JP6442440B2 - 悪性疾患の臨床症状より最大10年前に早期がんを検出及びがんを診断するための標的化2次元ウエスタンブロット分析の方法及び組成物 - Google Patents
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Description
なし。
本発明は、がん検出及び診断の分野、より詳細には、NADHを標的とした検出に基づく機能性1本鎖可変領域組換えENOX2抗体に一般的に関する。
なし。
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、全体として参照により本明細書に組み込まれる。2016年5月30日付けで作製された、前記ASCIIコピーは、MNCE1002.txtと名付けられ、サイズ18キロバイトである。
ブロットは、全てのENOX2検出する試薬、及びブロット上のENOX2転写物バリアントを活性化するENOX2の還元基質に曝露され、ブロットは、表1由来の1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在について分析され、
1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在を用いて、臨床症状より少なくとも1年前にヒトがんの原発組織が検出され、決定され、1又は2以上のインサイチュENOX2転写物バリアントの活性化は、非活性化ENOX2転写物バリアントと比較したとき、検出感度を10〜100倍増大する。
本発明を用いることで、ウエスタンブロット検出プロトコールの感度及び特異性の10〜100倍の増大は、抗体結合部位阻害性リガンドへの血清ENOX2の曝露後、NADH酸化の阻害の遅延時間が存在したという知見からもたらされた。阻害は、30分のインキュベーション中0から22分の間の種々の時間(22分はENOX2活性サイクルの長さである(Wang et al., 2001. Biochim. Biophys. Acta 1539:192-204))において生じることが観察された。従って、EEMTE抗体結合部位が抗体との結合に使用可能である、それぞれの22分の活性サイクル中の時間は、比較的短く、5分未満程度である。また、ENOX2タンパク質は、抗体が、この比較的短い枠の機会中に結合部位へのアクセスに到達させるために活性でなければならない。
転写物バリアントは、がん細胞により特異的に産生される分子署名分子であり、非がん細胞に非存在であるので、それらは、循環中に流れ出し、偽陽性と偽陰性のいずれの発生率も低い、リスク集団における原発がん及び再発がんの両方の早期検出のための決定的な非侵襲性及び感受性血清マーカーとして作用する可能性を有する。
ENOX2 EEMTETKETEESALVS (配列番号1)下線が引かれたアミノ酸399〜406
アルファ−フェチュイン GTDCVAKEATEAAKCN (配列番号2)下線が引かれたアミノ酸210〜216
セロトランスフェリン CLDGTRKPVEEYANCH (配列番号3)下線が引かれたアミノ酸588〜595
1.再水和溶液を調製/解凍する(−20、RBと標識した1.5mLのチューブ)。
a.使用前に1%ジチオスレイトール(DTT)を溶液に加える(0.01g/1.0mL)。
2.再水和バッファー120μLを1.7mlのチューブに加える。
3.血清 30μLをチューブに加える。
4.完全に混合されるまで溶液をボルテックスする。
5.冷凍庫(−20℃、pH3〜10)からImmobiline DryStripを取り出し、ストリップをRTまで5分間平衡化する。
a.ストリップをRTにおいて10分より長く置かない。
6.ストリップ由来のID番号を記録する。
7.7cmのDryStrip毎にトレイに試料130μLをロードする。トレイは同じ高さであることを確実にする。
8.DryStripゲルを下にして試料上に置く。
9.必要とされれば、試料の中及び外へストリップを数回注意深く持ち上げることにより、試料がストリップを通じてむらなく広がっていることを確実にする。
10.試料がストリップの1つの領域において濃縮されるなら、ピペッティングすることにより試料を再分配する。
11.DryStrip上においてピペットチップで優しく押し下げることにより、気泡を取り除く。
12.トレイ上に蓋を置き、ddi−H2Oに浸したペーパータオルを有するプラスチックバック内にトレイを置く。
13.バッグを密封する。
14.ストリップに試料を12〜24時間吸収させるレベル表面上で、一晩RTにおいて試料を再水和物させる。
1.IPGphorをオンにする(機械の正確な立ち上げを確実にする)。
2.次の通り、Manifold電気泳動トレイ上にストリップを置く。
a.ゲルを上にする。
b.陽性(酸性)終末まで元に戻す。
c.ストリップを並べる。
d.金属ストリップ間(つまり電極をフィットさせ、金属ストリップを接触させる)。
3.1つのストリップ当たり2つのPaper Wickを得る。
4.1つの芯当たりdi−H2O 150μLで芯を湿らせる。
5.ゲル(およそ0.3cm)の陽極端と陰極端に渡り芯を置く。
6.芯上に電極を置くが、ゲルから離し(極が金属プレート上にあることを確認する)、所定位置に固定する。
7.DryStrip Cover液でストリップをカバーする。
a.ストリップ全部のレーンをオイルで満たす。
b.ストリップが完全にカバーされていることを確実にする。
8.蓋を閉める。
9.IPGphor IIでIEF実行する。
a.最大アンペア数:50μAmps。
b.温度:20℃。
c.初期電圧をチェックすることにより、正確なアセンブリーを確実にする。
d.必要に応じて、実行を中止し、芯を置き換え、乾燥した前面が見えなくなるまで実行を継続する。
1.使用前に、石鹸及び温水中で十分にプレートを洗浄し、ごしごし洗う。
2.di−H2Oにおいてすすぐ。
3.プレートをそのまま空気乾燥させるか、又はエタノールに浸したKimwipeで拭く。
4.マニュアルの通り、Protean-plus Multi-Gel casting Chamber(Bio-Rad社)において(それぞれのプレートとブロックとの間の空間で)プレートを整える。
5.スクリューが完全に締め付けられていることを確実にする。
6.ゲル溶液を加える。
7.ゲルがガラスプレートの上部から約1〜1.5cmであるとき、注入を止める。
8.エタノールでゲルを優しく覆う。
9.Saran Wrapでカバーする。
10.ゲルを少なくとも1時間(なるべく一晩)重合させる。
1.トレイからストリップを取り出し、Kimwipe上に置いて、過剰のオイルを取り除く。
1.ストリップのゲルを上にしてKimwipe上に置く。
