JP6421453B2 - Cell culture container management method - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養容器の管理方法に関する。 The present invention relates to a method for managing a cell culture container.
再生医療分野では、患者から採取した細胞を生体外で培養し、シート形状の細胞構造体（以下、「細胞シート」とも記載する）を作製した上で、該細胞シートを患者の生体内へ移植する技術が開発されている。また、不妊治療等の生殖医療分野では、患者から採取した未受精卵又は体外受精後の受精卵を、液滴状の培養液中で一定期間培養することが行われている。 In the field of regenerative medicine, cells collected from a patient are cultured in vitro to produce a sheet-shaped cell structure (hereinafter also referred to as “cell sheet”), and then the cell sheet is transplanted into the patient's living body. Technology has been developed. Further, in the field of reproductive medicine such as infertility treatment, unfertilized eggs collected from patients or fertilized eggs after in vitro fertilization are cultured in a liquid culture medium for a certain period.
前記のような用途に使用される細胞培養容器では、細胞の接着性及び／又は培養液の均一な広がりを確保することを目的として、通常は、細胞を収容する内部（例えば底部）の表面が親水化処理される。前記親水化処理により、細胞培養容器の内部の表面における水との接触角を低くすることができる。前記親水化処理としては、プラズマ照射処理等の粒子線又は電磁波照射処理、及び親水化処理剤を用いる化学的処理等を挙げることができる。或いは、細胞培養容器自体を親水性の高い材料で作製することもできる。 In the cell culture container used for the above-mentioned applications, the surface of the inside (for example, the bottom) that accommodates the cells is usually used for the purpose of ensuring the adhesion of the cells and / or the uniform spread of the culture solution. Hydrophilized. By the hydrophilic treatment, the contact angle with water on the inner surface of the cell culture vessel can be lowered. Examples of the hydrophilic treatment include particle beam or electromagnetic wave irradiation treatment such as plasma irradiation treatment, and chemical treatment using a hydrophilic treatment agent. Alternatively, the cell culture container itself can be made of a highly hydrophilic material.
例えば、特許文献1は、底面が角度120度以下のロート状、曲率半径が10 mm以下の半球状、又はそれらの底面の中心部を平面にした形状をなし、容器内面の少なくとも底面が水接触角30度以下の親水性を有する培養容器を使用する、細胞凝集体の形成方法を記載する。当該文献は、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、又はリン脂質若しくはその誘導体等を塗布することによって該塗布面を親水化処理する方法を記載する。 For example, Patent Document 1 has a funnel shape with a bottom surface of an angle of 120 degrees or less, a hemispherical shape with a radius of curvature of 10 mm or less, or a shape in which the center of the bottom surface is a flat surface, and at least the bottom surface of the inner surface of the container is in water contact. A method for forming a cell aggregate using a culture vessel having a hydrophilicity of 30 degrees or less is described. This document describes a method of hydrophilizing the coated surface by coating polyhydroxyethyl methacrylate, ethylene vinyl alcohol copolymer, phospholipid or a derivative thereof.
特許文献2は、容器の培養液が接触する内面に水との接触角が10度以下の親水性の層を有し、該容器の内面の細胞が接触する部分に細胞培養に適した培養床を有する事を特徴とする細胞培養容器を記載する。当該文献は、前記親水性の層が、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシC2-C4アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、リン脂質・高分子複合体、及び2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又はこれを含む共重合体、から選ばれる少なくとも1つの材料からなることが好ましいことを記載する。
細胞培養容器の内部の表面を親水化処理する手段は、細胞培養容器の内部の表面に極性基を結合又は形成させることにより、該表面の親水性を向上させる。しかしながら、これらの手段によって結合又は形成された極性基は、時間経過に伴って徐々に脱離するか、又は非極性基へ変化し得る。このため、親水化処理によって親水化された表面は、時間経過に伴って親水性が徐々に失われていく可能性がある。 The means for hydrophilizing the inner surface of the cell culture container improves the hydrophilicity of the surface by binding or forming a polar group on the inner surface of the cell culture container. However, polar groups attached or formed by these means can be gradually removed over time or converted to nonpolar groups. For this reason, the hydrophilicity of the surface hydrophilized by the hydrophilization treatment may be gradually lost with time.
前記のように、親水化処理された細胞培養容器においては、所定の親水性を発揮するために、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する必要がある。しかしながら、多数の細胞培養容器を使用する際に、1個ずつの細胞培養容器の経過時間を記録することは煩雑である。このため、多数の細胞培養容器を使用する際に、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理することは困難であった。 As described above, in a cell culture vessel that has been subjected to a hydrophilic treatment, it is necessary to accurately manage the elapsed time from the time of the hydrophilic treatment in order to exhibit a predetermined hydrophilicity. However, when using many cell culture containers, it is complicated to record the elapsed time of each cell culture container. For this reason, when many cell culture containers are used, it has been difficult to accurately manage the elapsed time from the time when the hydrophilic treatment is performed.
それ故、本発明は、親水化処理された細胞培養容器において、簡便な工程で、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する手段を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide means for accurately managing the elapsed time from the time of hydrophilic treatment in a simple process in a cell culture vessel subjected to hydrophilic treatment.
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、細胞培養容器の底部に配置されたマイクロウェルに水等を滴下した際に形成される気泡量を指標とすることにより、該細胞培養容器の表面が親水化処理された時点からの経過時間を簡便に算出し得ることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
As a result of examining various means for solving the above problems, the present inventors have used, as an index, the amount of bubbles formed when water or the like is dropped into a microwell arranged at the bottom of a cell culture container. It was found that the elapsed time from the time when the surface of the cell culture vessel was hydrophilized can be easily calculated. Based on the above findings, the present inventors have completed the present invention.
That is, the gist of the present invention is as follows.
（1）少なくとも一部の表面が親水化処理された底部と、該底部に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルとを含む細胞培養容器を準備する、細胞培養容器準備工程；
前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程；
前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程；
前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程；
を含む、細胞培養容器の管理方法。
(1) preparing a cell culture vessel comprising a bottom part having at least a part of the surface hydrophilized, and at least one microwell disposed on the bottom part and having at least a part of the surface hydrophilized; Cell culture container preparation step;
At an elapsed time t x from the hydrophilization treatment, a liquid is introduced into at least one microwell in which at least a part of the surface has been hydrophilized, and the liquid is introduced into the hydrophilized surface of the microwell in the liquid. A bubble amount measuring step of measuring a bubble amount a x formed;
The bubble amount a x obtained in the bubble amount measurement step is determined based on the contact angle θ with the liquid on the hydrophilic surface of the microwell and the bubbles formed on the hydrophilic surface of the microwell in the liquid. Applying to the relationship with the amount a to obtain a contact angle θ x with the liquid corresponding to the bubble amount a x ;
The contact angle theta x and the liquid obtained by the contact angle obtaining step, by applying the relation of temporal change of the contact angle theta between the liquid in the hydrophilized surface of the microwell, contact with the liquid An elapsed time acquisition step of obtaining an elapsed time t x corresponding to the angle θ x ;
A method for managing a cell culture container.
（2）前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する、接触角及び気泡量の関係取得工程をさらに含む、前記（1）に記載の細胞培養容器の管理方法。 (2) obtaining a relationship between the contact angle θ with the liquid on the hydrophilic surface of the microwell and the amount of bubbles a formed on the hydrophilic surface of the microwell in the liquid; The method for managing a cell culture container according to (1), further comprising a step of obtaining a relationship between the amount of bubbles.
（3）前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する、接触角の経時変化の関係取得工程をさらに含む、前記（1）又は（2）に記載の細胞培養容器の管理方法。 (3) The method according to (1) or (2), further comprising the step of acquiring a relationship with time of change in contact angle θ with the liquid on the hydrophilized surface of the microwell. The management method of the cell culture container of description.
（4）前記細胞培養容器が、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む、前記（1）〜（3）のいずれかに記載の細胞培養容器の管理方法。 (4) The method for managing a cell culture container according to any one of (1) to (3), wherein the cell culture container includes a plurality of microwells having at least a part of the surface subjected to hydrophilic treatment.
（5）前記液体が水である、前記（1）〜（4）のいずれかに記載の細胞培養容器の管理方法。 (5) The method for managing a cell culture container according to any one of (1) to (4), wherein the liquid is water.
本発明により、親水化処理された細胞培養容器において、簡便な工程で、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する手段を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide means for accurately managing the elapsed time from the time of hydrophilic treatment in a simple process in a cell culture container subjected to hydrophilic treatment.
