JP2014147342A - Cell culture sheet, method of producing the same, and cell culture vessel using the same - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養シート、およびその製造方法、並びにこれを用いた細胞培養容器に関する。 The present invention relates to a cell culture sheet, a method for producing the same, and a cell culture container using the same.
近年、バイオ医薬に係る技術や、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に係る技術等の研究が盛んに行われている。これらの技術の研究においては、細胞、組織、器官等を効率良く培養、解析することが求められている。 In recent years, research on technologies related to biopharmaceuticals, technologies related to induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), and the like has been actively conducted. In research of these techniques, it is required to efficiently culture and analyze cells, tissues, organs and the like.
これまで、効率良く細胞等の培養、解析を行うためのいくつかの手法が報告されている。当該手法としては、例えば、細胞等を培養する際に細胞等の足場となる機能を有する細胞培養シートを工夫する方法が提案されている。なお、細胞培養シートは、一般に、微小孔を有しており、例えば、微小孔から培地の栄養素が供給される等により、細胞等の好適な培養環境を実現することができる。 Until now, several methods for efficiently culturing and analyzing cells and the like have been reported. As such a technique, for example, a method has been proposed in which a cell culture sheet having a function as a scaffold for cells or the like when culturing cells or the like is devised. The cell culture sheet generally has micropores. For example, a suitable culture environment for cells and the like can be realized by supplying nutrients of the medium from the micropores.
細胞培養シートの構造を工夫する方法の具体的な例として、例えば特許文献１には、可視または赤外領域の波長の光に対して透明な微小孔あきシートの形態の固体材料であって、シートが無孔の状態で透明な材料からなり、シートの両面において隣接する２孔間の平均距離が５μｍ以上、好ましくは７μｍ以上であることを特徴とする、微小孔あき固体シート材料（細胞培養シート）に係る発明が記載されている。特許文献１に係る細胞培養シートによれば、微小孔の間の平均距離を所定の値以上にすることにより、可視光線および赤外領域の波長に対して完全に透明であることが記載されている。これにより、例えば、顕微鏡で細胞等を観察する際に鮮明な観察画像を得ることができ、培養した細胞等の解析を効率良く行うことが可能となりうる。 As a specific example of a method for devising the structure of a cell culture sheet, for example, Patent Document 1 discloses a solid material in the form of a microporous sheet transparent to light having a wavelength in the visible or infrared region, A microporous solid sheet material (cell culture), characterized in that the sheet is made of a transparent material with no pores, and the average distance between two adjacent holes on both sides of the sheet is 5 μm or more, preferably 7 μm or more. The invention relating to the sheet) is described. According to the cell culture sheet according to Patent Document 1, it is described that the average distance between the micropores is not less than a predetermined value, so that the cell culture sheet is completely transparent to wavelengths in the visible light and infrared regions. Yes. Thereby, for example, when observing cells and the like with a microscope, a clear observation image can be obtained, and it becomes possible to efficiently analyze cultured cells and the like.
なお、特許文献１に記載の細胞培養シートは、可撓性合成ポリマーを材料とし、当該材料に重イオン照射による損傷の痕跡の付与（いわゆる、「トラック（損傷）エッチング」）を行った後、当該損傷を化学処理による浸食（いわゆる「ケミカルエッチング」）を施すという、従来一般に適用される細胞培養シートの製造方法により製造されている。 In addition, the cell culture sheet described in Patent Document 1 is made of a flexible synthetic polymer, and after applying a trace of damage caused by heavy ion irradiation to the material (so-called “track (damage) etching”), It is manufactured by a cell culture sheet manufacturing method that is generally applied in the past, in which the damage is eroded by chemical treatment (so-called “chemical etching”).
特許文献１に記載の細胞培養シートをはじめとする従来の細胞培養シートは、通常、高分子（可撓性ポリマー）を原料としている。しかしながら、高分子を原料とし、トラックエッチングおよびケミカルエッチングを施すことにより製造された細胞培養シートは優れた透明性が得られない場合があることが判明した。また、一定の透明性が得られうる場合であっても、細胞培養シートが有する微小孔の配置等に制約が生じ、所望の培養環境が実現できないことがある。このような場合には、細胞等の培養、解析を効率良く行うことができない可能性がある。 Conventional cell culture sheets including the cell culture sheet described in Patent Document 1 are usually made of a polymer (flexible polymer) as a raw material. However, it has been found that a cell culture sheet produced by using a polymer as a raw material and performing track etching and chemical etching may not have excellent transparency. Even when a certain level of transparency can be obtained, there are cases where the arrangement of the micropores of the cell culture sheet is restricted and a desired culture environment cannot be realized. In such a case, there is a possibility that culture and analysis of cells and the like cannot be performed efficiently.
これに対し、本発明者らは、透明な無機材料を含み、少なくとも１つの微小孔を有する、矩形板状細胞培養シートを提案している（電気学会センサ・マイクロマシン部門大会 第２９回「センサ・マイクロマシンと応用システム」シンポジウム論文集、第６８５〜６８８頁）。前記矩形板状細胞培養シートは、透明な無機材料を原料としていることから、透明な無機材料に起因する優れた透明性を実現することができる。また、透明性を実現するための微小孔の配置等についての制約がなく、またはほとんどなく、所望の培養環境を実現することができる。その結果、細胞等の培養、解析を効率良く行うことが可能となりうる。 On the other hand, the present inventors have proposed a rectangular plate-shaped cell culture sheet containing a transparent inorganic material and having at least one micropore (Electrotechnical Society of Sensor and Micromachine Division, 29th “Sensor ・Micromachine and Applied Systems "Symposium Proceedings, pp. 685-688). Since the rectangular plate-shaped cell culture sheet is made of a transparent inorganic material, excellent transparency resulting from the transparent inorganic material can be realized. In addition, a desired culture environment can be realized with little or no restriction on the arrangement of micropores for realizing transparency. As a result, it may be possible to efficiently culture and analyze cells and the like.
本発明者らは、効率良く細胞等の培養、解析を行うため、さらに詳細な検討を行ったところ、上記矩形板状細胞培養シートにおいては、培養した細胞等が細胞培養シート上で不均一に分布する場合があることが判明した。このような場合、細胞等を効率良く培養、解析することができない可能性がある。 The inventors of the present invention conducted further detailed studies in order to efficiently culture and analyze cells and the like. As a result, in the rectangular plate-shaped cell culture sheet, the cultured cells and the like were unevenly distributed on the cell culture sheet. It has been found that there are cases where it is distributed. In such a case, there is a possibility that cells and the like cannot be cultured and analyzed efficiently.
そこで、本発明は、細胞等をより効率良く培養、解析することができる細胞培養シートを提供することを目的とする。 Then, an object of this invention is to provide the cell culture sheet which can culture | cultivate and analyze a cell etc. more efficiently.
本発明者らは鋭意研究を行った結果、細胞培養シートの材料として透明な無機材料を使用し、かつ、細胞培養シートが平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有することにより、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have used the transparent inorganic material as the material for the cell culture sheet, and the cell culture sheet has a shape including a curve at least partially in plan view. Has been found to be solved, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、透明な無機材料を含む第１の無機層を有する細胞培養シートに関する。この際、前記第１の無機層は、少なくとも１つの微小孔を有する。また、前記細胞培養シートは、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有する。 That is, the present invention relates to a cell culture sheet having a first inorganic layer containing a transparent inorganic material. At this time, the first inorganic layer has at least one micropore. Further, the cell culture sheet has a shape including a curve at least partially in a plan view.
本発明によれば、細胞等を効率良く培養、解析することができる細胞培養シートを提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell culture sheet which can culture | cultivate and analyze a cell etc. efficiently can be provided.
より詳細には、本発明によれば、透明性に優れた細胞培養シートを提供できる。 More specifically, according to the present invention, a cell culture sheet having excellent transparency can be provided.
また、本発明によれば、培養した細胞が均一に分布する細胞培養シートを提供できる。 Moreover, according to this invention, the cell culture sheet in which the cultured cell distributes uniformly can be provided.
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail.
＜細胞培養シート＞
本発明に係る細胞培養シートは、透明な無機材料を含む第１の無機層を有する。この際、前記第１の無機層は、少なくとも１つの微小孔を有する。また、本発明に係る細胞培養シートは、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有する。なお、本明細書において、「平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状」とは、膜厚を有する板状の形状であって、上面および／または下面が平面視において少なくとも一部の曲線を含む形状を意味する。具体例としては、円板形状、卵形状、長円板形状、楕円板形状、角部にアール部を設けた多角形の板形状等を例示できる。これらのうち、前記「平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状」は、円板形状であることが好ましい。
<Cell culture sheet>
The cell culture sheet according to the present invention has a first inorganic layer containing a transparent inorganic material. At this time, the first inorganic layer has at least one micropore. In addition, the cell culture sheet according to the present invention has a shape including a curve at least partially in a plan view. In the present specification, “a shape including at least a curve in a plan view” is a plate-like shape having a film thickness, and the upper surface and / or the lower surface has at least a part of a curve in a plan view. It means the shape to include. Specific examples include a disk shape, an egg shape, an oblong plate shape, an elliptical plate shape, and a polygonal plate shape having rounded corners. Among these, the “shape including at least part of a curve in plan view” is preferably a disk shape.
本発明に係る細胞培養シートによれば、細胞、組織、器官等（本願では、これらをまとめて「細胞」と称することがある）を効率良く培養、解析することができる。 The cell culture sheet according to the present invention can efficiently culture and analyze cells, tissues, organs and the like (in the present application, these may be collectively referred to as “cells”).
本発明の一実施形態に係る細胞培養シートについて、図面を参照しながら説明する。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。 A cell culture sheet according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. In addition, the dimension ratio of drawing is exaggerated on account of description, and may differ from an actual ratio.
図１Ａは、本発明の一実施形態に係る細胞培養シートの斜視図である。図１の細胞培養シート１００は円板形状を有する。当該細胞培養シートは、透明な無機材料（例えば、窒化ケイ素）から構成される第１の無機層（窒化ケイ素から構成される無機層）１を有する。この際、第１の無機層１は円形の微小孔２を有する。 FIG. 1A is a perspective view of a cell culture sheet according to an embodiment of the present invention. The cell culture sheet 100 of FIG. 1 has a disk shape. The cell culture sheet has a first inorganic layer (inorganic layer composed of silicon nitride) 1 composed of a transparent inorganic material (for example, silicon nitride). At this time, the first inorganic layer 1 has circular micropores 2.
図１Ｂは、上記図１Ａの細胞培養シートの断面図である。図１Ｂに示されるように、細胞培養シート１００が有する微小孔２は、第１の無機層１を垂直方向（厚み方向）に貫通した構成を有している。 FIG. 1B is a cross-sectional view of the cell culture sheet of FIG. 1A. As shown in FIG. 1B, the micropores 2 of the cell culture sheet 100 have a configuration that penetrates the first inorganic layer 1 in the vertical direction (thickness direction).
以下、本発明に係る細胞培養シートの各構成について説明する。 Hereinafter, each structure of the cell culture sheet which concerns on this invention is demonstrated.
［第１の無機層］
第１の無機層は、細胞を培養する際に細胞の足場となる機能を有する。当該第１の無機層は、透明な無機材料を含む。
[First inorganic layer]
The first inorganic layer has a function of serving as a cell scaffold when cells are cultured. The first inorganic layer includes a transparent inorganic material.
第１の無機層は透明であることが好ましい。なお、本明細書において、「透明」とは、光線透過率が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。この際、前記光線透過率の値は、実施例の方法で測定した値のうち、波長５００ｎｍ〜６００ｎｍにおける光線透過率の値を採用するものとする。 The first inorganic layer is preferably transparent. In the present specification, “transparent” means that the light transmittance is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more. Under the present circumstances, the value of the light transmittance in wavelength 500nm -600nm shall be employ | adopted for the value of the said light transmittance among the values measured by the method of the Example.
第１の無機層の膜厚は、０．１〜５μｍであることが好ましく、０．５〜１．５μｍであることがより好ましい。第１の無機層の膜厚が０．１μｍ以上であると、細胞の足場としての機械的強度が十分に得られうることから好ましい。一方、第１の無機層の膜厚が５μｍ以下であると、第１の無機層が高い透明性を有しうることから好ましい。 The film thickness of the first inorganic layer is preferably 0.1 to 5 μm, and more preferably 0.5 to 1.5 μm. When the film thickness of the first inorganic layer is 0.1 μm or more, it is preferable because the mechanical strength as a cell scaffold can be sufficiently obtained. On the other hand, it is preferable that the film thickness of the first inorganic layer is 5 μm or less because the first inorganic layer can have high transparency.