2.第2のKimwipeでストリップを覆い、優しく拭き取って、オイルを取り除く。
2.ストリップを平衡プレート中にゲルを上にして置き、凍結するか、又は平衡化する。
1.凍結:プレートをプラスチックラップにおいて包み、−80℃において保存する。
a.平衡前にストリップを解凍する(解凍されたとき、透明)。
2.平衡化:次のステップまで継続する。
3.1つのストリップ当たり平衡バッファー約1.5mLでストリップをカバーする。
4.液化されるまで、アガロースを加熱する。
5.20分、RTにおいて振盪する。
1.約3cm×0.75cmに切断したWhatman 3MMクロマトグラフィー紙に標準液8μLを加えることにより、左(pH10側)マーカーを調製する。標準液は、紙の底部、高さ約1cmに加えられなければならない。
2.約3cm×0.75cmに切断したWhatman 3MMクロマトグラフィー紙に標準液8μLを約3cm×0.75cmに加えることにより、右(pH3側)マーカーを調製する。標準液は、紙の底部、高さ約1cmに加えられなければならない。
3.平衡バッファーを捨てる。
4.SDSランニングバッファーにおいてストリップをカバーし、過剰の平衡バッファーをすすぎだす。
5.SDSランニングバッファーをストリップから取り除く。
6.SDSランニングバッファーのすすぎを繰り返す。
7.ゲルを外にしてSDS−PAGEゲルの後ろプレート上にストリップを注意深く置く。
8.皮膚に触れるのに十分なほど冷却したら、1%低融点アガロースでストリップを覆う。
1.ゲルの下に気泡が形成されていないことを確実にする。
2.定規を用いてゲルを軽くたたき、気泡を取り除く。
9.マーカーがストリップ上のゲルまで平らであることを確実にしながら、IEFストリップの適当な端にマーカーの次のものを挿入する。
10.アガロースの重合作用を可能にする。
11.2次元においてロードされるべきそれぞれのストリップについて継続する。
12.Dodecaタンクにおいてヒンジ側を下にゲルを置く。
13.全てのゲルがタンクに入れられた後、ゲルが、全体としてSDSランニングバッファーによりカバーされていることを確実にする。
14.2次元実行が13℃において行われる。
1.250V。
2.1〜1.5時間(ゲルの前面がタンクの蓋の管類に近づくまで、ゲルを実行させる)。
1.Dodecaタンクからゲルを取り出す。
2.ゲルを所望のサイズに切る。
3.トレイ(ゲルをフィットさせるのに十分な大きさ)をトランスファーバッファーで満たす。
4.トランスブロット細胞においてスポンジを、1つのゲル当たり2つのスポンジを置いた。
5.トランスファーバッファーでタンクを満たして、スポンジにトランスファーバッファーを染み込ませる。
6.予め切断したトランスファー膜を浸す。
7.アセンブリートランスファーカセットは次の通り。
1.黒色側が下。
2.トランスファーバッファーにおいて浸されたスポンジ。
3.濾紙。
4.ゲル。
5.ニトロセルロース膜−一旦ゲル上に置いたら膜を動かしてはいけない。
6.濾紙。
7.スポンジ。
8.ゲルと膜との間で全ての気泡が取り除かれていることを確実にする。
9.トレイをトランスブロットタンクに置いて、トレイの黒色側(ゲル側)を黒色タンク側に置く。
10.4℃及び次の条件においてトランスファーする(必要とされるなら、トランスファーは氷浴中で成され得る)。
1.50分間90V。
2.膜は、トランスファーの後、一晩4℃においてタンク内にそのままにすることができる。
1.膜をトランスファーから取り出す。
2.膜を(膜をカバーするのに十分な)1%ミルクにおいてすすぎ、10分、RTにおいてブロッキングする。
3.(Abの抗体価指示に従い)抗体溶液を調製する。
4.ブロッキング溶液を取り除く(4℃において保存する)。
5.膜を抗体溶液を含む容器内に置く。
6.4℃において一晩(通常、8〜12時間)インキュベーションする。
1.1次抗体を取り除く。
2.膜を4回洗浄する。
1.TBSTで膜をカバーする。
2.RTにおいて5分間優しく振盪する。
3.Western Blueで膜をカバーする。
4.リファレンススポットが最大強度に達するまで、展開させる。
5.di−H2Oですすぐことにより、展開を停止させる。
6.膜を乾燥させる。
7.膜をスキャンする。
血清は、hemoguard closureを有するか、又は有しない標準B & D 13×100(7ml) vacutainer clot tube(又は同等物)において、(止血帯での)静脈穿刺により採取した血液5mlから調製された。凝固を可能にさせるためおよそ30分室温において後、血餅は、5〜10分間、2,500〜3,000rpmでの遠心分離によりペレット化された。血餅を含まない血清は、清潔なチューブにデカントされ、標識され、新鮮分析されるか、又は凍結保存された。
[実施例]
ウエスタンブロット上での組換え抗体のENOX2への結合の親和性及び特異性をさらに増強するために、ENOX2ファミリーのタンパク質のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフを具体的に模倣するようにリンカーを設計した。
DNA:5‘ GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT 3‘ 配列番号4。
アミノ酸:GlyGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySer 配列番号5。
1 ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC
51 TCGACTTCTT TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG
101 AGCGCGATGA AGGTGATAAA TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG
151 GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT GGTGATGTTA AATTAACACA
201 GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC ATGTTGGGTG
251 GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG
301 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC
351 TCTCAAAGTT GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG
401 AAGATCGTTT ATGTCATAAA ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT
451 CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT GTTGTTTTAT ACATGGACCC
501 AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA AAACGTATTG
551 AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA
601 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC
651 AAAATCGGAT CTGGTTCCGC GTGGATCCCC AGGAATTCCC 配列番号6
691 GAGGTCAAGC TGCAGGAGTC AGGAACTGAA GTGGTAAAGC CTGGGGCTTC
741 AGTGAAGTTG TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACA AGTTATGATA
791 TAGACTGGGT GAGGCAGACG CCTGAACAGG GACTTGAGTG GATTGGATGG
841 ATTTTTCCTG GAGAGGGGAG TACTGAATAC AATGAGAAGT TCAAGGGCAG
891 GGCCACACTG AGTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAT ATGGAGCTCA
941 CTAGGCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCTGTCT ATTTCTGTGC TAGAGGGGAC
991 TACTATAGGC GCTACTTTGA CTTGTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT
1041 CTCCTCA 配列番号7
DNA:5‘ GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT 3‘ 配列番号4。
アミノ酸:GlyGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySer 配列番号5。
1093 GAAAATGTGC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA
1143 GAGGGTCACC ATGACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTATACGT TACATATATT
1193 GGTACCAACA GAAGCCTGGA TCCTCCCCCA GACTCCTGAT TTATGACACA
1243 TCCAACGTGG CTCCTGGAGT CCCTTTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG
1293 GACCTCTTAT TCTCTCACAA TCAACCGAAT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA
1343 CTTATTACTG CCAGGAGTGG AGTGGTTATC CGTACACGTT CGGAGGGGGG
1393 ACCAAGCTGG AGCTGAAAGC G 配列番号8
1 ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC
51 TCGACTTCTT TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG
101 AGCGCGATGA AGGTGATAAA TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG
151 GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT GGTGATGTTA AATTAACACA
201 GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC ATGTTGGGTG
251 GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG
301 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC
351 TCTCAAAGTT GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG
401 AAGATCGTTT ATGTCATAAA ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT
451 CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT GTTGTTTTAT ACATGGACCC
501 AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA AAACGTATTG
551 AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA
601 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC
651 AAAATCGGAT CTGGTTCCGC GTGGATCCCC AGGAATTCCC GAGGTCAAGC
701 TGCAGGAGTC AGGAACTGAA GTGGTAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGTTG
751 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACA AGTTATGATA TAGACTGGGT
801 GAGGCAGACG CCTGAACAGG GACTTGAGTG GATTGGATGG ATTTTTCCTG
851 GAGAGGGGAG TACTGAATAC AATGAGAAGT TCAAGGGCAG GGCCACACTG