本明細書では、適宜図面を参照して本発明の特徴を説明する。図面では、明確化のために各部の寸法及び形状を誇張しており、実際の寸法及び形状を正確に描写してはいない。それ故、本発明の技術的範囲は、これら図面に表された各部の寸法及び形状に限定されるものではない。 In the present specification, features of the present invention will be described with reference to the drawings as appropriate. In the drawings, the size and shape of each part are exaggerated for clarity, and the actual size and shape are not accurately depicted. Therefore, the technical scope of the present invention is not limited to the size and shape of each part shown in these drawings.
＜1. 細胞培養容器の管理方法＞
本発明は、細胞培養容器の管理方法に関する。本発明の細胞培養容器の管理方法は、細胞培養容器準備工程、気泡量測定工程、接触角取得工程、及び経過時間取得工程を含むことが必要である。以下、各工程について、詳細に説明する。
<1. Cell culture container management method>
The present invention relates to a method for managing a cell culture container. The cell culture container management method of the present invention needs to include a cell culture container preparation step, a bubble amount measurement step, a contact angle acquisition step, and an elapsed time acquisition step. Hereinafter, each step will be described in detail.
［1-1. 細胞培養容器準備工程］
本発明の方法は、細胞培養容器を準備する、細胞培養容器準備工程を含むことが必要である。
[1-1. Cell culture container preparation process]
The method of the present invention needs to include a cell culture container preparation step of preparing a cell culture container.
本工程において準備される細胞培養容器は、少なくとも一部の表面が親水化処理された底部と、該底部に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルとを含むことが必要である。前記特徴を備える細胞培養容器を準備することにより、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを用いて、該細胞培養容器を親水化処理した時点からの経過時間を算出することができる。 The cell culture container prepared in this step comprises a bottom part having at least a part of the surface subjected to hydrophilization, and at least one microwell disposed on the bottom part and having at least a part of the surface hydrophilized. It is necessary to include. By preparing a cell culture container having the above characteristics, the elapsed time from the time when the cell culture container is hydrophilized can be calculated using the microwells on which at least a part of the surface is hydrophilized. it can.
本工程において準備される細胞培養容器の好ましい一実施形態を図1に示す。図1に示すように、本工程において準備される細胞培養容器1は、少なくとも一部の表面14が親水化処理された底部11と、該底部11に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェル12とを含む。本工程において準備される細胞培養容器1は、底部11と、該底部11の上面においてその周縁に立設された側壁部13と、該側壁部13の上端側の外縁によって画定される上方に開放した開放口とを有する形状であることが好ましい。この場合、底部11及び側壁部13によって画定される空間が、細胞を収容するための収容部として使用される。本明細書において、前記形状を「ディッシュ型」又は「プレート型」と記載する場合がある。本工程において準備される細胞培養容器1がディッシュ型の形状の場合、その具体的な形状は特に限定されず、当該技術分野で通常使用される楕円形、方形又は多角形等の各種の形状を採用することができる。或いは、本工程において準備される細胞培養容器は、フラスコ型等の他の形状であってもよい。本工程において準備される細胞培養容器は、当該技術分野で通常使用される各種の形状を採用することができる。また、本工程において準備される細胞培養容器の大きさは、特に限定されない。当該技術分野で通常使用される各種の大きさを採用することができる。例えば、前記細胞培養容器が円形のディッシュ型の場合、その直径は、通常は、10〜100 mmの範囲であり、典型的には、10〜50 mmの範囲である。
A preferred embodiment of the cell culture container prepared in this step is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the cell culture vessel 1 prepared in this step is provided with a
本工程において準備される細胞培養容器において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの形状は、円柱形状であることが好ましく、該細胞培養容器の底部に対して略平行な底部を有する円柱形状、又は該細胞培養容器の底部に対して特定の傾斜角を有する逆円錐形状の底部を有する円柱形状であることがより好ましい。この場合、円柱形状である前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの開口部の直径は、600 μm以下であることが好ましく、100〜600 μmの範囲であることがより好ましく、100〜300 μmの範囲であることがさらに好ましい。円柱形状である前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの深さは、300 μm以下であることが好ましく、50〜300 μmの範囲であることがより好ましく、100〜200 μmの範囲であることがさらに好ましい。前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの底部の形状が逆円錐形状の場合、該円錐形状の傾斜角は、前記細胞培養容器の底部の表面と略平行な面を基準として1〜15°の範囲であることが好ましく、5〜10°の範囲であることがより好ましい。前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルが前記形状の場合、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの形状に起因する気泡の形成を実質的に抑制することができる。それ故、前記形状の少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを含む細胞培養容器を用いることにより、該マイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量をより正確に測定することができる。 In the cell culture container prepared in this step, the shape of the microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized is preferably a columnar shape, and a bottom part substantially parallel to the bottom part of the cell culture container Or a cylindrical shape having an inverted conical bottom having a specific inclination angle with respect to the bottom of the cell culture vessel. In this case, the diameter of the opening of the microwell in which at least a part of the surface having a cylindrical shape is hydrophilized is preferably 600 μm or less, more preferably in the range of 100 to 600 μm, More preferably, it is in the range of 100 to 300 μm. The depth of the microwell in which at least a part of the surface having a cylindrical shape is hydrophilized is preferably 300 μm or less, more preferably in the range of 50 to 300 μm, and more preferably in the range of 100 to 200 μm. More preferably, it is in the range. When the shape of the bottom of the microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized is an inverted cone, the inclination angle of the cone is 1 with respect to a plane substantially parallel to the surface of the bottom of the cell culture container. It is preferably in the range of -15 °, more preferably in the range of 5-10 °. When the microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized has the shape, it is possible to substantially suppress the formation of bubbles due to the shape of the microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized. . Therefore, by using a cell culture vessel including a microwell in which at least a part of the surface of the shape is hydrophilized, the amount of bubbles formed on the hydrophilized surface of the microwell is more accurately measured. be able to.
本工程において準備される細胞培養容器は、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含むことが好ましい。この場合、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの数は、通常は50個以下であり、2〜50個の範囲であることが好ましく、2〜30個の範囲であることがより好ましく、5〜25個の範囲であることがさらに好ましい。少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む前記細胞培養容器を用いることにより、親水化処理された時点からの経過時間をより正確に算出することができる。 The cell culture container prepared in this step preferably includes a plurality of microwells having at least a part of the surface subjected to hydrophilic treatment. In this case, the number of microwells on which at least a part of the surface has been hydrophilized is usually 50 or less, preferably in the range of 2-50, and in the range of 2-30. Is more preferable, and the range of 5 to 25 is more preferable. By using the cell culture vessel including a plurality of microwells having at least a part of the surface hydrophilized, the elapsed time from the time of hydrophilization can be calculated more accurately.
本工程において準備される細胞培養容器は、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに加えて、場合により、表面が親水化処理されていない少なくとも1個のマイクロウェルを含んでもよい。この場合、表面が親水化処理されていないマイクロウェルの特徴（例えば形状、位置又は材質等）は、所望の用途に応じて適宜設定することができる。表面が親水化処理されていないマイクロウェルは、表面の親水化処理以外の特徴に関して、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルと同様の特徴を有することが好ましい。前記の特徴を有することにより、表面が親水化処理されていないマイクロウェルは、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルと実質的に同様に取り扱うことができる。 In addition to at least one microwell whose surface is at least partially hydrophilized, the cell culture container prepared in this step may optionally include at least one microwell whose surface is not hydrophilized. May be included. In this case, the characteristics (for example, shape, position, material, etc.) of the microwell whose surface is not hydrophilized can be appropriately set according to a desired application. The microwell whose surface is not hydrophilized preferably has the same characteristics as the microwell whose surface is at least partially hydrophilized with respect to characteristics other than the surface hydrophilizing process. By having the above characteristics, a microwell whose surface is not hydrophilized can be handled in substantially the same manner as a microwell whose surface is at least partially hydrophilized.
本工程において準備される細胞培養容器において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル及び場合により表面が親水化処理されていないマイクロウェルは、該細胞培養容器の底部に配置される限り、その位置は特に限定されない。例えば、前記細胞培養容器の底部の中央部分に配置されていてもよく、該底部の外縁部分に配置されていてもよい。前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル及び場合により表面が親水化処理されていないマイクロウェルが複数配置される場合、全ての該マイクロウェルを特定の位置（例えば、前記細胞培養容器の底部の中央部分又は外縁部分）に配置してもよく、一部を特定の位置（例えば、前記細胞培養容器の底部の中央部分）に、残りを別の特定の位置（例えば、前記細胞培養容器の底部の外縁部分）に配置してもよい。いずれの場合も、本工程において準備される細胞培養容器の実施形態に包含される。 In the cell culture container prepared in this step, the microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized and in some cases the microwell in which the surface is not hydrophilized are arranged at the bottom of the cell culture container. As long as the position is not particularly limited. For example, the cell culture container may be disposed at the center of the bottom, or may be disposed at the outer edge of the bottom. In the case where a plurality of microwells in which at least a part of the surface is hydrophilized and in some cases a plurality of microwells in which the surface is not hydrophilized are disposed, all the microwells are placed at specific positions (for example, the cell culture vessel May be disposed at a specific position (for example, the central portion of the bottom of the cell culture vessel) and the remaining at another specific position (for example, the cell culture). You may arrange | position in the outer edge part of the bottom part of a container. Either case is included in the embodiment of the cell culture container prepared in this step.
