JP6456284B2 - 光増感物質とキトサンのコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

光増感物質とキトサンのコンジュゲートおよびその使用 Download PDF

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Description

本発明は、光増感剤とコンジュゲートした生体適合性のポリマーキトサン誘導体を含む新規のキトサン系コンジュゲート(例えばナノ担体)、および、光化学的内在化(PCI)および光線力学的療法(PDT)におけるその使用に関する。本発明はまた、病気特に癌の治療または予防およびワクチン接種目的における本発明の新規のコンジュゲートの使用に関する。
ナノ材料は、同組成のバルク材料と比較して小サイズであり、質量比に対する表面積が大きく、高活性であるなどの生理化学的特性を有する。これらのユニークな特性は、従来の医薬品において見られたいくつかの限界を改善および克服できる。ナノ材料を適用することによって、溶解度、温度拡散率、血液循環半減期、薬物放出性、免疫原性等の特性を改良する機会が与えられる。ここ20年、病気治療のために、ナノ粒子をベースとした多数のエージェント(剤)が治療適用および診断適用のために開発されてきた。
ナノ材料の使用は、より効果的でより便利な投与ルート、低毒性、副作用の最小化、生物学的利用能の向上、およびシステムにおける生成物のライフサイクルの延長を提供し得る。ナノ粒子またはナノ担体は、薬物送達システムとして、標的化送達および制御放出を提供することができる。更に、ナノ材料を診断目的で使用することもできる。ナノ材料は、例えば、確立された従来のアプローチでは検出できなかった前癌細胞、ウイルス断片、および疾患マーカの検出を可能にし得る。
現在、天然ポリマーおよび合成ポリマーが、リポソームと並んで文献にみられる主要なナノ粒子プラットフォームである(Peer et al., 2007, Natl., 2(12), p751-760)。他の一般的なプラットフォームとしては、デンドリマー、オイル・ナノエマルション、メソポーラスシリカナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子等が挙げられる。
ナノ担体であり得る本発明の新規のコンジュゲートは、キチン由来の生体適合性のポリマーキトサン誘導体を含む。キチン(ポリ(β−(1→4)−N−アセチル−D−グルコサミン))は天然多糖類であり、昆虫および甲殻類のサポート材料である。キチンは、セルロースの次に地球上で2番目に豊富な天然多糖類である。キチンは、通常蟹や海老の殻などから得られる。構造的には、キチンはセルロースと類似しているが、ポリマー骨格のC2位にヒドロキシル基の代わりにアセトアミド基を有する。
キトサンは最も重要なキチンの誘導体であり、通常アルカリ法によってアセチル基を除去して作られる。天然ポリマーの大部分は本来中性または酸性であるが、キトサンは高度に塩基性の多糖類である。C2位の窒素原子は、合成戦略によってポリマーを修飾する機会を提供するものであり、分子が例えば向上した溶解度および改良された生物学的特性などの特定の望ましい特性を持つように調整する。
キトサンポリマーは、様々な脱アセチル化度(DD)を有するβ−(1→4)結合D−グルコサミン単位からなり、直鎖状ポリマー鎖全体に渡って残存アセチル基がブロックでまたはランダムに分布している。酸性条件下でアミノ基は陽電荷であるため、キトサンは酢酸などの希釈酸に溶解する。DDは非常に可変であるが、100%になることはほぼない。DDに関するキチン対キトサンの特有の呼び方は定義されていないが、キトサンのDDは40〜100%の範囲で変化できる。分子量は最大2000kDaになり得るが、分子量が50kDa未満の場合はオリゴキトサンであると考えられる場合もある。
ここ数十年間、キチンおよびキトサンは、それらの医薬品における適用潜在性について注目されてきた。溶解度を促進し且つその物理的特性、化学的特性および生物学的特性を更に改良するために、様々なキトサン誘導体が設計および合成されてきた。
キトサン誘導体に加え、本発明のコンジュゲートは光増感剤も含む。光増感剤は、キトサンとコンジュゲートしている。従って、該コンジュゲートは、光増感に関与する方法において特定の用途を有する。
光増感は、吸収された光のエネルギーを伝達するプロセスである。光の吸収後、エネルギーは(選択された)反応物に伝達される。光増感物質は、光のエネルギーをII型化学反応に転換できる化合物である。これらのプロセスの高反応性最終生成物は、細胞毒性および血管毒性をもたらす。
光増感物質は、様々なメカニズムによって、直接的または間接的にその効果を発揮し得る。例えば、特定の光増感物質は、光によって活性化されると直接的に毒性を持つようになり、一方で、他の光増感物質は、毒性種(例えば一重項酸素などの酸化剤または他の酸素由来フリーラジカル)を生成するよう働く。毒性種は、細胞材料、および脂質、タンパク質、核酸などの生体分子に対して極めて高い破壊力を持つ。
公知の光増感剤としては、ポルフィリン類、フタロシアニン類、プルプリン類、クロリン類、ベンゾポルフィリン類、リソソーム向性の弱塩基類、ナフタロシアニン類、カチオン染色およびテトラサイクリン類またはそれらの誘導体など多くのものが存在する(Berg et al., (1997), J. Photochemistry and Photobiology, 65, 403-409)。他の光増感剤としては、テキサフィリン類、フェオホルビド類、ポルフィセン類、バクテリオクロリン類、ケトクロリン類、ヘマトポルフィリン誘導体、および5-アミノレブリン酸によって誘発される内因性光増感物質が挙げられる。下記に説明するように、本発明のキトサン系分子において、ポルフィリン類およびクロリン類、特にテトラフェニルポルフィリン(TPP)およびテトラフェニルクロリン(TPC)が採用されている。
ポルフィリン類は、最も広範囲にわたって研究されてきた光増感剤である。それらの分子構造は、メチン架橋を介して結合した4つのピロール環を含む。ポルフィリン類は、多くの場合、金属錯体を形成できる天然化合物である。例えば、酸素運搬タンパク質ヘモグロビンの場合、鉄原子がヘムBのポルフィリンコアに導入される。
クロリン類は、そのコアが、4つのメチン結合で繋がった3つのピロールと1つのピロリンとからなる大きな複素環式芳香環である。従って、ポルフィリンとは異なり、クロリンは大部分が芳香族であるが、環の外周全体としては芳香族性をもたない。
光増感剤は、光線力学的療法(PDT)および光化学的内在化(PCI)方法において用いられる。PDTは、全身にまたは局所的に光増感物質を投与する工程と、それに続いて、好適な波長の光を照射する工程とに関与する2工程プロセスである。細胞毒性効果を引き起こすためには、分子酸素の存在も必須である。これらの3つの要素(すなわち、光増感物質、光および酸素)がうまく組み合わさると、光線力学的反応が発生する。光線力学的反応は、細胞死および組織損傷を引き起こす細胞毒性種を発生させる。
PDTは、例えば癌の治療に用いられる。光線力学的反応からのラジカル中間体は、生体組織内の酸素に捕捉されて、一重項酸素(12)などの活性酸素種(ROS)を生成する。12は高い細胞毒性潜在性を有する短命な形の酸素である。よって、全身性副作用を大幅に防止する選択性の高い細胞毒性治療を達成できる。
PCIは、PDTと同じ原理に基づくが、(例えば低い光照射量を用いて)より少ない数のROSを生成することによって、ROSによる著しい細胞死なしで閉じ込めた薬物および高分子をエンドソームからサイトゾル内に放出させる。PCIにおいて、光励起が、リソソーム膜および/またはエンドソーム膜のROSを媒介した損傷選択、および閉じ込めた親水性薬物および高分子の放出を引き起こす。これにより、エンドサイトーシスによって取り込まれた分子は、リソソーム内で分解される前に、アクションの標的に辿り着くように放出される。
PCIは、多種多様な高分子および原形質膜を容易に透過しない他の分子の生物活性を促進することが示されてきた。これらの分子としては、例えばI型リボソーム不活性化タンパク質、イムノトキシン類、ブレオマイシン(Blenoxane(登録商標))およびドキソルビシンなどの化学療法剤、プラスミドをコードする遺伝子、およびオリゴヌクレオチド類が挙げられる。PCIは、対応するPDTと比べてより深い組織層で細胞毒性を誘発することが分かっている。固形腫瘍に選択的に蓄積される光増感物質により誘発される光活性化サイトゾル送達と標的治療とを組み合わせることによって、PCIは高い特異性を有することができ、抗腫瘍効能の促進にも寄与している。
臨床適用におけるPDT関連の共通する課題の一つは、皮膚光感作性および好ましくない光増感物質の生体内分布である。副作用を減少し、PDTにおける薬物動態を向上するための一つのアプローチとして、デンドリマー、リポソームおよび高分子ミセルなどのナノ担体が導入されてきた。
PCIおよびPDT方法で用いるナノ担体および光増感剤の改良が依然求められている。本発明は、このニーズに取り組む。本発明者は、光増感物質とキトサンのコンジュゲートをベースとした新規の化合物を開発した。下記実施例に記載の如く、インビトロおよびインビボの両方で驚くべき優れた効能を実証した新規の分子は、PCI方法において驚くべき高い効能を有する。
従って、第一の態様において、本発明は、光増感物質とキトサンのコンジュゲートを含む下記式(I)で表される化合物(例えば、ナノ担体)を提供する。
[前記式中、
nは、3以上の整数であり、
Rは、前記化合物においてn回出現する。
前記総Rn基の0.1%〜99.9%において、各Rは、
H,
但し、aは1、2、3、4または5であり;XはBr、ClまたはOHである。;
但し、各R1は、同一であっても異なっていてもよく、H、CH3および−(CH2c−CH3から選択され;bは1、2、3、4または5であり;cは0、1、2、3、4または5である(対イオンは、例えばCI-であり得る)。;
但し、YはO;S;SO2;−NCH3;または−N(CH2eCH3であり;d=1、2、3、4または5であり;e=1、2、3、4または5である。;
但し、R2は−(CH2h−CH3または−CO−(CH2h−CH3であり;fは1、2、3、4または5であり;gは1、2、3、4または5であり;hは0、1、2、3、4または5である。;
但し、R3は−(CH2j−CH3であり;iは1〜200の整数、好ましくは1〜50または1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、または10、20、30、40、50、60、70、80、90、100もしくは200以上の整数であり;jは0、1、2、3、4または5であり;kは1、2、3、4または5である。;
但し、R3は−(CH2j−CH3であり;iは上記定義の整数であり;jは0、1、2、3、4または5である。;
但し、R3は−(CH2j−CH3であり;iは上記定義の整数であり;jは0、1、2、3、4または5であり;各R1は同一であっても異なっていてもよく、H、CH3および−(CH2c−CH3から選択され;cは0、1、2、3、4または5である。;
但し、R3=−(CH2j−CH3であり;iは上記定義の整数であり;jは0、1、2、3、4または5である。;
但し、R3=−(CH2j−CH3であり;iは上記定義の整数であり;Lは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり;jは0、1、2、3、4または5である。;
および
但し、mは1、2、3、4または5である。;
から選択される基Aである。
前記総Rn基の0.1%〜99.9%において、各Rは、
から選択される基Bである。
ここで、pは0、1、2、3、4または5であり;qは1、2、3、4または5であり;rは1、2、3、4または5である。;
4は、
から選択される基である。;
(好ましくは、R4は、
から選択される。);
Wは、O、S、NHまたはN(CH3)から選択される基である。;
5は、−(CH2s−CO−;−(CH2s−Z−(CH2t−CO−および−(CH2s−Z−(CH2t−Z−CO−から選択される基であり;sは0、1、2、3、4または5であり;tは0、1、2、3、4または5である。;
Zは、NH、O、S、またはSO2である。;
6は、−CNおよびCH3から選択される基である。;
7は、
から選択される基である。;
Vは、CO、SO2、PO、PO2HまたはCH2から選択される基である。;
(好ましくは、R7は、
から選択される。);
8は、同一であっても異なっていてもよく、H、−OH、−OCH3、−CH3、−COCH3、C(CH34、−NH2、−NHCH3、−N(CH32および−NCOCH3から選択される基(o、mまたはp位で置換)である(好ましくは、各R8はHまたは少なくとも一つのR8はHではない)。;
各R基は、同一であっても異なっていてもよい。]
前記キトサンポリマーは、少なくとも3単位(n=3)有する。しかしながら、好ましくは、nは、10、20、50、100、500、1000以上、例えば10〜100または10〜50である。
上述の通り、コンジュゲートに採用された光増感物質は、ポルフィリンおよびクロリン誘導体、特にTPPa、TPCa1、TPCa2、TPPc、TPCc1およびTPCc2である。前記光増感物質誘導体R4またはR7は、好ましくはTPCa1、TPCa2、TPCc1またはTPCc、特に好ましくはTPCa1またはTPCa2である。
コンジュゲートのキトサン誘導体は、上記R基の置換度(DS)を種々異ならせることができる。例えば、1つ以上の上記R基は、有する場合、1%未満、好ましくは0.1〜1.0%、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5もしくは99.9%よりも大きいキトサン置換を有し得る。上記記載の如く、R基の基Aおよび基Bは、それぞれ総Rn基の0.1%〜99.9%(好ましくは0.5〜99.5%)である。好ましくは、基Aは、総Rn基の50%以上、好ましくは60、70、80、90または95%以上である。特に好ましくは、基Aは、総Rn基の50〜95%、例えば70〜95%である。好ましくは、基Bは、総Rn基の50%未満、例えば40、30、20、10または5%未満である。特に好ましくは、基Bは、総Rn基の5〜30%、例えば10〜25%である。
R基の基A(またはR基の基B)は、同一であっても異なっていてもよい。異なる基が存在する好適な態様において(例えば、R基の基Aにおいて)、各基の割合は変化し得る。例として、一つのR基が主成分として例えば(総Rn基の)75〜95%の範囲で存在し得るのに対し、他のR基は副成分として例えば(総Rn基の)0.1〜10%の範囲で存在し得る。しかしながら、別の場合では、主成分が低レベル(例えば50〜90%)で存在し、副成分が高レベル(例えば0.1〜50%)で存在し得る。好ましくは、存在するR基の基Aがキトサン分子のアセチル化を反映する場合、すなわちRが
である場合、それは総Rn基の1%未満で存在する。該R基は、本発明の化合物を生成するのに用いられる原料キトサン分子のアセチル化度(DA)を反映する傾向があり、そのため、その普及度(prevalence)は変化し得る。好ましくは、それは総Rn基の60%未満であり、好ましくは30%または20%未満、例えば総Rn基の0.1〜30%である。
R基のすべての基Aおよび基Bが占める総%は100%であり、上記の範囲内から選択が行われることが理解されるであろう。
使用した合成方法によっては、多少の不純物または別の生成物が低レベルで存在し得ることに気付くであろう。例えば微量の他のR基または残余保護基(例えばTBDMS)が最終生成物に残り得る。しかしながら、そのような微量の成分または化合物は、存在するにしても全体の1%未満(好ましくは0.1%未満)であり、機能性に影響を与えることはない。そのような微量の成分または化合物を含む化合物または組成物は、本発明の範囲内にある。
本明細書に記載する好適な態様において、選択されたR基の%は、総Rn基における割合を示す。そのような場合、%範囲が好ましい(例えば、製造におけるばらつきを反映するため)。好ましくはその範囲は5%である。すなわち、特定の構造を有するR基の基A:90%について述べる場合、これは該R基の基Aを85〜95%有する化合物にまで及ぶ。
好ましいR基の基Aは、
但し、好ましくは、各R1はCH3、bは1である。;
但し、好ましくはYは−NCH3であり、dは1である。;
但し、好ましくはjは0または1であり;iは3または6であり、kは1である。;
但し、好ましくはjは1であり、iは2である。;
但し、好ましくはjは0または1であり、iは2、4または5(例えば2または4)であり、Lは1である。;
但し、好ましくはmは1である。;
から選択される。
好ましくは、上記R基は、主成分(すなわち、総Rn基の75%を超える(上述の通り))としてまたは副成分(すなわち、総Rn基の10%未満(上述の通り))として存在する。好ましくは、基
は、副成分としてのみ存在する。
好ましいR基の基Bは、
但し、好ましくはpは1である。;
但し、好ましくはpは1であり、qは1である。;
但し、好ましくはpは1である。;および
但し、好ましくはpは1である;
から選択される。
特に好ましいR基の基Aは、
但し、好ましくは各R1はCH3であり、bは1である。;
但し、好ましくはYは−NCH3であり、dは1である。;
但し、好ましくはjは1であり、iは2である。;
但し、好ましくは、jは0または1であり、iは2、4または5(例えば2または4)であり、Lは1である。;
から選択される。
特に好ましいR基の基Bは、
但し、好ましくはpは1である。;
但し、好ましくはpは1であり、qは1である。;
但し、好ましくはpは1である。;
から選択される。
好ましいR基、および総Rn基におけるそれらの相対的な普及度を下の表に示す。表において、キトサンとコンジュゲートする様々なR基が示されている。R基の各タイプの優位性(predominance)を括弧内に記すが、記載値の±5%の範囲で変化し得る。R基の基Bには、光増感物質基R4またはR7が結合している。
特に好ましい本発明の化合物もまた、図1に示されている通りである。そこにR基の普及度が記載されているが、普及度は記載値の最大±5%の範囲で変化し得る。いずれの場合にも、光増感物質が結合しているR基は、低い記載普及度を有する。
本発明の化合物は、本明細書の実施例に記載の如く準備され得る。その合成方法としては、当該技術において標準的な手順が用いられる。当該手順は、当業者にとって馴染み深いものであり、下記の実施例において説明されている。関連するR基を提供するためのPEG化(PEGylation)およびTEG化(TEGylation)は、当該技術において標準的な方法に従って実施することができる。本発明はまた、例えば本願明細書に記載の実施例およびスキームに記載の如く、本発明の化合物を準備する方法にも適用される。
本発明の化合物は毒性が低く、そのため様々な医療適用に適している。
本発明の化合物は、PCI方法における使用に特に適している。本実施例に例示されているように、本発明の化合物は、分子の細胞内への内在化において驚くべき優れた効能を有する。実施例3において、本発明の化合物の効能は、増感物質単独(本ケースでは、PCI用に特別に設計され且つ癌治療のために臨床開発中の光増感物質TPCS2aが用いられた(Berg et al. 2011, Photochem. Photobiol. Sci., 10, p1637-1651))で達成される効能と比較して非常に優れていることが分かった。TPCS2aと比較すると、本発明の化合物は、少なくとも10倍活性である、すなわち該コンジュゲートは、10分の1の濃度で使用された場合であっても、TPCS2aを用いた観察よりも実質的により大きなトランスフェクションの促進をもたらした(図19および20を参照)。
光化学的内在化(PCI)の基本的な方法は、WO96/07432およびWO00/54802に記載されており、引用によって本明細書に援用される。要約すると、内在化対象分子および光増感剤(本ケースでは、本発明の化合物の一部としての光増感物質)を細胞に接触させる。光増感剤および内在化対象分子は、細胞内の細胞膜結合サブ区画(cellular membrane-bound subcompartment)に取り込まれる。細胞を好適な波長の光で曝露すると、光増感剤が活性化し、細胞内区画膜を破壊する反応種を直接的または間接的に生成する。これにより、内在化された分子はサイトゾル内に放出される。
これらの方法は、その他には、膜不透過性分子(または難透過性分子)を細胞のサイトゾル内に導入するためのメカニズムとして、その方法論(methodology)が例えば照射回数または光増感物質の量を減らすことによって過剰な毒性種の生成を回避するように適切に調整されていれば、広範囲な細胞破壊または細胞死を招かないような方法で、光化学効果を利用している。
このように、本発明はまた、分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法であって、導入対象分子と本発明の化合物とを前記細胞に接触させること、および、前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含む方法を提供する。一旦光増感剤が活性化されると、前記化合物を含む前記細胞内の細胞内区画は、これらの区画に含まれていた分子をサイトゾル内に放出する。内在化したい分子を内在化するために本発明の化合物を用いることも、本発明の一部を形成する。
PCIは、多くの異なる種類の分子を細胞内にトランスフェクションすることを可能にする。分子は、例えば、DNAもしくはアンチセンスDNA;オリゴ(デオキシ)ヌクレオチド;mRNA、siRNA、二本鎖(ds)RNA、一本鎖(ss)RNAもしくはアンチセンスRNA等のRNA;PNA、糖類;タンパク質類;ペプチド類;膜不透過性薬物;その他の膜不透過性分子、または上記分子の共有結合もしくは非共有結合の組合せから選択され得る。好ましくは、導入対象分子は、PCIの手助けなしでは顕著に内在化(すなわち、サイトゾル内に)されない。例えば、分子の内在化は、分子が適用された細胞のうち50%未満(例えば、30%または10%未満)の細胞が4時間の期間内に1つ以上の分子をサイトゾル内に内在化するように制限される。
内在化対象分子は、様々な結果を達成するよう選択され得る、例えば、標的遺伝子の発現を変化(例えば減少もしくは増加)させるように、または細胞の特性もしくは生存能力に影響力を持つように選択され得る。遺伝子発現に影響を与えるために、移動対象分子は、センスまたはアンチセンス・オリゴまたはポリヌクレオチド、例えばプラスミドまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNA分子などにおける遺伝子配列であり得る。このような方法は、癌などの病気および疾患を治療するまたは予防するのに有効であり、遺伝子療法の適用においても有効であろう。
本発明の方法は、内在化対象分子のサイトゾル内への転位(translocation)を実現する。しかしながら、理解されるであろうが、細胞と接触した一つ一つの分子をサイトゾル内に取り込みむことはできない。しかしながら、PCIまたは本発明の化合物が用いられていない背景水準と比較すると、顕著かつ改良された内在化を達成することができる。
本発明の方法は、分子の内在化を、その効果が例えば細胞の発現生成物においてまたは細胞に対する効果によって明らかに分かるレベルで可能にすることが好ましい。細胞と接触する分子の適切な濃度は、この目的を達成するよう調整され得る。例えば、いくつかの適用では、標的遺伝子(または導入された遺伝子)の発現を上昇もしくは低減させること、または細胞毒性分子の導入後に細胞死を達成することが望まれる。発現の低減または細胞死は、それぞれ、10%以上、例えば20、30、40、50、60、70、80もしくは90%以上の発現の低減(例えば、標的遺伝子によってコードされる1つ以上のタンパク質の発現において)、または、例えば24、48、72もしくは96時間(例えば24〜48時間)細胞とインキュベーションした後の細胞死であり得る。発現の上昇は、非内因性分子が使用された場合にはゼロになり得る既存レベルに対して評価されてもよく、発現の低減に関して上述されたレベルと数値的に同等のレベルの発現の上昇が達成され得る。同様に、(本発明の)化合物のタイプおよび/または濃度および照射時間を調整することによって、上述した発現の低減を達成することができる。
発現生成物のレベルを、例えば当該技術において公知の標準的な手法(ウェスタンブロッテイング等)を用いて細胞内のタンパク質レベルを決定することによって、測定することができる。タンパク質の低減レベルは、タンパク質の半減期に依存する。すなわち、既存のタンパク質は、半減期に伴い取り除かれる。細胞死は、任意の適切な手段によって決定され得る。
導入された遺伝子材料の効果を、例えば細胞内に存在するmRNAの発現レベルの観点からも測定することができる。例としては、この方法は、例えば24、48、72または96時間、具体的には24〜48時間、細胞とインキュベーションした後のmRNAレベルの上昇または低減が、遺伝子材料を加えていない標的または導入配列の同じタイムポイントでのmRNAレベルに対して、10%以上、例えば20、30、40、50、60、70、80または90%以上の上昇または低減を達成するよう実施され得る。これを、ハイブリダイゼーションまたはブロッテイング手法などの当該技術において公知の標準的な手法およびRT−PCRを用いて測定することもできる。
本明細書で用いられる「細胞」という用語には、あらゆる真核細胞(昆虫細胞および真菌細胞を含む)が含まれる。従って代表的な「細胞」としては、あらゆるタイプの哺乳類および非哺乳類の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞および原生動物が挙げられる。しかしながら、該細胞は、好ましくは哺乳類、例えば猫、犬、馬、ロバ、羊、豚、山羊、牛、マウス、ラット、ウサギ、モルモットからの細胞であり、最も好ましくはヒトからの細胞である。
本明細書で用いられているように、「接触(contacting)」とは、本発明の化合物を含む光増感剤および/または導入対象分子と細胞とを、細胞内への内在化に適した環境下、例えば好ましくは適切な栄養培地において37℃にて、例えば25〜39℃にて、互いに物理的に接触させることを指す。
