過を行って濾液を回収することで精製を行ってもよい。 The thermolysin treatment conditions for obtaining the thermolysin treatment composition of the present invention are not particularly limited as long as the thermolysin activity is obtained, and can be appropriately set. For example, a rice bran and thermolysin can be mixed with water, and it can be processed by making it react about 10 to 30 hours, stirring gently around 37 degreeC. In addition, you may deactivate thermolysin after the said process. The thermolysin deactivation treatment can be performed, for example, by heating (for example, treatment at 100 ° C. for about 10 to 20 minutes). In addition, you may refine | purify by filtering after a process and collect | recovering filtrates.
本発明のキモトリプシン処理組成物を得るために米糠をキモトリプシン処理するにあたり、その処理条件についてはキモトリプシンの活性が得られる限り特に制限はされず、適宜設定することができる。例えば、米糠及びキモトリプシンを水に混合したうえ、３７℃前後で穏やかに撹拌しながら１０〜３０時間程度反応させることで処理を行うことができる。なお、当該処理後、キモトリプシンを失活させてもよい。キモトリプシンの失活処理は、例えば加熱（例えば１００℃、１０〜２０分程度）等により行うことが出来る。なお、処理後にろ過を行って濾液を回収することで精製を行ってもよい。 In treating rice bran with chymotrypsin to obtain the chymotrypsin treatment composition of the present invention, the treatment conditions are not particularly limited as long as the activity of chymotrypsin is obtained, and can be set as appropriate. For example, rice bran and chymotrypsin can be mixed with water, and the reaction can be carried out by reacting for about 10 to 30 hours with gentle stirring at around 37 ° C. Note that chymotrypsin may be inactivated after the treatment. The inactivation treatment of chymotrypsin can be performed, for example, by heating (for example, about 100 ° C. for about 10 to 20 minutes). In addition, you may refine | purify by filtering after a process and collect | recovering filtrates.
本発明のサーモリシン処理組成物は、米糠をサーモリシンにより処理して得られる組成物であり、サーモリシンによる米糠タンパク質分解物（特にペプチド）を含む組成物である。当該組成物は、ＡＣＥ阻害活性を有する。当該組成物は、特に経口摂取により血圧上昇抑制効果若しくは血圧低下効果を奏する。また、当該組成物の形態は特に制限されない。例えば当該処理液そのものであってもよく、また当該処理液を蒸留して濃縮した濃縮物や、当該処理液を凍結乾燥した凍結乾燥処理物などであってもよい。なお、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を示す、サーモリシンによる米糠タンパク質分解物、特にペプチド、も包含する。当該ペプチドは、約１０ｋＤａ以下のものが特に好ましい。 The thermolysin treatment composition of the present invention is a composition obtained by treating rice bran with thermolysin, and is a composition containing a rice bran protein degradation product (especially a peptide) by thermolysin. The composition has ACE inhibitory activity. The composition exhibits an effect of suppressing blood pressure increase or an effect of lowering blood pressure, particularly when taken orally. Further, the form of the composition is not particularly limited. For example, the treatment liquid itself may be used, or a concentrate obtained by distilling and concentrating the treatment liquid, or a freeze-dried treatment product obtained by freeze-drying the treatment liquid. In addition, this invention also includes the rice bran protein degradation product by thermolysin which shows ACE inhibitory activity, especially a peptide. The peptide is particularly preferably about 10 kDa or less.
本発明のキモトリプシン処理組成物は、米糠をキモトリプシンにより処理して得られる組成物であり、キモトリプシンによる米糠タンパク質分解物（特にペプチド）を含む組成物である。当該組成物は、ＡＣＥ阻害活性を有する。当該組成物は、特に経口摂取により血圧上昇抑制効果若しくは血圧低下効果を奏する。また、当該組成物の形態は特に制限されない。例えば当該処理液そのものであってもよく、また当該処理液を蒸留して濃縮した濃縮物や、当該処理液を凍結乾燥した凍結乾燥処理物などであってもよい。なお、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を示す、キモトリプシンによる米糠タンパク質分解物、特にペプチド、も包含する。当該ペプチドは、約１０ｋＤａ以下のものが特に好ましい。 The chymotrypsin treatment composition of the present invention is a composition obtained by treating rice bran with chymotrypsin, and is a composition containing a rice bran protein degradation product (particularly a peptide) by chymotrypsin. The composition has ACE inhibitory activity. The composition exhibits an effect of suppressing blood pressure increase or an effect of lowering blood pressure, particularly when taken orally. Further, the form of the composition is not particularly limited. For example, the treatment liquid itself may be used, or a concentrate obtained by distilling and concentrating the treatment liquid, or a freeze-dried treatment product obtained by freeze-drying the treatment liquid. In addition, this invention also includes the rice bran protein degradation product by chymotrypsin which shows ACE inhibitory activity, especially a peptide. The peptide is particularly preferably about 10 kDa or less.