第１の無機層の表面粗さ（Ｒａ）は、１０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以下であることがより好ましい。第１の無機層の表面粗さが１０ｎｍ以下であると、第１の無機層が高い透明性を有しうることから好ましい。なお、本明細書において、「表面粗さ（Ｒａ）」の値は、ＪＩＳ Ｂ０６０１（２００１）に準拠した方法で測定された値を採用するものとする。 The surface roughness (Ra) of the first inorganic layer is preferably 10 nm or less, and more preferably 5 nm or less. It is preferable that the surface roughness of the first inorganic layer is 10 nm or less because the first inorganic layer can have high transparency. In addition, in this specification, the value measured by the method based on JIS B0601 (2001) shall be employ | adopted for the value of "surface roughness (Ra)."
（透明な無機材料）
用いられうる透明な無機材料としては、透明な無機の材料であれば特に制限されない。例えば、ケイ素、チタン、亜鉛、スズ、アルミニウムの窒化物、酸化物、酸化窒化物等のうち、透明なものが挙げられる。具体的には、窒化ケイ素（ＳｉＮ）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、酸化窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、酸化窒化チタン（ＴｉＯＮ）等が挙げられる。なお、透明でないという観点から、例えば、酸化アルミニウム等については透明な無機材料には含まれない。これらのうち、透明な無機材料は、窒化ケイ素、二酸化ケイ素であることが好ましく、窒化ケイ素であることがより好ましい。上述の透明な無機材料は単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
(Transparent inorganic material)
The transparent inorganic material that can be used is not particularly limited as long as it is a transparent inorganic material. For example, transparent ones of nitrides, oxides, oxynitrides of silicon, titanium, zinc, tin, and aluminum can be used. Specifically, silicon nitride (SiN), silicon oxide (SiO 2 ), titanium oxide (TiO 2 ), zinc oxide (ZnO), tin oxide (SnO 2 ), silicon oxynitride (SiON), titanium oxynitride (TiON) ) And the like. From the viewpoint of being not transparent, for example, aluminum oxide or the like is not included in the transparent inorganic material. Of these, the transparent inorganic material is preferably silicon nitride or silicon dioxide, and more preferably silicon nitride. The above-mentioned transparent inorganic materials may be used alone or in combination of two or more.
（微小孔）
第１の無機層は少なくとも１つの微小孔を有する。微小孔は、細胞培養シートが担持する細胞に培地の栄養素を供給する等により、細胞の好適な培養環境を実現する機能を有する。なお、本明細書において「微小孔」とは、孔を構成する任意の２点のうち、最大となる部分の長さ（直径）が２０μｍ以下、好ましくは０．１〜１０μｍ、さらに好ましくは０．５〜５μｍである孔を意味する。
(Micropore)
The first inorganic layer has at least one micropore. The micropores have a function of realizing a suitable culture environment for cells, for example, by supplying nutrients of the medium to the cells carried by the cell culture sheet. In the present specification, the term “micropore” means that the maximum length (diameter) of any two points constituting the hole is 20 μm or less, preferably 0.1 to 10 μm, more preferably 0. Means pores that are 5-5 μm.
微小孔の形状は、特に制限されないが、円形、楕円形、三角形、四角形、五角形、六角形等でありうる。微小孔の形状は、１種のみであっても、２種以上が混合したものであってもよい。微小孔の形状は、培養しようとする細胞や、培養の目的等に応じて適宜設定されうる。 The shape of the micropore is not particularly limited, but may be a circle, an ellipse, a triangle, a quadrangle, a pentagon, a hexagon, or the like. The shape of the micropores may be only one type or a mixture of two or more types. The shape of the micropores can be appropriately set according to the cells to be cultured, the purpose of the culture, and the like.
微小孔の角度、すなわち、第１の無機層の垂直断面において、第１の無機層の面に対する微小孔の断面がなす角度は、８０〜１００度であることが好ましく、８５〜９５度であることがより好ましく、９０度であることがさらに好ましい。前記微小孔の角度が上記範囲内にあると、光の散乱や吸収を防止することができ、細胞培養シートが高い透明性を有することから好ましい。 The angle of the micropore, that is, the angle formed by the cross section of the micropore with respect to the surface of the first inorganic layer in the vertical cross section of the first inorganic layer is preferably 80 to 100 degrees, and preferably 85 to 95 degrees. More preferably, it is 90 degrees. When the angle of the micropores is within the above range, it is preferable because light scattering and absorption can be prevented and the cell culture sheet has high transparency.
第１の無機層における微小孔の面積率は、微小孔の孔径によっても異なるが、１０〜７０％であることが好ましく、１０〜５０％であることがより好ましく、１０〜２０％であることがさらに好ましい。微小孔の面積率が１０％以上であると、微小孔を通じた栄養素の供給が円滑に行われうることから好ましい。一方、微小孔の面積率が７０％以下であると、高い透明性が得られうることから好ましい。この際、微小孔の孔径が大きいほど、面積率が高値となっても高い透明性を実現できる傾向がある。 The area ratio of the micropores in the first inorganic layer varies depending on the pore size of the micropores, but is preferably 10 to 70%, more preferably 10 to 50%, and more preferably 10 to 20%. Is more preferable. It is preferable that the area ratio of the micropores is 10% or more because nutrients can be smoothly supplied through the micropores. On the other hand, when the area ratio of the micropores is 70% or less, it is preferable because high transparency can be obtained. At this time, the larger the hole diameter of the micropores, the higher the transparency, the higher the area ratio tends to be realized.
微小孔の分布は、細胞培養シート上の細胞を同等の条件で培養できる観点から、均一であることが好ましい。しかし、培養の目的等に応じて、微小孔の分布を不均一なものとしてもよい。 The distribution of the micropores is preferably uniform from the viewpoint that the cells on the cell culture sheet can be cultured under the same conditions. However, the micropore distribution may be nonuniform depending on the purpose of the culture.
（表面修飾）
前記第１の無機層は、培養の目的等に応じて、その表面が機能性分子で修飾（表面修飾）されていてもよい。第１の無機層の表面が機能性分子で修飾されることにより、例えば、細胞培養シート上に配置される細胞を細胞培養シートに高い接着性で固定させること、細胞の増殖を促進させること等が可能となる。
(Surface modification)
The surface of the first inorganic layer may be modified with a functional molecule (surface modification) depending on the purpose of the culture. By modifying the surface of the first inorganic layer with a functional molecule, for example, fixing cells arranged on the cell culture sheet to the cell culture sheet with high adhesion, promoting cell proliferation, etc. Is possible.
前記機能性分子は、通常、第１の無機層を構成する無機材料に導入された官能基を介して化学的に結合する。すなわち、表面修飾された細胞培養シートは、第１の無機層上に官能基を介して機能性分子が結合した構成を有しうる。 The functional molecule is usually chemically bonded via a functional group introduced into an inorganic material constituting the first inorganic layer. That is, the surface-modified cell culture sheet may have a configuration in which a functional molecule is bonded to the first inorganic layer via a functional group.
前記機能性分子としては、特に制限されず、適宜選択されうる。具体的な機能性分子としては、コラーゲン、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エンタクチン、エラスチン、ヒアルロン酸、テネイシン等の細胞外マトリクス；アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ロイシン−アスパラギン酸−バリン、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン等の細胞接着ペプチド；ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン等の合成分子が挙げられる。 The functional molecule is not particularly limited and may be appropriately selected. Specific functional molecules include: extracellular matrix such as collagen, proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, fibronectin, laminin, entactin, elastin, hyaluronic acid, tenascin; arginine-glycine-aspartic acid, leucine-aspartic acid-valine, arginine -Cell adhesion peptides such as glutamic acid-aspartic acid-valine; and synthetic molecules such as poly-L-lysine and poly-L-ornithine.
前記官能基としては、前記機能性分子と結合を形成しうるものであれば特に制限されないが、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、チオール基、活性化エステル基、マレイミド基等が挙げられる。これらのうち、前記機能性分子との結合形成が容易であるという観点から、前記官能基は、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、活性化エステル基であることが好ましく、アミノ基、カルボキシ基であることがより好ましい。なお、前記官能基は、例えば、第１の無機層をプラズマ処理等した後に、前期官能基を有するシランカップリング剤等を作用させることで、透明な無機材料に導入することができる。 The functional group is not particularly limited as long as it can form a bond with the functional molecule, and examples thereof include a hydroxy group, an amino group, a carboxy group, a thiol group, an activated ester group, and a maleimide group. Among these, from the viewpoint of easy bond formation with the functional molecule, the functional group is preferably a hydroxy group, an amino group, a carboxy group, or an activated ester group. More preferably. The functional group can be introduced into a transparent inorganic material, for example, by subjecting the first inorganic layer to plasma treatment or the like and then acting on a silane coupling agent having a previous functional group.
［外周層］
細胞培養シートは、第１の無機層の外周上に外周層をさらに有していてもよい。外周層は、基材層を含む。前記外周層は、必要に応じて、透明な無機材料を含む第２の無機層やその他の任意の層をさらに有してもよい。
[Outer peripheral layer]
The cell culture sheet may further have an outer peripheral layer on the outer periphery of the first inorganic layer. The outer peripheral layer includes a base material layer. The outer peripheral layer may further include a second inorganic layer containing a transparent inorganic material and other arbitrary layers as necessary.
細胞培養シートが外周層を有することにより、細胞培養シートの外周面の機械的強度が向上しうる。また、後述する細胞培養容器を形成する際、円筒部材に細胞培養シートを好適に配置することができる。 When the cell culture sheet has an outer peripheral layer, the mechanical strength of the outer peripheral surface of the cell culture sheet can be improved. Moreover, when forming the cell culture container mentioned later, a cell culture sheet can be arrange | positioned suitably at a cylindrical member.
図２Ａには、本発明の一実施形態に係る外周層を有する細胞培養シートの斜視図を示す。図２Ａの細胞培養シート２００は円板形状を有し、微小孔２が形成された第１の無機層１の外周円上に外周層３を有する。当該外周層３は、基材層（例えば、シリコンウエハ）４と第２の無機層（例えば、窒化ケイ素の無機層）５を有する。 FIG. 2A shows a perspective view of a cell culture sheet having an outer peripheral layer according to an embodiment of the present invention. The cell culture sheet 200 of FIG. 2A has a disc shape, and has an outer peripheral layer 3 on the outer peripheral circle of the first inorganic layer 1 in which the micropores 2 are formed. The outer peripheral layer 3 includes a base layer (for example, a silicon wafer) 4 and a second inorganic layer (for example, an inorganic layer of silicon nitride) 5.
図２Ｂには、上記図２Ａの細胞培養シート２００の垂直断面図を示す。図２Ｂによれば、外周層３は、第１の無機層１の面に対して基材層４の露出面（例えば、シリコンウエハの（１１１）面）がなす傾斜角θ１を有するように形成されている。その結果、第１の無機層１と接する基材層４の幅ｍ１は、第２の無機層５と接する基材層４の幅ｎ１よりも大きくなっている。 FIG. 2B shows a vertical sectional view of the cell culture sheet 200 of FIG. 2A. According to FIG. 2B, the outer peripheral layer 3 has an inclination angle θ 1 formed by the exposed surface of the base material layer 4 (for example, the (111) surface of the silicon wafer) with respect to the surface of the first inorganic layer 1. Is formed. As a result, the width m 1 of the base material layer 4 in contact with the first inorganic layer 1 is larger than the width n 1 of the base material layer 4 in contact with the second inorganic layer 5.
外周層は、上記図２Ｂに示すように、第１の無機層の面に対して基材層の露出面がなす傾斜角を有することが好ましい。当該傾斜角は、０度超９０度以下であることが好ましく、４５〜９０度であることがより好ましい。ただし、本形態に係る細胞培養シートはこれに限定されず、傾斜角が９０度超であってもよい。傾斜角が９０度超である場合には、上記図２Ｂにおける第１の無機層１と接する基材層４の幅ｍ１は、第２の無機層５と接する基材層４の幅ｎ１よりも小さくなる。 As shown in FIG. 2B, the outer peripheral layer preferably has an inclination angle formed by the exposed surface of the base material layer with respect to the surface of the first inorganic layer. The inclination angle is preferably more than 0 degrees and not more than 90 degrees, and more preferably 45 to 90 degrees. However, the cell culture sheet according to the present embodiment is not limited to this, and the inclination angle may be more than 90 degrees. When the inclination angle exceeds 90 degrees, the width m 1 of the base material layer 4 in contact with the first inorganic layer 1 in FIG. 2B is the width n 1 of the base material layer 4 in contact with the second inorganic layer 5. Smaller than.
（基材層）
基材層は、外周層の必須の構成要素である。
(Base material layer)
The base material layer is an essential component of the outer peripheral layer.