本工程において準備される細胞培養容器を形成する材料は、特に限定されない。当該技術分野で細胞培養容器に通常使用される材料を使用することができる。また、前記細胞培養容器において、該細胞培養容器の収容部を構成する部材、すなわち底部及び側壁部と、該底部の表面に配置される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル及び場合により表面が親水化処理されていないマイクロウェルとは、通常は、同一の材料からなる。前記材料としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、並びにガラス及び石英等の無機材料を挙げることができる。前記樹脂材料は、所望により、1種以上の樹脂材料を組み合わせて使用してもよい。本工程において準備される細胞培養容器を形成する材料は、前記群より選択される少なくとも1種の樹脂材料であることが好ましく、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることがより好ましく、ポリスチレン樹脂であることがさらに好ましい。前記材料を用いることにより、生体適合性の高い細胞培養容器を形成することができる。 The material which forms the cell culture container prepared in this process is not specifically limited. Materials commonly used in cell culture containers in the art can be used. Further, in the cell culture container, a member constituting the housing part of the cell culture container, that is, a bottom part and a side wall part, and a microwell in which at least a part of the surface disposed on the surface of the bottom part is hydrophilized and Usually, the microwells whose surfaces are not hydrophilized are made of the same material. Examples of the material include polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polyethylene terephthalate resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, Examples thereof include resin materials such as epoxy resins and vinyl chloride resins, and inorganic materials such as glass and quartz. If desired, the resin material may be used in combination of one or more resin materials. The material forming the cell culture vessel prepared in this step is preferably at least one resin material selected from the above group, more preferably a polystyrene resin or a polyethylene terephthalate resin, and a polystyrene resin. More preferably. By using the material, a cell culture container with high biocompatibility can be formed.
本発明において、表面の「親水化処理」は、該表面の親水性を向上させる処理を意味し、通常は、該表面に極性基を結合又は形成させることにより、該表面の親水性を向上させる処理を意味する。本工程において準備される細胞培養容器において、底部の少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とを親水化処理する手段は特に限定されず、該細胞培養容器の材料等に基づき、当業者が適宜選択することができる。前記親水化処理の手段としては、プラズマ照射処理、コロナ照射処理、紫外線（UV）照射処理、放射線照射処理、及び親水化処理剤を用いる化学的処理等を挙げることができる。前記親水化処理の手段がプラズマ照射処理の場合、使用されるプラズマの種類は、高温プラズマ又は低温プラズマのような熱プラズマであることが好ましい。プラズマ照射出力は、100〜500 Wの範囲であることが好ましく、100〜400 Wの範囲であることがより好ましい。プラズマ照射時間は、10秒〜5分の範囲であることが好ましく、30秒〜1分の範囲であることがより好ましい。前記親水化処理の手段がコロナ照射処理の場合、使用されるコロナの種類は、グロー放電によるものが好ましい。コロナ照射出力は、10〜500 Wの範囲であることが好ましく、50〜300 Wの範囲であることがより好ましい。コロナ照射時間は、10秒〜1分の範囲であることが好ましく、20〜40秒の範囲であることがより好ましい。前記親水化処理の手段がUV照射処理の場合、使用されるUVの波長は、172〜254 nmの範囲であることが好ましい。UV照射出力は、0.5〜40 Wの範囲であることが好ましい。UV照射時間は、1〜60分の範囲であることが好ましい。照度は10〜50 mW/cm2の範囲であることが好ましい。照射源と被処理物との距離は適宜調整されるが、通常は、10〜200 mm程度である。或いは、本工程において準備される細胞培養容器自体を親水性の高い材料で作製することにより、底部の少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とが親水化処理された細胞培養容器を得てもよい。このような場合も、本発明における親水化処理の実施形態に包含される。本工程において準備される細胞培養容器を前記の条件で親水化処理することにより、細胞の接着性及び／又は培養液の均一な広がりを確保することができる。 In the present invention, “hydrophilization treatment” of a surface means treatment for improving the hydrophilicity of the surface, and usually the hydrophilicity of the surface is improved by bonding or forming a polar group on the surface. Means processing. In the cell culture container prepared in this step, means for hydrophilizing at least a part of the surface of the bottom and at least a part of the surface of the microwell disposed on the bottom is not particularly limited, and the cell culture A person skilled in the art can select as appropriate based on the material of the container. Examples of the hydrophilic treatment means include plasma irradiation treatment, corona irradiation treatment, ultraviolet (UV) irradiation treatment, radiation irradiation treatment, and chemical treatment using a hydrophilic treatment agent. When the hydrophilic treatment means is a plasma irradiation treatment, the kind of plasma used is preferably thermal plasma such as high temperature plasma or low temperature plasma. The plasma irradiation output is preferably in the range of 100 to 500 W, and more preferably in the range of 100 to 400 W. The plasma irradiation time is preferably in the range of 10 seconds to 5 minutes, and more preferably in the range of 30 seconds to 1 minute. When the means for hydrophilization treatment is corona irradiation treatment, the type of corona used is preferably glow discharge. The corona irradiation output is preferably in the range of 10 to 500 W, and more preferably in the range of 50 to 300 W. The corona irradiation time is preferably in the range of 10 seconds to 1 minute, and more preferably in the range of 20 to 40 seconds. When the hydrophilic treatment means is UV irradiation treatment, the wavelength of UV used is preferably in the range of 172 to 254 nm. The UV irradiation output is preferably in the range of 0.5 to 40 W. The UV irradiation time is preferably in the range of 1 to 60 minutes. The illuminance is preferably in the range of 10 to 50 mW / cm 2 . The distance between the irradiation source and the object to be processed is appropriately adjusted, but is usually about 10 to 200 mm. Alternatively, by preparing the cell culture container itself prepared in this step with a highly hydrophilic material, at least a part of the surface of the bottom part and at least a part of the surface of the microwell arranged on the bottom part are hydrophilic. You may obtain the cell culture container by which the chemical treatment was carried out. Such a case is also included in the embodiment of the hydrophilic treatment in the present invention. By subjecting the cell culture vessel prepared in this step to a hydrophilic treatment under the above conditions, cell adhesion and / or uniform spread of the culture solution can be ensured.
本工程において準備される細胞培養容器において、底部の少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とを親水化処理する手段及び条件は、通常は、実質的に同一である。この場合、前記細胞培養容器の底部の親水化処理された少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの親水化処理された少なくとも一部の表面との親水性を、実質的に同調させることができる。それ故、本発明の方法を実施することにより、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル内に形成される気泡量を指標として、前記細胞培養容器における底部の表面の親水性の経時変化を正確に予測することができる。 In the cell culture container prepared in this step, means and conditions for hydrophilizing at least a part of the surface of the bottom and at least a part of the surface of the microwell arranged at the bottom are usually substantially Are identical. In this case, the hydrophilicity between at least a part of the bottom of the cell culture container subjected to the hydrophilic treatment and at least a part of the surface of the microwell disposed on the bottom subjected to the hydrophilic treatment is substantially Can be tuned. Therefore, by carrying out the method of the present invention, the hydrophilicity of the surface of the bottom of the cell culture vessel is used as an index, with the amount of bubbles formed in the microwell in which the at least part of the surface is hydrophilized. A change with time can be accurately predicted.
本工程において準備される細胞培養容器において、底部の表面の少なくとも80％が親水化処理されていることが好ましく、底部の表面の少なくとも90％が親水化処理されていることがより好ましく、底部の表面の少なくとも95％が親水化処理されていることがさらに好ましく、底部の表面の略全面、すなわち約100％が親水化処理されていることが特に好ましい。本工程において準備される細胞培養容器の底部の表面を前記範囲に亘って親水化処理することにより、細胞の接着性及び／又は培養液の均一な広がりを確保することができる。 In the cell culture container prepared in this step, it is preferable that at least 80% of the bottom surface is hydrophilized, more preferably at least 90% of the bottom surface is hydrophilized, It is more preferable that at least 95% of the surface is hydrophilized, and it is particularly preferable that substantially the entire surface of the bottom portion, that is, about 100% is hydrophilized. By subjecting the surface of the bottom of the cell culture vessel prepared in this step to a hydrophilic treatment over the above range, cell adhesion and / or uniform spreading of the culture solution can be ensured.