なお、本発明の米糠のサーモリシン処理組成物は、米糠をサーモリシン以外のプロテアーゼで予め又は更に処理したものは包含しない。サーモリシン以外のプロテアーゼ処理により、サーモリシン処理により生成したＡＣＥ阻害活性を有するタンパク質分解物（特にペプチド）がさらに分解され、ＡＣＥ阻害活性を喪失するおそれが考えられるからである。 The rice bran thermolysin treatment composition of the present invention does not include rice bran pretreated or further treated with a protease other than thermolysin. This is because it is considered that a protein degradation product (particularly a peptide) having an ACE inhibitory activity generated by the treatment with thermolysin is further degraded by a protease treatment other than thermolysin, and the ACE inhibitory activity may be lost.
同様に、本発明の米糠のキモトリプシン処理組成物は、米糠をキモトリプシン以外のプロテアーゼで予め又は更に処理したものは包含しない。キモトリプシン以外のプロテアーゼ処理により、キモトリプシン処理により生成したＡＣＥ阻害活性を有するタンパク質分解物（特にペプチド）がさらに分解され、ＡＣＥ阻害活性を喪失するおそれが考えられるからである。 Similarly, the rice bran chymotrypsin treatment composition of the present invention does not include rice bran pretreated or further treated with a protease other than chymotrypsin. This is because a proteolytic product (especially a peptide) having an ACE inhibitory activity generated by the chymotrypsin treatment may be further degraded by a protease treatment other than chymotrypsin, and the ACE inhibitory activity may be lost.
なお、上記の説明にも表れているように、本発明の米糠のサーモリシン処理組成物又はキモトリプシン処理組成物は、米糠の水抽出物をサーモリシン処理又はキモトリプシン処理して得られる組成物であってもよい。米糠の水抽出物は、米糠を水で抽出して得られる。米糠水抽出物は、好ましくは米糠を水で抽出処理して得られた液体組成物（水及び抽出された米糠成分からなる）である。当該米糠水抽出物に対して、サーモリシン又はキモトリプシンを加えて、処理することで、本発明の米糠のサーモリシン処理組成物又はキモトリプシン処理組成物を得ることもできる。水抽出条件は特に制限されないが、例えば１０〜５０℃程度の水に米糠を１〜２４時間程度浸漬（又は撹拌）する方法が例示される。 As shown in the above description, the rice bran thermolysin treatment composition or chymotrypsin treatment composition of the present invention may be a composition obtained by subjecting a rice bran water extract to thermolysin treatment or chymotrypsin treatment. Good. An aqueous extract of rice bran is obtained by extracting rice bran with water. The rice bran extract is preferably a liquid composition (consisting of water and extracted rice bran components) obtained by extracting rice bran with water. A thermolysin treatment composition or a chymotrypsin treatment composition of the present invention can also be obtained by adding thermolysin or chymotrypsin to the rice bran extract and treating it. Although the water extraction conditions are not particularly limited, for example, a method of immersing (or stirring) rice bran in water at about 10 to 50 ° C. for about 1 to 24 hours is exemplified.
本発明の米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物は、上述の通りＡＣＥ阻害活性を有し、特に経口摂取により血圧低下効果を奏することから、例えば、ＡＣＥ阻害用組成物、抗高血圧組成物、血圧低下用組成物等として用いることができる。また、特に医薬組成物、食品添加物、又は食品組成物として好適に用いることができる。米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物をそのまま用いてもよいし、薬学上又は食品衛生学上許容される担体等を適宜配合したうえで、製品として調製することもできる。本発明は、このような製品も包含する。すなわち、本発明は、上記米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物を含む医薬品、医薬部外品又は食品も包含する。なお、食品の中でも、特定保健用食品が好ましい。 The rice bran thermolysin or chymotrypsin treatment composition of the present invention has an ACE inhibitory activity as described above, and exhibits a blood pressure lowering effect particularly when taken orally. Thus, for example, a composition for ACE inhibition, an antihypertensive composition, a blood pressure lowering It can be used as a composition for use. In particular, it can be suitably used as a pharmaceutical composition, a food additive, or a food composition. The rice bran thermolysin or chymotrypsin treatment composition may be used as it is, or it may be prepared as a product after appropriately blending a pharmaceutically or food hygienically acceptable carrier. The present invention also includes such products. That is, this invention also includes the pharmaceutical, quasi-drug, or foodstuff containing the said rice bran thermolysin or chymotrypsin processing composition. Among foods, food for specified health use is preferable.