光増感剤を活性化するための細胞の「照射」は、下記に説明するように、直接的または間接的に光を投与することを指す。従って、細胞は、光源を用いて例えば直接的に(具体的には、インビトロ、単細胞上)または間接的に(具体的には、インビボ、細胞が皮膚表面下にある場合、または細胞が細胞層の形をとり、全ての細胞に直接的に光が照射される(すなわち他の細胞によるスクリーンがない)わけではない場合)照射される。
光増感剤を活性化するための光照射工程は、当該技術において周知の手法および手順に従って実施され得る。光の波長および強さは、使用された光増感剤に応じて選択される。適した人工光源は、当該技術において周知の、例えば青色(450〜475nm)または赤色(620〜750nm)の波長光である。
本発明の方法における細胞の光曝露時間は変化し得る。分子のサイトゾル内への内在化効率は、光への曝露を最大まで増加させるにつれて高まる。最大を超えると、細胞損傷および細胞死が増加する。
好適な照射工程の時間の長さは、標的、光増感物質(本発明の化合物内)、標的細胞または標的組織に蓄積された光増感物質の量、および光増感物質の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの間のオーバーラップなどの要因に依存する。一般的に、照射工程の時間の長さは、数秒から数分または最大数時間のオーダーにあり、例えば好ましくは60分間まで、具体的には0.25もしくは1分間から30分間、例えば0.5〜3分間または1〜5分間または1〜10分間、具体的には3〜7分間、好ましくは約3分間、例えば2.5〜3.5分間である。短い照射時間、例えば1〜60秒間、具体的には10〜50、20〜40または25〜35秒も用いられ得る。
適切な光照射量は、当業者によって選択され得るが、これもまた、使用した光増感物質(本発明の化合物内)および標的細胞または標的組織に蓄積された光増感物質の量に依存する。例えば、光増感物質のフォトフリン(Photofrin)およびプロトポルフィリン前駆体の5−アミノレブリン酸を使用する癌の光線力学的治療に使用される典型的な光照射量は、高熱を避けるために、200mW/cm2未満のフルエンス範囲で50〜150J/cm2の範囲にある。可視スペクトルの赤色領域においてより高い吸光係数を有する光増感物質を用いる場合、通常光照射量は低い。PCI方法では、より低い照射量が用いられ得る。例えば、光照射量は75〜150mW/cm2のフルエンス範囲で5〜25J/cm2の範囲にある。更に、光増感物質の蓄積が少ない非癌性組織の治療では、必要となる総光量は、癌治療よりも実質的に高くなり得る。更に、細胞の生存能力を維持しなければならない場合、毒性種の過剰レベルの生成を避けなければならず、そのため関連パラメータが調整され得る。
本発明のPCI方法は、光化学的処理の性質上、すなわち光増感剤を活性化して毒性種を生成することを介するPDTの効果上、不可避的に細胞殺傷を多少引き起こすであろう。提案された使用によっては、この細胞死は重要ではなく、実際にいくつかの適用(例えば癌治療)においては有利になり得る。
一実施形態において、本発明は細胞死を達成する方法を提供する。前記方法は、本発明の化合物を前記細胞に接触させること、および、前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することを含む。細胞死(PDTによる)を達成させる場合、照射工程のタイミング、強さおよび波長を適切に選択して、最適に標的細胞の細胞死を達成する。
しかしながら、本発明のいくつかの実施形態において、例えば細胞毒性無しで遺伝子発現を抑制することが望ましい場合または細胞死が代わりに導入された分子によって達成される場合、細胞死が避けられる。例えば、いくつかの使用において、遺伝子発現の抑制、または一般的な細胞毒性が無い状態での発現、または細胞生存能力への効果を達成することは、例えばいくつかの遺伝子療法アプローチにおいて非常に有利である。本発明の方法は、光増感剤(本発明の化合物内)の濃度に応じて光照射量を選択することによって、生存細胞の比率または割合を調節するように改良され得る。このような手法もまた、当該技術において公知である。
生存細胞が望ましい適用において、実質上すべての細胞、あるいは大多数の細胞(具体的には、細胞の50%以上、より好ましくは60、70、80または90%以上)が殺傷されない。PCI治療に伴う細胞生存能力は、MTS試験などの当該技術において公知の標準的な手法によって測定することができる。
いくつかの適用において、光増感物質の活性化によって引き起こされた細胞死の量に関係なく、PCI効果が現れているいくつかの個々の細胞が、純粋な光化学的処理によっては殺傷されないように光照射量を調節することは重要である(もっとも細胞内に導入された分子に細胞毒性効果があれば、後にそれらの分子によって殺傷されるかもしれない)。
細胞毒性効果は、例えば細胞毒性分子(例えばゲロニン(gelonin)またはブレオマイシンなどの細胞毒性ペプチド)を導入することによって、または本発明の方法によって、例えば遺伝子アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNA分子などのエージェントを腫瘍細胞に内在化させる遺伝子療法を用いることによって、達成され得る。
本発明の化合物および方法は、例えば遺伝子療法において、特定の遺伝子産物の発現を抑制または上昇させるなどの様々な目的のために、インビトロまたはインビボ、例えばその場(in situ)での処理あるいは生体外(ex vivo)での処理に使用され、その後、該処理細胞を身体に投与するものであってもよい。
従って、本発明の更なる態様は、本発明の化合物またはコンジュゲートを含む組成物(例えば、医薬組成物)と、任意選択で別個に内在化対象分子とを提供する。該組成物が医薬組成物である場合、1つ以上の医薬的に許容される希釈剤または賦形剤を含む。
更なる態様において、本発明は、治療のための該化合物または組成物を提供する。
本発明は、本明細書に記載の本発明の化合物または組成物と、内在化対象分子とを含むキットを提供する。好ましくは、該キット(または製品)は、医療において、同時に、別個に、または順に使用され、好ましくは癌の治療、または以下に更に詳述されているようにワクチン接種のためのキットである。
従って、更なる態様は、対象における病気、疾患または感染、好ましくは異常なもしくは過剰な細胞成長が明らかである、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現が明らかである、特に好ましくは該病気が癌である場合の治療または予防に使用される、本明細書に定義された化合物または組成物と、任意選択で内在化対象分子とを提供する。対象における病気、疾患または感染を、本発明の化合物または組成物と、任意選択で内在化対象分子とを投与することによって治療するまたは予防する方法(本明細書に記載された使用に対応)も含まれる。好ましくは、該治療または予防は、本明細書に記載された方法を用いて達成される。
この方法はPCI方法を用いて実施され得る。または、細胞死が最終目的である場合、PCI方法またはPDT方法が使用され得る。
従って、PCI方法は上記記載の如く実施され得る、すなわち導入対象分子と該化合物または組成物とを対象における細胞に接触させ、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射することによって実施され得る。好ましくは、導入対象分子は細胞毒性分子、好ましくはブレオマイシンである。
PDT方法は、該化合物または組成物を対象における細胞に接触させ、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射して、細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することによって実施され得る。
或いは、本発明は、病気、疾患または感染の治療または予防のための薬剤調製における、本明細書に記載の化合物または組成物および任意選択で細胞内に内在化される分子の使用を提供する。また、該治療または予防のための薬剤調製における、該化合物または組成物の使用も提供する。該治療または予防は、本明細書に記載されている通りである。該病気、疾患または感染は、異常なもしくは過剰な細胞成長を示すもの、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現を示すもの、および/または細胞成長の減少から恩恵を受けるもの、または1つ以上の遺伝子発現の抑制もしくは上昇から恩恵を受けるものが好ましい。
本明細書では、異常または過剰とは、年齢および性別をマッチさせた正常な個々または同じ個体の他の正常な部分において、正常でないと考えられるものを指す。従って、異常な成長とは、癌、良性腫瘍を指し、過剰な細胞成長とは、光線性角化症、いぼ、ほくろなどの皮膚の状態を指し得る。本発明の方法が適用され得る癌としては、頭部癌、頸部癌、胆管癌、脳腫瘍、黒色腫、皮膚転移(異なる癌から)、肺癌、中皮腫、膵臓癌、胃癌、直腸癌、肛門癌、陰茎癌、外陰癌および食道癌が挙げられる。従って、薬剤は、癌の治療に使用され得る。内在化対象分子が使用される場合、それは抗癌性化学療法剤であり得る。
異常に上昇したまたは異常に抑制された遺伝子発現は、例えば内在化対象分子が遺伝子アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNA分子である場合、該対象における1つ以上の標的遺伝子の発現を変化させることによって治療され得る。好ましくは、該薬剤は、遺伝子療法のための薬剤、すなわち異常な遺伝子発現を特徴とするまたは1つ以上の遺伝子を抑制することから恩恵を受ける病気、疾患または感染を治療するまたは予防するための薬剤である。該発現の変化は、該発現の下方制御(down regulation)も含む。
PCI方法を使用すると、化合物(または本発明の組成物)および内在化対象分子を、同時にまたは順に患者(または対象)の細胞または組織に接触させることができ、該細胞は、該化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で照射される。照射は、細胞が該化合物および分子を該光増感剤を含む細胞内区画内に取り込む前、取り込む間または取り込んだ後に、好ましくは細胞が該輸送分子を細胞内区画内に取り込む前に、実施される。
また、細胞を治療して、それらを対象に投与する方法も意図している。従って、代替の態様において、本発明は、患者における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するための方法を提供する。該方法は、本発明の化合物(または組成物)と任意選択で内在化対象分子とを、上記記載の方法に従って、インビトロ、インビボまたは生体外で1つ以上の細胞に導入すること、および、必要に応じて(すなわち、トランスフェクションをインビトロまたは生体外で実施する場合)、該細胞を該患者に投与することを含む。従って、生成された細胞は、上記記載の治療または特定の使用で用いられ得る。
本明細書では、対象は動物であり、好ましくは哺乳動物、例えば牛、馬、羊、豚、山羊、ウサギ、猫、犬であり、特に好ましくはヒトである。
本明細書に定義される「治療(treatment)」は、治療前の症状に関して、治療される1以上の病気、疾患または感染の症状を軽減し、緩和し、または取り除くことを指す。「予防」は、病気、疾患または感染の症状の発現を遅らせる、または防ぐことを指す。
本発明の組成物もまた、本発明の方法によって分子がサイトゾル内に内在化されている細胞を含み得る。本発明は更に、療法用の、特に癌療法用または遺伝子療法用のこのような組成物にも適用される。
従って、本発明の他の更なる態様は、分子がサイトゾル内に内在化されている細胞または細胞集団を提供する。該細胞は、本発明の方法によって得ることができる。
本発明の他の更なる態様は、上記記載の療法、好ましくは癌療法または遺伝子療法に使用される組成物または薬剤を調製するためのそうした細胞または細胞集団の使用を提供する。
本発明は更に、本発明の細胞または組成物を患者に投与することを含む、患者の治療または予防の方法を提供する。すなわち、該方法は、上記記載の如く、分子を細胞内に導入する工程、および、このように調製された該細胞を該患者に投与する工程を含む。該方法は、好ましくは癌の治療または遺伝子療法(または、下記記載の如く、ワクチン接種)において使用される。
インビボでは、当該技術において一般的なまたは標準的な任意の投与方式、例えば、身体の内部および外部表面などに対する注射、注入、局所性投与、経皮投与が使用できる。インビボでの使用について、本発明は、光増感剤または内在化対象分子をそこに局在化させる細胞を含む任意の組織、固形組織ばかりでなく体液の存在場所を含めて、任意の組織に関して使用することができる。標的細胞により光増感物質が取り込まれ且つ光が適切に伝達される限りは、あらゆる組織を処置することができる。
従って、本発明の組成物は、医薬技術において公知の手法および手順に従って、例えば1つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を用いて簡便に作製され得る。本明細書に記載の「医薬的に許容される」とは、組成物の他の成分と親和性があり且つ受け取り側にとって生理的に受容できる成分を指す。組成物の性質、担体または賦形剤材料、投与量等は、選択および所望の投与ルート、治療目的などに応じて通常の方法で選択することができる。投与量も同様で、通常の方法で同様に決定することができ、分子の性質、治療目的、患者の年齢、投与の方式等に依存する。光増感剤に関しては、照射による膜破壊の潜在性/能力についても考慮されるべきである。
本発明の化合物および組成物の更なる使用は、ワクチン接種のプロトコルにおける使用である。なぜなら、PCI方法を使用して、抗原を細胞表面上に提示または発現させることができるからである。従って、PCIによって内在化対象分子が細胞のサイトゾル内に輸送および放出された後、分子は細胞表面に輸送され、そこで細胞の外側(すなわち細胞表面上)に提示されるであろう。この方法はワクチン接種の分野において特に有用である。この場合、ワクチン成分(すなわち抗原または免疫原)を表面提示のために細胞内に導入して、免疫応答を誘発、促進または増強してもよい。
従って、本発明は、抗原分子(例えば抗原)またはその一部を細胞表面上、好ましくは抗原提示細胞の表面上に発現させる方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の化合物および方法を用いて、PCIによって分子を細胞のサイトゾル内に導入することを含む。該分子またはその一部は、後に該細胞表面上に提示される。
もう一つの選択肢として、本発明は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法を提供する。該方法は、該抗原分子と本明細書に定義された化合物とを該細胞に接触させること、および、該化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を該細胞に照射することを含む。該抗原分子は細胞のサイトゾル内に放出され、免疫応答を刺激するのに十分な大きさの該抗原分子またはその一部は該細胞の表面上に提示される。
本明細書で使用する「発現」は、該分子の少なくとも一部が、該細胞を取り巻く環境に曝されアクセスできるように、該細胞の表面に、該抗原分子またはその一部が存在することを指す。「表面」での発現は、発現対象分子が、細胞膜および/または細胞膜に存在するまたは存在させた成分と接触している状態で達成され得る。
そのような抗原の提示は、有利な面として、結果的に免疫応答を刺激、好ましくは該抗原分子またはその一部を構成するまたは含む実体(entity)による次の攻撃に対する防御を与える免疫応答を刺激し得る。その結果、本発明は、ワクチン接種方法としての特別な有用性を見出した。
より具体的には、本発明の本態様は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法を提供する。該方法は、該抗原分子と本発明の化合物とを該細胞に接触させて、該分子および該化合物をそれぞれ該細胞の細胞内膜制限区画に取り込ませること、および、該細胞内区画の膜が破壊されるように、該化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を該細胞に照射して、細胞を殺傷することなく該分子を細胞のサイトゾル内に放出することを含む。該放出された抗原分子またはその一部は、後に該細胞表面上に提示される。
本明細書で使用する「破壊された(disrupted)」区画とは、その中に含まれる抗原分子が放出されるのに十分な程度に、永久的にまたは一時的にその区画の膜の完全性(integrity)が破壊されたことを指す。
或いは、本発明の本態様は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるのに使用される化合物または組成物も提供する。該化合物または組成物は、例えば、対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、好ましくは免疫応答を引き起こすまたは刺激するために、好ましくはワクチン接種の方法で使用される。該組成物は、好ましくは抗原分子と、本発明の化合物とを含む。好ましくは、該組成物は、医薬的に許容されるものであり、上記記載の医薬的に許容される賦形剤、担体または希釈剤も含む。好ましくは、該治療または予防は、本明細書に記載の方法を用いて達成される。
更なる態様において、本発明は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるのに使用される薬剤の調製における、抗原分子および/または本発明のエージェント(剤)の化合物の使用も提供する。これらは、例えば、対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、好ましくは免疫応答を引き起こすまたは刺激するために、好ましくはワクチン接種の方法で使用される。好ましくは、該治療または予防は、本明細書に記載の方法を用いて達成される。該抗原分子および本発明の化合物を投与することによる、対応の治療方法または予防方法も提供する。
本発明の他の更なる態様は、抗原分子と本発明の化合物とを含む組み合わせ製剤(combined preparation)としての製品(生成物)を提供する。該製品(生成物)は、該抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるために、同時に、別個に、または順に使用され、例えば、対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、好ましくは免疫応答を刺激するために使用される。
本発明の他の更なる態様は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるのに使用されるキットを提供する。該キットは、該抗原分子を収容する第1の容器と、本発明の化合物を収容する第2の容器とを含む。
本発明において、抗原分子は適切に免疫システムに提示されているときに該分子およびその一部が免疫応答を刺激することができるなら、どのような分子であってもよい。従って、抗原分子は、ワクチン抗原またはワクチン成分、例えばポリペプチドを含む実体であることが有利である。
そうした抗原または抗原ワクチン成分の多くは当該技術において公知であり、あらゆる種類の細菌性抗原もしくはウイルス性抗原、または原生動物もしくは高等生物等の任意の病原性種の抗原または抗原性成分を含む。伝統的に、ワクチンの抗原性成分は、生物全体(生きたもの、死んだもの、または弱毒化されたもの)、すなわち全細胞ワクチンを含み、更に、サブユニットワクチン、すなわち生物の特定の抗原性成分をベースとするワクチン(例えば、タンパク質、またはペプチド、または炭水化物でさえも)を含み、これらは幅広く研究され、文献に報告されてきた。このような任意の「サブユニット」ベースのワクチン成分を、本発明による抗原分子として使用してもよい。
しかしながら、本発明は、ペプチドワクチンの分野において、特別な有用性を見出した。従って、本発明による好適な抗原分子は、ペプチドである(本明細書で定義するペプチドは、短いペプチドと長いペプチドの両方(すなわち、ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド)、およびタンパク質分子またはそのフラグメント(例えば、5〜500アミノ酸、具体的には10〜250アミノ酸、例えば15〜75アミノ酸、あるいは8〜25アミノ酸のペプチド)を含む)。提示または発現される抗原分子の部分は、好ましくは抗原処理機構(antigen-processing machinery)によって細胞内に生成される部分を含む。しかしながら、それらの部分は、他の手段によっても生成され得る。例えば、適切な抗原設計(例えば、pH感受バンド)または他の細胞処理手段によって達成され得る。このような部分は、免疫応答を生じさせるのに十分な大きさ、例えばペプチドの場合、5アミノ酸を超える大きさ(具体的には10または20アミノ酸を超える大きさ)が好都合である。
膨大な数のペプチドワクチン候補が、例えばAIDS/HIV感染またはインフルエンザ、犬パルボウイルス、ウシ白血病ウイルス、肝炎などのウイルス性の病気および感染の治療についての文献に提案されてきた(例えば、Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruse et al., Proc. Natl. Sci. USA, 1994 91 (20), 9588-92; Kabeya et al., Vaccine 1996, 14(12), 1118-22; Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23) 9174-8を参照)。
同様に、細菌性ペプチドを、実際に他の生物または種由来のペプチド抗原のように使用してもよい。
病原性生物由来の抗原に加えて、ペプチドは、癌または多発性硬化症のような他の病気に対するワクチンとしての使用が提案されてきた。例えば、変異癌遺伝子ペプチドは、細胞毒性Tリンパ球の刺激における抗原の役割をする癌ワクチンとして、非常に期待がもてるペプチドである(Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451;Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327)。合成ペプチドワクチンもまた、転移性黒色腫の治療について評価されてきた(Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7)。多発性硬化症を治療するためのT細胞受容体ペプチドワクチンは、Wilsonら、J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28に記載されている。このようなペプチドワクチン成分のいずれも、実際に文献においてペプチドワクチンとして記載または提案されている任意のペプチドのように、本発明の抗原分子として用いてもよい。従って、ペプチドは、合成されたものであっても、単離したものであっても、生物由来のものであってもよい。
本発明の方法や使用などに供される細胞は、そのサイトゾル内に投与または輸送される分子をその表面上に発現または提示することができるものであれば、どのような細胞であってもよい。
細胞は、免疫エフェクター細胞、すなわち免疫応答に関与する細胞であることが都合がよい。しかしながら、他の細胞もまた免疫システムに抗原を提示するかもしれず、これらも本発明の範囲内にある。従って、本発明による細胞は、有利には、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、液性免疫および細胞媒介性免疫の両方を含め、免疫応答のいかなる局面または「アーム」に関わってもよく、例えば、抗体産生の刺激、または細胞毒性細胞もしくはキラー細胞(これらは細胞表面に「外来」抗体を発現する細胞を認識し破壊する(もしくは排除する))の刺激である。従って、「免疫応答を刺激する」という用語は、あらゆる種類の免疫応答およびそれらを刺激するメカニズムを含む。
細胞毒性細胞または抗体産生細胞の刺激は、抗原提示細胞による特定の様式、例えば、MHCクラスI提示によって刺激される細胞に対して、抗原が提示されることを要求する(具体的には、CD8+細胞毒性T細胞の活性化は、MHC−1抗原提示を要求する)。
抗原提示細胞は、当該技術において公知であり、文献に記載されており、これには例えばリンパ球(T細胞およびB細胞の両方)、樹状細胞、マクロファージなどが挙げられる。その他にも、例えば癌細胞(具体的にはメラノーマ細胞)が挙げられる。
抗原提示細胞によって抗原を細胞毒性T細胞(CTL)に提示するためには、抗原分子を抗原提示細胞のサイトゾルに入り込ませる必要がある(Germain, Cell, 1994, 76, 287-299)。本発明は、抗原分子をサイトゾル内に送達する効率的な手段を提供する。
抗原分子は、一旦光化学的内在化プロセスによって細胞のサイトゾル内に放出されると、細胞の抗原処理機構によって処理され、例えばクラスI MHCによって適切に細胞表面上に提示され得る。この処理は、抗原の分解、例えばタンパク質またはポリペプチド抗原のペプチドへの分解を伴い、次いで該ペプチドは提示のためにMHCの分子と複合化される。従って、本発明に基づき細胞表面上に発現または提示される抗原分子は、内在化(エンドサイトーシス)される抗原分子の一部またはフラグメントであり得る。
抗原は、エンドサイトーシスによって抗原提示細胞に取り込まれ、エンドサイトーシス小胞においてペプチドに分解され得る。これらのペプチドは、エンドソーム中でMHCクラスII分子に結合して細胞表面に輸送され、そこでペプチド−MHCクラスII複合体がCD4+Tヘルパー細胞によって認識され、免疫応答を引き起こすことになる。或いは、サイトゾル内のタンパク質が例えばプロテアソームによって分解され、TAP(抗原提示に関与するトランスポータ)によって小胞体内に輸送され得る。そこにおいて、ペプチドはMHCクラスI分子に結合し、細胞表面に輸送され得る(Yewdell and Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52: 1-123)。ペプチドが外来の抗原由来のものであれば、ペプチド−MHCクラスI複合体はCD8+細胞毒性T細胞(CTL)によって認識されるであろう。CTLは、ペプチド−MHC(HLA)クラスI複合体に結合して活性化され、増殖を開始してCTLのクローンを形成するであろう。標的細胞および細胞表面上に同じペプチド−MHCクラスI複合体を有する他の標的細胞は、CTLクローンによって殺傷され得る。外来抗原に対する免疫は、十分な量の抗原をサイトゾル内に導入できれば、確立されることができる(Yewdell and Bennink, 1992, supra;Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137)。これは、特に癌ワクチンの開発の基礎となる。