本工程において準備される細胞培養容器において、前記マイクロウェルの1個の表面の少なくとも80％が親水化処理されていることが好ましく、前記マイクロウェルの1個の表面の少なくとも90％が親水化処理されていることがより好ましく、前記マイクロウェルの1個の表面の少なくとも95％が親水化処理されていることがさらに好ましく、前記マイクロウェルの1個の表面の略全面、すなわち約100％が親水化処理されていることが特に好ましい。本工程において準備される細胞培養容器において、前記マイクロウェルの表面を前記範囲に亘って親水化処理することにより、親水化処理された時点からの経過時間をより正確に算出することができる。 In the cell culture container prepared in this step, it is preferable that at least 80% of one surface of the microwell is hydrophilized, and at least 90% of one surface of the microwell is hydrophilized. More preferably, at least 95% of one surface of the microwell is hydrophilized, and substantially the entire surface of one surface of the microwell, that is, about 100% is hydrophilic. It is particularly preferable that the treatment is performed. In the cell culture container prepared in this step, the elapsed time from the time of the hydrophilic treatment can be calculated more accurately by hydrophilizing the surface of the microwell over the above range.
本工程において準備される細胞培養容器は、所望により、滅菌処理されていてもよい。前記滅菌処理としては、例えば、放射線照射処理（例えばガンマ線照射処理）、プラズマ照射処理、コロナ照射処理、紫外線（UV）照射処理、又はエチレンオキシドガスを用いる化学的処理等の当該技術分野で通常使用される処理を適宜採用することができる。前記滅菌処理は、前記で説明した親水化処理から一定時間経過後、好ましくは親水化処理直後に実施することが好ましい。前記親水化処理から滅菌処理までの経過時間を一定とすることにより、本発明の方法によって算出される親水化処理された時点からの経過時間に基づき、滅菌処理された時点からの経過時間を合わせて算出することができる。 The cell culture container prepared in this step may be sterilized as desired. As the sterilization treatment, for example, radiation treatment (for example, gamma irradiation treatment), plasma irradiation treatment, corona irradiation treatment, ultraviolet (UV) irradiation treatment, or chemical treatment using ethylene oxide gas is usually used in the technical field. Can be appropriately employed. The sterilization treatment is preferably performed after a certain period of time has passed since the hydrophilic treatment described above, and preferably immediately after the hydrophilic treatment. By making the elapsed time from the hydrophilization treatment to the sterilization treatment constant, the elapsed time from the sterilization time is adjusted based on the elapsed time from the hydrophilization time calculated by the method of the present invention. Can be calculated.
［1-2. 気泡量測定工程］
本発明の方法は、前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程を含むことが必要である。
[1-2. Bubble volume measurement process]
In the method of the present invention, at an elapsed time t x from the hydrophilization treatment, a liquid is introduced into at least one microwell in which at least a part of the surface has been hydrophilized, It is necessary to include a bubble amount measurement step of measuring the amount of bubbles a x formed on the hydrophilic surface.
本発明の方法において、経過時間txは、本発明の方法で使用される細胞培養容器を親水化処理した時点からの経過時間を意味する。細胞培養容器を親水化処理することによって結合又は形成された極性基は、時間経過に伴って徐々に脱離するか、又は非極性基へ変化し得る。このため、親水化処理された細胞培養容器の底部及びマイクロウェルの表面は、時間経過に伴って親水性が徐々に失われていく可能性がある。本発明の方法を実施することにより、本発明の方法で使用される細胞培養容器を親水化処理した時点からの経過時間txを算出することができる。 In the method of the present invention, the elapsed time t x means the elapsed time from the time when the cell culture vessel used in the method of the present invention is hydrophilized. The polar group bound or formed by subjecting the cell culture vessel to a hydrophilization treatment may be gradually detached or changed to a nonpolar group over time. For this reason, the hydrophilicity of the bottom of the cell culture vessel and the surface of the microwell that have been subjected to hydrophilic treatment may be gradually lost over time. By carrying out the method of the present invention, it is possible to calculate the elapsed time t x from the time when the cell culture container used in the method of the present invention is hydrophilized.
本工程において使用される液体は、水、又は本発明の方法で使用される細胞培養容器で細胞培養に使用される新鮮培地であることが好ましく、水（例えば純水）であることがより好ましい。前記液体として水を用いる場合、以下において説明する各工程において、該液体との接触角を正確に測定又は算出することができる。また、前記液体として細胞培養に使用される新鮮培地を用いる場合、実際の使用条件において形成し得る量に略等しい気泡量を得ることができる。 The liquid used in this step is preferably water or a fresh medium used for cell culture in the cell culture container used in the method of the present invention, and more preferably water (for example, pure water). . When water is used as the liquid, the contact angle with the liquid can be accurately measured or calculated in each step described below. Further, when a fresh medium used for cell culture is used as the liquid, it is possible to obtain an amount of bubbles substantially equal to the amount that can be formed under actual use conditions.
本工程において、液体が導入される少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルは、前記細胞培養容器に含まれる少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの全てであってもよく、一部であってもよい。この場合、液体が導入される前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの数は、通常は50個以下であり、2〜50個の範囲であることが好ましく、2〜30個の範囲であることがより好ましく、5〜25個の範囲であることがさらに好ましい。前記細胞培養容器が少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む場合、本工程において、液体が導入される少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルは、該少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの複数個の中から任意に選択することができる。例えば、少なくとも一部の表面が親水化処理された複数のマイクロウェルのうち、一部が前記細胞培養容器の底部の中央部分に配置され、残りが該細胞培養容器の底部の外縁部分に配置されている場合、本工程において、液体が導入される少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルは、該細胞培養容器の底部の中央部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択されてもよく、該細胞培養容器の底部の外縁部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択されてもよい。前記細胞培養容器の底部の中央部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択される場合、気泡の観察が容易になることから、気泡量の測定を容易に実施することができる。前記細胞培養容器の底部の外縁部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択される場合、該底部の中央部分で行われる細胞の培養を阻害することなく、気泡量の測定を実施することができる。 In this step, at least one microwell in which at least a part of the surface into which the liquid is introduced is hydrophilized is all of the microwells in which at least a part of the surface contained in the cell culture container is hydrophilized. Or a part thereof. In this case, the number of microwells into which at least a part of the surface into which the liquid is introduced has been subjected to a hydrophilic treatment is usually 50 or less, preferably in the range of 2 to 50, preferably 2 to 30 Is more preferable, and a range of 5 to 25 is more preferable. In the case where the cell culture container includes a plurality of microwells on which at least a part of the surface is hydrophilized, in this step, at least one microwell on which at least a part of the surface into which the liquid is introduced is hydrophilized Can be arbitrarily selected from a plurality of microwells in which at least a part of the surface is hydrophilized. For example, among a plurality of microwells whose surfaces are at least partially hydrophilized, a part is disposed in the central part of the bottom of the cell culture container, and the rest is disposed in the outer edge part of the bottom of the cell culture container. In this step, at least one microwell in which at least a part of the surface into which the liquid is introduced has been subjected to a hydrophilic treatment is at least a part of the surface disposed in the central part of the bottom of the cell culture container May be selected from among the microwells that have been hydrophilized, or at least a part of the surface disposed at the outer edge of the bottom of the cell culture vessel may be selected from among the microwells that have been hydrophilized. Good. When at least a part of the surface arranged in the central part of the bottom of the cell culture vessel is selected from a microwell that has been hydrophilized, it is easy to measure the amount of bubbles because it is easy to observe bubbles. Can be implemented. When at least a part of the surface arranged at the outer edge portion of the bottom of the cell culture container is selected from microwells that have been subjected to a hydrophilic treatment, without inhibiting cell culture performed at the center of the bottom The amount of bubbles can be measured.
本工程において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入する手段は特に限定されない。例えばマイクロピペット等の当該技術分野で通常使用される分注器具を用いて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに前記液体を穏やかに滴下しながら導入することが好ましい。前記の手段で前記液体を導入することにより、該液体の導入時の衝撃によって気泡が形成又は消失することを実質的に防止することができる。 In this step, the means for introducing the liquid into at least one microwell in which at least a part of the surface has been subjected to a hydrophilic treatment is not particularly limited. For example, using a dispensing device commonly used in the technical field such as a micropipette, the liquid is introduced into at least one microwell whose surface is at least partially hydrophilized while gently dropping. Is preferred. By introducing the liquid by the above-described means, it is possible to substantially prevent bubbles from being formed or disappear due to an impact at the time of introducing the liquid.