上記米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物は、当該医薬品又は医薬部外品には有効成分として、また、特定保健用食品には関与成分として、それぞれ含まれることが好ましい。また、上記米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物に含まれる特定の１又は複数のペプチドが、有効成分として医薬品又は医薬部外品に含まれてもよく、また、関与成分として特定保健用食品に含まれてもよい。 The above-described rice bran thermolysin or chymotrypsin treatment composition is preferably contained as an active ingredient in the pharmaceutical or quasi-drug, and as a participating ingredient in the food for specified health use. Moreover, the specific 1 or several peptide contained in the thermolysin or chymotrypsin processing composition of the said rice bran may be contained in a pharmaceutical or a quasi-drug as an active ingredient, and it is contained in the food for specific health as a participating ingredient. May be.
医薬品、医薬部外品又は食品に含まれる米糠のサーモリシン又はキモトリプシン処理組成物の量は、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば０．１〜９９質量％、好ましくは１〜９０質量％程度含まれ得る。 The amount of the thermolysin or chymotrypsin treatment composition of rice bran contained in a pharmaceutical product, quasi-drug or food is not particularly limited as long as the effect of the present invention is obtained, and is, for example, 0.1 to 99% by mass, preferably 1 to 90%. About mass% can be included.
なお、当該医薬品は高血圧の患者に用いることが好ましく、また、当該医薬部外品又は食品（特に特定保健用食品）は血圧が高めの方に用いることが好ましい。ここでの血圧が高めの方とは、いわゆる高血圧予備軍と呼ばれる人であり、より具体的には、収縮期血圧が１３０〜１３９ｍｍＨｇ又は拡張期血圧が８５〜８９ｍｍＨｇの方が好ましく例示される。 In addition, it is preferable to use the said pharmaceutical for a hypertensive patient, and it is preferable to use the said quasi-drug or food (especially food for specified health use) for the person whose blood pressure is high. Here, the person with higher blood pressure is a person called a so-called hypertensive reserve, and more specifically, systolic blood pressure is 130 to 139 mmHg or diastolic blood pressure is 85 to 89 mmHg.
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described, but the present invention is not limited to the following examples.
米糠酵素処理組成物の調製
次のようにして、米糠を酵素処理して、酵素処理物を得た。酵素処理物は、米糠のタンパク質が酵素により分解されて調製されたペプチドが複数種含まれる組成物である。
Preparation of rice bran enzyme-treated composition Rice bran was enzyme-treated as follows to obtain an enzyme-treated product. The enzyme-treated product is a composition containing a plurality of types of peptides prepared by degrading rice bran protein with an enzyme.
酵素としては、サーモリシン（株式会社ペプチド研究所；Code3504）、αキモトリプシン（東京化成工業株式会社；code C0342）、及びペプシン（SIGMA；「Pepsin from porcine gastric mucosa」）を用いた。 As the enzyme, thermolysin (Peptide Institute Inc .; Code 3504), α-chymotrypsin (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .; code C0342), and pepsin (SIGMA; “Pepsin from porcine gastric mucosa”) were used.
また、米糠としては、ハイブレフ（サンブラン株式会社製）を用いた。ハイブレフは、米糠を圧搾することより脱脂を行った圧搾脱脂米糠である。 As rice bran, Hiblev (manufactured by Sun Blanc) was used. Hiblev is a pressed defatted rice bran that has been defatted by pressing the rice bran.
まず、超純水に米糠を３０ｇ／Ｌとなるように混合し、これにサーモリシンを０．４ｇ／Ｌとなるように加えた。そして、当該混合物を３７℃インキュベータ内でスターラーを用いて２５０ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら２０時間インキュベートした。さらに、沸騰水浴に浸漬して１５分間処理し、酵素を失活させた。１５℃、７１５０ｒ．ｐ．ｍ．（８０００×ｇ）１５分で遠心分離処理を行い、得られた上清のｐＨをＮａＯＨを用いて７．０に調整し、フィルターペーパーＮｏ．２（アドバンテック社製）を用いて濾過して、得られた濾液を凍結乾燥した。当該凍結乾燥物を、米糠サーモリシン処理組成物として検討に用いた。なお、当該米糠サーモリシン処理組成物を、以下「ＨＢ−Ｔ」と記載することがある。 First, rice bran was mixed with ultrapure water at 30 g / L, and thermolysin was added at 0.4 g / L. Then, the mixture was placed in a 37 ° C. incubator using a stirrer at 250 r. p. m. Incubated for 20 hours with stirring. Furthermore, it was immersed in a boiling water bath and treated for 15 minutes to deactivate the enzyme. 15 ° C., 7150 r. p. m. (8000 × g) Centrifugation was performed for 15 minutes, and the pH of the obtained supernatant was adjusted to 7.0 using NaOH. 2 (manufactured by Advantech) and the resulting filtrate was lyophilized. The lyophilized product was used for the study as a rice bran thermolysin treatment composition. In addition, the said rice bran thermolysin processing composition may be described as "HB-T" below.