基材層を構成する材料としては、特に制限されないが、シリコンウエハ、シリコンカーバイドウエハ、サファイアウエハ、リン化ガリウムウエハ、ヒ化ガリウムウエハ、リン化インジウムウエハ、窒化ガリウムウエハ、ガラス、石英、セラミック等が挙げられる。 The material constituting the base layer is not particularly limited, but silicon wafer, silicon carbide wafer, sapphire wafer, gallium phosphide wafer, gallium arsenide wafer, indium phosphide wafer, gallium nitride wafer, glass, quartz, ceramic, etc. Is mentioned.
基材層の膜厚は、２００μｍ以上であることが好ましく、２５０〜３５０μｍであることがより好ましい。 The thickness of the base material layer is preferably 200 μm or more, and more preferably 250 to 350 μm.
第１の無機層と接する面における基材層の幅は、０．５〜３ｍｍであることが好ましく、１〜２ｍｍであることがより好ましい。 The width of the base material layer on the surface in contact with the first inorganic layer is preferably 0.5 to 3 mm, and more preferably 1 to 2 mm.
また、基材層の第１の無機層が配置された面とは反対の面（基材層上に第２の無機層を有する場合には、第２の無機層と接する面）における基材層の幅は、０．１〜２ｍｍであることが好ましく、０．５〜１．５ｍｍであることがより好ましい。 Further, the base material on the surface opposite to the surface on which the first inorganic layer of the base material layer is disposed (the surface in contact with the second inorganic layer when the second inorganic layer is provided on the base material layer). The width of the layer is preferably 0.1 to 2 mm, and more preferably 0.5 to 1.5 mm.
（第２の無機層）
第２の無機層は、外周層の任意の構成要素である。前記第２の無機層は、透明な無機材料を含む。
(Second inorganic layer)
The second inorganic layer is an optional component of the outer peripheral layer. The second inorganic layer includes a transparent inorganic material.
前記無機材料は、上記第１の無機層と同様のものが用いられうることからここでは説明を省略する。なお、第２の無機層を構成する透明な無機材料は、第１の無機層を構成する透明な無機材料と同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。 Since the inorganic material similar to the first inorganic layer can be used, the description thereof is omitted here. In addition, the transparent inorganic material which comprises a 2nd inorganic layer may be the same as the transparent inorganic material which comprises a 1st inorganic layer, and may differ.
第２の無機層の膜厚は、０．５μｍ以上であることが好ましく、１〜２μｍであることがより好ましい。 The film thickness of the second inorganic layer is preferably 0.5 μm or more, and more preferably 1 to 2 μm.
［仕切り層］
細胞培養シートは、第１の無機層上に仕切り層をさらに有していてもよい。仕切り層は、基材層を含む。前記仕切り層は、必要に応じて、透明な無機材料を含む第２の無機層やその他の任意の層をさらに有してもよい。なお、本明細書において「仕切り層」とは、第１の無機層を少なくとも２つの領域に分離する層を意味する。
[Partition layer]
The cell culture sheet may further have a partition layer on the first inorganic layer. The partition layer includes a base material layer. The partition layer may further include a second inorganic layer containing a transparent inorganic material and other arbitrary layers as necessary. In the present specification, the “partition layer” means a layer that separates the first inorganic layer into at least two regions.
細胞培養シートが仕切り層を有することにより、細胞培養シートの膜強度が向上しうる。 When the cell culture sheet has a partition layer, the membrane strength of the cell culture sheet can be improved.
図３Ａには、本発明の一実施形態に係る仕切り層を有する細胞培養シートの斜視図を示す。図３Ａの細胞培養シート３００は円板形状を有し、微小孔２が形成された第１の無機層１上に、縦方向に２つ、横方向に１つの仕切り層６を有する。当該仕切り層６は、基材層４と第２の無機層５を有する。 FIG. 3A shows a perspective view of a cell culture sheet having a partition layer according to one embodiment of the present invention. The cell culture sheet 300 of FIG. 3A has a disk shape, and has two partition layers 6 in the vertical direction and one partition layer 6 in the horizontal direction on the first inorganic layer 1 in which the micropores 2 are formed. The partition layer 6 includes a base material layer 4 and a second inorganic layer 5.
図３Ｂには、上記図３Ａの細胞培養シート３００の垂直断面図を示す。図３Ｂによれば、仕切り層６は、外周層と同様に、第１の無機層１の面に対して基材層４の露出面（例えば、シリコンウエハの（１１１）面）がなす傾斜角θ２を有するように形成されている。その結果、第１の無機層１と接する基材層４の幅ｍ２は、第２の無機層５と接する基材層４の幅ｎ２よりも大きくなっている。 FIG. 3B shows a vertical sectional view of the cell culture sheet 300 of FIG. 3A. According to FIG. 3B, the partition layer 6 has an inclination angle formed by the exposed surface of the base material layer 4 (for example, the (111) surface of the silicon wafer) with respect to the surface of the first inorganic layer 1, similarly to the outer peripheral layer. and it is formed to have a theta 2. As a result, the width m 2 of the base material layer 4 in contact with the first inorganic layer 1 is larger than the width n 2 of the base material layer 4 in contact with the second inorganic layer 5.
仕切り層は、上記図３Ｂに示すように、第１の無機層の面に対して基材層の露出面がなす傾斜角を有することが好ましい。当該傾斜角は、０度超９０度以下であることが好ましく、４５〜９０度であることがより好ましい。ただし、上記外周層と同様に、本形態に係る細胞培養シートはこれに限定されず、傾斜角が９０度超であってもよい。 As shown in FIG. 3B, the partition layer preferably has an inclination angle formed by the exposed surface of the base material layer with respect to the surface of the first inorganic layer. The inclination angle is preferably more than 0 degrees and not more than 90 degrees, and more preferably 45 to 90 degrees. However, like the outer peripheral layer, the cell culture sheet according to the present embodiment is not limited to this, and the inclination angle may be more than 90 degrees.
仕切り層の数は、特に制限されず、所望の細胞培養シートに応じて適宜設定されうる。 The number in particular of a partition layer is not restrict | limited, According to a desired cell culture sheet, it can set suitably.
仕切り層の形状は、特に制限されず、直線状であっても、曲線状であってもよい。 The shape of the partition layer is not particularly limited, and may be linear or curved.
仕切り層の配置についても特に制限されないが、中央部に配置しても、端部に配置してもよい。なお、２以上の仕切り層を有する場合には、当該仕切り層が、格子状、ひし形状の形態で配置されることが好ましい。 The arrangement of the partition layer is not particularly limited, but may be arranged at the center or at the end. In addition, when it has two or more partition layers, it is preferable that the said partition layer is arrange | positioned with the form of a grid | lattice form and a rhombus shape.
なお、本発明の一実施形態において、細胞培養シートは、外周層および仕切り層をともに有することが好ましい。 In one embodiment of the present invention, the cell culture sheet preferably has both an outer peripheral layer and a partition layer.
（基材層）
基材層は、仕切り層の必須の構成要素である。
(Base material layer)
The base material layer is an essential component of the partition layer.
基材層は、上述と同様のものが用いられうることから、ここでは説明を省略する。 Since the same thing as the above-mentioned can be used for a base material layer, description is abbreviate | omitted here.
基材層の膜厚は、２００μｍ以上であることが好ましく、２５０〜３５０μｍであることがより好ましい。 The thickness of the base material layer is preferably 200 μm or more, and more preferably 250 to 350 μm.
第１の無機層と接する面における基材層の幅は、１０〜８００μｍであることが好ましく、５０〜３５０μｍであることがより好ましい。 The width of the base material layer on the surface in contact with the first inorganic layer is preferably 10 to 800 μm, and more preferably 50 to 350 μm.
また、基材層の第１の無機層が配置された面とは反対の面（基材層上に第２の無機層を有する場合には、第２の無機層と接する面）における基材層の幅は、１０〜２００μｍであることが好ましく、５０〜１００μｍであることがより好ましい。 Further, the base material on the surface opposite to the surface on which the first inorganic layer of the base material layer is disposed (the surface in contact with the second inorganic layer when the second inorganic layer is provided on the base material layer). The width of the layer is preferably 10 to 200 μm, and more preferably 50 to 100 μm.
（第２の無機層）
第２の無機層は、仕切り層の任意の構成要素である。
(Second inorganic layer)
The second inorganic layer is an optional component of the partition layer.
第２の無機層は、上述と同様のものが用いられうることから、ここでは説明を省略する。 Since the same thing as the above-mentioned can be used for the 2nd inorganic layer, description is abbreviate | omitted here.
第２の無機層の膜厚は、０．５μｍ以上であることが好ましく、１〜２μｍであることがより好ましい。 The film thickness of the second inorganic layer is preferably 0.5 μm or more, and more preferably 1 to 2 μm.
本発明の一実施形態において、細胞培養シートの培養面は、１０ｍｍ２以上であることが好ましく、２０〜５００ｍｍ２であることがより好ましい。培養面が１０ｍｍ２以上であると、培養可能な細胞数が多くなることから好ましい。なお、「培養面」とは、細胞が配置可能な第１の無機層の表面積を意味する。例えば、細胞培養シートが外周層を備える場合には、外周層が形成された部分を除く第１の無機層の表面積である。本発明の一実施形態において、前記培養面は、円形、長円形、楕円形、角部にアール部を設けた多角形の形状であることが好ましく、円形であることがより好ましい。 In one embodiment of the present invention, the culture surface of the cell culture sheet is preferably 10 mm 2 or more, more preferably 20 to 500 mm 2. A culture surface of 10 mm 2 or more is preferable because the number of cells that can be cultured increases. “Culture surface” means the surface area of the first inorganic layer on which cells can be arranged. For example, when the cell culture sheet includes an outer peripheral layer, the surface area of the first inorganic layer excluding the portion where the outer peripheral layer is formed. In one embodiment of the present invention, the culture surface is preferably circular, oval, elliptical, or a polygonal shape with rounded corners, and more preferably circular.
本発明に係る細胞培養シートによれば、細胞を効率良く培養、解析することができる。 According to the cell culture sheet of the present invention, cells can be efficiently cultured and analyzed.
具体的には、本発明に係る細胞培養シートは、透明性に優れる。その結果、例えば、細胞を解析するために、細胞を細胞培養シートの裏面から観察した細胞観察像が鮮明に得られうることから、細胞の解析を効率良く行うことが可能となりうる。 Specifically, the cell culture sheet according to the present invention is excellent in transparency. As a result, for example, in order to analyze a cell, a cell observation image obtained by observing the cell from the back surface of the cell culture sheet can be clearly obtained, so that the cell can be analyzed efficiently.
従来の細胞培養シートは、高分子を材料とするものが多く、通常、１０μｍ以上の膜厚を有するため、細胞培養シートが有する微小孔内で光の散乱や吸収が起こりやすい。特に、所望とする培養を実現する等の目的で、微小孔の孔径を小さく、および／または微小孔の面積率を大きくするほど、前記光の散乱や吸収がより起こりやすくなる。また、高分子を材料とする細胞培養シートは、その表面粗さが大きくなり、細胞培養シート面においても光の散乱や吸収が起こりやすい。さらに、高分子を材料とする細胞培養シートは、その製造方法において、通常、トラックエッチングおよびケミカルエッチングを施すことにより製造されている。よって、上記微小孔の形成方法に起因して、微小孔の角度（細胞培養シートの垂直断面において、細胞培養の表面に対する微小孔の断面がなす角度）が垂直ではなく斜めに形成されることがあり、その結果として、微小孔内における光の散乱や吸収をより増大しうる。したがって、高分子を材料とする細胞培養シートは、優れた透明性を実現することが困難である。そのため、優れた透明性を得るためには、特許文献１のように、微小孔の配置等を適宜規定する必要がある。しかし、これらの透明性を得るために規定された微小孔を有する細胞培養シートでは、培養しようとする細胞や、細胞培養の目的によっては適用できないこともありうる。 Many conventional cell culture sheets are made of a polymer, and usually have a film thickness of 10 μm or more. Therefore, light scattering and absorption are likely to occur in the micropores of the cell culture sheet. In particular, for the purpose of realizing desired culture and the like, the smaller the pore diameter and / or the larger the area ratio of the micropores, the more easily the light is scattered and absorbed. In addition, a cell culture sheet made of a polymer has a large surface roughness, and light scattering and absorption are likely to occur on the cell culture sheet surface. Furthermore, a cell culture sheet made of a polymer material is usually produced by performing track etching and chemical etching in the production method. Therefore, due to the above micropore formation method, the micropore angle (in the vertical cross section of the cell culture sheet, the angle formed by the cross section of the micropore with respect to the surface of the cell culture) may be formed obliquely rather than vertical. As a result, light scattering and absorption in the micropores can be further increased. Therefore, it is difficult for a cell culture sheet made of a polymer material to achieve excellent transparency. Therefore, in order to obtain excellent transparency, it is necessary to appropriately define the arrangement of micropores as in Patent Document 1. However, the cell culture sheet having micropores defined to obtain these transparency may not be applicable depending on the cell to be cultured and the purpose of cell culture.