本工程において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルに導入された液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する。気泡量axは、気泡が形成された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの総数として表してもよく、使用される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの総数に対する気泡が形成された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの個数の百分率として算出される、気泡形成率（％）として表してもよい。使用される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルが1個の場合、気泡量axは、気泡が形成された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの総数、すなわち、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルにおいて気泡が形成されるときを1、形成されないときを0として表すことが好ましい。また、使用される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルが複数個の場合、気泡量axは、気泡形成率（％）として表すことが好ましい。前記の方法により、気泡量axの測定を容易に実施することができる。なお、気泡の形成は、限定するものではないが、例えば、肉眼又は顕微鏡による観察によって、確認することができる。 In this step, at least part of the surface to measure the amount of bubbles a x formed hydrophilized surface of the microwells in a liquid introduced into microwells hydrophilized. The bubble amount a x may be expressed as the total number of microwells in which at least some of the surfaces in which bubbles are formed are hydrophilized, and the total number of microwells in which at least some of the surfaces used are hydrophilized. It may be expressed as a bubble formation rate (%) which is calculated as a percentage of the number of microwells in which at least a part of the surface on which bubbles are formed is hydrophilized. When at least a part of the surface to be used has one microwell subjected to hydrophilization treatment, the bubble amount a x is the total number of microwells in which at least a part of the surface on which bubbles are formed is hydrophilized, i.e., It is preferable to express as 1 when bubbles are formed in a microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized, and as 0 when bubbles are not formed. In addition, when a plurality of microwells in which at least a part of the surface to be used is hydrophilized are used, the bubble amount a x is preferably expressed as a bubble formation rate (%). By the above method, the bubble amount a x can be easily measured. In addition, although formation of a bubble is not limited, For example, it can confirm by observation with the naked eye or a microscope.
［1-3. 接触角及び気泡量の関係取得工程］
本発明の方法は、場合により、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する、接触角及び気泡量の関係取得工程を含んでもよい。
[1-3. Process for obtaining relationship between contact angle and bubble volume]
In some cases, the method of the present invention has a relationship between the contact angle θ with the liquid on the hydrophilic surface of the microwell and the amount of bubbles a formed on the hydrophilic surface of the microwell in the liquid. A step of acquiring a relationship between the contact angle and the bubble amount may be included.
本工程は、例えば、以下の手順で実施することができる。前記細胞培養容器準備工程において準備された細胞培養容器を、前記で説明した手段によって親水化処理することにより、親水化処理の程度が異なる複数の細胞培養容器を準備する。ここで、親水化処理の程度は、前記で説明した親水化処理の手段における各種条件（例えば、照射出力又は照射時間等）を変化させることにより、調節することができる。前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角を測定する。前記で説明したように、本発明の方法で使用される細胞培養容器において、底部の少なくとも一部の表面と、該底部の表面に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とを親水化処理する手段及び条件は、通常は、実質的に同一である。また、前記細胞培養容器において、該細胞培養容器の収容部を構成する部材、すなわち底部及び側壁部と、該底部に配置される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルとは、通常は、同一の材料からなる。このため、前記細胞培養容器の底部の親水化処理された少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの親水化処理された少なくとも一部の表面とは、実質的に同程度まで親水化処理されて、実質的に同一の接触角を有する。それ故、本工程において、前記親水化処理後の細胞培養容器の底部の表面における前記液体との接触角を測定して、その値を、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角として取り扱うことが好ましい。ここで、接触角の測定は、当該技術分野で通常使用される接触角計等の測定機器を用いることにより、測定することができる。前記手順で本工程を実施することにより、接触角を容易に測定することができる。 This step can be performed, for example, according to the following procedure. By subjecting the cell culture container prepared in the cell culture container preparation step to a hydrophilic treatment by the means described above, a plurality of cell culture containers having different degrees of hydrophilic treatment are prepared. Here, the degree of the hydrophilic treatment can be adjusted by changing various conditions (for example, irradiation output or irradiation time) in the hydrophilic treatment means described above. The contact angle with the liquid on the hydrophilized surface of the microwell is measured. As described above, in the cell culture container used in the method of the present invention, at least a part of the surface of the bottom and a surface of at least a part of the microwell disposed on the surface of the bottom are hydrophilized. The means and conditions for doing this are usually substantially the same. Further, in the cell culture container, the members constituting the housing part of the cell culture container, that is, the bottom part and the side wall part, and the microwell in which at least a part of the surface disposed on the bottom part has been subjected to hydrophilic treatment are usually Are made of the same material. For this reason, at least a part of the surface of the bottom of the cell culture vessel that has been subjected to the hydrophilic treatment and at least a part of the surface of the microwell that is disposed on the bottom are subjected to substantially the same level. It is hydrophilized and has substantially the same contact angle. Therefore, in this step, the contact angle with the liquid on the surface of the bottom of the cell culture container after the hydrophilization treatment is measured, and the value is measured with the liquid on the hydrophilized surface of the microwell. It is preferable to handle it as a contact angle. Here, the contact angle can be measured by using a measuring instrument such as a contact angle meter that is usually used in the technical field. By performing this step according to the above procedure, the contact angle can be easily measured.
本工程において使用される液体は、前記気泡量測定工程において使用される液体と同一であることが好ましい。前記液体を使用することにより、本発明の方法に基づき親水化処理された時点からの経過時間をより正確に算出することができる。 The liquid used in this step is preferably the same as the liquid used in the bubble amount measuring step. By using the liquid, it is possible to more accurately calculate the elapsed time from the time of the hydrophilic treatment based on the method of the present invention.
本工程において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルに前記液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aを測定する。ここで、気泡量aは、前記で説明した気泡量axの測定と同様の手段により、実施することができる。得られた結果に基づき、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する。前記接触角θと気泡量aとの関係は、例えば、接触角θ及び気泡量aの測定値を用いて回帰分析を行うことにより、接触角θと気泡量aとの関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。前記手順は、複数の細胞培養容器を用いて反復実施して、得られた結果を統計的に処理することにより、実施してもよい。 In this step, the liquid is introduced into the microwell in which at least a part of the surface is hydrophilized, and the amount of bubbles a formed on the hydrophilized surface of the microwell in the liquid is measured. Here, the bubble amount a is, by measuring the same unit amount of bubbles a x described above, can be carried out. Based on the obtained results, the relationship between the contact angle θ with the liquid on the hydrophilic surface of the microwell and the amount of bubbles a formed on the hydrophilic surface of the microwell in the liquid is obtained. . The relationship between the contact angle θ and the bubble amount a is, for example, a mathematical expression or regression representing the relationship between the contact angle θ and the bubble amount a by performing regression analysis using the measured values of the contact angle θ and the bubble amount a. It can be acquired as a curve. The above procedure may be performed by repeatedly performing the procedure using a plurality of cell culture vessels and statistically processing the obtained results.
本工程は、以下において説明する接触角の経時変化の関係取得工程の前に実施してもよく、後に実施してもよい。しかしながら、本工程は、以下において説明する接触角取得工程の前に実施することが好ましい。接触角取得工程の前に本工程を実施することにより、本工程において得られる前記液体との接触角と気泡形成率との関係を、接触角取得工程で使用することができる。 This step may be performed before or after the relationship acquisition step for the change in contact angle with time described below. However, this step is preferably performed before the contact angle acquisition step described below. By performing this step before the contact angle acquisition step, the relationship between the contact angle with the liquid and the bubble formation rate obtained in this step can be used in the contact angle acquisition step.
本工程は、本発明の方法を実施する度に行ってもよい。しかしながら、本工程において得られる前記液体との接触角と気泡形成率との関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器に対して同様に適用することができる。このため、前記液体との接触角と気泡形成率との関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器について、少なくとも一回、本工程を実施することにより取得すればよい。このようにして取得された前記液体との接触角と気泡形成率との関係は、例えば演算装置等に蓄積しておき、以下において説明する接触角取得工程を実施する際に、該演算装置等から呼び出して使用することが好ましい。前記のように、予め演算装置等に蓄積された前記液体との接触角と気泡形成率との関係を該演算装置等から呼び出して取得する場合、本発明の方法において、本工程を実施する必要はない。それ故、前記の場合、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。 This step may be performed every time the method of the present invention is carried out. However, the relationship between the contact angle with the liquid and the bubble formation rate obtained in this step can be similarly applied to cell culture containers prepared under the same conditions. For this reason, the relationship between the contact angle with the liquid and the bubble formation rate may be obtained by carrying out this process at least once for a cell culture container prepared under the same conditions. The relationship between the contact angle with the liquid acquired in this way and the bubble formation rate is accumulated in, for example, an arithmetic device or the like, and when the contact angle acquisition process described below is performed, the arithmetic device or the like It is preferable to call and use from. As described above, when the relationship between the contact angle with the liquid and the bubble formation rate accumulated in advance in the arithmetic device or the like is obtained by calling from the arithmetic device or the like, it is necessary to perform this step in the method of the present invention. There is no. Therefore, in the above case, the implementation time of the method of the present invention can be shortened.