実用化への最大の課題の一つは、十分な量の抗原(または抗原の一部)をサイトゾル内に導入することである。これは、本発明によると解決され得る。
これらの方法は、上記記載の如く、インビトロまたはインビボで使用され得る。
従って、本発明の更なる態様は、抗原分子またはその一部をその表面上に発現する抗原提示細胞を提供する。当該細胞は、上記に定義された方法によって得ることができる(または得られる)細胞である。本発明の他の態様は、そうした細胞の集団または培養、特に生存能力があり機能性が損なわれていないそうした細胞の集団または培養を提供し、また、特に免疫応答を刺激するための、とりわけCTLを刺激するためのそうした細胞(または、細胞の集団もしくは培養)の療法における使用も提供する。
また、免疫応答を刺激するための、特にCTLを刺激するための薬剤(例えばワクチン組成物)の調製におけるそうした細胞(または、細胞の集団もしくは培養)の使用を提供する。
本発明を、以下の限定されない実施例において、以下の図面を参照しながら更に詳述する。
図1(図1−1及び図1−2)は、特に好ましい本発明の化合物を示す(TPC=テトラフェニルクロリン)。 図1(図1−1及び図1−2)は、特に好ましい本発明の化合物を示す(TPC=テトラフェニルクロリン)。 図2は、スキーム1:化合物5を合成するための合成ルートを示す。試薬と条件:(a)プロピオン酸、還流、1時間(20%);(b)NaNO2(1.8eq)、TFA、室温、3分、67%);(c)SnCl2・2H2O、濃縮HCl、60℃、1時間(88%);(d)臭化ブロモアセチル、Et3N、CH2Cl2、室温、1時間(64%);(e)ピペラジン、CH2Cl2、室温、1時間(94%)。 図3は、スキーム2:N−修飾キトサン誘導体(TPP−CS−TMAおよびTPP−CS−MP)の合成を示す。ここで、Aは第1バッチの化合物を示し、Bは第2バッチの化合物を示す。試薬と条件:(a)MeSO3H/H2O、10℃−室温、1時間、(90%);(b)TBDMSCl、イミダゾール、DMSO、室温、24時間(96%);(c)臭化ブロモアセチル、Et3N、CH2Cl2、−20℃、1時間(92%);(d)化合物5、すなわち、TPP−NH−Pip(0.1または0.25eq)、Et3N、CHCl3、室温、2時間(92−90%);(e)NMe3または1−メチルピペラジン、CHCl3、室温、24時間;(f)TBAF、NMP、55℃、24時間、または、濃縮HCl/MeOH、室温、24時間。 図4は、TPPp0.1−CS−MP0.9(18A)の合成における全ての中間体および最終化合物の代表的なFT−IRスペクトルのオーバーレイを示す:(A)TPP−NH−Pip 5;(B)BrA−DiTBDMS−C 9;(C)TPPp0.1−CH2CO−DiTBDMS−C 10A;(D)TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9 14A;(E)TPPp0.1−CS−MP0.9 18A。 図5は、TPPp0.1−CS−MP0.9(18A)の合成における全ての中間体および最終化合物の代表的な1H NMRスペクトルのオーバーレイを示す:(A)DiTBDMS−C 8;(B)BrA−DiTBDMS−C 9;(C)TPPp0.1−CH2CO−DiTBDMS−C 10A;(D)TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9 14A;(E)TPPp0.1−CS−MP0.9 18A。 図6は、水性:CHCl3二相系に溶解した化合物の分配(partitioning)を示す。(A)TPP(p−NH21 3;(B)TPPNH−Pip 5;(C)TPPp0.25−CS−TMA0.75 17A;(D)TPPp0.25−CS−MP0.75 19A。上部が水相である。 図7は、TPPp0.25−CS−TMA0.75(17B)およびTPPp0.25−CS−MP0.75(19B)の代表的な最終化合物の固体13C NMRスペクトルを示す。 図8は、(I)溶媒中のTPPp0.25−CS−TMA0.75 17Bの1H NMRスペクトルを示す:(A)DMSO−d6:D2O(98:2);(B)DMSO−d6:D2O(75:25);(C)DMSO−d6:D2O(50:50);(D)DMSO−d6:D2O(25:75);(E)DMSO−d6:D2O(0:100);(II)共溶媒中の定濃度(0.3mg/L)のTPPp0.25−CS−TMA0.75 17BのUV−vis吸収スペクトルのオーバーレイを示す:(A)DMSO:H2O(100:0);(B)DMSO:H2O(75:25);(C)DMSO:H2O(50:50);(D)DMSO:H2O(25:75);(E)DMSO:H2O(0:100);(III)一定の吸光度(0.85−0.90;データ図示せず)であり、共溶媒中419nm(3-3 slit)にて励起された時のTPPp0.25−CS−TMA0.75 17Bの蛍光発光スペクトルのオーバーレイを示す:(A)DMSO:H2O(100:0);(B)DMSO:H2O(75:25);(C)DMSO:H2O(50:50);(D)DMSO:H2O(25:75);(E)DMSO:H2O(0:100)を示す。 図9は、(A)TPP−CS−TMA独立ナノ粒子のSEM画像;(B)TPP−CS−TMA樹状ナノ凝集体のSEM画像;(C)TPP−CS誘導体の接触角のグラフを示す。 図10は、スキーム3−化合物1、3、20および21の合成スキームを示す。反応および条件:(A)プロピオン酸、還流、1時間、(20%);(b)NaNO2(1.8eq.)、TFA、室温、3分;(C)SnCl2・2H2O、濃縮HCl、60℃、1時間、(54%);(d1)p−トルエンスルホニルヒドラジド、K2CO3、ピリジン、還流、24時間;(d2)o−クロラニル、CH2Cl2、室温、(80%);(e)塩化クロロアセチル、Et3N、CH2Cl2、室温、2時間、in situ;(f)ピペラジン、CH2Cl2、室温、12時間、(61%)。化合物20および21の全ての誘導体は、TPCa1およびTPCa2異性体を含む。しかしながら、TPCa1構造のみがスキームおよび構造図に示されている。 図11は、スキーム4−化合物22〜28の合成スキームを示す。反応および条件:(a)塩化アセチル、MeOH、還流、24時間、(87%);(b)BF3.Et2O、CHCl3、室温、p−クロラニル、48時間、(14%);(c)2N KOH(MeOH中)、THF:ピリジン(10:1)、還流、24時間(71%);(d1)p−トルエンスルホニルヒドラジド、K2CO3、ピリジン、還流、24時間;(d2)o−クロラニル、CH2Cl2:MeOH(75:25)、室温、(70%);(e)EDCI.HCl、HOBT、Et3N、N−Boc−ピペラジン 5、DMF、室温、24時間(54%);(f)TFA、CH2Cl2、 室温、1時間(89%)。化合物26〜28の全ての誘導体は、TPCc1およびTPCc2異性体を含む。しかしながら、TPCc1構造のみがスキームおよび構造図に示されている。 図12は、スキーム5−化合物7〜9の合成を示す。試薬と条件:(a)MeSO3H/H2O、10℃−室温、1時間、(90%);(b)TBDMSCl、イミダゾール、DMSO、室温、24時間、(96%);(C)臭化ブロモアセチル、Et3N、CH2Cl2、−20℃、1時間、(92%)。 図13は、スキーム6Aおよび6Bを示す。 試薬と条件(6A):(a)化合物21、すなわちTPC−NH−Pip(0.1eq)、Et3N、CHCl3、室温、2時間(78%);(b)NMe3または1−メチルピペラジン、CHCl3、 室温、24時間。試薬と条件(6B):a)化合物28、すなわちTPC−CO−Pip(0.1eq)、Et3N、NMP、75℃、12時間(89%);(b)NMe3または1−メチルピペラジン、CHCl3、 室温、24時間。 図14は、CDCl3におけるTPC−CO−Pip(28)の1H NMRスペクトルを示す。2つの異性体が示されている。 図15は、CDCl3における化合物21(TPC−NH−Pip)の1H NMRスペクトルを示す(2つの異性体が示されている)。 図16は、CDCl3における化合物29の1H NMRスペクトルを示す。この化合物は、TPCa1およびTPCa2異性体を含む。 図17は、CDCl3における化合物34の1H NMRスペクトルを示す。この化合物は、TPCc1およびTPCc2異性体を含む。 図18は、d6−DMSO/D2Oにおける最終担体化合物(37、38、32および33)のNMRスペクトルを示す。 図19は、HCT116/LUC細胞におけるpEGFP−N1を用いたトランスフェクションを示す。トランスフェクションは、フローサイトメトリーによって照射48時間後に測定された。細胞生残率はMTTアッセイによって測定された。(a)16A、0.1μg/ml TPP、(b)16B、0.1μg/ml TPP、(C)17A、0.01μg/ml TPP、(d)19A、0.01μg/ml TPP、(e)TPCS2a、0.1μg/ml。 図20は、HCT116/LUC細胞におけるpEGFP−N1を用いたトランスフェクションを示す。トランスフェクションは、フローサイトメトリーによって照射48時間後に測定された。細胞生残率はMTTアッセイによって測定された。(a)化合物37、0.05μg/ml TPC(b)化合物38、0.05μg/ml TPC(C)化合物32、0.05μg/ml TPC(d)化合物33、0.05μg/ml TPC(e)TPCS2a、0.1μg/ml。 図21は、HCT116/LUC細胞におけるpEGFP−N1を用いたトランスフェクションを示す。トランスフェクションは、フローサイトメトリーによって照射48時間後に測定された。細胞生残率はMTTアッセイによって測定された。化合物54は、濃度0.1μg/mlで用いられた。 図22は、担癌動物をキトサンコンジュゲートおよびブレオマイシンを用いてPCI治療を行った後の、インビボでの生物発光画像を示す。これらの動物は、実施例3の材料および方法の項に記載の如く取り扱われた。各動物の治療および画像のタイムポイント(光増感物質投入後の日数)が示されている。 図23は、担癌動物を化合物37、38または33およびブレオマイシンを用いてPCI治療を行った後の腫瘍の成長を示す。これらの動物は、実施例3の材料および方法に記載の如く取り扱われた。PS:光増感物質 図24は、スキーム7−TEG化およびPEG化のための試薬の合成を示す。反応条件:(a)KOH、p−TsCl、THF/H2O、室温、12時間;(b)ピペラジン、CH3CN、室温、12時間、(41%);(C)スワーン酸化:(COCl)2、CH2Cl2、DMSO、Et3N、−78℃。 図25は、スキーム8−DiTBDMS−キトサンのTEG化を示す。試薬と条件:(a)MeSO3H/H2O、10℃−室温、1時間、(90%);(b)TBDMSCl、イミダゾール、DMSO、室温、24時間(96%);(c)TEG−OTs 42、Cs2CO3、NMP、KI、50℃、24時間;(d)HCl/MeOH(30% v/v)、室温、24時間;(e)臭化ブロモアセチル、Et3N、CH2Cl2、−20℃、1時間(92%);(f)TEG−Pip 46 Et3N、CH2Cl2、室温、24時間;(g)HCl/MeOH(30%v/v)、室温、24時間。 図26は、スキーム9−TEG化されたキトサン−TPPコンジュゲートの合成を示す。試薬と条件:(a)臭化ブロモアセチル、Et3N、CH2Cl2、−20℃、1時間(92%);(b)TPP−NH−Pip 5(0.1eq.)、CH2Cl2、Et3N、室温;(c)TEG−PIP(化合物46)(2eq.)、CH2Cl2、Et3N、室温、24時間;(d)MeOH中30%(V/V)HCl、室温、12時間;(e)化合物4(0.25eq)、NMP、50℃、Cs2CO3、24時間;(f)TEG−モノエチルエーテル−トシラート(化合物42)、NMP、50℃、KI、24時間;(g)MeOH中30%(V/V)HCl、室温、12時間。 図27は、化合物54の1H NMR(400MHz、DMSO−d6:D2O、96:4)を示す。 図28は、マウス初代マクロファージにおけるIL−2産生を示す。該マウス初代マクロファージは、オバルブミン特異的(OVA 257−264)CD8+T細胞クローンを有する抗原特異的T細胞設定(antigen-specific T cell setting)において、化合物32(A)、38(B)およびオバルブミンOVA 257−264とインキュベートされたものである。活性化されたCD8+T細胞からのIL−2産生は、ELISAによって分析された。
実施例1−メソ−テトラフェニルポルフィリン−キトサン系ナノ担体の合成
7ステップの手順において、3,6−di−O−tert−ブチルジメチルシリル−キトサン(DiTBDMS−CS)および5−(p−アミノフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリン[TPP(p−NH21]を原料として、光増感物質のメソ−テトラフェニルポルフィリン(TPP)にテザーされた(tethered)高水溶性キトサンナノ担体を合成した。DiTBDMS−CSは、CH2Cl2への溶解性が高く、そのため高親油性の光増感物質は定量反応で導入され、0.1および0.25の置換度を得ることができた。次に、トリメチルアンモニウミル(trimethylammoniumyl)および/または1−メチルピペラジニル基をポリマー骨格に導入して、最終脱保護担体の水溶解度を増加させた。この方法は再現性が高く、得られた材料は、固体NMR、FT−IRおよび1H NMRによって十分に特徴づけることができることが分かった。担体は動的構造であり、水溶液においてナノ粒子状構造を形成し、そのコアは半固体のπ−スタックされた光増感物質であることがUV−Vis、蛍光およびNMR調査で分かった。親油性環境下、これらの構造はアンフォールドできるため、光増感物質部分を細胞膜内に挿入することができると考えられる。
一般的な材料および方法
Genis EHF社(アイスランド)から提供されたキトサンポリマーを合成に用いた[キトサンポリマーGO30626−2(95%DD、95cp)]。溶媒および試薬はすべて市販品を購入して、更に精製することなく用いた。NMRスペクトルは、298KでDRX400MHz BRUKER NMRスペクトロメーターに記録した。ケミカルシフトは、使用された重水素化NMR溶媒[1H NMR:CDCl3(7.26ppm)、DMSO−d6(2.50ppm);13C NMR:CDCl3(77.16ppm)、DMSO−d6(39.52 ppm)]に対するシフトを報告した。アセトンピーク(2.22ppm)を、溶媒D2Oの内部基準として用いた。ポルフィリンのフェニル環上のプロトン(オルト、メタ、パラ)は、フェニル環上の置換基に対してではなく、ポルフィリン環系と相対的なそれらの位置に対して特定された。
化合物17Bおよび19Bの固体13C NMRは、ダラム大学(Durham University)の化学科から入手した。これらのスペクトルは、13Cに100.56MHzで動作するVarian VNMRSスペクトロメーターを使って得られたスペクトルである。交差分極マジック角回転試験(Cross-polarization magic-angle spinning experiments)を、6mm(rotor o.d.)のプローブを用いて実施した。スペクトルを、回転速度6.8kHz、接触時間1ミリ秒、リサイクル遅れ1.5秒にて、“TOSS”回転サイドバンド抑圧を用いて記録した。スペクトル基準は、アダマンタンからの高周波信号を38.5ppmに設定することによって間接的に行なわれる正味の(neat)テトラメチルシランの外部サンプルに対する基準である。
質量スペクトルをBRUKER Autoflex IIIまたはBRUKER micrOTOF−Q11に記録した。FTIR測定は、AVATAR 370 FT−IR装置(Thermo Nicolet社, Madison, USA)を用いて実施した。サンプル(2〜3mg)は、KBrを用いて十分に混練した。そのサンプルを、Specacコンプレッサ(Specac社, Smyrna, USA)を用いてペレット状にプレスした。融点は、Buchi Melting Point B−540に記録した。ポリマーサンプルは、Spectra/Por透析膜(MWCO:3500)を用いて透析した。
吸収スペクトルおよび定常状態の蛍光スペクトル
UV−Vis測定を、ペルチェ(Peltier)温度プログラマを備えたPerkin−Elmer Lambda 25 UV−Visスペクトロメーターに記録した。170〜2200nmのスペクトル範囲を有する細胞(Spectrocell社, Oreland, PA, USA)を使って、SPEX FluoroMaxスペクトロメーターを用いて、蛍光発光スペクトルを得た。パス長10mmの石英キュベットを用いて、吸収スペクトルを20℃にて、蛍光発光スペクトルを周囲温度にて記録した。全ての蛍光スペクトルは、励起1nm、発光1nmの一定のスリット幅で記録した。蛍光スペクトルを、量子収量の研究のため、3回スキャンして平均化した。しかしながら、図5(III)の蛍光スペクトルは、励起3nm、発光3nmのスリット幅で得られたスペクトルである。
定常状態比較法を用いて、無水エタノール中の標準アントラセン(ΦF = 0.27, λex = 365.5 nm)の希薄溶液に対する化合物3、5、16A〜19Bの蛍光量子収量(全てλex. = λmax =419nmにて励起)を決定した。下記式を用いた:
ΦX = ΦST (GradX / GradST) (ηX 2 / ηST 2)
ここで、下付き文字STおよびXは、それぞれ標準(standard)およびテスト(test)を示し、Φは蛍光量子収量であり、Gradは積分蛍光強度対吸光度のプロットからの勾配であり、ηは溶媒の屈折率である。
安定性研究
物理的安定性を研究するために、17AをH2O(1mg/mL)に溶解し、30分間超音波処理し、遠心分離機(HERMLE Z−320、4000rpm、10分間)にかけ、デカンターに移してアルミホイルで包んだ。UV−Vis吸光度を、0〜90日間の期間に亘ってH2O中でλmax= 419nmにて測定した。
1H NMRによる置換度(DS)の決定
TPP−NH−Pipの置換度を計算するために、最終化合物の1H NMRを用いた。最終化合物16A〜19BからDSを計算するために、TPPピーク(TPP−NH−Pip部から)の積分値およびH−1ピーク(キトサン部から)の積分値を用いた。TPP(芳香族領域からの4つのピーク)の積分を考慮に入れ、またH−1基の積分を計算して、下記式に用いた。
この条件下、ポリマー骨格は、HDOピークによって部分的にオーバーラップされるが、DSは、H−1ピークとTPPピークの積分の相対比から、精度よく決定することができる。
TPC−NH−PipおよびTPC−CO−PipのDSを計算するために、中間体化合物29&34およびTPCピークの積分値(芳香族領域におけるTPC−NH−PipまたはTPC−CO−Pip並びにα-ピロールNHピークの積分から)、およびTBDMSピークの積分値(キトサンから)を下記式において用いた。
様々なキトサン誘導体のTEG化のDSを計算するために、対応する1H NMRを用いた。キトサンのH−1ピークの積分値およびキトサン骨格の(TEGの末端エチルピークの)CH3の積分値を考慮に入れた。−エチルエンドトリプレットの積分値は、置換度が100%の場合、3に等しくなるだろう。従って、式は下記の通り。
SEM及びエリプソメトリ(Elipsometry)
クラス−100のクリーンルーム環境下、溶液を、従来のスピナーを用いて未処理の(pristine)シリコン<100>基板(15mm x 15mm)上に1000rpmでスピンコートした。そのシリコンは約15A厚の自然酸化物層を有する。更に、10μlの同溶液を直接シリコン基板上にピペットで移して、空気中で室温にて乾燥させた。コーティングされた基板を、インレンズ検出器を用いて、加速電圧10keV、作動距離2mmにてZeiss LEO 1550走査型電子顕微鏡においてイメージ化した。
水接触角測定
水接触角を、KSV CAM 200光学接触角メーター(KSV Instruments社)を用いて決定した。5μlの脱イオン水の水滴をシリコンウェーハ中央に滴下して、水接触角をラプラス&ヤング方程式に基づいて決定した。室温、周囲湿度で測定を行った。
合成
TPP−NH−Pipの合成は、図2のスキーム1を参照のこと。
メソ−テトラフェニルポルフィリン(1) 文献の手順に従う(Adler、J Organic Chem 1967, 32:476)。
5−(4−ニトロフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリン[TPP(p−NO21](2) 文献の手順に従う(Luguya R et al. Tetrahedron 2004, 60:2757)。
5−(4−アミノフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリン[TPP(p−NH21](3) 文献の手順に従う(Luguya R et al. Tetrahedron 2004, 60:2757)。
5−(4α−ブロモアセチルアミドフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリン(4) 化合物3(500mg、0.793mmol)をCH2Cl2(15mL)に溶解してN2雰囲気下で攪拌した。トリエチルアミン(0.24mL、1.75mmol)を加えた後、臭化ブロモアセチル(0.097mL、1.11mmol)を室温にて滴下して、1時間室温にて攪拌し続けた。反応混合物をCH2Cl2(45mL)で希釈して、水(2x25mL)とブライン(20mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。CH2Cl2とヘキサンと溶離剤として用い、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、385mg(64%)の所望の生成物4を得た。TLC (Hexane/CH2Cl2 3:7): Rf =0.17; FT-IR, ν cm-1: 3313 (N-H), 3049,3019 (aryl C-H), 1687,1594 (CONH),1556, 1514, 1471, 1439,1399, 1348, 1177, 1153, 964, 798, 726, 699; 1H NMR (CDCl3): δ = 8.88-8.91 (m. 8H, β-pyrrole H), 8.41 (br s, 1H, TPPNHCO), 8.22-8.27 (m, 8H, tetraphenyl HO), 7.91 (d, J= 8Hz, 2H, CONH-phenyl-Hm ), 7.75-7.80 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.15 (s, 2H, COCH2Br), -2.70 (br s, 2H, α-pyrrole NH) ppm; 13C NMR (CDCl3): δ = 163.78, 142.26, 139.20, 136.78, 135.25, 134.68, 131.23, 127. 87, 126.83, 120.42, 120.38, 119.24, 118.34, 29.72 ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C46H33BrN5O ([M+H]+) 750.1863 found 750.1864; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
5−(4α−ピペラジンアセチルアミドフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリン[TPP−NH−Pip](5) 化合物4(275mg,0.366mmol)および過剰なピペラジン(158mg、1.83mmol)をCH2Cl2(10mL)中で混合し、N2雰囲気下で1時間室温にて攪拌した。反応終了後、反応混合物をCH2Cl2(85mL)で希釈して、水(2x40mL)とブライン(35mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。1:12のMeOH:CH2Cl2を溶離剤として用いて、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、紫色の固体としての名称化合物5(260mg、94%)を得た。TLC (CH2Cl2/ MeOH, 9:1): Rf =0.15; FT-IR (KBr): ν 3442 (pip. NH), 3312 (aryl N-H), 3052,3022 (aryl C-H), 2903, 2816 (aliphatic CH2), 1691,1596 (CONH),1557, 1517, 1471,1439, 1400, 1349, 1309, 1179, 1153, 1071, 1001, 965, 799, 728, 700 cm-1; 1H NMR(CDCl3): δ = 9.51 (br s, 1H, TPP-NHCO), 8.89-8.93 (m, 8H, β-pyrrole H ), 8.23-8.26 (m, 8H, tetraphenyl HO ), 8.01 (d, J= 8.0 Hz, 2H, Pip-NH-phenyl-Hm ), 7.75-7.81 (m, 9H, triphenyl-Hm,p ), 3.31 (s, 2H, COCH2-Pip.), 3.11 (t, 4H), 2.77 (br t, 4H), 2.60 (br s, 1H, piperazine NH), -2.71 (br s, α-pyrrole 2H) ppm; 13C NMR (CDCl3): δ = 168.75, 142.30, 138.26, 137.44, 135.33, 134.68, 131.26, 127.86, 126.83, 120.32, 119.66, 117.89, 62.87, 54.53, 46.24 ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C50H42N7O ([M+H]+) 756.3445 found 756.3467; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