また、当該サーモリシン処理と同様にして、サーモリシンのかわりにキモトリプシン又はペプシンを用い、米糠のキモトリプシン処理組成物、及び米糠のペプシン処理組成物（凍結乾燥物）を得た。ただし、ペプシン処理を行う際には、ＨＣｌによりｐＨを２．０に調整した上で処理を行った。当該米糠キモトリプシン処理組成物を以下「ＨＢ−Ｃ」と記載することがある。また、当該米糠ペプシン処理組成物を以下「ＨＢ−Ｐ」と記載することがある。 Further, in the same manner as the thermolysin treatment, chymotrypsin or pepsin was used instead of thermolysin to obtain a rice bran chymotrypsin treatment composition and a rice bran pepsin treatment composition (lyophilized product). However, when pepsin treatment was performed, the treatment was performed after adjusting the pH to 2.0 with HCl. The said rice bran chymotrypsin processing composition may be described as "HB-C" below. In addition, the rice bran pepsin treatment composition may be hereinafter referred to as “HB-P”.
なお、サーモリシンを加えない以外は、当該サーモリシン処理と同様の処理を行い、組成物（凍結乾燥物）を得た。当該組成物を以下「Ｉ−ＨＢ」と記載することがある。 In addition, except having not added thermolysin, the process similar to the said thermolysin process was performed and the composition (freeze-dried material) was obtained. Hereinafter, the composition may be referred to as “I-HB”.
ゴマサーモリシン処理物の精製
上記特許文献１及び非特許文献１に記載されるように、ゴマのサーモリシン処理物は、ＡＣＥ阻害活性を有することが知られており、ゴマサーモリシン処理物が含まれる食品も上市されている。そこで、次のようにしてゴマサーモリシン処理物を精製し、対照として用いた。
Purification of processed sesame thermolysin As described in
市販されている「胡麻麦茶」（サントリー株式会社）７００ｍＬをナスフラスコへ入れ、凍結乾燥させて凍結乾燥物を２．４ｇ得た。当該凍結乾燥物をゴマサーモリシン処理物として用いた。以下当該凍結乾燥物を「ゴマ−Ｔ」と記載することがある。なお、上記非特許文献１によれば、「胡麻麦茶」７００ｍＬ中には約１．８ｇのゴマサーモリシン処理物（ペプチド）が含まれている。
700 mL of commercially available “sesame barley tea” (Suntory Co., Ltd.) was put into an eggplant flask and freeze-dried to obtain 2.4 g of a freeze-dried product. The freeze-dried product was used as a sesame thermolysin-treated product. Hereinafter, the lyophilized product may be referred to as “sesame-T”. In addition, according to the said
ＡＣＥ阻害活性の測定
各サンプルのＡＣＥ阻害活性の測定は、測定キット「ACE Kit - WST」（株式会社同仁
化学研究所）を用いて行った。当該キットは、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を酵素法により検出するものである
。操作は当該キットの取扱説明書に従い、ＡＣＥ阻害率を測定した。
Measurement of ACE inhibitory activity The ACE inhibitory activity of each sample was measured using a measurement kit “ACE Kit-WST” (Dojindo Laboratories). This kit detects 3-Hydroxybutyric acid (3HB) excised from 3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) by an enzymatic method. The operation was performed according to the instruction manual of the kit, and the ACE inhibition rate was measured.
＜ＨＢ−Ｔ及びゴマ−ＴのＡＣＥ阻害活性測定＞
ＨＢ−Ｔ及びゴマ−Ｔについて、それぞれＡＣＥ阻害活性を測定した（ｎ＝３）。それぞれの測定結果からＩＣ５０値を求めた。ＩＣ５０値の結果を図１に示す。なお、図１中のゴマ−Ｔの濃度は、ゴマペプチド量（上記「ゴマサーモリシン処理物の精製」における約１．８ｇ）を基準とした値である。当該結果から、ＨＢ−Ｔは、ゴマ−Ｔに比べ、ＡＣＥ阻害活性が有意に高いことがわかった。
<Measurement of ACE inhibitory activity of HB-T and sesame-T>
ACE inhibitory activity was measured for HB-T and sesame-T, respectively (n = 3). IC50 value was calculated | required from each measurement result. The results of IC50 values are shown in FIG. In addition, the density | concentration of sesame-T in FIG. 1 is a value on the basis of the amount of sesame peptides (about 1.8 g in said "purification of a processed sesame thermolysin"). From the results, it was found that HB-T has significantly higher ACE inhibitory activity than sesame-T.