［1-4. 接触角の経時変化の関係取得工程］
本発明の方法は、場合により、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する、接触角の経時変化の関係取得工程を含んでもよい。
[1-4. Relationship acquisition process of contact angle over time]
The method of the present invention may optionally include a relationship obtaining step of contact angle change over time, which obtains a relationship with time of contact angle θ with the liquid on the hydrophilicized surface of the microwell.
本工程は、例えば、以下の手順で実施することができる。前記細胞培養容器準備工程において準備された細胞培養容器において、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角を測定する。接触角の測定は、前記接触角及び気泡量の関係取得工程と同様の手段によって実施することができる。次に、前記細胞培養容器を所定の外部環境下で静置する。所定時間経過後、前記と同様の手順で、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角を経時的に測定する。ここで、前記外部環境（例えば、温度、湿度、気相雰囲気及び光等）及び時間は、前記細胞培養容器を使用又は保管する外部環境に基づき、適宜設定することができる。例えば、前記外部環境の温度は、0℃〜50℃の範囲であることが好ましく、4℃〜30℃の範囲であることがより好ましい。前記外部環境の湿度（相対湿度）は、0〜70％の範囲であることが好ましい。前記外部環境の気相雰囲気は、空気であることが好ましい。前記外部環境の光の照度は、0〜10,000 lxの範囲であることが好ましい。また、前記外部環境下で前記細胞培養容器を静置する時間は、0〜52週の範囲であることが好ましく、0〜12週の範囲であることがより好ましい。得られた結果に基づき、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する。前記接触角θの経時変化の関係は、例えば、接触角θ及び経過時間の測定値を用いて回帰分析を行うことにより、接触角θと経過時間との関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。前記手順は、複数の細胞培養容器を用いて反復実施して、得られた結果を統計的に処理することにより、実施してもよい。 This step can be performed, for example, according to the following procedure. In the cell culture container prepared in the cell culture container preparation step, the contact angle with the liquid on the hydrophilized surface of the microwell is measured. The measurement of the contact angle can be performed by the same means as in the step of obtaining the relationship between the contact angle and the bubble amount. Next, the cell culture container is allowed to stand under a predetermined external environment. After a predetermined time has elapsed, the contact angle with the liquid on the hydrophilized surface of the microwell is measured over time by the same procedure as described above. Here, the external environment (for example, temperature, humidity, gas phase atmosphere and light) and time can be appropriately set based on the external environment in which the cell culture container is used or stored. For example, the temperature of the external environment is preferably in the range of 0 ° C to 50 ° C, and more preferably in the range of 4 ° C to 30 ° C. The humidity (relative humidity) of the external environment is preferably in the range of 0 to 70%. The gas phase atmosphere of the external environment is preferably air. The illuminance of light in the external environment is preferably in the range of 0 to 10,000 lx. Further, the time for allowing the cell culture container to stand in the external environment is preferably in the range of 0 to 52 weeks, and more preferably in the range of 0 to 12 weeks. Based on the obtained results, the relationship of change with time of the contact angle θ with the liquid on the hydrophilicized surface of the microwell is obtained. The relationship of change with time of the contact angle θ is acquired as a mathematical expression or a regression curve representing the relationship between the contact angle θ and the elapsed time, for example, by performing regression analysis using the measured values of the contact angle θ and the elapsed time. be able to. The above procedure may be performed by repeatedly performing the procedure using a plurality of cell culture vessels and statistically processing the obtained results.
本工程は、前記接触角及び気泡量の関係取得工程の前に実施してもよく、後に実施してもよい。しかしながら、本工程は、以下において説明する経過時間取得工程の前に実施することが好ましい。経過時間取得工程の前に本工程を実施することにより、本工程において得られる前記液体との接触角θの経時変化の関係を、経過時間取得工程で使用することができる。 This step may be performed before or after the contact angle and bubble amount relationship acquisition step. However, this step is preferably performed before the elapsed time acquisition step described below. By performing this step before the elapsed time acquisition step, the relationship with time of the contact angle θ with the liquid obtained in this step can be used in the elapsed time acquisition step.
本工程は、本発明の方法を実施する度に行ってもよい。しかしながら、本工程において得られる液体との接触角θの経時変化の関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器に対して同様に適用することができる。このため、前記液体との接触角θの経時変化の関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器について、少なくとも一回、本工程を実施することにより取得すればよい。このようにして取得された前記液体との接触角θの経時変化の関係は、例えば演算装置等に蓄積しておき、以下において説明する経過時間取得工程を実施する際に、該演算装置等から呼び出して使用することが好ましい。前記のように、予め演算装置等に蓄積された前記液体との接触角θの経時変化の関係を該演算装置等から呼び出して取得する場合、本発明の方法において、本工程を実施する必要はない。それ故、前記の場合、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。 This step may be performed every time the method of the present invention is carried out. However, the relationship over time of the contact angle θ with the liquid obtained in this step can be similarly applied to the cell culture container prepared under the same conditions. For this reason, the relationship of the change with time of the contact angle θ with the liquid may be obtained by carrying out this step at least once for the cell culture container prepared under the same conditions. The relationship of the change with time of the contact angle θ obtained with the liquid obtained in this way is accumulated in, for example, a calculation device or the like, and when the elapsed time acquisition step described below is performed, the calculation device or the like It is preferable to call and use. As described above, in the case where the relationship of the change with time of the contact angle θ with the liquid accumulated in the arithmetic device or the like in advance is obtained by calling from the arithmetic device or the like, it is necessary to perform this step in the method of the present invention. Absent. Therefore, in the above case, the implementation time of the method of the present invention can be shortened.
［1-5. 接触角取得工程］
本発明の方法は、前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程を含むことが必要である。
[1-5. Contact angle acquisition process]
In the method of the present invention, the bubble amount a x obtained in the bubble amount measurement step is determined by making the contact angle θ with the liquid on the hydrophilicized surface of the microwell, and making the microwell hydrophilic in the liquid. It is necessary to include a contact angle obtaining step of obtaining a contact angle θ x with the liquid corresponding to the bubble amount a x by applying to the relationship with the bubble amount a formed on the surface.
本工程において使用される接触角θと気泡量aとの関係は、前記で説明した接触角及び気泡量の関係取得工程を実施することにより、取得することができる。 The relationship between the contact angle θ and the bubble amount “a” used in this step can be acquired by performing the contact angle and bubble amount relationship acquisition step described above.
本工程において、前記接触角及び気泡量の関係取得工程を実施することによって取得された接触角θと気泡量aとの関係に対し、前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを適用することにより、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得ることができる。例えば、前記接触角及び気泡量の関係取得工程において説明した接触角θと気泡量aとの関係を表す数式又は回帰曲線に対し、前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを代入することにより、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る。これにより、気泡量axが、前記接触角及び気泡量の関係取得工程における気泡量aの測定値と一致しない場合であっても、接触角θxを得ることができる。この場合、予め前記接触角及び気泡量の関係取得工程を実施することによって取得され、演算装置に蓄積された前記接触角θと気泡量aとの関係を、該演算装置から呼び出して、本工程を実施することが好ましい。このようにすることで、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。 In this step, the bubble amount a x obtained in the bubble amount measurement step is applied to the relationship between the contact angle θ and the bubble amount a acquired by performing the relationship angle and bubble amount relationship acquisition step. Thus, the contact angle θ x with the liquid corresponding to the bubble amount a x can be obtained. For example, substituting the bubble amount a x obtained in the bubble amount measurement step for the mathematical expression or regression curve representing the relationship between the contact angle θ and the bubble amount a described in the contact angle and bubble amount relationship acquisition step. gives a contact angle theta x with liquid corresponding to the amount of bubbles a x. Thereby, even when the bubble amount a x does not coincide with the measured value of the bubble amount a in the contact angle and bubble amount relationship acquisition step, the contact angle θ x can be obtained. In this case, the relationship between the contact angle θ and the bubble amount a acquired in advance by performing the contact angle and bubble amount relationship acquisition step and accumulated in the calculation device is called from the calculation device, and this step is performed. It is preferable to implement. By doing in this way, the implementation time of the method of this invention can be shortened.