901 AGTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAT ATGGAGCTCA CTAGGCTGAC
951 ATCTGAGGAC TCTGCTGTCT ATTTCTGTGC TAGAGGGGAC TACTATAGGC
1001 GCTACTTTGA CTTGTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGC
1051 GGGGGTGGTA GCTGCGGCGG TGGATCGTGT GGCGGTGGCA GTGAAAATGT
1101 GCTCACCCAG TCTCCAGCAA TCATGTCTGC ATCTCCAGGG GAGAGGGTCA
1151 CCATGACCTG CAGTGCCAGC TCAAGTATAC GTTACATATA TTGGTACCAA
1201 CAGAAGCCTG GATCCTCCCC CAGACTCCTG ATTTATGACA CATCCAACGT
1251 GGCTCCTGGA GTCCCTTTTC GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT
1301 ATTCTCTCAC AATCAACCGA ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC
1351 TGCCAGGAGT GGAGTGGTTA TCCGTACACG TTCGGAGGGG GGACCAAGCT
1401 GGAGCTGAAA GCG 配列番号9
1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttctt
1 M S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L
61 ttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaa
21 L E Y L E E K Y E E H L Y E R D E G D K
121 tggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgat
41 W R N K K F E L G L E F P N L P Y Y I D
181 ggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaac
61 G D V K L T Q S M A I I R Y I A D K H N
241 atgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg
81 M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L
301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagtt
101 D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V
361 gattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaa
121 D F L S K L P E M L K M F E D R L C H K
421 acatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgat
141 T Y L N G D H V T H P D F M L Y D A L D
481 gttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaa
161 V V L Y M D P M C L D A F P K L V C F K
541 aaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca
181 K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A
601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggat
201 W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S D
661 ctggttccgcgtggatccccaggaattcccgaggtcaagctgcaggagtcaggaactgaa
221 L V P R G S P G I P E V K L Q E S G T E
721 gtggtaaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacatcttcaca
241 V V K P G A S V K L S C K A S G Y I F T
781 agttatgatatagactgggtgaggcagacgcctgaacagggacttgagtggattggatgg
261 S Y D I D W V R Q T P E Q G L E W I G W
841 atttttcctggagaggggagtactgaatacaatgagaagttcaagggcagggccacactg
281 I F P G E G S T E Y N E K F K G R A T L
901 agtgtagacaagtcctccagcacagcctatatggagctcactaggctgacatctgaggac
301 S V D K S S S T A Y M E L T R L T S E D
961 tctgctgtctatttctgtgctagaggggactactataggcgctactttgacttgtggggc
321 S A V Y F C A R G D Y Y R R Y F D L W G
1021 caagggaccacggtcaccgtctcctcaggcgggggtggtagctgcggcggtggatcgtgt
341 Q G T T V T V S S G G G G S C G G G S C
1081 ggcggtggcagtgaaaatgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggg
361 G G G S E N V L T Q S P A I M S A S P G
1141 gagagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtatacgttacatatattggtaccaa
381 E R V T M T C S A S S S I R Y I Y W Y Q
1201 cagaagcctggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacgtggctcctgga
401 Q K P G S S P R L L I Y D T S N V A P G
1261 gtcccttttcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcacaatcaaccga
421 V P F R F S G S G S G T S Y S L T I N R
1321 atggaggctgaggatgctgccacttattactgccaggagtggagtggttatccgtacacg
441 M E A E D A A T Y Y C Q E W S G Y P Y T
1381 ttcggaggggggaccaagctggagctgaaagcg
461 F G G G T K L E L K A
1 MSPILGYWKI KGLVQPTRLL LEYLEEKYEE HLYERDEGDK WRNKKFELGL EFPNLPYYID
61 GDVKLTQSMA IIRYIADKHN MLGGCPKERA EISMLEGAVL DIRYGVSRIA YSKDFETLKV
121 DFLSKLPEML KMFEDRLCHK TYLNGDHVTH PDFMLYDALD VVLYMDPMCL DAFPKLVCFK
181 KRIEAIPQID KYLKSSKYIA WPLQGWQATF GGGDHPPKSD LVPRGSPGIP EVKLQESGTE
241 VVKPGASVKL SCKASGYIFT SYDIDWVRQT PEQGLEWIGW IFPGEGSTEY NEKFKGRATL
301 SVDKSSSTAY MELTRLTSED SAVYFCARGD YYRRYFDLWG QGTTVTVSSG GGGSCGGGSC
リンカー
361 GGGSENVLTQ SPAIMSASPG ERVTMTCSAS SSIRYIYWYQ QKPGSSPRLL IYDTSNVAPG
421 VPFRFSGSGS GTSYSLTINR MEAEDAATYY CQEWSGYPYT FGGGTKLELK A 配列番号11
アミノ酸長:477
分子量(kD):53.52
等電点(IP):5.87
モル吸光係数(L/mol/cm);ジスルフィド結合としての全てのシステイン残基:1.02E+05
モル吸光係数(L/mol/cm);ジスルフィド結合としての50%システイン残基:1.02E+05
モル吸光係数(L/mol/cm);ジスルフィド結合なし:1.01E+05
Gly.Ser.Cysを有するリンカー
アミノ酸配列:GlyGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySerCytGlyGlyGlySer 配列番号5
DNA配列:5’−GGCGGGGGTG GTAGCTGCGG CGGTGGATCG TGTGGCGGTG GCAGT−3’ 配列番号4
scFv(S)重鎖N末端(プライマー15)配列番号12
5’ GGA TCC CCA GGA ATT C(EcoRI)CC GAG GTC AAG CTG CAG GAG TCA GGA 3’
scFv(S)重鎖C末端プラスリンカー1
アミノ酸配列:GTTVTVSS(重鎖C末端)配列番号13 GGGGSCGGGSCGGGS(リンカー)配列番号14
1 GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGCGGG GGTGGTAGCT GCGGCGGTGG
51 ATCGTGTGGC GGTGGCAGT 配列番号15
1 GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGGGGTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGC
1 G T T V T V S S G G G G S C G G G S C G
61 GGTGGCAGT
21 G G S 配列番号16
5’ACC GCC ACA CGA TCC ACC GCC GCA GCT ACC ACC CCC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC 3’ 配列番号17
リンカープラスscFv(S)軽N末端 配列番号18
アミノ酸配列:G GSC GGG SCG GGS(リンカー) ENV LTQ SP(軽鎖N末端)
1
GGTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGCGGTGGCAGTGAAAATGTGCTCACCCAGTCT
1 G G S C G G G S C G G G S E N V L T Q S
61 CCA 配列番号19
21 P 配列番号20
PCR増幅のためのscFv(S)軽鎖についてのフォワードプライマー(プライマー19)
5‘ GGT GGT AGC TGC GGC GGT GGA TCG TGT GGC GGT GGC AGT GAA AAT GTG CTC ACC CAG TCT CCA 3‘ 配列番号21
センスDNA配列:5‘ GAACGCCAGCACATGGACAGCTGACTCGAGCGGCCGGTG 3’ 配列番号22
アンチセンスDNA配列:5‘ CACCGGCCGCTCGA(XhoI)GTCAGCTGTCCATGTGCTGGCGTTC 3’ 配列番号23
プライマー15及び17で配列決定したscFv(SC)DNA
>L_132420_プライマー15_025.ab1 1464 21 860 ABI
AAAAAACAATGCAAAGTGGTAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCT
GCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACAAGTTATGATATAGACTGGGTGAGG
CAGACGCCTGAACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGA
GGGGAGTACTGAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGAGTG
TAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTATATGGAGCTCACTAGGCTGACATCT
GAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCTAGAGGGGACTACTACAGGCGCTA
CTTTGACTTGTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGGG
GTGGTAGCTGCGGCGGTGGATCGTGTGGCGGTGGCAGTGAAAATGTGCTC
ACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAGGGTCACCAT
GACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATACGTTACATATATTGGTACCAACAGA
AGCCTGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACGTGGCT
CCTGGAGTCCCTTTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTC
TCTCACAATCAACCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCC
AGGAGTGGAGTGGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAG
CTGAAAGCGAAAGAAACTGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGA
CAGCTGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGC
GTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG
GTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGG
CGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCCGGGCCCCGCCATGACCCAGTCAC
GTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGAAT
CGCCTATTTTTATAGGGTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAAACGTC
AAGGGGGCACTTTTTCGGGAAATGTGCGCCGAAACCCCTAATTTGTTTTA
TTTTTCAAAATCCATTTCAATTAAGTTTCCCCCTCATGGAAACAATAACC
CCTGGAAAAAAGGCTTTCATTAAATATTGAAAAAAAGGAAAAAAGTTAAA
AATTATTTCAAAATTTTCCCTGTGTTCCCCCCTTTATTTTCCCCTTTTTT
TTGCGGGCCATTTTTTGCCCTTTTCCCTGGTTTTTTTTGCCCCCCCCCCC
CAAAAAAACCCCCCTGGGGTGAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAATGTCTTT
AAAAAAAAATTTCCAATTTTTGTGGGGGGGGGGCCCCCCCAAAAGAGTTG
GGGGGGTTTTTTAAACCACTTCTCCCAAAACAACATTGGGTGGAGATATT
TCTTCTTCACAAAA 配列番号24
>L_132420_プライマー17_026.ab1 1492 22 854 ABI
GGTGGGTAAATTTAGCAGCAGCAGTTTCTTTCGCTTTCAGCTCCAGCTTG
GTCCCCCCTCCGAACGTGTCCGGATAACCACTCCACTCCTGGCAGTAATA
AGTGGCAGCATCCTCAGCCTCCATTCGGTTGATTGTGAGAGAATAAGAGG
TCCCAGACCCACTGCCACTGAAGCGAAAAGGGACTCCAGGAGCCACGTTG
GATGTGTCATAAATCAGGAGTCTGGGGGAGGATCCAGGCTTCTGTTGGTA
CCAATATATGTAACGTATACTTGAGCTGGCACTGCAGGTCATGGTGACCC
TCTCCCCTGGAGATGCAGACATGATTGCTGGAGACTGGGTGAGCACATTT
TCACTGCCACCGCCACACGATCCACCGCCGCAGCTACCACCCCCGCCTGA
GGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCACAAGTCAAAGTAGCGCCTGT
AGTAGTCCCCTCTAGCACAGAAATAGACAGCAGAGTCCTCAGATGTCAGC
CTAGTGAGCTCCATATAGGCTGTGCTGGAGGACTTGTCTACACTCAGTGT
GGCCCTGCCCTTGAACTTCTCATTGTATTCAGTACTCCCCTCTCCAGGAA
AAATCCATCCAATCCACTCAAGTCCCTGTTCAGGCGTCTGCCTCACCCAG
TCTATATCATAACTTGTGAAGATGTAGCCAGAAGCCTTGCAGGACAACTT
CACTGAAGCCCCAGGCTTTACCACTTCAGTTCCTGACTCCTGCAGCTTGA
CCTCGGGAATTCCAGAAAGGGCCTGCTTGAACTTCTCCTTTGCTTCTTCC
ATATCTTTCTCATGGGCGGATCCACGCGGAACCAGATCCGATTTTGGAGG
ATGGTCGCCACCACCAAACGTGGCTTGCCAGCCCTGGCAAGGCCATGCTA
TATACTTGCTGGATTTCAAGTACTTATCAATTTGTGGGAATAGCTTCCTT
ACGTTTTTTTAAAACAAACTAATTTTGGGAACGCATCCAGGCCCATTTGG
TCCATGTATTAAAACACCATCAAAAACCTCCTACAACATGAAATTCCGGA
AGGGGTTTACATAATCCCCCATTTTAAATATTGTTTTTATGACATAAAAC
CAATCTTTCCAAACTTTTTTTCACATTTTCCAGGTAACCTTGGTAAAAAA
AAAACCACTTTTGAAAAGTTTTTCAAAATTCTTTTTATTAAAATGCAAAT
TTTCCCGAAAAAAACCCCTTATTTCTAAAAATTCCCAAAAACCCGCTCCC
CTTTCCAAGCCCTTTGAAAAATTTCTTTGCCCCCCCCCTCTTTTTTGGGG