＜ＨＢ−Ｔ、ＨＢ−Ｃ、及びＨＢ−ＰのＡＣＥ阻害活性測定＞
ＨＢ−Ｔ、ＨＢ−Ｃ及びＨＢ−Ｐを、それぞれ超純水に溶解させ、それぞれＡＣＥ阻害活性を測定した（ｎ＝３）。結果を図２に示す。また、それぞれの測定結果から求めたＩＣ５０値を表１に示す。
<Measurement of ACE inhibitory activity of HB-T, HB-C, and HB-P>
HB-T, HB-C, and HB-P were each dissolved in ultrapure water, and each ACE inhibitory activity was measured (n = 3). The results are shown in FIG. In addition, Table 1 shows IC50 values obtained from the respective measurement results.
当該結果から、特にＨＢ−Ｔ及びＨＢ−Ｃ（すなわち、米糠のサーモリシン処理組成物及びキモトリプシン処理組成物）は、優れたＡＣＥ阻害活性を有することがわかった。 From the results, it was found that particularly HB-T and HB-C (that is, a rice bran thermolysin treatment composition and a chymotrypsin treatment composition) have excellent ACE inhibitory activity.
ＨＢ−ＴのＡＣＥ阻害活性成分の分画
＜限外濾過による分画＞
ＨＢ−Ｔを超純水に溶解した溶液を、限外濾過により分画した。具体的には、ＨＢ−Ｔ水溶液（濃度：３ｍｇ／ｍＬ）１５ｍＬを限外濾過膜付き遠心カラム（Millipore社製ア
ミコンウルトラ 10,000NMWLメンブレン）に詰めて、遠心（4000×g, 25 ℃, 40 min）し、濾液及び膜上に残った液を回収した。当該濾液については、さらに限外濾過膜付き遠心カラム（Millipore社製アミコンウルトラ 3,000NMWLメンブレン）に詰めて遠心（4000×g
, 25 ℃, 40 min）し、濾液及び膜上に残った液を回収した。
Fractionation of ACE inhibitory active component of HB-T < Fractionation by ultrafiltration>
A solution in which HB-T was dissolved in ultrapure water was fractionated by ultrafiltration. Specifically, 15 mL of HB-T aqueous solution (concentration: 3 mg / mL) was packed in a centrifugal column with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 10,000NMWL membrane manufactured by Millipore) and centrifuged (4000 × g, 25 ° C., 40 min The filtrate and the liquid remaining on the membrane were recovered. The filtrate is further packed in a centrifugal column with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 3,000NMWL membrane manufactured by Millipore) and centrifuged (4000 × g
, 25 ° C., 40 min), and the filtrate and the liquid remaining on the membrane were recovered.
以上のようにして、ＨＢ−Ｔ水溶液を（i）約１０ｋＤａ以上画分、（ii）約１０〜３
ｋＤａ画分、及び（iii）約３ｋDａ以下画分、の３画分に分画した。これら（i）〜（iii）の画分について、それぞれを凍結乾燥し、超純水に溶解させ、上記と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。測定結果をグラフにしたものを図３に示す。また、各画分１２０μｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ阻害活性をグラフにしたものを図４に示す。当該結果から、ＨＢ−ＴのＡＣＥ阻害活性は、主に１０ｋＤａ以下の成分が有するものであることがわかった。
As described above, the HB-T aqueous solution was subjected to (i) a fraction of about 10 kDa or more, (ii) about 10 to 3
The fraction was fractionated into three fractions: a kDa fraction, and (iii) a fraction of about 3 kDa or less. These fractions (i) to (iii) were lyophilized and dissolved in ultrapure water, and the ACE inhibitory activity was measured in the same manner as described above. A graph of the measurement results is shown in FIG. FIG. 4 is a graph showing the ACE inhibitory activity in each fraction at 120 μg / mL. From the results, it was found that the ACE inhibitory activity of HB-T is mainly possessed by components of 10 kDa or less.
＜オープンカラムによる分画＞
メタノールに溶いた担体（フジシリシア化学社製 CHROMATOREX ODS DM1020T）をカラムに40 g詰めて、分画用カラムとした。当該カラムを２０％メタノールで置換し、少量（２ｍｌ程度）の超純水に溶解したＨＢ−Ｔ２．８ｇをアプライした。その後２０％メタノールで溶出を行った。
<Fractionation by open column>
40 g of a carrier dissolved in methanol (CHROMATOREX ODS DM1020T manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd.) was packed in a column to obtain a fractionation column. The column was replaced with 20% methanol, and 2.8 g of HB-T dissolved in a small amount (about 2 ml) of ultrapure water was applied. Thereafter, elution was performed with 20% methanol.