図3のスキーム2および図12のスキーム5を参照のこと。
キトサンメシラート(7) 弊社が以前公表した手順に従って合成した(Song et al. Carbohydrate Polymers 2010, 81:140)。
3,6−O−di−tert−ブチルジメチルシリルキトサン[DiTBDMS−CS](8) 弊社が以前公表した手順に従って合成した(Song et al. Carbohydrate Polymers 2010, 81:140)。
N−ブロモアセチル−3,6−O−DiTBDMS−CS[BrA−DiTBDMS−CS](9) DiTBDMS−CS 8(1g、2.60mmol)を、N2雰囲気下で丸底フラスコ内の乾燥CH2Cl2(15mL)に溶解した。次に、反応混合物を氷/塩の混合物を用いて−20℃まで冷却した。Et3N(1.81mL、13mmol)を加え、続いて臭化ブロモアセチル(0.91mL、10mmol)をゆっくりと滴下した。1時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈して、減圧下で濃縮した。粗生成物をアセトニトリル中で攪拌し、濾過してフレッシュなアセトニトリルで洗浄した。乾燥材料をCH2Cl2に溶解・抽出して、水とブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。1.2g(92%収量)の薄黄色の粉末状の生成物9を得た。FT-IR (KBr): ν 3402 (br , NH), 2957,2931, 2886, 2858 (s, C-H TBDMS), 1682 (vs, C=O amide I), 1530 (vs, C=O amide II), 1473, 1391, 1362, 1311, 1259, 1101, 1005, 837, 777 (Si-C), 669 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 4.40 (br s, H-1), 4.02-3.26 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=OCH2Br), 0.90 and 0.88 (br s, (CH3)3C), 0.13 and 0.07 (br s, (CH3)2Si) ppm.
(N−TPP−NH−Pip−アセチル)0.1−(N−ブロモアセチル)0.9−DiTBDMS−CS[TPPp0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS](10A)
化合物9(700mg、1.38mmol)および化合物NH−pip−TPP5(105mg、0.138mmol)をN2雰囲気下でCH2Cl2に溶解した。5に対して正確に等モル量のEt3N(19.3μL、0.130mmol)を加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。原料の総消費量をTLCで確認した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、抽出し、水とブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、730mg(92%)の生成物10Aを得た。FT-IR (KBr): ν 3324 (br , NH), 2955, 2929, 2884, 2856 (s, C-H TBDMS), 1678 (vs, C=O amide I),1600 ,1524 (vs, C=O amide II),1472, 1403, 1361, 1311, 1256, 1098,1004,966, 837,801,778, 701, 670, 550 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 9.30(s, TPPNHCO), 8.85 (m, β-pyrrole H ), 8.23-8.20 (m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.73(m, triphenyl-Hm,p), 4.41(br s, H-1), 4.13-3.50 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, TPPNHCOCH2pip, CH2CONGlc and (CH2)2 of piperazine), 2.81-2.86 (m, piperazine-H), 0.92, 0.89 (br s, (CH3)3C), 0.14, 0.07(br s, (CH3)2Si), -2.77 (br s, α-pyrrole NH) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
TPPp0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS(10B) 中間体5(180mg、0.24mmol)および9(1.2g、2.4mmol)を用いて、化合物10B(1.3mg、91%)を上記の手順通りに準備した。
TPPp0.25−BrA0.75−DiTBDMS−CS(11A) 化合物9(550mg、1.09mmol)および化合物NH−pip−TPP5(206mg、0.273mmol)をN2雰囲気下でCH2Cl2に溶解した。5に対して正確に等モル量のEt3N(38μL、0.27mmol)を加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。原料の総消費量をTLCで確認した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、抽出し、水とブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、670mg(91%)の生成物11Aを得た。FT-IR (KBr): ν 3317(br , NH), 2952,2926, 2883, 2855 (s, C-H TBDMS), 1680 (vs, C=O amide I), 1598, 1520,1471, 1440, 1402, 1361, 1309, 1254, 1096, 1002, 966, 837, 800, 778, 730, 701, 667, 558 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 9.30(s, TPPNHCO), 8.85 (m, β-pyrrole H ), 8.22-8.20 (m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.80-7.75(m, triphenyl-Hm,p ), 4.40(br s, H-1), 4.06-3.63 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, TPPNHCOCH2pip, CH2CONGlc and (CH2)2 of piperazine), 2.81-2.86 (m, piperazine-H), 0.92, 0.89(br s, (CH3)3C), 0.14, 0.10, 0.07 and 0.02(br s, (CH3)2Si), -2.77 (br s, α-pyrrole NH) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
TPPp0.25−BrA0.75−DiTBDMS−CS(11B) 中間体5(415mg、0.55mmol)および9(1.1g、2.18mmol)を用いて、化合物11B(1.35g、92%)を上記の手順通りに準備した。
化合物12A、12B、13Aおよび13Bを合成するための一般的な手順A
(N−TPP−NH−Pip−アセチル)0.1−(N−(N,N,N−トリメチルアンモニウミル)アセチル)0.9−DiTBDMS−CS[TPPp0.1−DiTBDMS−CS−TMA0.9](12A) 化合物10A(350mg、0.61mmol)をN2雰囲気下でCH2Cl2に溶解した。過剰量のトリメチルアミン溶液を加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、紫色の固体としての粗生成物12A(420mg、99%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3426, 3021, 3011, 2962, 2855, 27.7, 2560, 2438, 1749, 1689, 1599, 1563, 1482, 1443, 1401, 1360, 1288, 1254, 1053, 1010, 966, 922, 901, 837, 797, 779, 744, 701, 671, 552 cm-1.
TPPp0.1−DiTBDMS−CS−TMA0.9(12B) 一般的な手順Aに従って、10B(600mg、1.04mmol)およびNMe3を用いて、粗固体としての12B(720mg、99%)を得た。
TPPp0.25−DiTBDMS−CS−TMA0.75(13A) 一般的な手順Aに従って、11A(300mg、0.44mmol)およびNMe3を用いて、粗固体としての13A(340mg、98%)を得た。FTIR (KBr): ν 3415, 3021,3011,2962,2854, 1749, 1686, 1598, 1522, 1482, 1442, 1402, 1360, 1311, 1288, 1252, 1053, 1010, 966, 922, 901, 837, 798, 779, 744, 701, 671, 558 cm-1.
TPPp0.25−DiTBDMS−CS−TMA0.75(13B) 一般的な手順Aに従って、11B(600mg、0.89mol)およびNMe3を用いて、粗固体としての13B(685mg、99%)を得た。
化合物14A、14B、15Aおよび15Bのための一般的な手順B
(N−TPP−NH−Pip−アセチル)0.1−(N−(N−メチルピペラジニル)アセチル)0.9−DiTBDMS−CS[TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9](14A) 化合物10A(350mg、0.61mmol)をN2雰囲気下でCH2Cl2に溶解した。過剰量の1−メチルピペラジンを加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。その後、粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、対応する粗生成物14A(425、105%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3378 , 2950, 2930, 2884, 2854, 2798, 2694, 2608, 2477, 2223, 1678, 1617, 1519, 1461,1394, 1371, 1293, 1253, 1168, 1092,1051,1003,966, 939, 920, 837, 801, 779, 701, 671, 612 cm-1.
TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9(14B) 一般的な手順Bに従って、10B(600mg、1.04mol)および1−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての14B(710mg、102%)を得た。
TPPp0.25−DiTBDMS−CS−MP0.75(15A) 一般的な手順Bに従って、11A(250mg、0.37mmol)および1−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての15A(290mg、104%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3380, 2950, 2930, 2884, 2854, 2800, 2480, 1677, 1598, 1519, 1461, 1400, 1394, 1371, 1284, 1252, 1168, 1089, 1050, 1003,966, 939, 920, 837, 801, 779, 732, 701, 671, 591 cm-1.
TPP0.25−DiTBDMS−CS−MP0.75(15B) 一般的な手順Bに従って、11B(650mg、0.96mol)および1−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての15B(735mg、102%)を得た。
化合物16A、17A、18A&19A(第1バッチの化合物)のための一般的なTBDMS脱保護手順C
TPPp0.1−CS−TMA0.9(16A) 材料12A(350mg、0.50mmol)をMeOH(5〜10mL)に溶解して、濃縮HCl(2〜3mL)を加えた。反応混合物を12時間室温にて攪拌した。過剰量の脱イオン水を反応混合物に加え30分間攪拌した後、8%NaClに対して1日間透析し、脱イオン水に対して3日間透析した。この期間、溶液の色は徐々に深緑色から赤色に変化した。赤色の溶液を冷凍乾燥して、茶色のスポンジ状の材料を得た。材料を再び脱保護し、イオン交換し、透析して冷凍乾燥した。同じ条件を用いてこの手順を繰り返して微量のTBDMSを取り除き、茶色のスポンジ材料としての16A(210mg、89%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3419 (br, O-H), 3064 (C-H), 1683, 1558, 1506,1488, 1473, 1403, 1296, 1153, 1112, 1068, 1032, 966, 911, 800, 730, 701, 618 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.81 (br m, β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.04 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.75-7.84(m, triphenyl-Hm,p ),4.66 (br s, H-1), 4.21 (br s, BrCH2C=O), 3.83-3.54 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.32 (s, +N(CH3)3)) ppm.
TPPp0.25−CS−TMA0.75(17A) 一般的な手順Cに従って、13A(240mg、0.30mmol)および濃縮HCl/MeOHを用いて、紫色の固体としての17A(120mg、71%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3392, 3061, 2950, 1683, 1559, 1506, 1489, 1473, 1402, 1350, 1296, 1154, 1112, 1068, 1032, 966, 911, 800, 730, 701, 619 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2) δ ppm: 8.81 (br m, β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.04 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.87(m, triphenyl-Hm,p ),4.50 (br s, H-1), 4.15 (br s, BrCH2C=O), 3.27-3.65 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.24 (s, +N(CH3)3)) ppm.
TPPp0.1−CS−MP0.9(18A) 一般的な手順Cに従って、14A(350mg、0.52mmol)および濃縮HCl/MeOHを用いて、紫色の固体としての18A(200mg、87%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3419 (br, O-H), 3057 (C-H), 1683, 1558, 1474, 1403, 1296, 1234, 1154, 1112,1068,1032,966, 930, 911,799,730, 701cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.83 (br m, β-pyrrole H ), 8.13-8.19 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.08 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.87(m, triphenyl-Hm,p ),4.48 (br s, H-1), 3.24-3.78 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.30-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.48 (br s, piperazine, N-CH3) ppm.
TPPp0.25−CS−MP0.75(19A) 一般的な手順Cに従って、15A(200mg、0.26mmol)および1−メチルピペラジンを用いて、紫色の固体としての19A(80mg、58%)を得た。FT-IR (KBr): ν 3392, 3056, 2947, 1683, 1558, 1520, 1489, 1472, 1458, 1400, 1349, 1309, 1248, 1154, 1068, 1031, 1001, 966, 911, 800, 729, 701, 658 cm-1. 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.83 (br m, β-pyrrole H ), 8.14-8.20 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.08 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.78-7.86(m, triphenyl-Hm,p ),4.50 (br s, H-1), 3.24-3.78 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.28-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.48 (br s, piperazine, N-CH3) ppm.
最終化合物16B、17B、18Bおよび19B(第2バッチの化合物)のための一般的なTBDMS脱保護手順D(代表例として化合物16B)
TPPp0.1−CS−TMA0.9(16B) 材料12B(600mg、0.86mmol)をN−メチル−2−ピロリドン(NMP)(5〜10mL)に溶解し、続いて過剰量のテトラ−n−ブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)を加えた。反応混合物を55℃にて24時間攪拌し、冷却し、希釈したHClで酸性化して30分間攪拌し、次に脱イオン水中で8%NaCl(w/v)に対して2日間透析し、脱イオン水に対して3日間透析した。この期間、溶液の色は徐々に灰色から赤色に変化した。赤色の溶液を冷凍乾燥して、茶色のスポンジ状の材料を得た。材料を再び脱保護し、イオン交換し、透析して冷凍乾燥した。同じ条件を用いてこの手順を繰り返して残った微量のTBDMSを取り除き、茶色のスポンジ材料としての16B(350mg、87%)を得た。FTIR (KBr): ν 3405, 2943, 2817, 1655, 1528, 1459, 1401, 1375, 1308, 1248, 1153, 1111, 1068, 1031, 966, 832, 799, 729, 702 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.82 (br m, β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.04 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.75-7.84(m, triphenyl-Hm,p ),4.47 (br s, H-1), 4.04 (br s, BrCH2C=O), 3.24-3.55 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.19 (br s, +N(CH3)3)) ppm.
TPPp0.25−CS−TMA0.75(17B) 一般的な手順Cに従って、13B(650mg、0.84mmol)およびTBAF/NMPを用いて、紫色の固体としての17B(400mg、87%)を得た。FTIR(KBr):ν 3396, 2942, 2829, 1662, 1526, 1458, 1441, 1401, 1310, 1249, 1068, 1032, 1002, 966, 800, 730, 701 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2) δ ppm: 8.81 (br m, β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.08 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.74-7.86(m, triphenyl-Hm,p ),4.51 (br s, H-1), 4.10 (br s, BrCH2C=O), 3.26-3.55 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.22 (br s, +N(CH3)3)) ppm; Solid-state 13C NMR (100.56 MHz): δ 170.85, 164.68, 128.11, 119.45, 101.53, 75.39, 61.09, 55.47.
TPPp0.1−CS−MP0.9(18B) 一般的な手順Cに従って、14B(600mg、0.90mmol)およびTBAF/NMPを用いて、紫色の固体としての18B(315mg、80%)を得た。FTIR (KBr): ν 3396, 3315 (br, OH, NH), 2941, 1655 (vs, C=O amide I), 1534 (vs, C=O amide II), 1522, 1471, 1440, 1401, 1375, 1310, 1244, 1069, 1030, 1001, 966, 800, 729, 701cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2) δ ppm: 8.81 (br m, β-pyrrole H ), 8.13-8.19 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.07 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.85(m, triphenyl-Hm,p ),4.48 (br s, H-1), 3.24-3.72 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.33-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.48 (br s, piperazine, N-CH3) ppm.
TPPp0.1−CS−MP0.9(19B) 一般的な手順Cに従って、15B(700mg、0.93mmol)およびTBAF/NMPを用いて、紫色の固体としての19B(415mg、85%)を得た。FTIR (KBr): ν 3396, 3315 (br, OH, NH), 2941, 1655 (vs, C=O amide I), 1534 (vs, C=O amide II), 1522, 1471, 1440, 1401, 1375, 1310, 1244, 1069, 1030, 1001, 966, 800, 729, 701cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 95:5) δ ppm: 8.82 (br m, β-pyrrole H ), 8.13-8.19 (br m, phenyl-Ho & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.07 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.87(m, triphenyl-Hm,p ),4.49 (br s, H-1), 3.24-3.78 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.30-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.40 (br s, piperazine, N-CH3) ppm; Solid-state 13C NMR (100.56 MHz): δ 171.63, 138.74, 127.97, 119.74, 101.93, 75.54, 61.54, 55.42, 45.34 ppm.