AACAAAACCCCCCCCCACAAACTTGGGTTGGGGGTGGTTTTTGTGTCCAC
GCCCAAATATAAAAAAACAGTATAAATTAAGATGGGGCCCCCACATATAA
AAAACTGGGGGGGGTTTTTTTATATAATTTTTTAAAACACAACATCCCCC
CCCCCCCCCCACATCCCACACAAAATAAAATATATAATAAAA 配列番号25
scFv(SC)の発現
プラスミドpGEX4T-scFv(SC)を有するBL21(DE3)細胞を、LB/カルベニシリン(100μg/ml)10mlにおいて接種した。細胞を6時間増殖させ、6,000rpm(3,700×g)において6分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、新たなLB/アンピシリン(100μg/ml)2mlにおいて再懸濁し、250mlのErlenmyerフラスコにおける2つのLB/amp培地100mlに移した。細胞を、3時間、37℃において250rpmにて増殖させた。温度を25℃まで下げ、IPTGを加えた(最終濃度0.15mM)。細胞をさらに15時間増殖させ、採取し、20mMトリス−HCl、pH8.0バッファー20mlにおいて再懸濁した。タンパク質を、French Pressureにより抽出した(20,000psiにおいて3継代)。scFv(SC)の発現を、SDS−PAGE、続いてPonceau S染色、及びウエスタンブロットにより分析した。
本発明の重要な実施形態は、化学的安定性及び生物学的効力を維持しながら、濃縮した溶液の物理的安定性を増強することである。本発明は、配列番号11と少なくとも99%同一であり、7×l0−7MのENOX2タンパク質についてのkDa、及び純度少なくとも95%を有する、scFv抗体を提供する。
確認された偽陽性及び確認された偽陰性の発生率は、それぞれ1%未満と低い(D. J. Morre and D. S. Gilmartin. 2015 ONCOblot Reports 1 (1):1-2)。複数のがんについて、2又は3以上のENOX2転写物バリアントは、原発組織の正確な同定を可能にするためにOrigin Cancer TestのONCOblot組織内に存在しなければならない。これらは、膀胱がん、結腸直腸がん、胃がん、中皮腫、卵巣がん、腎細胞がん、及び子宮がんを含む。1又は2以上のENOX2転写物バリアントが、非存在であるか、又は検出の限度未満であるなら、がんの原発組織を誤って同定するかもしれない。現在のプロトコール下で分析した最も新しいONCOblotのうち、誤った同定率は2.8%である。従って、臨床的に診断されたがんでの試験の全般的な正確さは、少なくとも95%である。
本明細書に要約する証拠は、その現在の構成の試験の能力が、提供した感度の10倍の増大と一致する、臨床症状より10〜20年前に、がんを検出することであることを確認した。
Claims (19)
- 以下の(a)〜(c)のステップを含む、対象における、良性病変から悪性腫瘍へのトランスフォーメーションを検出するためのデータを取得する方法。
(a)前記対象由来の試料由来のタンパク質を電気泳動でタンパク質分離にかけるステップ;
(b)電気泳動で分離されたENOX2転写物バリアントをENOX2電子供与体で活性化するステップ;及び
(c)活性化ENOX2転写物バリアントを検出可能な結合試薬を用いて1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在を検出するステップであって、前記試料中の1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在が、前記対象における、良性病変から悪性腫瘍へのトランスフォーメーションを示し、それにより、同等の非活性化ENOX2転写物バリアントと比較したとき、前記1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントについて、検出感度の10〜100倍の増大が得られる、ステップ; - ENOX2転写物バリアントを活性化するために必要とされるENOX2電子供与体が、還元ピリジンヌクレオチド、NADH、NAD(P)H、又はENOX2電子供与体である合成基質の少なくとも1つから選択され、2Dブロット上で1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントを検出する、請求項1に記載の方法。
- NADH又はNAD(P)Hの最終濃度が、10μM〜50μMの範囲内である、請求項2に記載の方法。
- 対象由来の試料由来のタンパク質が、1又は2以上のENOX2転写物バリアントを結合し、濃縮するためのニッケル−アガロース基質を用いて、血液、血清、又は血漿試料から濃縮されたタンパク質であり、
工程(a)において、2次元(2D)電気泳動によりタンパク質分離を行い、フィルム若しくはペーパー上でブロットする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - (i)活性化ENOX2転写物バリアントを検出可能な結合試薬が、抗ENOX2 scFv融合タンパク質を含み、当該タンパク質が、
4℃から40℃の間において凝集せず、
CXXXXC又はCXXXXXCのいずれかとして間隔を空けられた2つのシステイン(C)を含有するアミノ酸残基の小さな側鎖(Gly/Ser)を含み、
ENOX2のタンパク質ジスルフィド−チオール相互変換機能モチーフと鎖間ジスルフィド結合を形成する能力があるか、又は、
(ii)活性化ENOX2転写物バリアントを検出可能な結合試薬が、配列番号11のscFvを含み、配列番号11のscFvの安定性、結合効率、及び保存可能期間が、凝集を防ぐために50%グリセロール中で保存することにより改善される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 試料が、
臨床症状より少なくとも1年前のがんを含む試料、
家族性がん病歴、環境曝露を有する集団、又は一般的な集団における早期がんを含む試料、
原発不明がん(CUP)を含む試料、
ステージ0及びステージ1のがんを含む試料、又は
再出現したがんを含む試料
である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 以下の表1に記載のENOX2転写物バリアントの存在に基づき、1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの原発組織を決定するためのデータを取得するステップをさらに含み、