一方、本形態に係る細胞培養シートによれば、細胞を配置することとなる第１の無機層は、それ自体優れた透明性を有する無機材料を含む。また、第１の無機層は、上述のように、薄膜であり、表面粗さも低値である。さらに、微小孔の角度も垂直またはこれに近い形状で構成されうる。よって、本発明の一実施形態によれば、微小孔等を特別に規定することなく、透明性に優れる細胞培養シートが得られうる。その結果、培養しようとする細胞や、細胞培養の目的に応じて微小孔の密度や配置等を適宜調節することができる。 On the other hand, according to the cell culture sheet concerning this form, the 1st inorganic layer which will arrange a cell contains the inorganic material which has the transparency which was excellent in itself. Moreover, the 1st inorganic layer is a thin film as mentioned above, and its surface roughness is also low. Furthermore, the angle of the micropores can also be configured to be vertical or close to this. Therefore, according to one embodiment of the present invention, a cell culture sheet having excellent transparency can be obtained without specially defining micropores. As a result, the density and arrangement of the micropores can be appropriately adjusted according to the cells to be cultured and the purpose of the cell culture.
また、本発明に係る細胞培養シートは、表面修飾により好適に機能性分子を配置することができる。その結果、細胞培養シートは、細胞を高い接着性で固定させること、細胞の増殖を促進させること等が可能となりうる。 In addition, the cell culture sheet according to the present invention can favorably arrange functional molecules by surface modification. As a result, the cell culture sheet may be able to fix cells with high adhesion, promote cell proliferation, and the like.
従来の高分子を材料とする細胞培養シートは、機能性分子（例えば、コラーゲン）を物理吸着させることによって表面処理されていた。その結果、機能性分子の細胞培養シート表面への結合が弱く、機能性分子が剥離することがあった。また、物理吸着による表面処理の場合、機能性分子の細胞培養シート上における分布は不均一となることがあり、細胞の培養や解析において、例えば、再現性が得られないという不都合が生じることがあった。なお、高分子表面を親水化する方法や、プラズマ照射等でポリマーに官能基を形成して、化学結合により機能性分子を導入する試みも行われている。しかしながら、高分子に存在する官能基は、熱力学的安定性等の観点から、ポリマー内部に位置する構造をとりやすく、官能基を介して機能性分子を導入しても、配置された機能性分子の状態が不安定となりうる。 A cell culture sheet made of a conventional polymer has been surface-treated by physical adsorption of a functional molecule (for example, collagen). As a result, the binding of the functional molecule to the cell culture sheet surface was weak, and the functional molecule might peel off. In addition, in the case of surface treatment by physical adsorption, the distribution of functional molecules on the cell culture sheet may be non-uniform, resulting in inconvenience that, for example, reproducibility cannot be obtained in cell culture and analysis. there were. In addition, attempts have been made to introduce functional molecules by chemical bonding by forming a functional group in the polymer by a method of hydrophilizing the polymer surface, plasma irradiation or the like. However, the functional group present in the polymer tends to have a structure located inside the polymer from the viewpoint of thermodynamic stability, etc., and even if the functional molecule is introduced through the functional group, the arranged functionality The molecular state can be unstable.
一方、本発明に係る細胞培養シートによれば、第１の無機層が透明な無機材料を含む。そのため、透明な無機材料表面には、容易に官能基を導入することができ、また、導入された官能基も第１の無機層の外側に位置している。その結果、機能性分子を化学結合により導入することができ、導入された機能性分子も第１の無機層表面に安定に存在することができる。また、導入された機能性分子は均一な分布を有しうる。 On the other hand, according to the cell culture sheet of the present invention, the first inorganic layer contains a transparent inorganic material. Therefore, a functional group can be easily introduced on the surface of the transparent inorganic material, and the introduced functional group is located outside the first inorganic layer. As a result, the functional molecule can be introduced by chemical bonding, and the introduced functional molecule can be stably present on the surface of the first inorganic layer. In addition, the introduced functional molecule may have a uniform distribution.
その他、本発明に係る細胞培養シートは、高分子を材料とする従来の細胞培養シートと対比して、高い耐熱性、耐薬品性を有する。その結果、細胞の培養前に、オートクレーブ滅菌（高圧蒸気滅菌）や感熱滅菌（１６０〜２００℃、３０分〜２時間）等を行うことができ、好適な培養環境を提供することができる。また、薬物等を使用した細胞の培養、解析等を好適に行うことができる。 In addition, the cell culture sheet according to the present invention has high heat resistance and chemical resistance as compared with a conventional cell culture sheet made of a polymer. As a result, autoclave sterilization (high-pressure steam sterilization), heat-sensitive sterilization (160 to 200 ° C., 30 minutes to 2 hours) or the like can be performed before culturing cells, and a suitable culture environment can be provided. In addition, cell culture, analysis, and the like using a drug or the like can be suitably performed.
また、本発明に係る細胞培養シートは、高分子を材料とする従来の細胞培養シートと対比して、自家発光が少ない。その結果、細胞を蛍光観察する場合において、バックグラウンドが少なく、高いＳ／Ｎ比の観察画像を得ることができる。 In addition, the cell culture sheet according to the present invention has less auto-luminescence compared to a conventional cell culture sheet made of a polymer. As a result, when the cells are fluorescently observed, an observation image with a low background and a high S / N ratio can be obtained.
本発明に係る細胞培養シートはまた、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有していることから、細胞を効率良く培養、解析することができる。 Since the cell culture sheet according to the present invention also has a shape including a curve at least partially in plan view, cells can be cultured and analyzed efficiently.
本発明者らが報告した矩形板状細胞培養シートは、細胞を培養する表面が矩形であるため、細胞培養シート上に配置される培養成分が四隅において生じうる屈曲（凹型メニスカス等）等の影響により、培養した細胞の分布が不均一になりうる。 Since the rectangular plate-shaped cell culture sheet reported by the present inventors has a rectangular surface for culturing cells, the influence of bending (concave meniscus etc.) that the culture components placed on the cell culture sheet may occur at the four corners. As a result, the distribution of the cultured cells can be non-uniform.
一方、本発明に係る細胞培養シートによれば、細胞を培養する表面は平面視において少なくとも一部に曲線を含むことから、培養成分が均一となり、培養した細胞の分布も均一となりうる。 On the other hand, according to the cell culture sheet according to the present invention, the surface on which the cells are cultured includes a curve at least partially in a plan view, so that the culture components are uniform and the distribution of the cultured cells can be uniform.
また、本発明のように、細胞培養シートが平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有することによって、矩形状の形状と比べて、細胞培養シートに付与されうる内部応力を好適に緩和することができ、高い耐久性が得られうる。 In addition, as in the present invention, when the cell culture sheet has a shape including at least a curve in a plan view, the internal stress that can be applied to the cell culture sheet is preferably alleviated compared to a rectangular shape. And high durability can be obtained.
＜細胞培養シートの製造方法＞
本発明に係る細胞培養シートは、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。例えば、ガラス上に微小孔を形成するためのマスクを形成した後、透明な無機材料を蒸着して無機層を形成し、次いで、形成された無機層を剥離させることにより細胞培養シートを製造する方法；シリコンウエハ上に透明な無機材料を蒸着して無機層を形成し、パターニングしたレジストを用いて無機層をドライエッチングすることにより微小孔を形成し、次いで、形成された無機層を剥離することにより細胞培養シートを製造する方法等が挙げられる。この際、少なくとも一部に曲線を含む表面を有するガラス、シリコンウエハを使用する方法；形成された無機層を加工する方法等を適宜行うことにより、細胞培養シートが、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有することとなりうる。
<Method for producing cell culture sheet>
The cell culture sheet according to the present invention is not particularly limited, and can be produced by various methods. For example, after forming a mask for forming micropores on glass, a transparent inorganic material is deposited to form an inorganic layer, and then the formed inorganic layer is peeled to produce a cell culture sheet. Method: depositing a transparent inorganic material on a silicon wafer to form an inorganic layer, forming a micropore by dry-etching the inorganic layer using a patterned resist, and then peeling the formed inorganic layer And a method for producing a cell culture sheet. At this time, the cell culture sheet is at least partially in plan view by appropriately performing a method using a glass or silicon wafer having a curved surface at least partially; a method of processing the formed inorganic layer, or the like. It may have a shape that includes a curve.
以下の説明では、本発明において、好ましい実施形態に係る細胞培養シートの製造方法について、図面を参照しながら説明する。 In the following description, in the present invention, a method for producing a cell culture sheet according to a preferred embodiment will be described with reference to the drawings.
図４は、本発明の一実施形態に係る細胞培養シートの製造工程を示す模式図である。図４によると、（１）はじめにシリコンウエハ７の下面に無機材料（例えば、窒化ケイ素）を含む第１の層（例えば、窒化ケイ素の層）８を形成する。次に、（２）シリコンウエハ７の上面に第２の層（例えば、窒化ケイ素の層）９を形成する。そして、（３）形成した第１の層をエッチングすることにより、微小孔２を形成する。この際、微小孔２が形成された第１の層８が、細胞培養シートにおける第１の無機層に対応する。その後、（４）第２の層９をエッチングすることにより、エッチング窓１０を形成する。この際、エッチング窓１０が形成された第２の層９が、細胞培養シートにおける外周層を構成する第２の無機層に対応する。最後に、（５）第２の層の方向から、すなわち、エッチング窓１０により露出したシリコンウエハ７の表面に対して、結晶異方性エッチングを行う。この際、エッチングが行われた後のシリコンウエハ７が、細胞培養シートの外周層を構成する基材層に対応する。なお、本実施形態においては、図示されていないが、使用したシリコンウエハが円板状であるため、当該シリコンウエハ表面に形成された第１の層も円板状の形状を有している。よって、本実施形態により製造された細胞培養シートは、上述の図２Ａおよび図２Ｂの実施形態に係る細胞培養シートと同様の構成を有する。 FIG. 4 is a schematic view showing a manufacturing process of the cell culture sheet according to one embodiment of the present invention. According to FIG. 4, (1) First, a first layer (for example, a layer of silicon nitride) 8 containing an inorganic material (for example, silicon nitride) is formed on the lower surface of the silicon wafer 7. Next, (2) a second layer (for example, a silicon nitride layer) 9 is formed on the upper surface of the silicon wafer 7. Then, (3) the fine hole 2 is formed by etching the formed first layer. At this time, the first layer 8 in which the micropores 2 are formed corresponds to the first inorganic layer in the cell culture sheet. Thereafter, (4) the second layer 9 is etched to form an etching window 10. Under the present circumstances, the 2nd layer 9 in which the etching window 10 was formed respond | corresponds to the 2nd inorganic layer which comprises the outer periphery layer in a cell culture sheet. Finally, (5) crystal anisotropic etching is performed from the direction of the second layer, that is, the surface of the silicon wafer 7 exposed by the etching window 10. At this time, the silicon wafer 7 after the etching corresponds to the base material layer constituting the outer peripheral layer of the cell culture sheet. In the present embodiment, although not shown, since the used silicon wafer has a disc shape, the first layer formed on the surface of the silicon wafer also has a disc shape. Therefore, the cell culture sheet manufactured by this embodiment has the same configuration as the cell culture sheet according to the embodiment of FIGS. 2A and 2B described above.
すなわち、本発明の好ましい一形態においては、細胞培養シートの製造方法が提供される。当該細胞培養シートの製造方法は、シリコンウエハの一方の面上に透明な無機材料を含む第１の層を形成する工程（１）と、前記シリコンウエハの他方の面上に透明な無機材料を含む第２の層を形成する工程（２）と、前記第１の層に微小孔を形成する工程（３）と、前記第２の層にエッチング窓を形成する工程（４）と、前記第２の層の方向から結晶異方性エッチングを行う工程（５）と、を含む。 That is, in a preferred embodiment of the present invention, a method for producing a cell culture sheet is provided. The cell culture sheet manufacturing method includes the step (1) of forming a first layer containing a transparent inorganic material on one surface of a silicon wafer, and a transparent inorganic material on the other surface of the silicon wafer. A step (2) of forming a second layer, a step (3) of forming a microhole in the first layer, a step (4) of forming an etching window in the second layer, (5) performing crystal anisotropic etching from the direction of the second layer.
以下、各工程について詳細に説明する。 Hereinafter, each step will be described in detail.