結果および議論
求核性TPP中間体5 現在の研究において、TPP 1は大規模に合成され、原料として用いられてきた。モノ−ニトロTPP(p−NO2)1 2の機能性をTFA中で1.8当量のNaNO2を用いてレジオ選択的に導入した後、SnCl2・2H2Oで還元して、モノ−アミノポルフィリンTPP(p−NH2)1 3を得た。還元工程前の時間のかかる粗材料2の精製を省くことによって、以前報告された手順を簡略化した。その後精製を経て、全収率(54%)を損なうことなく、アミノポルフィリン3を得た。
アミノポルフィリンTPP(p−NH2)1 3は弱求核性であることが知られており、SN2攻撃によってこの化合物を求電子性BrA−DiTBDMS−CS 9にリンクすることを試みるが、厳しい条件下でも我々の初期研究において望ましい結果をもたらさなかった。従って、この光増感物質誘導体をより強力な求核剤に変換するために、先ずTPP(p−NH2)1をアシル化してブロモアシル−TPP 4を得、次に過剰量のピペラジンを用いて求核置換反応を引き起こして、求核性ポルフィリン中間体TPP−NH−Pip 5を得た。ピペラジンモチーフは、生理学的条件下、正電荷を有する(水溶液pH7.4)。ピペラジン部分もまた、低毒性、および、いくつかの周知の代謝反応に関与する体内変化のため、スペーサーとして適している。TPP−NH−Pipの合成の全合成ルートを図2のスキーム1に示す。
求電子性キトサン中間体9 以前報告されたようにキトサンを修飾して、DiTBDMS−CS 8を得た。ヒドロキシル基を保護した後、バイオポリマーの溶解度は劇的に変化して、高親油性部分の修飾を促進するCH2Cl2などの一般的な有機溶媒に溶けやすくなる。従って、8を2−臭化ブロモアセチルと反応させて、求電子性中間体BrA−DiTBDMS−CS 9を準備した(図3のスキーム2)。この反応では、脱保護やエステル化などの副反応を防ぐために、反応時間、温度、および異なる試薬の当量比の正確な制御が要求される。8を臭化ブロモアセチルと0℃で1.5時間反応させると、CH2Cl2に不溶な材料が得られた。FT−IR分析によると、エステルピークは1760cm-1、アミドピークは1680cm-1(データ不掲載)であった。従って、副反応を防ぎ、溶解し易い材料を得るためには、反応を正確に最適化する必要があった。この反応の最適化条件は、厳密に4当量の臭化ブロモアセチルと5当量のEt3Nを用いること、および、反応温度を−20℃に1時間維持することである。得られた中間体9をCH2Cl2に十分に溶解して、その正確な構造を1H NMRおよびFT−IR分析で確認した。その後、化合物9を、キトサン担体の合成における重要な求電子性中間体として用いた。
キトサンのTPP誘導体(16A−19B) 合計8つのキトサン化合物のTPP誘導体を、4つの異なる化合物を用いた2つの別々のバッチにおいて合成した。第1バッチ(“A”と称する)を80〜200mgの規模で合成し、第2バッチ(“B”と称する)をそれより少し大きい300〜450mgの規模で合成して、手順の再現性および整合性を確認した。
BrA−DiTBDMS−CS 9と求核性TPP−NH−Pip 5中間体とを反応させて、親油性PSをポリマー骨格に共有結合させた。この反応は定量的であり、得られる材料における置換度の良好な制御を容易にする。事前の調査によって、高いポルフィリン置換度(DS)を有する担体は水溶液に不溶であり、そのため修飾は0.1および0.25DS(グルコサミン単量体当たり)に限られることが分かった。従って、TPP−NH−Pip 5を、求電子性キトサン中間体9の単量体当たり0.1または0.25当量に制御しながら反応を行い、所望の生成物TPPp0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS(10A/10B)またはTPPp0.25−BrA0.75−DiTBDMS−CS(11A/11B)をそれぞれ得た。反応の進行をTLCによってモニターし、5が無くなると反応を止めて、副反応を防いだ。これらの材料の1H NMR分析は、TPPのキトサンへの共有結合における定量反応と一致した。
次に、カチオン部分をTPP置換キトサン骨格に導入して、担体の水溶解度を促進し、エンドサイトーシス膜に対する親和性を与えた。従って、化合物10A/10Bおよび11A/11Bを過剰量のMe3N(TMA)と反応させて、一定のカチオン電荷を有するTPPp0.1−DiTBDMS−CS−TMA0.9 (12A/12B)およびTPPp0.25−DiTBDMS−CS−TMA0.75(13A、13B)をそれぞれ得た。同様に、化合物10A/10Bおよび11A/11Bを過剰量の1−メチルピペラジン(MP)と反応させて、TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9(14A/14B)およびTPPp0.25−DiTBDMS−CS−MP0.75(15A、15B)をそれぞれ得た。これらの粗材料を、最終脱保護工程において直接用いた。
最後に、第1バッチからの粗材料12A〜15Aを濃縮HCl(MeOH中、室温、12時間)で脱保護し、第2バッチからの粗材料12B〜15BをTBAF/NMP(60℃、24時間)で脱保護した。これにより、最終生成物16A〜19Aおよび16B〜19Bをそれぞれ得た。両方の場合において、最初の脱保護工程の後も依然存在する微量のTBDMS(1.5〜7%)を取り除くために、脱保護工程を繰り返した。MeOH中での濃縮HClを用いた脱保護は従来から用いられてきたが、近年では、よりマイルドなDiTBDMSキトサン誘導体のTBAF/NMP脱保護を導入して、ポリマー骨格を分解し得る強い酸性条件を回避している。しかしながら、後者の方法は、NMP溶媒の除去に非常に長い透析工程を要するという欠点をもつ。トリメチルアンモニウム(Me3+)誘導体[TPPp0.1−CS−TMA0.9(16A、16B)およびTPPp0.25−CS−TMA0.75(17A、17B)]は、1−メチルピペラジン誘導体[TPPp0.1−CS−MP0.9(18A、18B)、TPPp0.25−CS−MP0.75(19A、19B)]よりも早く水に溶けた。これは、前者の担体化合物には、一定のイオン電荷が存在するからだと考えられる。
ナノ担体のキャラクタリゼーション
FT−IR分析:図4に、代表的な最終化合物TPPp0.1−CS−MP0.9(18A)の合成における様々な中間体のFT−IRスペクトル比較を示す。ポルフィリン中間体TPP−NH−Pip 5(図4A)の特徴的なピークは3310〜3450cm-1の領域にN−H伸縮(stretching)として示され、芳香族および脂肪族のC−H伸縮は3022および2816cm-1に示されている。1691および1595cm-1のピークはアミド結合と一致し、966、799、700cm-1の3つの強いピークはTPP環系の特徴である(矢印で図示)。
BrA−DiTBDMS−CS中間体9における最も特徴的なピークは2858〜2957cm-1に観察され、Si−CH3のC−H伸縮を示している。アミドピークは1682および1530cm-1である。また、836および777cm-1のピークはSi−C伸縮およびCH3横揺れ(rocking)を表している(これら最後の2つのピークは、図4Bに矢印で示されている)。
中間体TPPp0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS 10A(図4C)のスペクトルに特徴的なTPPピークが現れたことから、ポルフィリン(TPP−NH−Pip 5)のキトサン(9)への共有結合が確認された。10Aが粗TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9 14Aに変換されても、スペクトルに顕著な変化は観察されなかった。しかしながら、材料を最終TBDMS脱保護してTPPp0.1−CS−MP0.9 18Aが得られたことは、特徴的なSi−CH3ピークが不在であること、広いO−Hピークが現れたこと、その一方で特徴的なTPPピークは損なわれていないことから、明確に示された(図4E)。
1Hおよび13C(固体)核磁気共鳴分光学(NMR)分析:
1H NMR分析:図5は、TPPp0.1−CS−MP0.9 18Aの合成における全ての中間体および最終化合物の代表的な1H NMRスペクトルのオーバーレイを示す。TBDMS保護後、材料(DiTBDMS−CS 8)は、CDCl3に見事に可溶になり、またキトサン骨格における各プロトンのよく分解された(well resolved)ピーク(図5A)も示している。0.90〜0.89(br s)および0.13〜0.05(br s)のピークは、それぞれ(CH33C−Siおよび(CH3)2Siに割り当てることができる。
H−2(GluN)ピークがダウンフィールドにシフトしていることから、DiTBDMS−CSがブロモアセチル化してBrA−DiTBDMS−CS 9が得られたことが示されている。また、COCH2Brピークと共に全てのキトサン骨格ピークH−1〜H−6が4.40〜3.26ppmで一緒になっており、その一方でTBDMSピークにはその位置に目立った変化は見られない(図5B)。
TPPp0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS 10A中間体の1H NMRスペクトル(図5C)によって、芳香族領域に見られるTPP部分の特徴的なピークが確認され、また−2.7のピーク[図5Cにおいて図示せず]も特定された。−2.7のピークは、通常、遊離塩基ポルフィリンのコア内の2つのピロールインナーアミンプロトン(pyrrolic inner amine protons)と関係している。更に、ピペラジン部分の環状−CH2基の半分に割り当てることができる一つの特徴的なピークが2.81〜2.86(m)ppmにて観察された。ピペラジンの残りの環状−CH2基は、キトサン部分の広い領域(3.3〜4.5ppm)に属している。
TPPp0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9 14Aのスペクトルにおいて、1−メチルピペラジン部分のN−CH3に関する新たなピークが観察された(図5D)。精製はこの段階で行なわれなかったため、このスペクトルは過剰な1−メチルピペラジンを示す。
最終脱保護工程後、優れた水溶解度を有する材料が得られた。最終化合物TPPp0.1−CS−MP0.9 18Aの1H NMRスペクトルにおいて、1−メチルピペラジンピークと共に、キトサン骨格の全てのピークを明確に特定することができた。しかしながら、観察可能なTPP部分のNMRシグナルは存在しない(図5E)。全ての脱保護された最終化合物(17A〜19B)について、同様の結果が観察された。d6−DMSOにおいて、TPPピークを観察することができたが、この場合、キトサン骨格のピークは広くなり、はっきりと特定できなかった。この溶媒における担体の溶解度も乏しかった。最良の結果は、これらの2つの溶媒の混合物を用いて得られることを発見した(下記の議論を参照)。TPPp0.1−CS−MP0.9 18Aは赤褐色であり、PSの存在を確認した。分配実験(partitioning experiment)において、高親油性PS部分TPP−NH2およびTPP−NH−Pipは、二相系H2O/CHCl3において水相に分配されなかったが(図6)、最終(極性)TPP−CS−TMA担体およびTPP−CS−MP担体は高極性であることが分かった。それらは水相に十分に溶解し、有機相には分配されなかった。
固体13C NMR分析:最終担体の炭素ピークを固体NMRにおいて観察することができた(図7)。グルコサミンのC2〜C6炭素およびCOCH2炭素は60〜80ppmの領域において観察され、C1ピークは〜102ppmではっきりと分解されている。115〜155ppmのピークは、TPP部分のCmeso(〜119)、Cm、p(〜128)、Cβ(〜131)、Co(〜138)、Ci(〜140)およびCα(〜150)として割り当てることができる。この割り当ては、TPP−NH−Pip 5の溶液13C NMRスペクトルと完全に比較することができる。カルボニル(CS−NH−C=OおよびTPP−NH−C=O)は、160〜169ppmに現れている。N−(2−(N,N,N−トリメチルアンモニウミル)アセチル)誘導体TPPp0.25−CS−TMA0.75(17B)において、第4級メチル炭素(+N(CH33)は、強いピークとして55.5ppmにて観察することができる。N−メチル−ピペラジニル誘導体TPPp0.25−CS−MP0.75(19B)において、メチル炭素(N−CH3)は45ppmにて観察することができる。環状メチレン(−CH2−N)炭素は、グルコサミンシグナルと50〜55ppmの領域でマージする。従って、固体13C NMRは、共有結合されたPSを有する担体と一致している。
置換度(DS)および変換効率 下の表1は、最終担体化合物のDSを示す。その目的は、反応工程“e”(図3のスキーム2)において、DSを化合物5と化合物9の当量比で制御することである。最終DSは、標的値(反応における当量(0.1または0.25)が2%のマージン内にあり、反応における100%の効率を示す値)とマッチしている。従来から、様々な親油性部分のキトサンへの共有結合が調査されてきた。親油性部分としては、例えばドキソルビシンおよびパクリタクセルなどの薬物;5α−コラン酸、5β−コラン酸、デオキシコール酸およびコレステロールなどの内因性生体分子;並びにクロリンe6(Ce6)およびプロトポルフィリンIX(PpIX)などの光増感物質が挙げられる。ほとんどの場合、DSは、高親油性TPPについて我々が本明細書に報告しているDSよりも著しく低い。従来の研究者達は、コンジュゲーション効率は置換度が上がるにつれて減少するであろうとの見解も持っていた。本プロセスは、有機溶媒への溶解性が高く、そのため温穏和な条件下で親油性PS部分と効率的に結合できる保護キトサンを使用している点で有利である。2つのバッチ(AおよびB)におけるDSが同じ2%のマージン内でマッチしているため、優れた反応再現性も確認された。
担体の自己凝集によるナノ粒子の形成および担体ナノ粒子のアンフォールディングに関する分析
芳香族ポルフィリンは、J凝集(レッドシフト)またはH凝集(ブルーシフト)と定義されるπ−πスタッキングシステムを形成することができる。周辺置換基は、凝集機構に寄与することができる。この凝集は、NMR、UV−Visおよび蛍光分光法によって観察することができる。カルボキシフェニル-ポルフィリン(TCPP)凝集体、p−スルホナトフェニルおよびフェニルメソ置換ポルフィリン、並びに3種類のカチオンポルフィリン(TOPyP、TMPyPおよびAPP)に関して、1H NMRにおける極端なピーク広がりおよびピーク損失が報告されてきた。同様に、親油性のn−ブチルメタクリレートとポリ(エチレンオキサイド)マクロモノマーとの分散共重合においても、固定化(immobilization)によるシグナル損失が観察されてきた。
今回の研究において、最終化合物16A〜19BのD2O中での1H NMRにおいて、芳香族領域におけるピークの欠如は、π−πスタッキングによるD2O中でのTPP部分の凝集および疎水性相互作用を示唆している。図8は、代表的なTPPp0.1−CS−TMA0.9 16B化合物のDMSO−d6:D2O混合物におけるNMR研究を示す。純粋なD2O中ではTPP部分のピークは無く、DMSO−d6:D2O(25:75)の混合物中では芳香族領域に非常に弱いピークが観察されるのみであるが、キトサン骨格ピークは観察することができる。DMSO−d6の含有量を更にDMSO−d6:D2O(50:50)まで増加させると、広いピークを観察することができる(図8(I)C)。混合物中、DMSO−d6の含有量が増加するにつれて、芳香族ピークの相対強度は高まる。ほぼ純粋なd6−DMSO(僅か2%D2O v/v)中では、H−1ピーク、残存キトサン骨格ピークおよび+NMe3ピークと共に、芳香族TPPピークをはっきり見ることができる(図8(I)A)。これは、これらの条件下で担体が十分にアンフォールドされたことも示唆している。この解釈は、UV−Vis研究および蛍光研究(図8)によって更に裏付けられた。
水に溶解されたナノ担体は、π−πスタックされた光増感物質に関して、417nmにて最大吸収度を有する広いソーレー帯を示している(図8(II))。このピークは、DMSO濃度が増加して構造がアンフォールドするにつれて、徐々に鋭くなり、僅かにシフトする(100%DMSOにおいて、420nmにシフト)。
純水中で、蛍光はほぼ完全に消光する。これも光増感物質部分の凝集と一致する。DMSOの含有量を50%まで増加させると、蛍光強度は劇的に増加する。更にDMSO濃度を徐々に100%まで増加させると、急激な蛍光強度の増加が観察される(図8(III))。
ナノ担体粒子を、走査電子顕微鏡法によって更に特徴付けることを試みた。ナノ担体溶液の液滴をシリコンウェーハの表面にピペットで移し、SEMで乾燥させた(図9A、9B)。いくつかのサンプルにおいて、ナノ粒子懸濁液を乾燥させると通常観察されるものと同じように、サイズ(粒度)のバラツキが10〜200nmの単離された(図9A)、塊となった、またはデンドライト構造に結晶化された(図9B)ナノ粒子を観察することができた。粒子凝集を避けるために、サンプルのスピンコーティングを試みたが、この場合、特徴のないフィルムやいくつかの粒子が観察された。スピンコーティング後のフィルム厚は、分光偏光解析法によって10nmよりも大幅に小さいと評価された。しかしながら、表面の溶液を乾燥させた後に形成された層の最大厚は、約100nmであった。水接触角測定によって、フィルム表面は比較的疎水性であること、フィルムの疎水性は塗布された担体サンプルの濃度に依存することが明らかになった(図9C)。これらの結果は、コーティングされるとアンフォールドし、その親水性のポリマー骨格が極性の二酸化ケイ素の表面に付着してその粒子コアから疎水性の光増感物質部分を露出する、動的なナノ粒子と一致している。
不溶性凝集体の形成を導くナノ粒子凝集および物理的不安定性は、共通して観察されることである。TPPp0.25−CS−MP0.75(17A)の1mg/ml水溶液の物理的安定性を3ヶ月間に渡ってモニターした。この化合物の沈殿は観察されなかった。
蛍光量子収量
TPP(p−NH21、TPP−NH−PipおよびTPPキトサン誘導体(16A〜19B)の蛍光量子収量をDMSO中で調査した(419nmにて励起)。TPP(p−NH21の量子収量は、その誘導体であるTPP−NH−Pip並びにTPP−CS−TMA誘導体およびTPP−CS−MP誘導体の量子収量よりも少なかった。これは、励起状態が高いと、TPP(p−NH21は、その誘導体と比較して消光することを実証している。ΦFについては、全ての担体化合物(16A〜19B)がほぼ同じであり、中間体TPP−NH−Pipの値に対するばらつきは±0.004と軽微である。
しかしながら、TPP(p−NH21のΦF値(0.0002)は、いくつかの文献が公開するデータと比較して低い。Bhaumikら(J Org Chem 2009, 74:5894)は、DMF中で418nmにて励起した場合、ΦF値は0.05であると報告している。Bhaumikらは、664nmでの最大蛍光発光を報告しているが、これは我々の現在の発見である650nmとは異なる。TPPが標準として用いられている一方で、我々はアントラセンを標準として用いた。本研究でΦFが低いのは、光増感物質の自己会合によると考えられる。下の表2は、TPP修飾キトサン担体16A〜19Bの蛍光量子収量(ΦF)を示す。
結論
我々は、メソ−テトラフェニルポルフィリンにテザーされたキトサン系ナノ担体の高効率な合成に、DiTBDMSキトサンを使用できることを示してきた。これらの担体の合成は十分に再現可能であり、その方法によって高親油性光増感物質の置換度を正確に制御することができる。NMR研究、蛍光研究、およびUV−Vis研究は、光増感物質部分の自己会合と一致した。担体には極性があり、良好な水溶解度および物理的安定性を示す。DMSO中で、光増感物質は自己会合から分離(dissociates)して、蛍光を発するようになる。水溶液において、担体は、そのコアが凝集された(π−πスタックされた)親油性TPP部分で構成され、その周りにカチオン基とポリマー骨格で外殻を形成するナノ粒子状構造に組み立てられる。カチオン基およびポリマー骨格は、水溶液において比較的自由に動くため、NMRで観察することができる。対照的に、TPPコアは半固体であり動きが非常に限られているため、固体NMRにおいてのみ検出することができる。この構造は、アンフォールドした蛍光のフォームと動的に平衡状態であり、DMSO中で優位(dominant)になるため、NMRによってTPPを検出することができる。担体が細胞またはエンドサイトーシス膜と接触している場合、その構造はアンフォールドして親油性分子はエンドサイトーシス膜に挿入され、励起および光増感が可能となり、PDTおよびPCI効果がもたらされる。
実施例2−TPC−キトサン系ナノ担体の合成 一般的な材料および方法は、該当する場合、実施例1と同じである。
合成
TPC−NH−Pipの合成は、図10のスキーム3を参照のこと。
メソ−テトラフェニルポルフィリン(1) 化合物1(TPP)を、Journal of Organic Chemistry 1967, 32, 476に記載された手順に従って準備した。
5−(4−アミノフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリン [TPP(p−NH2)1](3) 化合物3を、Tetrahedron 2004, 60, 2757における文献の手順に従って準備した。
5−(4−アミノフェニル)−10,15,20−トリフェニルクロリン:TPC(p−NH21(20) 化合物3(1.5g、2.38mmol)を暗所にてN2下でピリジンに溶解した。K2CO3(2.96g、 21.5mmol)とp−トルエンスルホニルヒドラジド(0.887g、4.77mmol)を加え、得られた反応混合物を還流温度に加熱した。更なる量のp−トルエンスルホニルヒドラジド(0.887g、4.77mmol)を2、4、6および8時間後に加えた。攪拌を24時間還流温度にて続けた。反応混合物をEtOAc:H2Oの1:1混合物に加えて(2:1、900mL)、1時間還流させた。室温まで冷却した後、有機相を分離して2N HCl(3x200mL)で洗浄し、続いて水(2x100mL)とNaHCO3飽和水溶液(2x150mL)で洗浄した。次に、有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、1.3gの粗混合物を得た。粗生成物の可視スペクトルを分析したところ、それはクロリンとバクテリオクロリン(bacterochlorin)との混合物(帯域はそれぞれ651および738)であることが分かった。また、1H NMRスペクトル分析により、微量のポルフィリン原料も残っていないことが分かった。
上記反応工程から得られた粗材料(1.3g)(クロリン/バクテリオクロリン混合物)をCH2Cl2(100mL)に溶解した。次に、オルト−クロラニル(420mg、2.7mmol)を攪拌した有機溶液に室温にて一度に加え、反応の進行をUV−visによって同時にモニターした。バクテリオクロリン(738nm)のピークが完全に減少した直後に、反応混合物を5%重亜硫酸ナトリウム水溶液(2x125mL)で洗浄し、続いて水(100mL)、5%NaOH(2x150mL)で洗浄し、最後に水(150mL)で洗浄した。次に、有機相をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、茶色の固体としての名称クロリン化合物20(1.2g、80%)を独占的に得た。化合物3は、2つ以上の異性体において存在するようである。
TLC (Hexane/CH2Cl2 3:7): Rf =0.23, 1H NMR (CDCl3): δ = 7.86-8.66 (m, 14H, β-pyrrole-H & phenyl-Ho ), 7.63-7.73 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 7.00 (d, J=8Hz, 2H, NH2-phenyl-Hm), 4.14-4.23 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.95 (br s, 2H, NH2), -1.38 and -1.46 (br s, 2H, α-pyrrole-NH) ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C44H34N5 ([M+H]+) 632.2809, found 632.2792.; UV-vis (DMSO): λmax: 422, 524, 553, 600, 652 nm.