カラムから溶出した液を５ｍＬずつ試験管に回収した。計２０本（各試験管に回収された溶出液をＮＯ．１〜ＮＯ．２０とする）、合計１００ｍＬを回収した。この後、さらに４０％メタノールを５ｍＬカラムにアプライし、溶出液を５ｍＬ回収し、さらに１００％メタノールを５ｍＬカラムにアプライし、溶出液を５ｍＬ回収した。 5 mL of the solution eluted from the column was collected in a test tube. A total of 20 (the eluate collected in each test tube was designated as NO. 1 to NO. 20), a total of 100 mL, was collected. Thereafter, 40% methanol was further applied to a 5 mL column, and 5 mL of the eluate was recovered. Further, 100% methanol was applied to the 5 mL column, and 5 mL of the eluate was recovered.
そして、各フラクションを幾つかのグループ毎に合一し、エバポレーターによって蒸留した。残ったサンプル量の重量を測定した。結果を表２に示す。 And each fraction was united in several groups, and it distilled with the evaporator. The weight of the remaining sample amount was measured. The results are shown in Table 2.
例えば、表２において、ＮＯ欄の「４−５」はＮＯ．４及び５の回収溶出液を合一したことを示す。これをエバポレーターによって蒸留した結果、１．６８６８ｇのサンプルが残ったことを示し、当該重量は全回収サンプル量の５３．９％を占めることを示す。 For example, in Table 2, “4-5” in the NO column indicates NO. It shows that the recovery eluates of 4 and 5 were combined. As a result of distillation using an evaporator, 1.6868 g of the sample was left, and the weight represents 53.9% of the total recovered sample amount.
得られた各サンプル及びＨＢ−Ｔについて、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により、展開した。ＴＬＣプレートとしてHPTLC Silicagel 60 RP-18 WF254S（Merck Millipore）を用い、展開液として２０％メタノールを用いた。また、各サンプル及びＨＢ−Ｔを超純水に溶解（８０μｇ／ｍＬ）し、上記と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。ＴＬＣの結果を図５に、ＡＣＥ阻害活性測定結果を図６に示す。なお、図６の縦軸の数値は「ＡＣＥ阻害活性（％）」を示す。
Each sample and HB-T obtained were developed by TLC (thin layer chromatography).
また、Ｎｏ．１２〜１４及び１５〜２０のサンプルをさらに合一し（約０．１３ｇに相当）、適量の１０％メタノールに溶解させ分画用サンプルとした。さらに、メタノールに溶いた担体（フジシリシア化学社製 CHROMATOREX ODS DM1020T）をカラムに7.1 g詰めて
、分画用カラムとし、前記分画用サンプルをアプライし、１０％メタノールで溶出を行い、溶出液を５ｍＬずつ試験管に回収した（計１８本）。得られた各回収液を、エバポレーターで蒸留した後、展開液として１０％メタノールを用いた点以外は上記と同様にしてＴＬＣで展開した。結果を図７に示す。
No. Samples 12-14 and 15-20 were further combined (corresponding to about 0.13 g) and dissolved in an appropriate amount of 10% methanol to obtain a fractionation sample. Further, 7.1 g of a carrier dissolved in methanol (CHROMATOREX ODS DM1020T manufactured by Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.) is packed in a column to obtain a fractionation column, the fractionation sample is applied, and elution is performed with 10% methanol. 5 mL each was collected in a test tube (18 in total). Each recovered liquid obtained was distilled with an evaporator and then developed with TLC in the same manner as above except that 10% methanol was used as a developing liquid. The results are shown in FIG.