［工程（１）］
工程（１）は、シリコンウエハの一方の面上に透明な無機材料を含む第１の層を形成する工程である。
[Step (1)]
Step (1) is a step of forming a first layer containing a transparent inorganic material on one surface of the silicon wafer.
（シリコンウエハ）
シリコンウエハとしては、特に制限されないが、本形態においては、単結晶構造を有するシリコンウエハを用いる。この際、シリコンウエハが（１００）面を表面に有することが好ましい。
(Silicon wafer)
The silicon wafer is not particularly limited, but in this embodiment, a silicon wafer having a single crystal structure is used. At this time, the silicon wafer preferably has a (100) plane on the surface.
シリコンウエハの形状は、特に制限されないが、生産性の観点から円板状であることが好ましい。 The shape of the silicon wafer is not particularly limited, but is preferably a disc shape from the viewpoint of productivity.
（透明な無機材料）
透明な無機材料としては、上述したものと同様のものが用いられうることからここでは説明を省略する。
(Transparent inorganic material)
As the transparent inorganic material, the same materials as those described above can be used, and the description thereof is omitted here.
（第１の層）
第１の層は、通常、シリコンウエハの面上に配置される。この際、第１の層は透明な無機材料を含む。前記第１の層が形成される面は、シリコンウエハの（１００）面であることが好ましい。
(First layer)
The first layer is usually placed on the surface of the silicon wafer. At this time, the first layer includes a transparent inorganic material. The surface on which the first layer is formed is preferably the (100) surface of a silicon wafer.
第１の層の膜厚は、０．１〜５μｍであることが好ましく、０．５〜１．５μｍであることがより好ましい。 The film thickness of the first layer is preferably 0.1 to 5 μm, and more preferably 0.5 to 1.5 μm.
（第１の層の形成方法）
第１の層の形成方法としては、特に制限されず、公知の手法が適用されうる。具体例としては、蒸着法、イオンプレーティング法、スパッタ法等の物理的気相成長法；熱ＣＶＤ法、触媒化学気相成長法、光ＣＶＤ法、プラズマＣＶＤ法等の化学気相成長法が挙げられる。これらのうち、プラズマＣＶＤ法により第１の層を形成することが好ましい。
(Method for forming the first layer)
The method for forming the first layer is not particularly limited, and a known method can be applied. Specific examples include physical vapor deposition methods such as vapor deposition, ion plating, and sputtering; and chemical vapor deposition methods such as thermal CVD, catalytic chemical vapor deposition, photo CVD, and plasma CVD. Can be mentioned. Of these, it is preferable to form the first layer by plasma CVD.
プラズマＣＶＤ法の条件は特に制限されず、所望とする第１の層に応じて適宜設定されうる。 The conditions for the plasma CVD method are not particularly limited, and can be set as appropriate according to the desired first layer.
例えば、第１の層として窒化ケイ素の層を形成する場合、原料ガスとしては、シラン（ＳｉＨ４）ガスと、アンモニア（ＮＨ３）ガスおよび／または窒素（Ｎ２）ガスを混合して使用する。これらのガスは、例えば、水素（Ｈ２）ガス等で希釈してもよい。形成しようとする層の構成に応じて、使用する原料ガスは異なる。例えば、第１の層として窒化酸化ケイ素の層を形成しようとする場合、上記原料ガスに加えてさらに一酸化二窒素（Ｎ２Ｏ）ガスを混合した原料ガスを使用する。 For example, when a silicon nitride layer is formed as the first layer, silane (SiH 4 ) gas, ammonia (NH 3 ) gas and / or nitrogen (N 2 ) gas are mixed and used as the source gas. . These gases may be diluted with, for example, hydrogen (H 2 ) gas. The source gas used varies depending on the structure of the layer to be formed. For example, when a silicon nitride oxide layer is to be formed as the first layer, a source gas in which dinitrogen monoxide (N 2 O) gas is further mixed in addition to the source gas is used.
また、ガスの混合比や濃度、放電電力、ガスの圧力、シリコンウエハの温度等を適宜設定することで、形成される第１の層の性能、例えば内部応力や屈折率を制御することができる。 Further, by appropriately setting the gas mixture ratio, concentration, discharge power, gas pressure, silicon wafer temperature, etc., the performance of the formed first layer, such as internal stress and refractive index, can be controlled. .
［工程（２）］
工程（２）は、シリコンウエハの他方の面（第１の層が形成された面とは反対側の面）上に透明な無機材料を含む第２の層を形成する工程である。
[Step (2)]
Step (2) is a step of forming a second layer containing a transparent inorganic material on the other surface of the silicon wafer (the surface opposite to the surface on which the first layer is formed).
本工程は、通常、工程（１）と同様の方法で行われる。 This step is usually performed by the same method as in step (1).
第２の層が形成される面は、工程（５）において好適に結晶異方性エッチングを行う観点から、シリコンウエハの（１００）面であることが好ましい。 The surface on which the second layer is formed is preferably the (100) surface of the silicon wafer from the viewpoint of suitably performing crystal anisotropic etching in the step (5).
また、生産性の観点からは、第１の層を構成する透明な無機材料と、第２の層を構成する透明な無機材料と、は同じ材料であることが好ましい。 Further, from the viewpoint of productivity, the transparent inorganic material constituting the first layer and the transparent inorganic material constituting the second layer are preferably the same material.
［工程（３）］
工程（３）は、前記第１の層に微小孔を形成する工程である。
[Step (3)]
Step (3) is a step of forming micropores in the first layer.
本発明の一実施形態において、本工程は、より詳細には、第１の層の表面にレジスト層を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）で形成されたレジストをパターニングする工程（ｂ）と、第１の層をエッチングする工程（ｃ）と、を含む。 In one embodiment of the present invention, this step more specifically includes a step (a) of forming a resist layer on the surface of the first layer, and a step of patterning the resist formed in the step (a) (b And (c) etching the first layer.
工程（ａ）
工程（ａ）は第１の層の表面にレジスト層を形成する工程である。
Step (a)
Step (a) is a step of forming a resist layer on the surface of the first layer.
レジスト層は、レジストを含み、当該レジストはポジ型であっても、ネガ型であってもよい。これらのうち、ポジ型レジストを使用することが好ましい。なお、本明細書において、「ポジ型」とは、露光によって現像液の溶解性が増加するものを意味する。また、「ネガ型」とは、露光によって現像液の溶解性が低下するものを意味する。 The resist layer includes a resist, and the resist may be a positive type or a negative type. Of these, it is preferable to use a positive resist. In the present specification, “positive type” means that the solubility of the developer increases upon exposure. The “negative type” means that the solubility of the developer is lowered by exposure.
用いられうるポジ型レジストとしては、特に制限されないが、ジアゾナフトキノン−ノボラック型レジスト、化学増幅ポジ型レジストが挙げられる。ポジ型レジストは、市販品を使用してもよく、当該市販品としては、ＯＦＰＲ８００（東京応化工業株式会社製）、ＡＺ１３５０、ＡＺ１５００シリーズ（クラリアントジャパン株式会社製）等が挙げられる。 The positive resist that can be used is not particularly limited, and examples thereof include a diazonaphthoquinone-novolak resist and a chemically amplified positive resist. A commercial product may be used as the positive resist, and examples of the commercial product include OFPR800 (manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.), AZ1350, AZ1500 series (manufactured by Clariant Japan Co., Ltd.), and the like.
用いられうるネガ型レジストとしては、特に制限されないが、化学増幅ネガ型レジスト、光カチオン重合型レジスト、光ラジカル重合型レジスト、ポリヒドロキシスチレン−ビスアジド型レジスト、環化ゴム−ビスアジド型レジスト、ポリケイ皮酸ビニル型レジスト等が挙げられる。ネガ型レジストは、市販品を使用してもよく、当該市販品としては、ＺＰＮ−１１５０（日本ゼオン株式会社製）等が挙げられる。 The negative resist that can be used is not particularly limited, but is a chemically amplified negative resist, a photocationic polymerization resist, a photo radical polymerization resist, a polyhydroxystyrene-bisazide resist, a cyclized rubber-bisazide resist, a polysilica. Examples include vinyl acid resists. As the negative resist, commercially available products may be used, and examples of the commercially available products include ZPN-1150 (manufactured by ZEON CORPORATION).
レジスト層は、溶液状のレジストを塗布法によって塗布し、得られた塗膜を乾燥させることにより形成することができる。 The resist layer can be formed by applying a solution resist by a coating method and drying the obtained coating film.
塗布方法としては、特に制限されないが、ロールコート法、グラビアコート法、ナイフコート法、ディップコート法、スプレーコート法等の公知の方法が用いられうる。 Although it does not restrict | limit especially as a coating method, Well-known methods, such as a roll coat method, a gravure coat method, a knife coat method, a dip coat method, a spray coat method, can be used.
乾燥温度としては、使用するレジストによっても異なるが、８０〜１５０℃であることが好ましい。 The drying temperature is preferably 80 to 150 ° C., although it varies depending on the resist used.
乾燥時間としては、使用するレジストによっても異なるが、４０〜１２０秒であることが好ましく、６０〜９０秒であることがより好ましい。 The drying time varies depending on the resist to be used, but is preferably 40 to 120 seconds, and more preferably 60 to 90 seconds.
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、工程（ａ）で形成されたレジストをパターニングする工程である。
Step (b)
Step (b) is a step of patterning the resist formed in step (a).
パターニングの方法は特に制限されず、公知の手法が適用されうる。当該パターニングの方法としては、例えば、パターニングが施されたマスクを、第１の層上に配置した後、露光を行い、現像する方法が挙げられる。 The patterning method is not particularly limited, and a known method can be applied. Examples of the patterning method include a method in which a patterned mask is placed on the first layer, and then exposed and developed.
用いられうるマスクとしては、特に制限されないが、ガラス、シリコンウエハ、銅、クロム、鉄、アルミニウム等が挙げられる。 The mask that can be used is not particularly limited, and examples thereof include glass, silicon wafer, copper, chromium, iron, and aluminum.
露光は、特に制限されないが、紫外線、エキシマレーザー、電子線、Ｘ線等が挙げられる。 Exposure is not particularly limited, and examples include ultraviolet rays, excimer lasers, electron beams, and X-rays.
露光方法としては、マスクをレジストへ圧着させて露光する密着露光；マスクとレジストを圧着した後、圧着部を減圧して露光するバキュームコンタクト露光等の方法によって行われうる。 As an exposure method, it can be carried out by a method such as contact exposure in which a mask is pressure-bonded to a resist and exposed; vacuum contact exposure in which the pressure-bonded portion is decompressed and exposed after the mask and resist are pressure-bonded.
現像は、通常、現像液を浸漬することによって行われる。この際、上記レジストとしてポジ型レジストを使用した場合、露光した部分が現像される。他方、レジストとしてネガ型レジストを使用した場合、露光した部分が残存する。 Development is usually performed by immersing a developer. At this time, when a positive resist is used as the resist, the exposed portion is developed. On the other hand, when a negative resist is used as the resist, the exposed part remains.
用いられうる現像液としては、有機現像液、無機現像液のいずれを用いてもよい。 As the developer that can be used, either an organic developer or an inorganic developer may be used.
有機現像液に含有されうる有機材料としては、特に制限されないが、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、エチレンジアミンピロカテコール（ＥＤＰ）等が挙げられる。 The organic material that can be contained in the organic developer is not particularly limited, and examples thereof include tetramethylammonium hydroxide (TMAH) and ethylenediamine pyrocatechol (EDP).
無機現像液に含有されうる無機材料としては、特に制限されないが、水酸化カリウム、ヒドラジン等が挙げられる。 The inorganic material that can be contained in the inorganic developer is not particularly limited, and examples thereof include potassium hydroxide and hydrazine.
これらの現像液は、使用するレジストに応じて適宜選択されうる。また、現像液には、適宜界面活性剤等の公知の添加剤が添加されうる。 These developing solutions can be appropriately selected depending on the resist to be used. Moreover, well-known additives, such as surfactant, can be suitably added to a developing solution.
現像後は、通常、超純水等のリンス液により洗浄して、加熱することによってリンス液等を除去する。 After the development, the rinse liquid is usually removed by washing with a rinse liquid such as ultrapure water and heating.
工程（ｃ）
工程（ｃ）は第１の層をエッチングする工程である。
Step (c)
Step (c) is a step of etching the first layer.
エッチングは、通常、ドライエッチングで行われる。前記エッチングは、エッチングガス、イオン、ラジカルなどを用いて行うことができる。当該ドライエッチングとしては、反応性ガスエッチング、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）、反応性イオンビームエッチング（ＲＩＢＥ）、イオンビームエッチング（ＩＢＥ）、反応性レーザービームエッチングなどが挙げられる。これらのうち、ドライエッチングは、反応性ガスエッチングまたは反応性イオンエッチングで行うことが好ましく、反応性イオンエッチングで行うことがより好ましい。 Etching is usually performed by dry etching. The etching can be performed using an etching gas, ions, radicals, or the like. Examples of the dry etching include reactive gas etching, reactive ion etching (RIE), reactive ion beam etching (RIBE), ion beam etching (IBE), and reactive laser beam etching. Among these, dry etching is preferably performed by reactive gas etching or reactive ion etching, and more preferably by reactive ion etching.