中間体TPC−NH−pip(21)の合成 化合物20(600mg、0.95mmol)をCH2Cl2(15mL)に溶解してN2雰囲気下で攪拌した。Et3N(0.32mL、2.27mmol)を加え、塩化クロロアセチル(0.092mL、1.15mmol)を室温にて滴下し、室温にて攪拌を続けた。2時間in situ後、過剰量のピペラジン(0.328g、3.8mmol)を加え、一晩攪拌を続けた。反応混合物をCH2Cl2(85mL)で希釈し、抽出し、水(3x35mL)、ブライン(35mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。次に粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。溶離剤MeOH:CH2Cl2(8:92)において、所望の生成物を分離して、茶色の固体としての名称中間体21(440mg、61%)を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH, 9:1): Rf =0.15; 1H NMR (CDCl3): δ = 9.34, 9.39 (s, 1H, TPC-NH), 7.86-8.65 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m ), 7.66-7.73 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.18-4.19 (br s, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.30 (s, 2H, ArNHCOCH2-pip), 3.17 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 2.81 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), -1.37 (br s, 2H, α-pyrrole-NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 168.37, 167.48, 152.61, 143.14, 142.22, 140.86, 139.20, 138.32, 137.19, 136.99, 135.33, 134.64, 133.98, 133.01, 132.37, 132.12, 131.96, 128.17, 127.69, 126.81, 123.56, 123.38, 122.79, 122.08, 119.22, 117.94, 112.41, 111.65, 62.63, 53.50, 45.59, 35.90 ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 521, 549, 598, 651 nm.
図11のスキーム4を参照のこと。
tert−ブチルピペラジン−1−カルボキシレート(22)の合成 ピペラジン(6g、69.6mmol)をCH2Cl2(120mL)に溶解した。溶液を0℃まで冷却して、CH2Cl2(80mL)中Boc2O(7.6g、34.8mmol)を滴下した。反応混合物を室温に温めて、攪拌を24時間続けた。沈殿物を濾過してCH2Cl2(2x20mL)で洗浄し、合わせた(combined)ろ過液を分離して水(3x40mL)、ブライン(30mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、白い固体としての名称化合物22(6.5g、50%)を得た。
Mp 44-46 o C (lit. mp 46-47 o C); 1H NMR (CDCl3): δ = 3.32 (t, J= 4Hz, 4H), 2.74 (t, J= 4Hz, 4H), 1.39 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3): δ = 154.85, 80.00, 79.52, 45.96, 44.45, 28.45 ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C9H19N2O2 ([M+H]+) 187.1441 found 187.1412.
p−(メトキシカルボニル)ベンズアルデヒド(23)の合成 4−カルボキシベンズアルデヒド(4g、26.6mmol)を60mLの無水MeOHに懸濁して、N2下で攪拌した。反応混合物を0℃まで冷却して、塩化アセチル(9.5mL、133mmol)を滴下した。反応混合物を12時間室温にて攪拌した。MeOHを減圧下で除去して、粗混合物をEtOAc(120mL)で希釈した。有機相を1N NaOH水溶液(5x30mL)とブライン(2x25mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。次に、粗固体をEtOAcと石油エーテルを用いて再結晶させて、白い固体としてのエステル23(3.8g、87%)を得た。
TLC (Hexane: CH2Cl2, 3:7): Rf = 0.36; Mp: 61-63 oC (lit. mp 59-64 oC); 1H NMR (CDCl3): δ = 10.06 (s, 1H, CHO), 8.15 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.91 (d, J=8.4 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H) ppm; 13C NMR (CDCl3): δ =191.66, 166.07, 139.21, 135.13, 130.23, 129.55, 52.62 ppm.
5−(4−メトキシカルボニルフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリンTPP(p−CO2Me)1(24)の合成 文献の方法に従う(J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 4236-4237)。
5−(4−カルボキシフェニル)−10,15,20−トリフェニルポルフィリンTPP(p−CO2H)1(25)の合成
化合物24(1.2g、1.78mmol)をTHF:ピリジン(10:1、100mL)の混合物に溶解した。2NメタノールKOH(120mL)を加え、反応混合物を24時間還流させた。次に、反応混合物を室温まで冷却して、クエン酸飽和水溶液で中和した。続いて、反応混合物をMeOHとTHFが完全に除去されるまで減圧下で濃縮した。次に、粗混合物をCH2Cl2(150mL)と水(120mL)で希釈して、水相をCH2Cl2(3x50mL)を用いて抽出した。合わせた有機相を水(2x40mL)とブライン(35mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗混合物をMeOH:CH2Cl2(溶離剤、100:0〜96:4)を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、紫色の固体としての名称酸25(0.83 g、 71%)を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH 95:5): Rf = 0.54; 1H NMR (DMSO-d6): δ = 8.84 (br s, 8H, β-pyrrole-H), 8.33-8.39 (m, 4H, R-COTPP-phenyl-Ho,m), 8.21-8.23 (m, 6H, triphenyl-Ho), 7.81-7.88 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), -2.92 (s, 2H, NH) ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C45H31N4O2 ([M+H]+) 659.2442, found 659.2420.
5−(4−カルボキシフェニル)−10,15,20−トリフェニルクロリン TPC(p−CO2H)1(26)の合成 化合物25(600mg、0.9mmol)および無水K2CO3(1.13g、8.2mmol)を暗所にてN2雰囲気で下ピリジン(42mL)に溶解した。次に、トルエン−4−スルホニルヒドラジド(340mg、1.8mmol)を加え、混合物を還流温度にて攪拌した。3mLピリジンに、更なる量のトルエン−4−スルホニルヒドラジド(340mg、1.8mmol)を反応2、4、6、8および10時間後に加えた。攪拌を24時間還流温度にて続けた。室温まで冷却後、EtOAc(500mL)と脱イオン水(250mL)とを加えて反応混合物を再び1時間還流させた。室温まで冷却後、有機相を分離して2N HCl(2x150mL)で洗浄し、次に水(2x150mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、565mgの粗混合物を得た。粗生成物の可視スペクトルを分析したところ、それはクロリンとバクテリオクロリンとの混合物(帯域はそれぞれ651および738)であることが分かった。また、1H NMRスペクトル分析により、微量のポルフィリン原料も残っていないことが分かった。
上記反応工程から得られた粗材料(クロリン/バクテリオクロリン混合物、565mg)をCH2Cl2:MeOH (75:25)の混合物に完全に溶解した。次に、オルト−クロラニル(180mg、0.7mmol)を攪拌された有機溶液に室温にて一度に加え、反応の進行をUV−visによって同時にモニターした。バクテリオクロリン(738nm)の吸収ピークが減少した直後に、有機相を5%重亜硫酸ナトリウム水溶液(2x150mL)で洗浄し、続いて水(100mL)、次に5%NaOH水溶液(2x150mL)で洗浄し、最後に水(120mL)で洗浄した。エマルジョンが観察される場合には、有機相をクエン酸飽和水溶液で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、茶色の固体としての名称クロリン化合物26(420mg、70%)を独占的に得た。化合物9は、2つ以上の異性体において存在する。
TLC (CH2Cl2: MeOH, 95:5): Rf = 0.54, 1H NMR (DMSO-d6): δ = 7.91-8.58 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m ), 7.68-7.77 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.12-4.13 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), -1.53 and -1.60 (2 brs, 2H, α-pyrrole-NH); 1H NMR (CDCl3): δ =7.87-8.60 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.64-7.74 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.16-4.18 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), -1.39 and -1.49 (2 br s, 2H, α-pyrrole-NH) ppm; MS (ESI) calcd. for C45H33N4O2 ([M+H]+) 661.2598, found 661.2566; UV-vis (DMSO): λmax: 420, 520, 547, 599, 651 nm.
中間体tert−Butyl N−[ピペラジン−1−カルボキシレート]−5−(4−カルボキシフェニル)−10,15,20−トリフェニルクロリン)(27)の合成 クロリン化合物26(500mg、0.76mmol)およびtert−ブチルピペラジン−1−カルボキシレート22(155mg、0.83mmol)を暗所にてN2下でDMF(4mL)に溶解した。反応混合物にEDCI−HCl(174mg、0.91mmol)およびHOBT(123mg、0.91mmol)を加え、Et3N(0.26mL、1.82mmol)を室温にて加えた。次に、反応混合物を室温にて一晩攪拌し、撹拌水(100mL)にゆっくりと注ぎ込んだ。固体材料を濾過し、大量の水で洗浄し、十分に乾燥させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH 100:0〜99:1)によって精製して、茶色の固体としての名称アミド化合物27(340mg、54%)を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH 99:1): Rf =0.74; 1H NMR (CDCl3): δ = 7.74-8.59 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.65-7.72 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.16-4.17 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.78-3.86 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 3.63 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 1.53 (s, 9H, boc-(CH3)3), -1.39 and -1.47 (2 brs, 2H, α-pyrrole-NH) ppm.
中間体TPC−CO−pip(28)の合成 化合物27(320mg、0.39mmol)を暗所にてN2下でCH2Cl2(8mL)に溶解した。CH2Cl2:TFA(1:1、4mL)を加え、1時間室温にて攪拌した。反応混合物をCH2Cl2(40mL)で希釈して、水(2x15mL)、NaHCO3飽和水溶液(2x15mL)とブライン(15mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次に、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離剤、CH2Cl2:MeOH=100:0〜92:8)によって精製して、茶色の固体としての名称中間体28(250mg、89%)を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH, 9:1): Rf = 0.35, 1H NMR (CDCl3): δ = 7.74-8.59 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.64-7.72 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.16-4.17 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.73-3.90 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 3.04 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), -1.40 and -1.47 (2 brs, 2H, α-pyrrole-NH) ppm; MS (ESI) calcd. for C49H42N6O ([M+2H]+/2) 365.1705, found 365.1707; UV-vis (DMSO): λmax: 420, 520, 546, 599, 651 nm.
キトサンメシル酸塩(7) 弊社が以前公表した手順に従って合成した(Carbohydrate Polymers 2010, 81:140-144)。
N−ブロモアセチル−3,6−O−DiTBDMS−CS(BrA−DiTBDMS−CS, 9) DiTBDMS−CS 8(1g、2.60mmol)を、N2雰囲気下で丸底フラスコ内の乾燥CH2Cl2(15mL)に溶解した。反応混合物を氷/塩の混合物を用いて−20℃まで冷却した。Et3N(1.81mL、13mmol)を加え、続いて臭化ブロモアセチル(0.91mL、10mmol)をゆっくりと滴下した。攪拌を1時間続けた。反応混合物をCH2Cl2で希釈して、減圧下で濃縮した。粗生成物をアセトニトリル中で攪拌し、濾過してフレッシュなアセトニトリルで洗浄した。乾燥材料をCH2Cl2に溶解・抽出して、水とブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、薄黄色の粉末状固体としての名称ブロモ化合物26(1.2g、92%)を得た。
FT-IR (KBr): ν 3402 (br , NH), 2957,2931, 2886, 2858 (s, C-H TBDMS), 1682 (vs, C=O amide I), 1530 (vs, C=O amide II), 1473, 1391, 1362, 1311, 1259, 1101, 1005, 837, 777 (Si-C), 669 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 4.40 (br s, H-1), 4.02-3.26 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=OCH 2 Br), 0.90 and 0.88 (br s, (CH3)3C-Si), 0.13 and 0.07 (br s, (CH3)2Si) ppm.
図13のスキーム6Aを参照のこと。
中間体29の合成
(N−TPC−NH−Pip−アセチル)0.1−(N−ブロモアセチル)0.9−DiTBDMS−CS(TPCNP0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS,29) 化合物9(800mg、1.58mmol)および化合物TPC−NH−Pip21(120mg、0.158mmol)を暗所にてN2下でCH2Cl2(25mL)に溶解した。21に対して正確に等モル量のEt3N(22μL、0.158mmol)を加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。原料の総消費量をTLCで確認した。反応混合物をCH2Cl2(55mL)で希釈して、水(2x25mL)とブライン(25mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物29(700mg、78%)を得た。
1H NMR (CDCl3): δ = 9.21, 9.25 (s, TPCNHCO), 7.86-8.60 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m), 7.65-7.73 (m, triphenyl-Hm,p), 3.35-4.50 [br m, chitosan (H-1, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc), TPCNHCOCH2-pip, piperazin ring-CH2 and chlorin β-pyrrole-CH2], 2.77-2.83 (m, piperazine ring-CH2), 0.88-0.89 [br s, (CH3)3C-Si], 0.02-0.13 [ (br m, (CH3)2Si), -1.44 (br s, 2H, α-pyrrole-NH) ppm.
図13のスキーム6Bを参照のこと。
中間体34の合成
(N−TPC−CO−Pip−アセチル)0.1−(N−ブロモアセチル)0.9−DiTBDMS−CS(TPCCP0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS,34) 化合物9(800mg、1.58mmol)を暗所にてN2下でNMP(25mL)に溶解した。TPC−CO−Pip 28(125mg、0.173mmol)とNaHCO3(0.29g、3.45mmol)を室温にて加えた。次に、反応混合物を75℃にて加熱して一晩攪拌した後、冷却して撹拌水に注ぎ込んだ。固体を濾過し、大量の水で洗浄し、吸着乾燥させた。次に得られた固体をCH2Cl2に溶解し、濾過し、Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、茶色の固体としての化合物34(810mg、89%)を得た。
1H NMR (CDCl3): δ = 7.75-8.60 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.64-7.71 (m, triphenyl-Hm,p), 3.38-4.5 [br m, chitosan (H-1, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc), piperazin ring-CH2 and chlorin β-pyrrole-CH2], 2.76-2.84 (m, piperazin ring-CH2), 0.89-0.92 [br s, (CH3)3C-Si], 0.02-0.10 [ (br m, (CH3)2Si) ], -1.40 and -1.48 (br s, α-pyrrole-NH) ppm.
化合物30および35のための一般的な手順A
(N−TPC−NH−Pip−アセチル)0.1−(N−(N,N,N−トリメチルアンモニウミル)アセチル)0.9−DiTBDMS−CS(TPCNP0.1−DiTBDMS−CS−TMA0.9,30) 化合物29(350mg、0.61mmol)を暗所にてN2下でCH2Cl2(15mL)に溶解した。過剰量のトリメチルアミン溶液を加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、茶色の固体としての粗生成物30(355mg、94%)を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
(N−TPC−CO−Pip−アセチル)0.1−(N−(N,N,N−トリメチルアンモニウミル)アセチル)0.9−DiTBDMS−CS(TPCCP0.1−DiTBDMS−CS−TMA0.9, 35) 一般的な手順Aに従って、34(350mg、0.61mol)およびトリメチルアミン溶液を用いて、粗固体としての35(360mg、94%)を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
化合物31および36のための一般的な手順B
(N−TPC−NH−Pip−アセチル)0.1−(N−(N−メチルピペラジニル)アセチル)0.9-DiTBDMS−CS(TPCNP0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9, 31) 化合物29(350mg、0.61mmol)を暗所にてN2下でCH2Cl2(15mL)に溶解した。過剰量の1−メチルピペラジンを加え、反応混合物を24時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。次に、粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、対応する粗生成物31(330、89%)を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
(N−TPC−CO−Pip−アセチル)0.1−(N−(N−メチルピペラジニル)アセチル)0.9−DiTBDMS−CS(TPCCP0.1−DiTBDMS−CS−MP0.9, 36) 一般的な手順Bに従って、34(250mg、0.38mol)および1−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての36(265mg、93%)を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
最終生成物(32、33、37および38)の合成
以下の一般的な手順Cによって最終脱保護を行った:
化合物(30/31/35/36)を暗所にてN2下でMeOHに溶解した。反応混合物を5分間N2でパージして脱気し、続いて0℃まで冷却後、4mLの濃縮HClを加えた。反応混合物を室温まで温めて12時間攪拌し、減圧下で完全に濃縮した。粗残留物を再びMeOHに溶解して、暗所にてN2下で脱気した。反応混合物を0℃まで冷却した後、2mLの濃縮HClを加えた。反応混合物を室温まで温めて、12時間攪拌した。次に、反応混合物を希釈し、1時間5%NaCl水溶液を加えてイオン交換した後、8%NaCl水溶液に対して24時間透析し、脱イオン水に対して3日間透析した。続いて清潔な茶色の溶液を一晩凍結乾燥して、茶色のふわふわした(fluffy)材料としての最終生成物(それぞれ32/33/37/38)を得た。
TPCNP0.1−CS−TMA0.90(32) 一般的な手順Cに従って、30(325mg、0.52mmol)および濃縮HCl/MeOHを用いて、茶色の固体としての32(175mg、85%)を得た。
1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.83-8.62 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m), 7.69-7.77 (m, triphenyl-Hm,p), 4.52 (br s, H-1), 4.11-4.14 (m, -CH2CONGlc and chlorin β-pyrrole-CH2), 3.26-3.67 (br m, partially overlapped with HDO peak, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, TPCNHCOCH2-pip, piperazine ring-CH2) 3.24 (s, +N(CH3)3)) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 520, 549, 599, 651 nm.
TPCNP0.1−CS−MP0.90(33) 一般的な手順Cに従って、31(300mg、0.45mmol)および濃縮HCl/MeOHを用いて、茶色の固体としての33(165mg、84%)を得た。
1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.83-8.62 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m), 7.66-7.75 (m, triphenyl-Hm,p), 4.50 (br s, H-1), 4.10-4.14 (m, chlorin β-pyrrole-CH2), 2.92-3.55 (m, partially overlapped with HDO peak , H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc, TPCNHCOCH2-pip), 2.33-2.63 (m, partially overlapped with DMSO-d6 peak, piperazine ring-CH2, piperazine- N-CH3) ppm; UV-vis (H2O): λmax: 412, 430, 531, 560, 611, 664 nm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 521, 548, 596, 651nm.
TPCCP0.1−CS−TMA0.90(37)
一般的な手順Cに従って、35(300mg、0.48mmol)および濃縮HCl/MeOHを用いて、茶色の固体としての37(170mg、89%)を得た。
FT-IR (KBr): ν 3353, 3061, 2950, 1683, 1580, 1473, 1440, 1376, 1291, 1154, 1112, 1067, 1032, 970, 911, 794, 703 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.89-8.62 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.67-7.76 (m, triphenyl-Hm,p), 4.50 (br s, H-1), 4.06-4.16 (m, CH2CONGlc and chlorin β-pyrrole-CH2), 3.26-3.75 (m, partially overlapped with HDO peak, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, piperazine ring-CH2), 3.24 (s, +N(CH3)3)) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 420, 520, 547, 599, 651nm.
TPCCP0.1−CS−MP0.90(38) 一般的な手順Cに従って、36(240mg、0.38mmol)および濃縮HCl/MeOHを用いて、茶色の固体としての38(85mg、52%)を得た。
FT-IR (KBr): ν 3349, 2927, 1644, 1580, 1461, 1440, 1374, 1285, 1070, 1043, 985, 945, 794719, 703 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.86-8.63 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.67-7.76 (m, triphenyl-Hm,p), 4.50 (br s, H-1), 4.08-4.14 (m, chlorin β-pyrrole-CH2), 2.92-3.55 (m, partially overlapped with HDO peak , H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc) 2.27-2.63 (m, partially overlapped with DMSO-d6 peak, piperazine ring-CH2, piperazine- N-CH3) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 520, 547, 599, 651nm.