［1-6. 経過時間取得工程］
本発明の方法は、前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程を含むことが必要である。
[1-6. Elapsed time acquisition process]
The method of the present invention, the contact angle theta x and the liquid obtained by the contact angle obtaining step, by applying the relation of temporal change of the contact angle theta between the liquid in the hydrophilized surface of the microwell It is necessary to include an elapsed time acquisition step for obtaining an elapsed time t x corresponding to the contact angle θ x with the liquid.
本工程において使用される接触角θの経時変化の関係は、前記で説明した接触角の経時変化の関係取得工程を実施することにより、取得することができる。 The relationship of change with time of the contact angle θ used in this step can be acquired by performing the relationship acquisition process of change with time of the contact angle described above.
本工程において、前記接触角の経時変化の関係取得工程を実施することによって取得された接触角θの経時変化の関係に対し、前記接触角取得工程で得られる接触角θxを適用することにより、該接触角θxに対応する経過時間txを得ることができる。例えば、前記接触角の経時変化の関係取得工程において説明した接触角θの経時変化の関係を表す数式又は回帰曲線に対し、前記接触角取得工程で得られる接触角θxを代入することにより、接触角θxに対応する経過時間txを得る。これにより、接触角θxが、前記接触角の経時変化の関係取得工程における接触角θの測定値と一致しない場合であっても、経過時間txを得ることができる。この場合、予め前記接触角取得工程を実施することによって取得され、演算装置に蓄積された前記接触角θの経時変化の関係を、該演算装置から呼び出して、本工程を実施することが好ましい。このようにすることで、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。 In this step, with respect to the relationship changes over time in the the contact angle theta obtained by implementing the relation acquisition step of aging of the contact angle, by applying a contact angle theta x obtained by the contact angle acquisition step The elapsed time t x corresponding to the contact angle θ x can be obtained. For example, by substituting the contact angle θ x obtained in the contact angle acquisition step for the mathematical expression or regression curve representing the relationship of the contact angle θ with time explained in the contact angle change relationship acquisition step described above, An elapsed time t x corresponding to the contact angle θ x is obtained. Thus, the elapsed time t x can be obtained even when the contact angle θ x does not coincide with the measured value of the contact angle θ in the relationship acquisition step of the contact angle with time. In this case, it is preferable to execute this step by calling the relationship with time of the contact angle θ acquired in advance by performing the contact angle acquisition step and accumulated in the arithmetic device from the arithmetic device. By doing in this way, the implementation time of the method of this invention can be shortened.
本発明の方法に使用される細胞培養容器において、前記接触角取得工程において取得される接触角θxは、前記液体が水の場合、通常は、0〜90°の範囲であり、典型的には、0〜40°の範囲である。前記範囲の接触角θxを有する細胞培養容器は、表面を親水化処理した時点からの経過時間txが、通常は、0〜20週の範囲であり、典型的には、0〜10週の範囲である。 In a cell culture vessel used in the method of the present invention, the contact angle theta x acquired in the contact angle acquisition step, if the liquid is water, it is usually from 0 to 90 °, typically Is in the range of 0-40 °. Cell culture vessel having a contact angle theta x of the range, the elapsed time t x from the time when the surface hydrophilic treatment is usually in the range of 0 to 20 weeks, typically 0-10 weeks Range.
以上、詳細に説明したように、本発明の方法により、親水化処理されたそれぞれの細胞培養容器について、親水化処理された時点からの経過時間を1個ずつ管理することなく、任意の時点における表面の親水化処理からの経過時間、及び場合により滅菌処理からの経過時間を簡便に算出することができる。これにより、それぞれの細胞培養容器の使用期限を、容易に管理することができる。 As described above in detail, by the method of the present invention, for each cell culture vessel that has been subjected to hydrophilic treatment, without managing the elapsed time from the time of hydrophilic treatment one by one, at any time point The elapsed time from the surface hydrophilization treatment and, in some cases, the elapsed time from the sterilization treatment can be easily calculated. Thereby, the expiration date of each cell culture container can be managed easily.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
［実施例1：水との接触角と気泡量との関係］
3.5 cmサイズのポリスチレン製ディッシュの底部の表面に、直径286 μm、深さ167 μmのマイクロウェルを25個有する細胞培養用ディッシュを作製した。前記マイクロウェルの底部は、前記ディッシュの底部の表面と略平行な面を基準として7°の傾斜角を有する逆円錐形状とした。前記細胞培養用ディッシュの底部及びマイクロウェルの表面に、プラズマ照射（種類：熱プラズマ；出力：100 W；照射時間：1分）して、該底部及び25個全てのマイクロウェルの表面の略全面を親水化処理した。前記プラズマ照射処理の照射時間の条件を変化させて、親水化処理の程度が異なる複数の細胞培養用ディッシュを準備した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面のうち、表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの開口部の近傍における水との接触角を測定した。また、前記プラズマ照射処理後の表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルに水を滴下して、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量を測定した。前記試験を、25個のマイクロウェルを有する細胞培養用ディッシュを用いて三連で実施した。このため、気泡量の測定は、一処理区について、合計75個の表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルを用いて実施した。水との接触角は、各試験区における三連の測定値の平均値として算出した。また、気泡量は、使用された表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの総数75個に対する気泡が形成された表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの個数の百分率である、気泡の形成率（％）として算出した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化処理された表面に形成される気泡形成率との関係を図2に示す。図中、点線で示す直線及び数式は、水との接触角及び気泡形成率の測定値を用いて回帰分析を行うことによって得られた回帰曲線及び回帰式である。
[Example 1: Relationship between contact angle with water and amount of bubbles]
A cell culture dish having 25 microwells having a diameter of 286 μm and a depth of 167 μm on the surface of the bottom of a 3.5 cm size polystyrene dish was prepared. The bottom of the microwell has an inverted conical shape having an inclination angle of 7 ° with respect to a plane substantially parallel to the surface of the bottom of the dish. Plasma irradiation (type: thermal plasma; output: 100 W; irradiation time: 1 minute) is performed on the bottom of the cell culture dish and the surface of the microwell, and substantially the entire surface of the bottom and all 25 microwells. Was hydrophilized. A plurality of dishes for cell culture were prepared by changing the conditions of the irradiation time of the plasma irradiation treatment to have different degrees of hydrophilic treatment. Of the surface of the bottom of the cell culture dish after the plasma irradiation treatment, the contact angle with water in the vicinity of the opening of the microwell in which substantially the entire surface was hydrophilized was measured. In addition, water was dropped into a microwell in which substantially the entire surface after the plasma irradiation treatment was hydrophilized, and the amount of bubbles formed on the hydrophilized surface of the microwell in water was measured. The test was performed in triplicate using a cell culture dish having 25 microwells. For this reason, the amount of bubbles was measured using microwells in which approximately 75 surfaces in total were hydrophilized in one treatment section. The contact angle with water was calculated as the average of triplicate measurement values in each test section. Further, the amount of bubbles is a percentage of the number of microwells in which substantially the entire surface of the surface on which bubbles are formed is hydrophilized with respect to the total number of 75 microwells in which substantially the entire surface used is hydrophilized. It was calculated as the bubble formation rate (%). FIG. 2 shows the relationship between the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish after the plasma irradiation treatment and the bubble formation rate formed on the hydrophilized surface of the microwell in water. In the figure, straight lines and mathematical formulas indicated by dotted lines are regression curves and regression equations obtained by performing regression analysis using measured values of the contact angle with water and the bubble formation rate.
図2に示すように、前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡形成率との間には、一定の相関関係があることが確認された。 As shown in FIG. 2, between the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish after the plasma irradiation treatment and the bubble formation rate formed on the hydrophilized surface of the microwell in water. Was confirmed to have a certain correlation.
なお、前記プラズマ照射処理において、細胞培養用ディッシュの底部の表面及び25個全てのマイクロウェルの表面は、実質的に同程度まで親水化処理された。また、細胞培養用ディッシュの底部の表面及び25個全てのマイクロウェルの表面は、同一の材料（ポリスチレン）から作製された。それ故、前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角は、同一の細胞培養用ディッシュの底部に形成された表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの表面における水との接触角と実質的に同一となる。 In the plasma irradiation treatment, the surface of the bottom of the cell culture dish and the surfaces of all 25 microwells were hydrophilized to substantially the same extent. The surface of the bottom of the cell culture dish and the surfaces of all 25 microwells were made of the same material (polystyrene). Therefore, the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish after the plasma irradiation treatment is the same as that of the microwell in which substantially the entire surface formed on the bottom of the same cell culture dish is hydrophilized. The contact angle with water on the surface is substantially the same.