反応性ガスエッチングに用いられうる反応性ガスとしては、二フッ化キセノン（ＸｅＦ２）ガス等が挙げられる。 Examples of the reactive gas that can be used for reactive gas etching include xenon difluoride (XeF 2 ) gas.
反応性イオンエッチングに用いられうる反応性ガスとしては、四フッ化炭素（ＣＦ４）ガス、トリフルオロメタン（ＣＨＦ３）ガス、六フッ化硫黄（ＳＦ６）ガス等が挙げられる。 Examples of reactive gases that can be used for reactive ion etching include carbon tetrafluoride (CF 4 ) gas, trifluoromethane (CHF 3 ) gas, sulfur hexafluoride (SF 6 ) gas, and the like.
なお、エッチングにおけるエッチングガスの流量、圧力、エッチング時間等の条件は、第１の層を構成する透明な無機材料の種類、膜厚等に応じて適宜設定されうる。 Note that the conditions such as the flow rate, pressure, and etching time of the etching gas in the etching can be appropriately set according to the type, film thickness, and the like of the transparent inorganic material constituting the first layer.
［工程（４）］
工程（４）は、前記第２の層にエッチング窓を形成する工程である。
[Step (4)]
Step (4) is a step of forming an etching window in the second layer.
エッチング窓の形成方法は、原則として工程（３）と同様の方法で行われる。ただし、エッチング窓は、後述する工程（５）において、シリコンウエハを露出させて結晶異方性エッチングを行うために形成されるものである。よって、エッチング窓は、微小孔を形成する場合とは異なり、通常、第２の層がシリコンウエハの外周上に残存するような形態でエッチングされうる（すなわち、例えば、シリコンウエハが円板状である場合、エッチング窓は円形であり、シリコンウエハ上の第２の層はドーナツ状の形状を有する）。 In principle, the etching window is formed by the same method as in step (3). However, the etching window is formed in order to perform crystal anisotropic etching by exposing the silicon wafer in the step (5) described later. Therefore, the etching window can be etched in such a manner that the second layer remains on the outer periphery of the silicon wafer, unlike the case where the microhole is formed (that is, for example, the silicon wafer has a disk shape). In some cases, the etching window is circular and the second layer on the silicon wafer has a donut shape).
なお、残存する第２の層は、最終的に細胞培養シートの構成要素となりうる。具体的には、上記のように外周上に残存する第２の層は、最終的に外周層の構成要素となる。また、第２の層が、シリコンウエハを少なくとも２つの領域に分離するように残存している場合には、当該第２の層は仕切り層の構成要素となりうる。 The remaining second layer can finally become a component of the cell culture sheet. Specifically, the second layer remaining on the outer periphery as described above finally becomes a component of the outer peripheral layer. When the second layer remains so as to separate the silicon wafer into at least two regions, the second layer can be a component of the partition layer.
［工程（５）］
工程（５）は、第２の層の方向から結晶異方性エッチングを行う工程である。この際、前記第２の層がエッチングマスク層として機能する。
[Step (5)]
Step (5) is a step of performing crystal anisotropic etching from the direction of the second layer. At this time, the second layer functions as an etching mask layer.
結晶異方性エッチングは、通常、工程（４）で得られた積層体を、アルカリ系のエッチング液に浸漬することにより行われる。 Crystal anisotropic etching is usually performed by immersing the laminate obtained in step (4) in an alkaline etching solution.
用いられうるエッチング液としては、特に制限されないが、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、エチレンジアミンピロカテコール（ＥＤＰ）等が挙げられる。 Examples of the etching solution that can be used include, but are not limited to, potassium hydroxide (KOH), tetramethylammonium hydroxide (TMAH), ethylenediamine pyrocatechol (EDP), and the like.
ここで、好ましい実施形態において、第２の層は、シリコンウエハの（１００）面に形成されている。よって、本実施形態においては、工程（４）によってエッチング窓が形成されることにより、露出したシリコンウエハの表面は（１００）面となる。 Here, in a preferred embodiment, the second layer is formed on the (100) plane of the silicon wafer. Therefore, in the present embodiment, the exposed surface of the silicon wafer becomes the (100) plane by forming the etching window in the step (4).
一般に、シリコンウエハの（１００）面では、Ｓｉ原子の４つの結合のうち２つの結合が切れており、２つの結合を介してＳｉ原子が連結された構成を有している。他方、シリコンウエハの（１００）面に直交する（１１１）面では、Ｓｉ原子の４つの結合のうち１つの結合が切れており、３つの結合を介してＳｉ原子が連結された構成を有している。その結果、（１００）面と対比して、（１１１）面は、エッチング速度が遅く、エッチングされにくい。そのため、（１００）面の方向からエッチングを行うと、（１００）面の方向に対して、約５５度の傾斜角を有する（１１１）面が残留するようにシリコンウエハがエッチングされる。 In general, the (100) plane of a silicon wafer has a structure in which two of the four bonds of Si atoms are broken and the Si atoms are connected via the two bonds. On the other hand, in the (111) plane orthogonal to the (100) plane of the silicon wafer, one of the four bonds of Si atoms is broken, and the Si atoms are connected via the three bonds. ing. As a result, in contrast to the (100) plane, the (111) plane has a low etching rate and is not easily etched. Therefore, when etching is performed from the direction of the (100) plane, the silicon wafer is etched so that a (111) plane having an inclination angle of about 55 degrees with respect to the direction of the (100) plane remains.
この際、通常のエッチング液を使用してエッチングを行う場合には、残留する複数の（１１１）面が、エッチングによって露出した第１の層と交差して形成する面、すなわち、細胞を配置する培養面は矩形となり、少なくとも一部に曲線を含む形状とすることができない。 At this time, when etching is performed using a normal etching solution, a surface in which a plurality of remaining (111) surfaces intersect with the first layer exposed by etching, that is, cells are arranged. The culture surface is rectangular and cannot be formed into a shape including a curve at least partially.
そこで、当該培養面を少なくとも一部に曲線を含む形状とするために、上述のエッチング液、好ましくは水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）を含むエッチング液に所定の界面活性剤を添加したエッチング液を使用することが好ましい。 Therefore, in order to make the culture surface at least partially include a curve, an etching solution obtained by adding a predetermined surfactant to the etching solution described above, preferably an etching solution containing tetramethylammonium hydroxide (TMAH), is used. It is preferable to use it.
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、（イソオクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール等のアルキルフェノール系界面活性剤（例えば、Triton（登録商標）X-100：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（例えば、NCW-1002：和光純薬工業株式会社製）、ノニルフェノール系界面活性剤（例えば、NC-200：ライオン株式会社製）、ポリエチレングリコール等が挙げられる。これらのうち、Triton（登録商標）X-100を用いることが好ましい。 The surfactant is not particularly limited, but is an alkylphenol surfactant such as (isooctylphenoxy) polyethoxyethanol (for example, Triton (registered trademark) X-100: manufactured by GE Healthcare Bioscience), polyoxyalkylene Examples thereof include alkyl ethers (for example, NCW-1002: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), nonylphenol surfactants (for example, NC-200: manufactured by Lion Corporation), polyethylene glycol, and the like. Of these, Triton (registered trademark) X-100 is preferably used.
エッチング液中の界面活性剤の含有量としては、特に制限されないが、エッチング液全量に対して、０．０１〜０．１質量％であることが好ましく、０．０１〜０．０５質量％であることがより好ましい。 The content of the surfactant in the etching solution is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 0.1% by mass with respect to the total amount of the etching solution, and 0.01 to 0.05% by mass. More preferably.
上記エッチング液を使用することにより、エッチングによって露出した第１の層、すなわち、細胞を配置する培養面を少なくとも一部に曲線を含む形状にすることができる。 By using the etching solution, the first layer exposed by etching, that is, the culture surface on which the cells are arranged can be formed into a shape including a curve at least partially.
［工程（６）］
本発明の一実施形態において、本形態に係る製造方法は、培養面を表面処理する工程（６）をさらに含んでいてもよい。当該工程（６）は、プラズマ処理により培養面に官能基を導入する工程と、前記官能基に機能性分子を導入する工程と、を含む。
[Step (6)]
In one embodiment of the present invention, the production method according to this embodiment may further include a step (6) of surface-treating the culture surface. The step (6) includes a step of introducing a functional group into the culture surface by plasma treatment, and a step of introducing a functional molecule into the functional group.
＜細胞培養容器＞
本発明に係る細胞培養シートは、細胞培養容器に好適に使用される。
<Cell culture container>
The cell culture sheet according to the present invention is suitably used for a cell culture container.
すなわち、本発明の一形態によれば、細胞培養容器が提供される。前記細胞培養容器は、細胞培養シートと、前記細胞培養シートの外周縁に接触する、または隙間を隔てて向かい合う内壁面を備える筒状部材と、を含む。 That is, according to one aspect of the present invention, a cell culture container is provided. The cell culture container includes a cell culture sheet and a cylindrical member having an inner wall surface that contacts the outer peripheral edge of the cell culture sheet or faces the gap with a gap.
図５には、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の斜視図を示す。図５の細胞培養容器４００は、筒状部材として中空円筒部材１１を有する。そして、前記細胞培養容器４００は、前記中空円筒部材１１を構成する円柱の底面の一方に、本発明に係る細胞培養シート１００が配置された構成を有する。図５の細胞培養容器において、細胞培養シート１００の培養面には、細胞が配置される。そして、中空円筒部材１１によって提供されたウェル部には、培養液や薬剤等が導入されうる。これにより、細胞を好適に培養、解析することができる。 In FIG. 5, the perspective view of the cell culture container which concerns on one Embodiment of this invention is shown. The cell culture container 400 of FIG. 5 has the hollow cylindrical member 11 as a cylindrical member. The cell culture vessel 400 has a configuration in which the cell culture sheet 100 according to the present invention is disposed on one of the bottom surfaces of the columns constituting the hollow cylindrical member 11. In the cell culture container of FIG. 5, cells are arranged on the culture surface of the cell culture sheet 100. Then, a culture solution, a drug, or the like can be introduced into the well portion provided by the hollow cylindrical member 11. Thereby, a cell can be cultured and analyzed suitably.
また、図６には、本発明の別の一実施形態に係る細胞培養容器の斜視図を示す。図６の細胞培養容器５００は、筒状部材として中空円筒部材１１を有する。そして、前記細胞培養容器５００は、前記中空円筒部材１１を構成する円柱の軸線方向中央部の水平面に、本発明に係る細胞培養シートが配置された構成を有する。図６の細胞培養容器において、細胞培養シート１００の上面または上下両面に細胞が配置される。そして、中空円筒部材によって提供された２つのウェル部には、培養液や薬剤等が導入されうる。これにより、細胞を好適に培養、解析することができる。 FIG. 6 shows a perspective view of a cell culture container according to another embodiment of the present invention. The cell culture container 500 of FIG. 6 has the hollow cylindrical member 11 as a cylindrical member. And the said cell culture container 500 has the structure by which the cell culture sheet which concerns on this invention is arrange | positioned in the horizontal surface of the axial direction center part of the cylinder which comprises the said hollow cylindrical member 11. FIG. In the cell culture container of FIG. 6, cells are arranged on the upper surface or both upper and lower surfaces of the cell culture sheet 100. And a culture solution, a chemical | medical agent, etc. can be introduce | transduced into two well parts provided with the hollow cylindrical member. Thereby, a cell can be cultured and analyzed suitably.
以下、細胞培養容器の各構成について説明する。 Hereinafter, each structure of a cell culture container is demonstrated.
［筒状部材］
筒状部材は、細胞培養シートを保持するとともに、ウェルを提供する機能を有する。
[Cylindrical member]
The cylindrical member has a function of holding a cell culture sheet and providing a well.
筒状部材の材料としては、特に制限されないが、ステンレス等の金属；ガラス；シリコン等の無機材料；ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、シクロオレフィンポリマー等の樹脂が挙げられる。 Although it does not restrict | limit especially as a material of a cylindrical member, Metals, such as stainless steel; Glass; Inorganic materials, such as silicon; Polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate Examples thereof include resins such as resins, polyurethane resins, methylpentene resins, phenol resins, melamine resins, epoxy resins, vinyl chloride resins, and cycloolefin polymers.