化合物32、33、37および38のTPPアナログ
最終化合物32、33、37および38のための一般的なTBDMS脱保護手順Dに従って使用された場合、予想外の結果(TBAF/NMPによるTPC化合物のTPP化合物への再酸化(Back-oxidation))が観察された。
実施例:化合物32のTPPアナログ(TPPNP0.1−CS−TMA0.9) 材料30(600mg、0.86mmol)をN−メチル−2−ピロリドン(NMP)(5〜10mL)に溶解して、過剰量のフッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(TBAF)を加えた。反応混合物を55℃にて24時間攪拌し、冷却して、希釈HClで酸性化して30分間攪拌した後、脱イオン水中で8%NaCl(w/v)に対して2日間透析し、脱イオン水に対して3日間透析した。この期間、溶液の色は徐々に灰色から赤色に変化した。次に、赤色の溶液を冷凍乾燥して、茶色のスポンジ状の材料を得た。材料を再び脱保護し、イオン交換し、透析して冷凍乾燥した。しかしながら、驚いたことに、再酸化のため、化合物はそれらのTPPアナログに再変換(converted back)されたことがUV−Visによって確認された(650の特徴的なピークはほぼ完全に減少している)(データ図示せず)。
結果
下の表3は、最終担体化合物のDSを示す。表4は、TPC修飾キトサン担体の蛍光量子収量(ΦF)を示す。図14は、TPC−CO−Pip(28)の1H NMRスペクトルを示し、両方の異性体を図示している。図15〜17は、それぞれ化合物21、29および34の等価スペクトル(equivalent spectra)を示す。図18は、d6−DMSO/D2Oにおける最終担体化合物37、38、32および33のNMRスペクトルを示す。
実施例3−インビトロおよびインビボ研究
材料
Mohammed Amarzguioui博士(siRNAsense社、Oslo, Norway)から、HCT116/LUCヒト結腸癌細胞株(ルシフェラーゼをコードする遺伝子を永続的にトランスフェクトしたもの)の提供を受けた。MTT(3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−yl]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを、Sigma−Aldrich社(MO, USA;cat. no. M2128)から入手して、PBS中で5mg/mlの濃度に溶解し、滅菌ろ過して、4℃にて保管した。プラスミドpEGFP−N1はClontech Laboratories社(CA, USA; Cat. No. 6085-1)から購入した。これは、ELIM Biopharmaceuticals社(CA, USA)(lot# 1002)が製造し、滅菌水中、濃度2mg/mlで送達されたものである。この原液(stock solution)を分取(aliquoted)して−20℃にて保持した。ポリ−L−リジンHBr(分子量15000〜30000)はSigma−Aldrich社(MO, USA; cat. no. P 7890)から入手した。ポリ−L−リジンHBrを蒸留水に溶解・希釈して、滅菌ろ過して、−20℃にて保管した。
インビトロ研究
細胞培養法(cell cultivation)
HCT116/LUCを、37℃、5%CO2の湿潤環境において、10%ウシ胎仔血清(PAA Laboratories社, Pasching, Austria)、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Sigma-Aldrich社, MO, USA)を添加したDMEM培地(Lonza社, Veviers, Belgium)で培養した。
細胞の処理
HCT116/LUC細胞(トランスフェクション測定:1,5 x 105細胞/ウェル、MTTアッセイ:3,75 x 105細胞/ウェル)を、6ウェルプレート(トランスフェクション)と24ウェルプレート(MTT)(Nunc, Roskilde, Denmark)に播種して、24時間(5%CO2、37℃)インキュベートした。次に、光増感物質TPCS2aまたはキトサンコンジュゲート(16A、16B、17A、19A、37、38、32または33)を細胞に添加して、細胞を18時間インキュベートした(5%CO2、37℃)。次に、これらの細胞を細胞培養培地を用いて3回洗浄して、プラスミド複合体を含む培地で4時間(5%CO2、37℃)インキュベートした。次に、細胞を1回洗浄した。新しい培地を添加してから、細胞を異なる光照射量で照射した。48時間のインキュベート後、EGFP(増強緑色蛍光タンパク質)の発現をフローサイトメトリーによって分析した。細胞生残率は、並列実験においてMTTアッセイによって測定した。
細胞をLumiSource(登録商標)(PCI Biotech社, Oslo, Norway)からの光で曝露した。LumiSource(登録商標)は、ピーク波長領域が420〜435nmの青色光を主に発する4つの照明管群(4 x 18 W Osram L 18/67, Blue)で光を送達する。
プラスミド/ポリ−L−リジン複合体の準備
プラスミドDNA溶液とポリ−L−リジン溶液とを穏やかに混ぜ合わせて、チャージ比が2.2のプラスミド/ポリ−L−リジン複合体を形成した。2.5μlのDNA(原液2μg/μl)を47.5μlの水で希釈し、6.92μlのポリ−L−リジン(1μg/μl)を43.08μlの水で希釈した。混合後、溶液を30分間室温にてインキュベートし、最終体積が1mlになるまで培養培地で希釈して、細胞に添加した(1ml/ウェル)。
トランスフェクションの測定
細胞を100μlのトリプシン(Trypsin-EDTA, Sigma-Aldrich社, MO, USA)中でトリプシン処理し、500μlの細胞培養培地に再懸濁して、細胞ストレーナーキャップを有する5mlポリスチレン丸底チューブ(BD Falcon社)(50μmメッシュナイロンフィルター)でろ過した後、BD LSRフローサイトメーター(Becton Dickinson社, CA, USA)による分析を行った。EGFPは、488nmでの励起の後、425〜475nmのフィルターを通じて測定し、ヨウ化プロピダム(propidium iodide)(Calbiochem社, CA, USA)は、561nmでの励起の後、600〜620nmのフィルターを通じて測定した。ヨウ化プロピダム(1μg/ml)を用いて生存細胞から死細胞を区別し、パルス処理を行って単一細胞から細胞二重体(cell doublets)を区別した。各サンプルで10000事象を集めてデータをBD FACSDiva Software(Becton Dickinson社, CA, USA)を用いて分析した。
細胞生残率測定
生存して代謝的に活性のある細胞中に存在しているミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより、水溶性テトラゾリウム塩(MTT)が還元されて不溶性の紫色ホルマザン生成物になることに基づく方法により、細胞生残率を測定した。0,125mgのMTTを含む培地0,5mlを細胞に加え、5%CO2、37℃にて2時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶を、1ウェルあたり500μlのDMSO(Sigma-Aldrich社, MO, USA)を添加して溶解した。プレートをPowerWave XS2マイクロプレート分光光度計(BioTek Instruments社, VT, USA)によって読み取った。細胞生残率は、コントロール(光なしのパラレル)の割合として計算した。
インビボ研究
動物
Hsd:無胸腺ヌードFoxn1nu雌マウスは、ノルウェー・ラジウム病院(Norwegian Radium Hospital)の動物部門で繁殖された。これらのマウスは、特定の無菌状態で維持された。水と食物は自由に与えた。マウスに関与する手順はすべて、国家倫理委員会の動物保護に関するガイドラインの下で、ノルウェー・ラジウム病院の動物飼育委員会に是認されたプロトコルに従って実施された。
実験開始時のマウスは22〜25g(生後5〜8週目)であった。HCT116/LUC細胞を、移植前に37℃、5%CO2の湿潤環境で培養した。1,5 x 106の細胞を各マウスの右臀部に皮下注射した。腫瘍の大きさを、週に2、3回、二つの直交する直径を計測することによって測定した。腫瘍体積を次の式を用いて計算した:
V=(W2 x L)/2
ここで、Wは測定した腫瘍の幅、Lは直径の長さである)。
処理(treatment)
キトサンを、PBS(化合物37)および3%Tween80(化合物38および33)において、濃度1.25mg/ml TPCに希釈した。腫瘍体積が60〜100mm3に到達したときに88〜100μlを尾静脈に静脈注射した(最終用量5m/kg)。TPCS2aを、3%Tween80において、1.25mg/mlの濃度に希釈した。腫瘍体積が60〜100mm3に到達したときに88〜100μlを尾静脈に静脈注射した(最終用量5m/kg)。光増感物質の注射から96時間後に、652nmのダイオードレーザー(Ceramoptec社, Bonn, Germany)を用いて、腫瘍を放射照度90mW/cm2、光照射量15J/cm2の光に曝した。PCI+ブレオマイシン処理を受ける動物には、100μ中1500IUのブレオマイシン(欧州単位)を腹腔内注射した。BLMの注射から30分後に、652nmのダイオードレーザー(Ceramoptec社, Bonn, Germany)を用いて腫瘍を放射照度90mW/cm2の光に曝した。腫瘍部分を除いて、これらの動物にアルミ箔を被せた。アルミ箔には、腫瘍部分よりも直径2mm大きい穴を開けた。
インビボイメージングシステム
生物発光は、IVIS Lumina 100シリーズ(Caliper Life Sciences社、MA, USA)を用いて測定した。動物に麻酔をかけ(Zoletil)、200μlのD−ルシフェリン(Caliper Life Sciences社)(PBS中20mg/ml)を腹腔内注射した。D−ルシフェリンの注射から10分後にイメージを撮影した。生物発光は、PS注射後の11日目からほぼ週に一回測定した。動物は、腫瘍体積が1000mm3を超えた場合、或いは痛みのサインまたは異常行動を見せた場合に、殺処分された。データをリビングイメージ4.2ソフトウェア(Caliper Life Sciences社)を用いて分析した。
TPP−キトサンコンジュゲート16Aおよび16Bの生物学的効果を、実験を通してテストした。実験では、これらのコンジュゲートを、光化学的内在化において遺伝子送達を促進する光増感剤として用いた。実験の詳細は、材料および方法に記載されている。図19((a)および(b))から、コンジュゲート16Aおよび16Bは、低い光照射量でも実質的なトランスフェクションの促進が観察できた点で、PCI用の優れた光増感物質であることが分かる。この効果は、PCI用に特別に設計され且つ癌治療のために臨床開発中の光増感物質TPCS2a(Berg et al. 2011, supra)を用いて得られた効果と比較して、促進されていた。TPCS2aでは、より高い光照射量を採用した場合であっても、同レベルのトランスフェクションは達成されなかった(図19(e))。
TPP−キトサン17Aおよび19A(図19(c)および(d))を用いて、同様の実験を行った。これらのコンジュゲートは、16Aおよび16Bよりも更に効能があることが分かる。従って、TPCS2aと比較すると、これらのコンジュゲートは、1/10の濃度で使用された場合であってもTPCS2aで観察されたそれよりも実質的に大きなトランスフェクションの促進をもたらした点で、10倍以上活性であった。当業者は、キトサンコンジュゲートにおける増感剤分子の近接性(proximity)は光増感効果の消失を導き、そのためコンジュゲートはそのような消失効果に曝されない増感剤自由分子と比較して効果が劣ると予想していた点で、この結果は非常に驚くべきものであった。従って、光増感物質−キトサンコンジュゲートは、何らかの未知な方法でエンドサイトーシス膜と相互作用することによって、PCIおよび関連した方法での使用において、とりわけ適したものになったと考えられる。
図20から分かるように、TPC−キトサンコンジュゲート(化合物37、38、32および33)を用いても、同様の結果が得られた。これらのTPC−キトサンコンジュゲートは、TPP−コンジュゲートと比較すると、赤色光を用いた照射によっても活性化されるため、インビボでの使用においてより良好な組織透過が可能になるという利点がある。これは、インビボでの大きな病変(例えば大きな腫瘍)の治療において重要な特徴であるが、表層部の光化学効果のみを求める場合には、例えば所望の効果が皮膚の上層部にあるワクチン接種のアプローチにおいては、不利である。
図21から分かるように、化合物54を用いても同様の結果が得られた。PEGを含むコンジュゲートは、PCI効果の誘発に効果があることが示されている。
また、TPC−コンジュゲートをインビボ実験においても考察し、PDTおよびPCIベースの療法的アプローチにおいて活性があるかを調査した。図22は、コンジュゲート38および33のいずれかを単独で、または細胞毒性抗癌剤ブレオマイシン(詳細については、材料および方法を参照)を共に用いて処理された光照射に供された担癌マウスの写真を示す。未処理の動物、およびTPCS2a+ブレオマイシンを注射した動物を標準として用いた。使用された癌細胞は、ルシフェラーゼを発現するよう永続的にトランスフェクトされたものである。それにより、ルシフェリン注射後に生物発光を画像化することによって、腫瘍の程度をモニタリングすることができる。図22に示されているように、未処理の標準動物およびTPCS2a+ブレオマイシン動物(それぞれ8および7)は、光増感物質注射後11日目および15日目(照射後7日目および11日目)に強い蛍光を示し、腫瘍内での大量の生きた癌細胞の存在を示した。これらの動物は、腫瘍が非常に大きく成長したため、人道的な理由から15日目に殺処分されなければならなかった。対照的に、キトサンコンジュゲートで処理した動物は、11日目にわずか一匹の動物(動物3)が弱い蛍光を見せたのみであり、純粋な光化学的処理(PCI単独、PDT処理に類似)、およびPCI+ブレオマイシンの組み合わせ処理は、共に腫瘍内の癌細胞の量を強力に減少させたことを示している。PCI単独で処理された動物(動物3および5)において、蛍光は15日目〜20日目にかけて増加しているため、PCI光化学的処理単独では全ての腫瘍細胞を殺傷するのに十分でないことが分かった。対照的に、PCI+ブレオマイシンで処理した動物(動物4および6)は、20日目であっても実質的に蛍光を示さなかったことから、この組み合わせはPCI単独よりもかなり効果的であり、キトサンコンジュゲートは強い光化学的内在化効果を誘発し、そしてその効果は癌治療のために臨床開発中の光増感物質TPCS2aによって誘発される効果よりも遥かに強いことが分かった。
図23は、処理された動物における腫瘍成長の曲線を示す(化合物37キトサンコンジュゲートも含む)。図23は、図22に示された画像結果を立証するものであり、化合物38+ブレオマイシンまたは化合物33+ブレオマイシンを用いて処理した動物において、腫瘍は完全に根絶したらしいことを示している。これらの結果からも、キトサンコンジュゲートは、(本実験においてブレオマイシンと組み合わせても腫瘍成長に何ら効果のなかった)TPCS2aと比較して、遥かに効果的なPCI用エージェントであることが分かる。更に、処理スケジュールにブレオマイシンを加えることによって、テストを行った3つ全てのキトサンコンジュゲートの治療効果が著しく向上することが分かる(光化学的処理単独と比較)。これは、強い光化学的内在化効果は、これらのコンジュゲートによって誘発されることを示している。光増感物質−ポリマーコンジュゲートを設計した主な理由は、いわゆるEPR効果によってさらに優れた処理選択性を得ることであったため、この促進された効能は非常に驚くべきものである。しかしながら、当業者は、大きい分子量のコンジュゲートは、小さい分子の光増感物質よりも組織を介する拡散が遥かに遅く、そのため腫瘍細胞における増感剤の濃度が低くなり、また腫瘍内全ての細胞に増感剤を送達することの難しさから、この潜在的に促進された選択性は効能を低下させるであろうと予測するはずである。本発明に記載のキトサンコンジュゲートは、明らかにこれに該当しない。
実施例4
一般的な材料および方法は、該当する場合、実施例1と同じである。図24のスキーム7を参照のこと。
トリエチレングリコールモノメチルエーテルトシラート(40)の合成(2−(2−(2−メトキシエトキシ)エトキシ)エチル 4−メチルベンゼンスルホン酸とも称される)
トリエチレングリコールモノメチルエーテル39(4.87mL、30.43mmol)をTHF(25mL)に溶解した。水酸化カリウム(3.7g、65.95mmol)の水溶液(25mL)を加え、得られた混合物を0℃まで冷却した。次に、THF(50mL)に溶解した塩化パラトルエンスルホニル(p-toluenesulfonyl chloride)(6.86g、48.77mmol)を、30分間かけて滴下漏斗を介して滴下した。反応混合物を0℃にて2時間以上攪拌した後、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してTHFを除去し、その後EtOAc(40mL)と水(30mL)で希釈して、EtOAc(2x75mL)を用いて抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、灰色の濁った油状の材料としての化合物40(7.13g)を得た。
FT- IR: 2878, 1598, 1453, 1356, 1177, 1097 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.80 (d, J=8Hz, 2H), 7.34 (d, J=8Hz, 2H), 4.16 (t, 2H, CH 2 OTs), 3.67-3.70 (m, 2H, -CH 2 -CH2OTs ), 3.58-3.62 (m, 6H, TEG OCH 2 ´s), 3.37 (s, 3H, OCH 3 ), 2.44 (s, 3H, Ar-CH 3 ) ppm; 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ = 144.91, 133.19, 129.94, 128.12, 72.05, 70.90, 70.71, 69.36, 68.83, 59.17, 21.78 ppm.
(トリエチレングリコールモノエチルエーテルトシラート)(42)の合成(2−(2−(2−エトキシエトキシ)エトキシ)エチル 4−メチルベンゼンスルホン酸とも称される)
トリエチレングリコールモノエチルエーテル41(4.9mL、28.1mmol)をTHF(30mL)に溶解した。水酸化カリウム(3.7g、65.95mmol)の水溶液(25mL)を加えた。その後、反応混合物を0℃まで冷却した。次に、THF(50mL)に溶解した塩化パラトルエンスルホニル(6.86g、48.77mmol)を、30分間かけて滴下漏斗を介して滴下した。反応混合物を0℃にて2時間以上攪拌した後、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してTHFを除去し、その後EtOAc(40mL)と水(30mL)で希釈して、EtOAc(2x75mL)を用いて抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、ろ過して減圧下で濃縮して、灰色の濁った油状の材料としての化合物42(6.83g)を得た。
FT-IR: 2870, 2975, 1598, 1453, 1358, 1177, 1110 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.77 (d, J=8Hz, 2H), 7.31 (d, J=8Hz, 2H), 4.13 (t, 2H, CH 2 OTs), 3.64-3.67 (m, 2H, -CH 2 CH2OTs ), 3.52-3.59 (m, 8H, TEG OCH 2 ´s), 3.49 (q, J=8Hz, 2H, -OCH 2 CH3), 2.42 (s, 3H, Ar-CH 3 ), 1.17 (t, J=8Hz, 3H, -OCH2 CH 3 ) ppm.
メトキシポリエチレングリコールトシラート(44)の合成
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル43(5g、14.29mmol、平均分子量:350Da)をTHF(50mL)に溶解した。水酸化カリウム(1.76g、31.44mmol)の水溶液(25mL)を加えた。その後、反応混合物を0℃まで冷却した。次に、THF(50mL)に溶解した塩化パラトルエンスルホニル(3.27g、17.14mmol)を、30分間かけて滴下漏斗を介して滴下した。反応混合物を0℃にて2時間以上攪拌した後、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してTHFを除去し、その後EtOAc(40mL)と水(30mL)で希釈して、EtOAc(2x75mL)を用いて抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、ろ過して減圧下で濃縮して、灰色の濁った油状の材料としての化合物44(5.91g)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.74 (d, J=8Hz, 2H), 7.29 (d, J=8Hz, 2H), 4.11 (br t, 2H, CH 2 OTs), 3.49-3.65 (m, 28H, -CH 2 -CH2OTs & PEG OCH 2 ´s), 3.32 (s, 3H, OCH3), 2.39 (s, 3H, Ar-CH 3 ) ppm.
トリエチレングリコールモノエチルエーテルピペラジン(46)の合成(1−(2−(2−(2−エトキシエトキシ)エトキシ)エチル)ピペラジン)(46)とも称される)(TEG−Pip)
ピペラジン(10.4g、〜120mmol)を窒素雰囲気下アセトニトリル(150mL)に溶解した。アセトニトリル(30mL)に溶解した化合物42(5g、15.04mmol)を滴下した。得られた混合物を12時間室温にて攪拌し、減圧下で濃縮してアセトニトリルを除去した。MeOH:CH2Cl2(8:92)を溶離剤として用いて粗生成物をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、無色液体としての純粋な化合物46(1.52g、41%)を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3.54-3.64 (m, 10H, TEG OCH 2 ´s), 3.50 (q, J=8Hz, 2H, -OCH 2 CH3), 3.43 (s, 1H, NH), 2.88 (t, 4H, Piperazine ring-CH 2 ), 2.55 (t, 2H, OCH2-CH 2 -Piperazine), 2.46 (br m, 4H, Piperazine ring-CH 2 ), 1.18 (t, J=8Hz, 3H, -OCH2 CH 3 ) ppm; 13C NMR: 70.76, 70.70, 70.47, 69.92, 68.86, 66.73, 58.47, 54.89, 50.55, 45.99, 15.25 ppm; MS (ESI) calcd. for C12H27N2O3 ([M+H]+) 247.2016, found 247.2014.
2−(2−(2−メトキシエトキシ)エトキシ)アセトアルデヒド(45)の合成
塩化オキサリル(5mL、58.24mmol)を窒素雰囲気下CH2Cl2(75mL)に溶解した。得られた混合物をドライアイス/アセトン混合物を用いて−78℃まで冷却した後、CH2Cl2(15mL)で希釈したDMSO(5mL)を慎重に滴下した。滴下完了後、反応混合物を10分以上攪拌して、CH2Cl2(30mL)で希釈したトリエチレングリコールモノメチルエーテル39(5mL、31mmol)を滴下した。滴下完了後、反応混合物を15分間攪拌した。次に、CH2Cl2(20mL)で希釈したEt3N(20mL、143mmol)を20分間かけて滴下し、30分以上−78℃まで攪拌した後、室温に戻した。次に、白い「乳白」色の反応混合物を水(2x45mL)とブライン(40mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、ろ過して減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeOH/EtOAc(0:100〜10:90)を溶離剤として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、アルデヒド45(2.40g)を得た。1H NMR分析によって、化合物47が分離できないいくらかの不純物で汚染されたことが明らかになった。
FT-IR: 3436, 2879, 1734,1454,1353,1108, 1028 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ ppm: 9.73 (s, 1 H, CHO), 4.16 (s, 2H), 3.54-3.76 (m, 10H), 3.38 (s, 3H) ppm. (Product is contaminated with starting material. Product is approximately 50%.)
2−(2−(2−エトキシエトキシ)エトキシ)アセトアルデヒド(47)の合成
原料にトリエチレングリコールモノメチルエーテル(39)の代わりにトリエチレングリコールモノエチルエーテル(41)を使用したこと以外は、上記化合物と同じ手順を用いた。化合物47(収量:2.34g、〜42%)は、分離できないいくらかの不純物で汚染された。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ ppm: 9.67 (s, 1 H, CHO), 4.10 (s, 2H), 3.52-3.69 (m, 10H), 3.45 (q, 2H), 1.15 (t, 3H) ppm. (Product is contaminated with starting material. Product is approximately 42%).
3,6−di−O−TBDMS−キトサンの直接N修飾によるキトサンのTEG化
図25のスキーム8を参照のこと。
N−(2−(2−(2−エトキシエトキシ)エトキシ)エチルアミノキトサン TEG0.41−CS(49a)の合成
DiTBDMS−キトサン8(300mg、0.77mmol)をNMP(5mL)に溶解して、反応容器内で50℃に加熱した。Cs2CO3(1g、3,07mmol)と触媒量のヨウ化カリウムを加えた。次に、反応容器を密閉して反応混合物を2時間攪拌した後、シリンジを介して化合物42(767mg、2.31mmol)を加えた。反応混合物を48時間攪拌した後、冷却して氷水に流し込み、得られた沈殿物を濾過して真空オーブンで乾燥させた。黄色い粉末としての粗生成物48a(270mg)を得た。それを下述の次の脱保護工程でそのまま用いた。
ヒドロキシル基を脱保護するために(シリル基の除去)、粗化合物48aをMeOH(15mL)に懸濁した。濃縮HCl(2mL)を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を12時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeOH(15mL)に再懸濁して、濃縮HCl(2mL)を加えて12時間攪拌した後、希釈してNaCl水溶液(5%、35mL)でイオン交換して、脱イオン水に対して3日間透析した。透析完了後、水溶性材料を凍結乾燥して、白く粘着性のある材料としての49a(125mg)を得た。
FT-IR: 3418, 2874, 1712, 1631, 1536, 1378, 1077 cm-1; 1H NMR (400MHz, D2O) δ = 4.68 and 4.27 (s, 1H, chitosan H-1 & H-1´), 3.14-3.97 (br m, 10H, chitosan H-2 to H-6, TEG (〜41% DS) OCH 2 ´s and O-CH 2 CH3), 2.96-3.14 (br m, 1H, H-2 & H-2´), 1.21 (t, 1.24 H (〜41% DS) TEG O-CH2 CH 3 ) ppm.