［実施例2：水との接触角の経時変化］
実施例1と同様の細胞培養用ディッシュを準備した。前記細胞培養用ディッシュの底部及びマイクロウェルの表面に、プラズマ照射（種類：熱プラズマ；出力：100 W；照射時間：1分又は3分）して、該底部及びマイクロウェルの表面の略全面を親水化処理した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュを、所定時間、25℃、空気雰囲気の外部環境下で静置した。所定時間経過後、細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角を測定した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角の経時変化を図3に示す。図中、菱形のデータは、100 Wの出力で1分間、プラズマ照射処理した場合の結果を、四角形のデータは、100 Wの出力で3分間、プラズマ照射処理した場合の結果を、それぞれ示す。図中、点線で示す直線及び数式は、水との接触角及び経過時間の測定値を用いて回帰分析を行うことによって得られた回帰曲線及び回帰式である。
[Example 2: Change in contact angle with water over time]
A cell culture dish similar to that of Example 1 was prepared. Plasma irradiation (type: thermal plasma; output: 100 W; irradiation time: 1 minute or 3 minutes) is applied to the bottom of the cell culture dish and the surface of the microwell, so that substantially the entire surface of the bottom and the microwell are covered. Hydrophilic treatment was performed. The cell culture dish after the plasma irradiation treatment was allowed to stand in an external environment of an air atmosphere at 25 ° C. for a predetermined time. After a predetermined time, the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish was measured. FIG. 3 shows the change with time of the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish after the plasma irradiation treatment. In the figure, the diamond data indicates the results when the plasma irradiation treatment is performed at 100 W output for 1 minute, and the square data indicates the results when the plasma irradiation treatment is performed at 100 W output for 3 minutes. In the figure, the straight lines and mathematical formulas indicated by dotted lines are regression curves and regression equations obtained by performing regression analysis using measured values of contact angle with water and elapsed time.
図3に示すように、前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角は、時間の経過に伴い高くなることが確認された。 As shown in FIG. 3, it was confirmed that the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish after the plasma irradiation treatment increased with time.
［実施例3：細胞培養用ディッシュの管理方法］
以下の手順で、細胞培養用ディッシュの底部に配置されたマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量を測定することにより、該細胞培養用ディッシュを親水化処理した時点からの経過時間を算出することができる。
[Example 3: Management method of cell culture dish]
The elapsed time from the time when the cell culture dish was hydrophilized by measuring the amount of bubbles formed on the hydrophilized surface of the microwell arranged at the bottom of the cell culture dish by the following procedure. Can be calculated.
実施例1と同様の手順により、プラズマ照射処理によって表面が親水化処理された細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡形成率との関係を取得する。前記水との接触角と気泡形成率との関係は、図2に示すように、水との接触角及び気泡形成率の測定値を用いて回帰分析を行うことにより、水との接触角と気泡形成率との関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。また、実施例2と同様の手順により、プラズマ照射処理によって表面が親水化処理された細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角の経時変化の関係を取得する。前記水との接触角の経時変化の関係は、図3に示すように、水との接触角及び経過時間の測定値を用いて回帰分析を行うことにより、水との接触角と経過時間との関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。前記水との接触角と気泡形成率との関係、及び水との接触角の経時変化の関係は、同一の条件で作製された細胞培養用ディッシュに対して同様に適用することができる。このため、前記水との接触角と気泡形成率との関係、及び水との接触角の経時変化の関係は、例えばプラズマ照射処理直後に所定の個数の細胞培養用ディッシュを用いて取得すればよく、細胞培養用ディッシュを使用する度に該関係を取得する必要はない。 According to the same procedure as in Example 1, the contact angle with water on the surface of the bottom of the cell culture dish whose surface has been hydrophilized by plasma irradiation treatment, and the hydrophilized surface of the microwell in water are formed. Get the relationship with bubble formation rate. As shown in FIG. 2, the relationship between the contact angle with water and the bubble formation rate is determined by performing regression analysis using the measured values of the contact angle with water and the bubble formation rate. It can be acquired as a mathematical expression or a regression curve representing the relationship with the bubble formation rate. In addition, according to the same procedure as in Example 2, the relationship of change with time of the contact angle with water on the bottom surface of the cell culture dish whose surface has been hydrophilized by plasma irradiation treatment is obtained. As shown in FIG. 3, the relationship between the contact angle with water and the elapsed time is determined by performing regression analysis using the measured values of the contact angle with water and the elapsed time. It can be acquired as a mathematical expression or a regression curve representing the relationship. The relationship between the contact angle with water and the bubble formation rate and the relationship with time of change in the contact angle with water can be similarly applied to cell culture dishes produced under the same conditions. For this reason, the relationship between the contact angle with water and the bubble formation rate, and the relationship with time of the contact angle with water can be obtained using, for example, a predetermined number of cell culture dishes immediately after the plasma irradiation treatment. Well, it is not necessary to acquire this relationship every time a cell culture dish is used.
細胞培養用ディッシュを任意の時間に亘って使用又は保管した後、該細胞培養用ディッシュの少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルに水を滴下して、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する。得られた気泡量axを、予め取得された前記水との接触角と気泡形成率との関係に適用して、気泡量axに対応する水との接触角θxを得る。例えば、前記手順で取得した水との接触角と気泡形成率との関係を表す数式又は回帰曲線に対し、気泡量axを代入することにより、気泡量axに対応する水との接触角θxを得る。得られた水との接触角θxを、予め取得された前記水との接触角の経時変化の関係に適用して、水との接触角θxに対応する経過時間txを得る。例えば、前記手順で取得した水との接触角の経時変化を表す数式又は回帰曲線に対し、得られた水との接触角θxを代入することにより、水との接触角θxに対応する経過時間txを得ることができる。 After the cell culture dish is used or stored for an arbitrary period of time, water is dropped into the microwell in which at least a part of the surface of the cell culture dish is hydrophilized to make the microwell hydrophilic in water. The amount of bubbles a x formed on the formed surface is measured. The obtained bubble amount a x is applied to the previously obtained relationship between the contact angle with water and the bubble formation rate to obtain the contact angle θ x with water corresponding to the bubble amount a x . For example, with respect to formulas or regression curve representing the relationship between the contact angle and the bubble formation rate of the water obtained in the above procedure, by substituting the amount of bubbles a x, the contact angle with water corresponding to the amount of bubbles a x get the θ x. The obtained contact angle θ x with water is applied to the previously obtained relationship of change with time of the contact angle with water to obtain an elapsed time t x corresponding to the contact angle θ x with water. For example, by substituting the obtained contact angle θ x with water for the mathematical expression or regression curve representing the change with time of the contact angle with water obtained in the above procedure, it corresponds to the contact angle θ x with water. The elapsed time t x can be obtained.
以上の方法により、それぞれの細胞培養用ディッシュについて、親水化処理された時点からの経過時間を1個ずつ管理することなく、任意の時点における表面の親水化処理からの経過時間を簡便に算出することができる。これにより、それぞれの細胞培養用ディッシュの使用期限を、容易に管理することができる。 By the above method, for each dish for cell culture, the elapsed time from the surface hydrophilization treatment at an arbitrary time can be easily calculated without managing the elapsed time from the time of the hydrophilization treatment one by one. be able to. Thereby, the expiration date of each cell culture dish can be managed easily.
1…細胞培養容器
11…底部
12…少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル
13…側壁部
14…底部の表面
1 ... Cell culture vessel
11 ... Bottom
12 ... Microwells with at least a part of the surface hydrophilized
13 ... Side wall
14 ... bottom surface
Claims (5)
前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程；
前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程；
前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程；
を含む、細胞培養容器の管理方法。 A cell culture container comprising: a cell culture container comprising: a bottom having at least a part of the surface hydrophilized; and at least one microwell disposed on the bottom and having at least a part of the surface hydrophilized Preparation process;
At an elapsed time t x from the hydrophilization treatment, a liquid is introduced into at least one microwell in which at least a part of the surface has been hydrophilized, and the liquid is introduced into the hydrophilized surface of the microwell in the liquid. A bubble amount measuring step of measuring a bubble amount a x formed;
The bubble amount a x obtained in the bubble amount measurement step is determined based on the contact angle θ with the liquid on the hydrophilic surface of the microwell and the bubbles formed on the hydrophilic surface of the microwell in the liquid. Applying to the relationship with the amount a to obtain a contact angle θ x with the liquid corresponding to the bubble amount a x ;
The contact angle theta x and the liquid obtained by the contact angle obtaining step, by applying the relation of temporal change of the contact angle theta between the liquid in the hydrophilized surface of the microwell, contact with the liquid An elapsed time acquisition step of obtaining an elapsed time t x corresponding to the angle θ x ;
A method for managing a cell culture container.
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