筒状部材の形状は、細胞培養シートを保持できるものであれば特に制限されないが、中空円筒部材であることが好ましい。 The shape of the cylindrical member is not particularly limited as long as it can hold the cell culture sheet, but is preferably a hollow cylindrical member.
筒状部材の高さとしては、培養しようとする細胞や、培養の目的等に応じて異なり、特に制限されないが、２〜３０ｍｍであることが好ましく、８〜２０ｍｍであることがより好ましい。 The height of the cylindrical member varies depending on the cell to be cultured, the purpose of the culture, and the like, and is not particularly limited, but is preferably 2 to 30 mm, and more preferably 8 to 20 mm.
筒状部材の底面の大きさとしては、使用する細胞培養シートに応じて適宜設定され、細胞培養シートの外周縁に接触する、または隙間を隔てて向かい合う内壁面を備えるものであれば特に制限はないが、前記筒状部材は、細胞培養シートの外周縁に接触する内壁面を有することが好ましい。 The size of the bottom surface of the cylindrical member is appropriately set according to the cell culture sheet to be used, and is not particularly limited as long as it has an inner wall surface that contacts the outer peripheral edge of the cell culture sheet or faces with a gap. However, it is preferable that the cylindrical member has an inner wall surface that contacts the outer peripheral edge of the cell culture sheet.
筒状部材は単一の材料からなっていてもよいが、２種以上の材料からなっていてもよい。筒状部材が、２種以上の材料、例えば、内筒および外筒から構成される場合には、これらの材料は、螺合、嵌合等によって接続することができる。 The cylindrical member may be made of a single material, but may be made of two or more materials. When the cylindrical member is composed of two or more kinds of materials, for example, an inner cylinder and an outer cylinder, these materials can be connected by screwing, fitting or the like.
［細胞培養シート］
細胞培養シートは、筒状部材の筒部に配置される。
[Cell culture sheet]
A cell culture sheet is arrange | positioned at the cylinder part of a cylindrical member.
細胞培養シートは、上述したものが用いられうる。 As the cell culture sheet, those described above can be used.
前記培養シートが外周層を有する場合には、筒状部材等と接する面が大きくなることから、細胞培養シートを好適に嵌合することができる。 When the culture sheet has an outer peripheral layer, the surface in contact with the cylindrical member or the like becomes large, so that the cell culture sheet can be suitably fitted.
本発明の一実施形態において、前記培養シートは、筒状部材の底面に配置されることが好ましい。 In one Embodiment of this invention, it is preferable that the said culture sheet is arrange | positioned at the bottom face of a cylindrical member.
また、本発明の別の一実施形態において、前記培養シートは、筒状部材の中央部に配置されることが好ましい。本実施形態に係る細胞培養容器によれば、複数細胞の共培養、物質輸送や細胞移動の評価、薬剤の細胞透過性の評価、細胞の輸送能の評価、細胞間相互作用の評価等の解析がより好適に行うことができる。なお、本明細書において、「筒状部材の中央部」とは、筒状部材の高さに対して、筒状部材の底面から１／７〜６／７の位置、好ましくは３／７〜４／７の位置、さらに好ましくは１／２（すなわち、筒状部材の高さの中央部）の位置を意味する。 Moreover, in another one Embodiment of this invention, it is preferable that the said culture sheet is arrange | positioned in the center part of a cylindrical member. According to the cell culture container according to this embodiment, analysis of co-culture of a plurality of cells, evaluation of substance transport and cell migration, evaluation of drug cell permeability, evaluation of cell transport ability, evaluation of cell-cell interaction, etc. Can be performed more suitably. In the present specification, “the central portion of the cylindrical member” means a position 1/7 to 6/7 from the bottom surface of the cylindrical member, preferably 3/7 to the height of the cylindrical member. It means the position of 4/7, more preferably 1/2 (that is, the center of the height of the cylindrical member).
［その他の部材等］
細胞培養シートや、これを構成する筒状部材は適宜改変を施してもよいし、その他の部材を適宜使用してもよい。例えば、筒状部材を有底筒状に形成してもよい。また、筒状部材の内壁面に取り付けられ、細胞培養シートを筒状部材に対してより好適に固定するための支持部材を設けてもよい。この支持部材は、細胞培養シートの周囲が載置される形態、細胞培養シートの周縁を挟持して支持する形態等、種々の形態が採用されうる。さらに、培養した細胞を細胞培養シートの裏面（培養面とは反対の面）から観察するための観察部材を設けてもよい。これらのその他の部材等については、公知の技術が適宜採用されうる。
[Other members, etc.]
The cell culture sheet and the cylindrical member constituting the cell culture sheet may be appropriately modified, or other members may be appropriately used. For example, the cylindrical member may be formed in a bottomed cylindrical shape. Moreover, you may provide the supporting member attached to the inner wall surface of a cylindrical member, and fixing a cell culture sheet more suitably with respect to a cylindrical member. Various forms such as a form in which the periphery of the cell culture sheet is placed and a form in which the periphery of the cell culture sheet is sandwiched and supported can be adopted as the support member. Furthermore, you may provide the observation member for observing the cultured cell from the back surface (surface opposite to a culture surface) of a cell culture sheet. For these other members and the like, known techniques can be employed as appropriate.
なお、本形態に係る細胞培養容器は、ディッシュやマイクロタイタープレート等に細胞培養シートを配置することにより構成してもよい。市販品のディッシュやマイクロタイタープレートを使用することにより、簡便に細胞培養容器を製造することができる。 In addition, you may comprise the cell culture container which concerns on this form by arrange | positioning a cell culture sheet to a dish, a microtiter plate, etc. By using a commercially available dish or microtiter plate, a cell culture container can be easily produced.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, although the display of "part" or "%" is used in an Example, unless otherwise indicated, "part by mass" or "mass%" is represented.
＜実施例１＞
外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 1>
A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced.
［工程（１）］
はじめに円板状のシリコンウエハ（直径約５０ｍｍ）を準備した。
[Step (1)]
First, a disk-shaped silicon wafer (diameter: about 50 mm) was prepared.
次に、シリコンウエハの（１００）面に、プラズマＣＶＤにより第１の層としての窒化ケイ素の層を形成した。具体的には、原料ガスとして、シランガスとアンモニアガスの混合ガス（混合比：シランガス／アンモニアガス＝１０／１）を用い、放電電力１００Ｗ、ガスの圧力１２０Ｐａ、シリコンウエハの温度３００℃に設定してシリコンウエハの（１００）面に窒化ケイ素の層を形成した。形成した窒化ケイ素の層の膜厚は、１μｍであった。 Next, a silicon nitride layer as a first layer was formed on the (100) surface of the silicon wafer by plasma CVD. Specifically, a mixed gas of silane gas and ammonia gas (mixing ratio: silane gas / ammonia gas = 10/1) is used as the raw material gas, the discharge power is set to 100 W, the gas pressure is set to 120 Pa, and the silicon wafer temperature is set to 300 ° C. Then, a silicon nitride layer was formed on the (100) surface of the silicon wafer. The film thickness of the formed silicon nitride layer was 1 μm.
［工程（２）］
シリコンウエハの第１の層と対向する面上に、工程（１）と同様の方法で、第２の層としての窒化ケイ素の層を形成した。形成した窒化ケイ素の層の膜厚は、１μｍであった。
[Step (2)]
A silicon nitride layer as a second layer was formed on the surface of the silicon wafer facing the first layer by the same method as in step (1). The film thickness of the formed silicon nitride layer was 1 μm.
［工程（３）］
工程（ａ）
第１の層の表面に、ポジ型レジストであるＯＦＰＲ−８００ＬＢ ２３ＣＰ（東京応化工業株式会社製）をスピンコート法により塗布し、９０℃で９０秒乾燥させることによりレジスト層を形成した。
[Step (3)]
Step (a)
OFPR-800LB 23CP (manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.), which is a positive resist, was applied to the surface of the first layer by a spin coating method, and dried at 90 ° C. for 90 seconds to form a resist layer.
工程（ｂ）
予め、微小孔の孔径が９μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が５６％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを、工程（ａ）で形成したレジスト層上に配置した。ガラスマスクを圧着させてレジスト層に密着させ、紫外線（波長：４３６ｎｍ）によりレジスト層を露光した。次に、現像液であるＮＭＤ−３（水酸化テトラメチルアンモニウムの２．３８％水溶液、東京応化工業株式会社製）に、上記露光後のシリコンウエハ積層体を浸漬し、レジスト層を現像することで、レジストをパターニングした。
Step (b)
A resist layer in which a glass mask patterned in advance in step (a) is formed so that micropores having a micropore diameter of 9 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 56% are formed. Placed on top. A glass mask was pressed and adhered to the resist layer, and the resist layer was exposed to ultraviolet rays (wavelength: 436 nm). Next, the resist layer is developed by immersing the silicon wafer laminate after the exposure in NMD-3 (2.38% aqueous solution of tetramethylammonium hydroxide, manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) as a developer. Then, the resist was patterned.
工程（ｃ）
残存したレジスト層をマスクとして、ドライエッチングを行うことにより第１の層に微小孔を形成した。より詳細には、反応性ガスとして四フッ化炭素（ＣＦ４）ガスのプラズマにより、第１の層をエッチングした。この際、エッチングガスの流量は、５０ｍＬ／ｍｉｎ、圧力は５０Ｐａ、エッチング時間は３６０秒であった。次いで、アセトンに浸漬することにより、ポジ型レジストをすべて除去した。なお、形成された微小孔は孔径が９μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍであった。また、微小孔の角度は９０度であった。
Step (c)
Micropores were formed in the first layer by dry etching using the remaining resist layer as a mask. More specifically, the first layer was etched by plasma of carbon tetrafluoride (CF 4 ) gas as a reactive gas. At this time, the flow rate of the etching gas was 50 mL / min, the pressure was 50 Pa, and the etching time was 360 seconds. Next, all the positive resist was removed by immersing in acetone. The formed micropores had a pore diameter of 9 μm and a pitch between the micropores of 12 μm. The angle of the micropores was 90 degrees.
［工程（４）］
工程（５）における結晶異方性エッチングにより培養面の直径が７．１ｍｍ、面積が３９．６ｍｍ２となるようにパターニングしたガラスマスクを用いたことを除いては、上記工程（３）と同様の方法で、第２の層に円形のエッチング窓を形成した。
[Step (4)]
Same as the above step (3) except that a glass mask patterned by crystal anisotropic etching in step (5) so that the culture surface has a diameter of 7.1 mm and an area of 39.6 mm 2 is used. By this method, a circular etching window was formed in the second layer.
［工程（５）］
工程（４）において形成したエッチング窓から結晶異方性エッチングを行うことにより、外周層を有する細胞培養シートを形成した。
[Step (5)]
A cell culture sheet having an outer peripheral layer was formed by performing crystal anisotropic etching from the etching window formed in the step (4).
より詳細には、エッチング液として、２５質量％の水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液に、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加した。この際、前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、現像液中の濃度が０．０１質量％となる量で添加した。 More specifically, Triton X-100, which is a surfactant, was added as an etching solution to a 25% by mass tetramethylammonium hydroxide aqueous solution. At this time, the Triton X-100 was added in such an amount that the concentration in the developer was 0.01% by mass.
上記エッチング液を８０度に加熱し、シリコンウエハ積層体を浸漬することでシリコンウエハの結晶異方性エッチングを行った。当該結晶異方性エッチングは、シリコンウエハの第２の層と対向する面に形成された第１の層が露出するまで行い、外周層を有する細胞培養シートを製造した。この際、結晶異方性エッチングは、円形のエッチング窓から露出した（１００）面が選択的にエッチングされ、逆円錐台形状の窪みを形成しながら進行した。円形状に露出した第１の層、すなわち培養面は、直径が７．１ｍｍ、面積が３９．６ｍｍ２であった。また、第１の層の面に対して、エッチングによって露出した（１１１）面がなす傾斜角は、約４５度であった。 The etching liquid was heated to 80 ° C., and the silicon wafer laminate was immersed to carry out crystal anisotropic etching of the silicon wafer. The crystal anisotropic etching was performed until the first layer formed on the surface facing the second layer of the silicon wafer was exposed, and a cell culture sheet having an outer peripheral layer was manufactured. At this time, the crystal anisotropic etching proceeded while the (100) surface exposed from the circular etching window was selectively etched to form an inverted frustoconical depression. The first layer exposed in a circular shape, ie, the culture surface, had a diameter of 7.1 mm and an area of 39.6 mm 2 . The inclination angle formed by the (111) plane exposed by etching with respect to the surface of the first layer was about 45 degrees.