N−(2−(2−(2−エトキシエトキシ)エトキシ)エチルアミノキトサン TEG0.27−CS(51b)の合成(置換度27%)
トリエチレングリコールトシラート(42)エージェントを3当量の代わりに1.5当量用いたこと以外は、上記と同じ手順を用いて化合物49bを準備した。白く粘着性のある材料としての化合物49b(27mg)を得た。
FT-IR: 3417, 2876, 1602, 1382, 1259, 1078, 599 cm-1; 1H NMR (400MHz, D2O: DCl, 95:5) δ = 5.13 and 4.95 (s, 1H, chitosan H-1 & H-1´), 3.24-3.99 (br m, 12H, chitosan H-2 to H-6, H-2´, TEG (27% DS) OCH 2 ´s and O-CH 2 CH3), 1.21 (t, 0.89 H, TEG O-CH2 CH 3 ) ppm.
N−アセチルブロモ−3,6−O−diTBDMS−キトサン(9)の合成
DiTBDMS−キトサン 8(3g、7.70mmol)(Ingolfur Magnusson氏によって前もって合成されたもの)を窒素雰囲気下CH2Cl2(30mL)に溶解した。得られた混合物を−20℃まで冷却して、シリンジを用いてトリエチルアミン(5.30ml、38mmol)を加えた。10分間攪拌した後、CH2Cl2(2.5mL)で希釈した臭化ブロモアセチル(2.65ml、30.51mmol)をシリンジを用いて滴下した。反応混合物を−20℃にて1時間攪拌した後、CH2Cl2(70mL)で希釈して、即座に減圧下で濃縮した。次に、こげ茶色の材料を粉砕してアセトニトリル(3x35mL)で洗浄して乾燥させた後、CH2Cl2(40mL)に再溶解して分液漏斗に移し、水(2x25mL)とブライン(35mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、茶色の固体材料としてのブロモアシル中間体9(2.57g)を得た。
FT-IR (KBr): ν 3404 (br , NH), 2956-2858 (s, C-H TBDMS), 1682 (vs, C=O amide I), 1530 (vs, C=O amide II), 1473, 1391, 1362, 1311, 1259, 1101, 1005, 837, 777 (Si-C), 669 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 4.40 (br s, 1H, H-1), 3.26-4.02 (m, 8H, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and GluNH-C=OCH 2 Br), 0.90 and 0.88 (br s, 18H, (CH3)3C-Si), 0.13 and 0.07 (br s, 12H, CH3-Si) ppm.
N−アセチルブロモ−3,6−diTBDMS−キトサンに対する求核置換反応によるキトサンのPEG化
N−(アセチルピペラジン−TEG)−キトサン(51)
(i)アセチルブロモキトサン9(200mg、0.397mmol)を窒素雰囲気下でCH2Cl2(25mL)に溶解した。CH2Cl2(10mL)で希釈した化合物46(204mg、0.828mmol)を室温にて滴下した。得られた混合物を10分間攪拌した後、トリエチルアミン(115μL、0.828mmol)を加えた。攪拌を24時間室温にて続け、原料46の総消費量をMeOH:CH2Cl2(1:9)におけるTLCを調べて確認した。その後、反応混合物を分液漏斗に移し、有機相を水(2x35mL)とブライン(35mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、次の脱保護工程でそのまま用いられる粗液としての化合物50(214mg)を得た。
(ii)ヒドロキシル基を脱保護するために(シリル基の除去)、粗化合物50をMeOH(15mL)に懸濁した。濃縮HCl(2mL)を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を12時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeOH(15mL)に再懸濁して、濃縮HCl(2mL)を加えて12時間攪拌した後、希釈してNaCl水溶液(5%、35mL)でイオン交換して、脱イオン水に対して3日間透析した。透析完了後、水溶性材料を減圧下で乾燥させて、黄色がかった透明な粘着性のある材料としての51(112mg)を得た。
1H NMR (400MHz, D2O) δ = 4.63 (s, 1H, chitosan H-1), 2.74-3.76 (m, 30H, chitosan H-2 to H-6, GlcNHCOCH 2 -Pip-TEG, TEG OCH 2 ´s & O-CH 2 CH3, piperazine ring-CH 2 ´s ), 1.21 (t, 3 H, TEG O-CH2 CH 3 ) ppm; DS= 100%.
N−アセチル−ピペラジン−テトラフェニルポルフィリン(TPP−NH−Pip)(5)の合成
上記実施例1およびスキーム1に記載されている通りに合成した。
TPP−NH−CO−CH2−TBDMS−キトサン(55)の合成
図26のスキーム9を参照のこと。
DiTBDMS−キトサン(100mg、mmol)を55℃にてNMP(10mL)に溶解した。炭酸セシウム(500mg、1.54mmol)を加えて反応混合物を15分間攪拌した後、化合物4(72.2mg、0.096mmol)を加えた。触媒量のヨウ化カリウムを加えて24時間攪拌を続け、触媒量のDMAPを加えて24時間攪拌した後、冷却して水に注ぎ込んだ。沈殿物を濾過して真空オーブンで乾燥させ、粗固体としての化合物55を得た。しかしながら、赤色の水溶液が観察されており、化合物がいくらか水に溶けて無駄になったことを示している。これは、NMPによるものと考えられる。従って、この段階での透析は有益であろう。
1H NMR (400MHz, D2O) δ ppm: 8.84-8.86 (br m, β-pyrrole H), 8.68 (s, TPPNHCO), 8.21-8.22 (m, tetraphenyl-Ho), 7.99 (d, J= 8.0 Hz, RNHTPP-phenyl-Hm), 7.72-7.79 (m, triphenyl-Hm,p), 2.72-4.80 (m, chitosan H-2-H6, TPPNHCOCH 2 ), 0.89-0.90 (br s, (CH3)3C-Si), 0.05-0.07 (br s, 12H, CH3-Si). -2.78 (s, α-pyrrole NH); ( (DS of TPP-NHCOCH2 = 〜 5%)
TPPp0.1−BrA0.9−DiTBDMS−CS(52)の合成
化合物9(800mg、1.587mmol)を室温にて窒素雰囲気下でCH2Cl2(40mL)に溶解した。TPP−NH−Pip 5(120mg、0.158mmol)を加え、トリエチルアミン(30μl、0.216mmol)を加えた。反応混合物を室温にて24時間攪拌した。原料5の消費の完了をTLC(MeOH:CH2Cl2、1:9)で確認した。反応混合物をCH2Cl2(75mL)で希釈して水(2x35mL)とブライン(25mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、紫色の固体としての52(収量:716mg)を得た。
1H NMR (CDCl3) δ ppm: 9.31 (s, TPPNHCO), 8.84-8.86 (m, β-pyrrole H), 8.20-8.23 (m, tetraphenyl-Ho), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, RNHTPP-phenyl-Hm), 7.74-7.79 (m, triphenyl-Hm,p), 4.43 (br s, H-1), 3.50-4.14 (m, chitosan H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and H-2 GluNHCO, TPPNHCOCH 2 -Pip, -CH 2 CONGlc and Piperazine ring-CH 2 's), 2.81-2.86 (m, piperazine ring-CH 2 's), 0.91, 0.87 (br s, (CH 3 ) 3 C-Si), 0.07, 0.14 (br s, CH3-Si), -2.77 (br s, α-pyrrole NH) ppm; (DS of TPP-NH-Pip =〜10%).
TPPがコンジュゲートされたDiTBDMS−CSのTEG化および脱保護
TEG化されたN−(TPP−NH−CO−CH2)−キトサン(57)の合成
(i)粗化合物55(350mg、0.833mmol)を反応容器内で50℃にてNMP(10mL)に溶解した。Cs2CO3(1.09g、3.33mmol)を加えて反応混合物を30分間攪拌した後、化合物42(1.108g、4.16mmol)と触媒量のヨウ化カリウムを加えた。攪拌を12時間続けた後、反応混合物を冷却し、水(30mL)で希釈して脱イオン水に対して3日間透析し、凍結乾燥して、次の脱保護工程でそのまま用いられる化合物56を得た。
(ii)粗化合物56をMeOH(15mL)に懸濁した。濃縮HCl(2mL)を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を12時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeOH(15mL)に再懸濁して、濃縮HCl(2mL)を加えて12時間攪拌した後、希釈してNaCl水溶液(5%、35mL)でイオン交換して、脱イオン水に対して3日間透析した。透析完了後、水溶性材料の一部を減圧下で乾燥させて、茶色の固体としての57(115mg)を得た。
TEG化されたTPP−NH−Pip−キトサンTPPp0.1−CS−TEG0.9(54)の合成
(i)化合物52(400mg、0.799mmol)を窒素雰囲気下でCH2Cl2(35mL)に溶解した。化合物46(394mg、1.56mmol)を加え、続いてEt3N(222μl、1.56mmol)を加えて反応混合物を室温にて24時間攪拌した。次に、TLCを確認して、Et3N(222μl、1.56mmol)を加えて原料46の消費を完了させて、攪拌を12時間以上続けた。その後、反応混合物を減圧下で濃縮して、次の脱保護工程でそのまま用いられる粗材料としての53(417mg)を得た。
(ii)粗化合物53をMeOH(15mL)に懸濁した。濃縮HCl(2mL)を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を12時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeOH(15mL)に再懸濁して、濃縮HCl(2mL)を加えて12時間攪拌した後、希釈してNaCl水溶液(5%、35mL)でイオン交換して、脱イオン水に対して3日間透析した。透析完了後、水溶性材料を凍結乾燥して、赤紫褐色の固体としての最終化合物54(252mg)を得た。
FT-IR: 3431, 2869, 1665, 1529, 1442, 1308, 1109, 1070, 1029, 800, 701, 559 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.83 (br m, β-pyrrole H), 8.15-8.22 (m, tetraphenyl-Ho), 8.11(d, J= 8.0 Hz, RNHTPP-phenyl-Hm), 7.80-7.88 (m, triphenyl-Hm,p), 4.55 (br s, H-1), 2.54-3.65 (br m, partially overlapped with HDO peak, chitosan H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and H-2 GluNHCO, TPPNHCOCH 2 -pip, CH 2 CONGlc, piperazine ring-CH 2 's, TEG OCH2's and TEG OCH 2 CH3 ), 1.09 (t, TEG OCH2 CH 3 ) ppm.; (DS of TPP-NH-Pip = ~ 10% and DS of TEG= 〜90%)
構造データをNMR、FT−IRおよび質量分析(データ図示せず)によって確認した。図27に化合物54の代表的なNMRスペクトルを示す。
実施例5
インビトロT細胞活性化アッセイ
キトサンコンジュゲート32、38のMHCクラスI制限抗原提示およびCD8+T細胞活性化に対する効果をテストするために、オバルブミン特異的(OVA 257−264)CD8+T細胞クローンを有する抗原特異的T細胞設定(antigen-specific T cell setting)において、マウス初代マクロファージをコンジュゲート32、38およびオバルブミンOVA 257−264ペプチド抗原とインキュベートした。活性化CD8+T細胞からのIL−2産生を、ELISAで分析した。
骨髄由来のマクロファージ(BMDM)は、オバルブミン特異的T細胞ハイブリドーマを有する抗原特異的T細胞設定において、抗原提示細胞(APC)として用いられた。BMDMは、20%L−292細胞株上清を添加した培地において、マウス骨髄細胞を少なくとも5日間培養することによって産生された。
キトサンコンジュゲート32、38を添加して/添加せずに、1ウェルあたり30,000個のAPCを96ウェルプレート内で一晩インキュベートした。コンジュゲートの濃度は、TPC濃度が0.05μg/mlとなるように調整された。次の日、APCを2μg/mlの抗原性ペプチド(OVA 257−264、Anaspec社より入手)と4時間インキュベートした(全ての刺激を3倍にした)。
細胞を洗浄し、異なる照射量の青色光(0、30、60、90、180秒)で曝露した後、1ウェルあたり100,000個のオバルブミン特異的T細胞を添加してAPCと一晩共培養した。CD8+T細胞クローンRF33.70(OVA 257−264のMHC I−制限認識)を用いた。
CD8+T細胞およびAPCを一晩共培養した後、細胞培養から上清を採取した。上清を標準マウスIL−2 ELISAを用いて分析し、活性化されたT細胞からのインターロイキン(IL)−2の産生を調べた(IL-2 ELISA Duoset, RnD Systems社、T細胞培養の各ウェルからの2重(duplicates)分析、25μlの不希釈上清を各ELISAウェルにおいて分析した)。
その結果(図28)、これらのコンジュゲートを用いると、CD8+抗原特異的T細胞によるIL−2の産生が、照射された細胞において顕著に増加することが分かった(例えば化合物32コンジュゲートはIL−2の産生を2倍にした、図28A)。抗原を含まないコンジュゲートとインキュベートされた、照射された標準細胞には、そのような増加は見られなかった(データ図示せず)。これは、観察された効果は抗原依存であり、何らかの特定されていない光化学的処理の効果によるものではないことを実証している。APCの表面上で抗原性ペプチドの提示が促進したのは、観察されたIL−2産生の増加が原因であることを実証している。

Claims (44)

  1. 光増感物質とキトサンのコンジュゲートを含む、下記式(I)で表される化合物。
    [前記式中、
    nは、3以上の整数であり、
    Rは、前記化合物においてn回出現し(Rn基)、
    前記総Rn基の0.5%〜99.5%において、各Rは、
    H,
    但し、aは1、2、3、4または5であり;XはBr、ClまたはOHである。;
    但し、各R1は、同一であっても異なっていてもよく、H、CH3および−(CH2c−CH3から選択され;bは1、2、3、4または5であり;cは0、1、2、3、4または5である。;
    但し、YはO;S;SO2;−NCH3;または−N(CH2eCH3であり;d=1、2、3、4または5であり;e=1、2、3、4または5である。;
    但し、R2は−(CH2h−CH3または−CO−(CH2h−CH3であり;fは1、2、3、4または5であり;gは1、2、3、4または5であり;hは0、1、2、3、4または5である。;
    但し、R3は−(CH2j−CH3であり;iは1〜200の整数であり;jは0、1、2、3、4または5であり;kは1、2、3、4または5である。;
    但し、R3は−(CH2j−CH3であり;iは1〜200の整数であり;jは0、1、2、3、4または5である。;
    但し、R3は−(CH2j−CH3であり;iは1〜200の整数であり;jは0、1、2、3、4または5であり;各R1は同一であっても異なっていてもよく、H、CH3および−(CH2c−CH3から選択され;cは0、1、2、3、4または5である。;
    但し、R3=−(CH2j−CH3であり;iは1〜200の整数であり;jは0、1、2、3、4または5である。;
    但し、R3=−(CH2j−CH3であり;iは1〜200の整数であり;Lは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり;jは0、1、2、3、4または5である。;
    および
    但し、mは1、2、3、4または5である。;
    から選択される基Aであり、

    前記総Rn基の0.5%〜99.5%において、各Rは、
    から選択される基Bであり、
    但し、pは0、1、2、3、4または5であり;qは1、2、3、4または5である。;
    4は、
    から選択される基である。;
    Wは、O、S、NHまたはN(CH3)から選択される基である。
    7は、
    から選択される基である。;
    Vは、CO、SO2、PO、PO2HまたはCH2から選択される基である。;
    8は、同一であっても異なっていてもよく、H、−OH、−OCH3、−CH3、−COCH3、C(CH34、−NH2、−NHCH3、−N(CH32および−NCOCH3から選択される基(o、mまたはp位で置換)である。;
    各R基は、同一であっても異なっていてもよい。]
  2. iは1〜10の整数である、請求項1に記載の化合物。
  3. nは10〜100の整数である、請求項1または2に記載の化合物。
  4. 4は、
    から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  5. 7は、
    から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。
  6. 4は、TPCa1またはTPCa2である、請求項4に記載の化合物。
  7. 基Aは、総Rn基の70〜95%であり、基Bは、総Rn基の5〜30%である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
  8. R基の各基Aは、
    および
    から選択され、各R基は同一であっても異なっていてもよい、請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物。
  9. 基Aが
    の場合、各R1はCH3であり、bは1である、請求項8に記載の化合物。
  10. 基Aが
    の場合、Yは−NCH3であり、dは1である、請求項8に記載の化合物。
  11. 基Aが
    の場合、jは0または1であり;iは3または6であり、kは1である、請求項8に記載の化合物。
  12. 基Aが
    の場合、jは1であり、iは2である、請求項8に記載の化合物。
  13. 基Aが
    の場合、jは0または1であり、iは2、4または5であり、Lは1である、請求項8に記載の化合物。
  14. 基Aが
    の場合、mは1である、請求項8に記載の化合物。
  15. R基の各基Bは、
    から選択され、各R基は同一であっても異なっていてもよい、請求項1〜14のいずれか1項に記載の化合物。
  16. pは1であり、存在する場合、qは1である、請求項15に記載の化合物。
  17. 前記化合物は、下記に記載の化合物から選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の化合物。
  18. インビトロまたは生体外で分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法、あるいは、インビボで分子をヒト以外の動物の細胞のサイトゾル内に導入する方法であって、
    導入対象分子と請求項1〜17のいずれか1項に定義された化合物とを前記細胞に接触させること、および、
    前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記分子をサイトゾル内に放出することを含み、
    前記導入対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、方法。
  19. インビトロまたは生体外で細胞死を達成する方法、あるいは、インビボでヒト以外の動物の細胞死を達成する方法であって、
    請求項1〜17のいずれか1項に定義された化合物を前記細胞に接触させること、および、
    前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することを含む、方法。
  20. インビトロまたは生体外で抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法、あるいは、インビボで抗原分子またはその一部をヒト以外の動物の細胞表面上に発現させる方法であって、
    前記抗原分子と請求項1〜17のいずれか1項に定義された化合物とを前記細胞に接触させること、および、
    前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含み、
    前記抗原分子は前記細胞のサイトゾル内に放出され、免疫応答を刺激するのに十分な大きさの前記抗原分子またはその一部は前記細胞の表面上に提示される、方法。
  21. 請求項1〜17のいずれか1項に定義された化合物と、
    1つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と、
    任意選択で内在化対象分子とを含み、
    前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、医薬組成物。
  22. 療法、遺伝子療法または免疫応答刺激のための、請求項21に定義された組成物。
  23. 前記療法は癌療法である、請求項22に記載の療法のための組成物。
  24. 対象における病気、疾患または感染の治療または予防のための、請求項22のいずれか1項に定義された組成物であって、
    任意選択で内在化対象分子を含み、前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、組成物。
  25. 前記病気、疾患または感染において、異常なもしくは過剰な細胞成長が明らかである、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現が明らかである、請求項24に記載の治療または予防のための組成物。
  26. 前記病気が癌である、請求項25に記載の治療または予防のための組成物。
  27. 前記治療または予防は、内在化対象分子と前記組成物とを前記対象における細胞に接触させること、および、前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含む、請求項24〜26のいずれか1項に記載の治療または予防のための組成物。
  28. 前記内在化対象分子は、細胞毒性分子である、請求項27に記載の治療または予防のための組成物。
  29. 前記細胞毒性分子はブレオマイシンである、請求項28に記載の治療または予防のための組成物。
  30. 前記治療または予防は、前記組成物を前記対象における細胞に接触させること、および、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することを含む、請求項24〜26のいずれか1項に記載の治療または予防のための組成物。
  31. 免疫応答を生じさせることによって、対象における病気、疾患または感染を治療または予防する、請求項24のいずれか1項に定義された組成物。
  32. 前記治療または予防がワクチン接種によって達成される、請求項31に記載の治療または予防のための組成物。
  33. 前記治療または予防は、前記組成物と抗原分子とを対象における細胞に接触させること、および、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含み、
    前記抗原分子は前記細胞のサイトゾル内に放出され、免疫応答を刺激するのに十分な大きさの前記抗原分子またはその一部は前記細胞の表面上に提示される、請求項31または32に記載の治療または予防のための組成物。
  34. 請求項18〜20のいずれか1項に定義された方法によって得られる、細胞または細胞集団。
  35. 療法のための請求項34に定義された細胞または細胞集団。
  36. 癌療法、遺伝子療法または免疫応答刺激のための、請求項35に記載の療法のための細胞または細胞集団。
  37. 患者における病気、疾患または感染の治療または予防のための薬剤調製における、請求項1〜17および21のいずれか1項に定義された化合物または組成物および任意選択で内在化対象分子の使用であって、
    前記治療または予防は、前記化合物または組成物を請求項18に定義された方法によって、インビトロ、インビボまたは生体外(ex vivo)で1つ以上の細胞に導入すること、および、
    必要に応じて、前記細胞を前記患者に投与することを含み、
    前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、使用。
  38. 前記病気、疾患または感染において、異常なもしくは過剰な細胞成長が明らかである、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現が明らかである、請求項37に記載の使用。
  39. 前記病気が癌である、または前記治療または予防において免疫応答が生じる、請求項37または38に記載の使用。
  40. 前記治療または予防がワクチン接種である、請求項39に記載の使用。
  41. 請求項1〜17および21のいずれか1項に定義された化合物または組成物と、内在化対象分子とを含むキットであって、前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、キット。
  42. 対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、同時に、別個に、または順に使用される、請求項41に記載のキット。
  43. 療法のための、請求項41又は42に記載のキット。
  44. 前記療法が、癌療法、遺伝子療法または免疫応答を刺激するためのものである、請求項43に記載のキット。
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