図７で示されるＴＬＣに供された各試験管（計１８本；ｎｏ．１〜１８）の溶出液について、ｎｏ．１〜ｎｏ．１８とし、ｎｏ．２及び３、ｎｏ．４のみ、ｎｏ．５〜８、ｎｏ．９〜１５、を合一し、それぞれサンプルＩＩ−２−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５−８、ＩＩ−９−１５とした。これら４種のサンプルをエバポレーターで蒸留後、超純水に溶解させ、上記と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した（終濃度は８０μｇ／ｍＬ）。なお、終濃度８０μｇ／ｍＬとは、ＡＣＥ阻害活性を上記キットで測定するにあたり、測定時に各サンプルの濃度が８０μｇ／ｍＬとなるようにしたということである。各サンプルの重量はエバポレーターで蒸留した際に測定した値である。ＩＩ−４、ＩＩ−５−８、ＩＩ−９−１５についてのＡＣＥ阻害活性測定結果を図８に示す。 About the eluate of each test tube (18 in total; no. 1 to 18) subjected to TLC shown in FIG. 1-no. 18 and no. 2 and 3, no. 4 only, no. 5-8, no. 9 to 15 were combined into Samples II-2-3, II-4, II-5-8, and II-9-15, respectively. These four types of samples were distilled with an evaporator and then dissolved in ultrapure water, and the ACE inhibitory activity was measured in the same manner as described above (final concentration was 80 μg / mL). The final concentration of 80 μg / mL means that the concentration of each sample was 80 μg / mL at the time of measurement when measuring the ACE inhibitory activity with the above kit. The weight of each sample is a value measured when distilled by an evaporator. The ACE inhibitory activity measurement results for II-4, II-5-8, and II-9-15 are shown in FIG.
血圧降下作用の検討
雄性の本態性高血圧ラット(SHR/Izm)に、ＨＢ−Ｔを４週間反復投与し、収縮期血圧を
測定して、ＨＢ−Ｔの血圧降下作用を検討した。
Examination of blood pressure lowering effect HB-T was repeatedly administered to male essential hypertensive rats (SHR / Izm) for 4 weeks, and systolic blood pressure was measured to examine the blood pressure lowering effect of HB-T.
具体的には次のようにして検討を行った。 Specifically, the examination was conducted as follows.
ＨＢ−Ｔを蒸留水に溶解させて１００ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬの投与サンプルを調製した。また、Ｉ−ＨＢを蒸留水に溶解させて１００ｍｇ／ｍＬの投与サンプルを調製した。また、カプトプリルを蒸留水に溶解させて０．５ｍｇ／ｍＬの投与サンプルを調製した。なお、これらの投与サンプルは用時調製した。また、カプトプリルはＡＣＥ阻害薬であり、ポジティブコントロールとして用いた。 HB-T was dissolved in distilled water to prepare 100 mg / mL or 10 mg / mL administration samples. Moreover, I-HB was dissolved in distilled water to prepare a 100 mg / mL administration sample. In addition, captopril was dissolved in distilled water to prepare a 0.5 mg / mL administration sample. These administration samples were prepared at the time of use. Captopril is an ACE inhibitor and was used as a positive control.
また、市販の雄性の本態性高血圧ラット(SHR/Izm)を購入し、７週間の馴化期間経過後
、収縮期血圧の平均値と標準偏差値が群間でおおよそ均等になるように、下記表３に示すように群分けを行った。
In addition, after purchasing commercially available male essential hypertensive rats (SHR / Izm), after the acclimatization period of 7 weeks, the mean value and standard deviation value of systolic blood pressure are approximately equal between groups. Grouping was performed as shown in FIG.
群１のラットには蒸留水を、群２のラットにはＨＢ−Ｔ（１０ｍｇ／ｍＬ）の投与サンプルを５０ｍｇ／ｋｇとなるように、群３のラットにはＨＢ−Ｔ（１００ｍｇ／ｍＬ）の投与サンプルを５０ｍｇ／ｋｇとなるように、群４のラットにはＩ−ＨＢ（１００ｍｇ／ｍＬ）の投与サンプルを５０ｍｇ／ｋｇとなるように、群５のラットにはカプトプリル（０．５ｍｇ／ｍＬ）投与サンプルを２．５ｍｇ／ｋｇとなるように、それぞれ投与した。
各サンプル投与は、１日１回、２．５ｍＬ用シリンジおよびテフロン製胃ゾンデを用いて、胃内に強制経口投与することで行った。
Distilled water for
Each sample was administered by daily oral gavage into the stomach using a 2.5 mL syringe and a Teflon gastric sonde once a day.