前記原発組織が、膀胱、血液細胞、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫及び骨髄腫、乳房、頸部、結腸直腸、食道、胃、肝細胞、肺、非小細胞、メラノーマ、中皮腫、卵巣、膵臓、前立腺、腎細胞(腎臓)、肉腫、扁平細胞、精巣胚細胞、甲状腺濾胞、甲状腺乳頭、若しくは子宮の少なくとも1つから選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在に基づき、遠隔転移と複数の原発がんとを区別するためのデータを取得するステップをさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 以下のステップを含む、ウエスタンブロット上のENOX2転写物バリアントの定量の較正された方法。
対象由来の試料由来のタンパク質を電気泳動でタンパク質分離にかけるステップ;
電気泳動で分離されたタンパク質をタンパク質捕獲フィルム又はペーパー上にウエスタンブロットするステップ;
前記タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上の1又は2以上のENOX2転写物バリアントを、還元ENOX2基質で活性化するステップ;及び
活性化ENOX2転写物バリアントを検出可能な結合試薬を用いて、前記1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在を検出するステップであって、前記試料中の1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在は、がんの悪性トランスフォーメーションを示し、非活性化ENOX2と比較して、ENOX2についての検出感度の10〜100倍の増大が得られ、1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの量が、前記1又は2以上のENOX2転写物バリアントの公知の量と比較して、前記タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上のENOX2転写物バリアントのスポット径及び強度に基づき較正される、ステップ; - 試料が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、又は体液である請求項9に記載の方法。
- ENOX2転写物バリアントのスポット径が、組換えENOX2の標準曲線と比較される、請求項9又は10に記載の方法。
- ENOX2転写物バリアントのスポット径の対数と、ENOX2転写物バリアントの量の対数とが線形的に相関する、請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- 定量が、
(1)ENOX2転写物バリアントのスポット径と、ENOX2活性との組合せにより達成されるか、或いは
(2)ENOX2転写物バリアントのスポットを切り出すステップ、及び溶出及び銀ナノ粒子を形成するための四酸化銀との反応を用いてENOX2の量を定量するステップ、並びにENOX2のない対応するスポットと比較することにより、紫外−可視分光光度計又は光散乱分光光度計を用いた光散乱によって、前記ナノ粒子を定量するステップにより達成される、
請求項9〜12のいずれかに記載の方法。 - (2)の定量において、7%より高い、バックグラウンドより上のスポットのパーセンテージが、前記スポットにおけるENOX2転写物バリアントの存在を確認する、請求項13に記載の方法。
- 試料が、臨床症状より少なくとも1年前のヒトがんを含む試料であり、
ENOX2転写物バリアントの存在に基づき、1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの原発組織を決定するためのデータを取得するステップをさらに含む、請求項9〜14のいずれかに記載の方法。 - 活性化ENOX2転写物バリアントを検出可能な結合試薬が、配列番号11のscFvを含み、前記配列番号11のscFvの安定性、結合効率、及び保存可能期間が、凝集を防ぐために50%グリセロール中で保存することにより改善される、請求項9〜15のいずれかに記載の方法。
- 対象由来の試料由来のタンパク質が、1又は2以上のENOX2転写物バリアントを結合し、濃縮するためのニッケル−アガロース基質を用いて、血液、血清、又は血漿試料から濃縮されたタンパク質である、請求項9〜16のいずれかに記載の方法。
- 以下のステップを含む、対象における、良性病変から悪性腫瘍へのトランスフォーメーションを検出するためのデータを取得する方法。
前記対象由来の試料由来のタンパク質を、分子量による分離を行う電気泳動と、等電点電気泳動とによる2次元電気泳動により、タンパク質分離にかけるステップ;
前記タンパク質をタンパク質捕獲フィルム又はペーパーに移すステップ;
前記タンパク質捕獲フィルム又はペーパー上で、電気泳動で分離されたENOX2転写物バリアントをENOX2電子供与体で活性化するステップ;
活性化ENOX2転写物バリアントを検出可能な結合試薬を用いて1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントを検出するステップ;及び
以下の表1由来の試料中の1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在に基づき、前記がんの原発組織を決定するためのデータを取得するステップであって、インサイチュの前記1又は2以上のENOX2転写物バリアントの活性化が、非活性化ENOX2転写物バリアントと比較したとき、検出感度を10〜100倍増大させる、ステップ;
- 対象由来の濃縮された試料由来の1又は2以上の電気泳動で分離されたタンパク質を含むブロットを含むフィルム又はペーパーであって、活性化ENOX2転写物バリアントを検出する試薬と、前記ブロット上のENOX2転写物バリアントを活性化するENOX2の還元基質とに曝露され、以下の表1由来の1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在について分析され、前記1又は2以上の活性化ENOX2転写物バリアントの存在を用いて、臨床症状より少なくとも1年前にヒトがんの原発組織が検出、決定され、非活性化ENOX2転写物バリアントと比較したとき、インサイチュの前記1又は2以上のENOX2転写物バリアントの活性化が、検出感度を10〜100倍増大する、前記フィルム又はペーパー。
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