収縮期血圧の測定は、各ラットを加温器に入れて約３６〜３８℃に加温し、ラットの安定（心拍数の変動と外観上の動きで判断）を確認した後、血圧を3回測定してその平均値
を測定値とすることで行った。測定は、検討スタート日、及びスタート１週間後、２週間後、３週間後のサンプル投与前に行った。測定機器として非観血式自動血圧測定装置BP-98A（株式会社ソフトロン製）を用いた。
The systolic blood pressure is measured by placing each rat in a warmer and heating to about 36-38 ° C. After confirming the stability of the rat (determined by heart rate fluctuation and appearance movement), the blood pressure is 3 The measurement was performed once and the average value was taken as the measured value. The measurement was performed on the study start date and before
さらに、各群のラットについて、検討開始４週間後の血圧測定を行った後、１６時間以上絶食させた。そして、イソフルラン麻酔下にて腹部大動脈から全採血し（抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを使用）、安楽死させた。致死確認後に肺を採取した。また、採取した血液は遠心分離するまで氷中にて保存した。遠心分離は３，０００ ｒｐｍ、１５分、４℃にて行い、血漿を得た。得られた血漿は、８０℃以下にて保存した。また、採取した肺も８０℃以下で保存した。
Furthermore, blood pressure was measured for each group of
上記のようにして得られた各ラットの肺を用いて、益田の方法（Ｍａｓｕｄａ Ｏ．，
Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ．， ａｎｄ Ｔａｋａｎｏ Ｔ．， Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １２６， ３０６３−３０６８， １９９６）に準じた方法により酵素画分の抽出を行った。具体的には、各肺の左肺の下半分を切りとり、これを用いて４０００μｌ／１ｇの試料となるようにＢｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）／０．３Ｍ ＮａＣｌ）を加えた後、ホモジナイザーで４５秒間攪拌し、その上清を超遠心（４４０００×ｇ、９０ｍｉｎ、４℃）した。超遠心後に得られた上清を廃棄し、再度Ｂｕｆｆｅｒ５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）／０．３Ｍ ＮａＣｌ）を４０００μｌ／ｇの試料となるよう加え、超遠心（４４０００×ｇ、９０ｍｉｎ、４℃）した。その後、得られた沈殿物に対し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ含有上記Ｂｕｆｆｅｒを４０００μｌ／１ｇ試料となるよう加え、氷上で６０ｍｉｎ放置した。放置したサンプルを遠心（１０００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）し、得られた上清を酵素画分とした。
Using the lungs of each rat obtained as described above, Masuda's method (Masuda O.,
Nakamura Y. et al. , And Takano T. , The journal
of nutrition 126, 3063-3068, 1996), and the enzyme fraction was extracted. Specifically, the lower half of the left lung of each lung is cut out, and using this, Buffer (50 mmol / l Tris-HCl (pH 7.9) /0.3 M NaCl) is added to obtain a sample of 4000 μl / 1 g. After stirring for 45 seconds with a homogenizer, the supernatant was ultracentrifuged (44000 × g, 90 min, 4 ° C.). The supernatant obtained after ultracentrifugation was discarded, and
酵素分画のＡＣＥ活性をアンジオテンシン−１変換酵素活性測定キット（有限会社ライフ研究所）によって測定した。 The ACE activity of the enzyme fraction was measured with an angiotensin-1 converting enzyme activity measurement kit (Life Research Institute, Limited).
血圧測定結果を図９に、肺におけるＡＣＥ活性測定結果を図１０に、それぞれ示す。 The blood pressure measurement results are shown in FIG. 9, and the ACE activity measurement results in the lung are shown in FIG.
血中のトロポニンの測定
上記のようにして得られた各ラットの血漿中のトロポニン量を、MILLIPLEX Rat Cardiovascular Disease （CDV） Panel 1（メルクミリポア社製）を用いて測定した。結果を図１１に示す。なお、トロポニンは、心筋にかかる負荷の度合の指標として知られており、トロポニン量が多いほど心臓への負荷が大きいことを示す。（よって、トロポニン量が少なければ、抗高血圧効果が奏されていることが推定される。）
Measurement of Troponin in Blood The amount of troponin in the plasma of each rat obtained as described above was measured using MILLIPLEX Rat Cardiovascular Disease (CDV) Panel 1 (manufactured by Merck Millipore). The results are shown in FIG. Troponin is known as an index of the degree of load on the myocardium, and the greater the amount of troponin, the greater the load on the heart. (Thus, if the amount of troponin is small, it is estimated that an antihypertensive effect is achieved.)
処方例
以下に、ＨＢ−Ｔを用いた処方例を示す。
＜処方例１：飲料＞〔％は質量％を示す〕
ＨＢ−Ｔ ３ｇ（１．５％）
ライム果汁 ７ｇ（３．５％）
りんご透明濃縮果汁 １８ｇ（９％）
水 １７２ｇ（８６％）
合計 ２００ｇ（１００％）
なお、上記原料を撹拌混合した後、９５℃達温まで加熱殺菌した。
調製した飲料は、ｐＨが３．２４、Ｂｒｉｘが９．８４であった。
Formulation Example A formulation example using HB-T is shown below.
<Prescription Example 1: Beverage> [% indicates mass%]
HB-T 3g (1.5%)
Lime juice 7g (3.5%)
Apple transparent concentrated juice 18g (9%)
172 g (86%) of water
Total 200g (100%)
In addition, after stirring and mixing the said raw material, it heat-sterilized to 95 degreeC reach | attainment temperature.
The prepared beverage had a pH of 3.24 and a Brix of 9.84.
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