＜実施例２＞
微小孔の孔径が５μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が１７％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 2>
Except for using a glass mask patterned so that micropores having a micropore diameter of 5 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 17% are used, Example 1 A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜実施例３＞
微小孔の孔径が６μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が１％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 3>
Except for using a glass mask patterned to form micropores with a micropore diameter of 6 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 1%, Example 1 A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜実施例４＞
微小孔の孔径が６μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が１３％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 4>
Example 1 is the same as Example 1 except that a glass mask patterned to form micropores having a micropore diameter of 6 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 13% is used. A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜実施例５＞
微小孔の孔径が６μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が６６％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 5>
Except for using a glass mask patterned to form micropores with a micropore diameter of 6 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and an area ratio of micropores of 66%, Example 1 and A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜実施例６＞
微小孔の孔径が３μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が２％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 6>
Except for using a glass mask patterned so that micropores having a micropore diameter of 3 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 2% are formed, and Example 1 A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜実施例７＞
微小孔の孔径が３μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が１４％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 7>
Except for using a glass mask patterned so as to form micropores having a micropore diameter of 3 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 14%, Example 1 and A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜実施例８＞
微小孔の孔径が３μｍ、微小孔間のピッチが１２μｍ、微小孔の面積率が３８％の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例１と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
<Example 8>
Except for using a glass mask patterned so as to form micropores having a micropore diameter of 3 μm, a pitch between micropores of 12 μm, and a microhole area ratio of 38%, Example 1 and A cell culture sheet having an outer peripheral layer was produced by the same method.
＜比較例１＞
市販品のMillicell（登録商標）セルカルチャーインサート（孔径：８μｍ、微小孔間のピッチ：不規則、微小孔の面積率：不明、ポリカーボネート製、日本ミリポア株式会社性）を使用した。
<Comparative Example 1>
A commercially available Millicell (registered trademark) cell culture insert (pore size: 8 μm, pitch between micropores: irregular, area ratio of micropores: unknown, made of polycarbonate, Japan Millipore Corporation) was used.
＜比較例２＞
市販品のMillicell（登録商標）セルカルチャーインサート（孔径：０．４μｍ、微小孔間のピッチ：不規則、微小孔の面積率：１３％、ポリカーボネート製、日本ミリポア株式会社性）を使用した。
<Comparative example 2>
A commercially available Millicell (registered trademark) cell culture insert (pore diameter: 0.4 μm, pitch between micropores: irregular, area ratio of micropores: 13%, polycarbonate, Nippon Millipore Corporation) was used.
＜比較例３＞
エッチング液に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加せず、培養面の一辺の長さが６．３ｍｍ、面積が３９．７ｍｍ２となるように条件を調節したことを除いては、実施例２と同様の方法で、培養面が矩形の細胞培養シートを製造した。
<Comparative Example 3>
The etching solution, without the addition of Triton X-100, except that the length of one side of the culture surface was adjusted 6.3 mm, a condition such that the area is 39.7 mm 2, similarly to Example 2 In this way, a cell culture sheet having a rectangular culture surface was produced.
実施例および比較例において製造した細胞培養シートは下記表１の通りである。 The cell culture sheets produced in Examples and Comparative Examples are as shown in Table 1 below.
＜性能評価＞
実施例１〜８および比較例１〜３の細胞培養シートを用いて透明性および培養細胞の分布に係る性能評価を行った。
<Performance evaluation>
Using the cell culture sheets of Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 3, performance evaluation concerning transparency and the distribution of cultured cells was performed.
［透明性］
細胞培養シートを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に浸漬させた。次いで、マルチチャンネル分光器ＰＭＡ−１２ Ｃ１００２７−０１（浜松ホトニクス株式会社製）を使用し、培養液中における細胞培養シート（培養面）の波長域４００〜８００ｎｍにおける光透過率を求めた。
[transparency]
The cell culture sheet was immersed in a DMEM / F12 culture solution. Next, using a multichannel spectrometer PMA-12 C10027-01 (manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.), the light transmittance in the wavelength range of 400 to 800 nm of the cell culture sheet (culture surface) in the culture solution was determined.
（１）実施例および比較例の対比
まず、実施例１および２と、比較例１および２とを対比した。得られた結果を図７に示す。
(1) Comparison of Examples and Comparative Examples First, Examples 1 and 2 were compared with Comparative Examples 1 and 2. The obtained results are shown in FIG.
図７の結果から、実施例１および２の結果から、本発明に係る細胞培養装置は、４００〜８００ｎｍの全波長域にわたって９０％以上の高い光線透過率を示した。 From the results of FIG. 7, from the results of Examples 1 and 2, the cell culture device according to the present invention showed a high light transmittance of 90% or more over the entire wavelength region of 400 to 800 nm.
一方、比較例１および２の結果から、孔径が小さくなるにつれて、光線透過率の値も低下し、透明性が悪くなった。 On the other hand, from the results of Comparative Examples 1 and 2, as the hole diameter was reduced, the value of the light transmittance was also lowered and the transparency was deteriorated.
以上の結果から、本発明に係る細胞培養シートは、透明性に優れることが理解される。このことは、特に、実施例２および比較例１の結果を対比すると、実施例２の細胞培養シートは、比較例１の細胞培養シートよりも孔径が小さいにもかかわらず、高い透明性を有していることからも明らかである。 From the above results, it is understood that the cell culture sheet according to the present invention is excellent in transparency. In particular, when comparing the results of Example 2 and Comparative Example 1, the cell culture sheet of Example 2 has high transparency even though the pore diameter is smaller than that of the cell culture sheet of Comparative Example 1. It is clear from what they do.
（２）孔径６μｍおよび孔径３μｍの場合における微小孔の面積率の透明性への寄与
実施例３〜５および実施例６〜８について、それぞれ孔径を６μｍおよび３μｍに設定し、微小孔の面積率（開孔率）を適宜変更した場合における細胞培養シートの光線透過率を対比した。得られた結果を図８に示す。
(2) Contribution to the transparency of the micropore area ratio in the case of the pore diameter of 6 μm and the pore diameter of 3 μm For Examples 3 to 5 and Examples 6 to 8, the hole diameter was set to 6 μm and 3 μm, respectively, and the area ratio of the micropores The light transmittance of the cell culture sheet when the (opening ratio) was appropriately changed was compared. The obtained result is shown in FIG.
実施例３〜５においては、孔径が６μｍと大きい場合、開孔率が６６％と高値であっても８５％以上の極めて高い透明性を示した。 In Examples 3 to 5, when the pore diameter was as large as 6 μm, extremely high transparency of 85% or more was exhibited even when the aperture ratio was as high as 66%.
また、実施例６〜８において、孔径が３μｍと小さい場合であっても、開孔率２％、１４％、３８％で７０％以上と実用上問題ない高い透明性を示した。 Further, in Examples 6 to 8, even when the pore diameter was as small as 3 μm, high transparency with no practical problem was shown, with an aperture ratio of 2%, 14%, and 38% being 70% or more.
なお、特許文献１には、微小孔の孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍの場合に高い透明性を得るためには、開孔率をそれぞれ７．１％以下、１３．６％以下、２２．３％以下に抑える必要があることが記載されている。よって、従来の高分子を原料とする細胞培養シートと対比して、本発明に係る細胞培養シートは透明性に優れることが理解される。 In Patent Document 1, in order to obtain high transparency when the pore diameter is 3 μm, 5 μm, or 8 μm, the aperture ratio is 7.1% or less, 13.6% or less, and 22.3, respectively. It is described that it is necessary to keep it below%. Therefore, it is understood that the cell culture sheet according to the present invention is excellent in transparency as compared with a cell culture sheet using a conventional polymer as a raw material.
［細胞培養の分布］
次に実施例２および比較例３の細胞培養シートを用いて、細胞培養をした場合における細胞の分布について試験した。
[Distribution of cell culture]
Next, using the cell culture sheets of Example 2 and Comparative Example 3, the cell distribution in the case of cell culture was tested.
はじめに、実施例２および比較例３の細胞培養シートをポリスチレン製のディッシュの底部に配置して細胞培養シートを製造した。 First, the cell culture sheets of Example 2 and Comparative Example 3 were placed on the bottom of a polystyrene dish to produce a cell culture sheet.
次に、カルセインで蛍光染色した接着性細胞ＨｅＬａを、１０％の濃度でウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に添加した。この際、培養液の細胞密度は、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。当該培養液を細胞培養容器のウェル内に２００μＬ添加した。この際の播種細胞数は、８×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、平均細胞培養密度は、２００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２である。 Next, adherent cells HeLa fluorescently stained with calcein were added to a DMEM / F12 culture medium containing fetal calf serum at a concentration of 10%. At this time, the cell density of the culture solution was 4 × 10 4 cells / mL. 200 μL of the culture solution was added to the well of the cell culture container. In this case, the number of seeded cells is 8 × 10 3 cells / mL, and the average cell culture density is 200 cells / mm 2 .
細胞が培養面に十分接着するように、３７℃、６時間インキュベータで静置培養した。 The cells were statically cultured in an incubator at 37 ° C. for 6 hours so that the cells adhered sufficiently to the culture surface.
培養後、倒立顕微鏡ＴＥ２０００−Ｕ（株式会社ニコン製）を用いて蛍光観察を行い、得られた画像を用いて細胞分布を評価した。得られた結果を図９に示す。 After culture, fluorescence observation was performed using an inverted microscope TE2000-U (manufactured by Nikon Corporation), and cell distribution was evaluated using the obtained images. The obtained results are shown in FIG.
図９のＡ−１（実施例２）およびＢ−１（比較例３）には培養面の写真が示されている。この際、培養面の点は、蛍光染色された培養細胞に対応する。 9A-1 (Example 2) and B-1 (Comparative Example 3) show photographs of the culture surface. At this time, the points on the culture surface correspond to the fluorescence-stained cultured cells.
図９のＡ−２およびＢ−２は、上記の細胞分布を細胞密度比として数値化したものである。具体的には、培養面を一定区画に区分し、各区画の細胞数を測定した。次いで、すべての区画のうちで最小の細胞数となる区画（基準区画）の細胞数を基準として、各区画の細胞数の相対値（細胞密度比）を算出した。すなわち、図９のＡ−２およびＢ−２に記載された各区画における数値は、下記式により算出される。 A-2 and B-2 in FIG. 9 are obtained by quantifying the above cell distribution as a cell density ratio. Specifically, the culture surface was divided into fixed sections, and the number of cells in each section was measured. Next, the relative value (cell density ratio) of the number of cells in each section was calculated based on the number of cells in the section (reference section) having the smallest number of cells among all the sections. That is, the numerical value in each section described in A-2 and B-2 in FIG. 9 is calculated by the following formula.
図９のＡ−３およびＢ−３は、上記Ａ−２およびＢ−２に記載のＡ−Ａ’の細胞密度比をグラフで示したものである。 A-3 and B-3 in FIG. 9 are graphs showing the cell density ratio of A-A ′ described in A-2 and B-2 above.
図９からも明らかなように、培養面が円形の細胞培養シートにおいては、培養面全面において均一に培養細胞が分布していることが分かる。 As is apparent from FIG. 9, in the cell culture sheet having a circular culture surface, it can be seen that the cultured cells are uniformly distributed over the entire culture surface.
一方、培養面が矩形の細胞培養シートにおいては、培養面が中央部から端部にいくにつれて培養細胞の分布が多くなっていることが分かる。特に、Ｂ−２およびＢ−３からも明らかなように、培養面の４つの角では培養細胞の密度が特に高値となっていることが分かる。 On the other hand, in the cell culture sheet having a rectangular culture surface, it can be seen that the distribution of the cultured cells increases as the culture surface moves from the center to the end. In particular, as is clear from B-2 and B-3, it can be seen that the density of the cultured cells is particularly high at the four corners of the culture surface.
よって、培養面を円形にすることにより、細胞を均一に培養することができることが理解される。 Therefore, it is understood that the cells can be cultured uniformly by making the culture surface circular.
１００、２００、３００ 細胞培養シート、
１ 第１の無機層、
２ 微小孔、
３ 外周層、
４ 基材層、
５ 第２の無機層、
６ 仕切り層、
７ シリコンウエハ、
８ 第１の層、
９ 第２の層、
１０ エッチング窓、
４００、５００ 細胞培養装置、
１１ 中空円筒部材。
100, 200, 300 cell culture sheet,
1 first inorganic layer,
2 micropores,
3 outer peripheral layer,
4 base material layer,
5 second inorganic layer,
6 partition layer,
7 Silicon wafer,
8 First layer,
9 Second layer,
10 Etching window,
400, 500 cell culture device,
11 Hollow cylindrical member.
Claims (12)
前記第１の無機層が、少なくとも１つの微小孔を有し、
平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有する、細胞培養シート。 A cell culture sheet having a first inorganic layer containing a transparent inorganic material,
The first inorganic layer has at least one micropore;
A cell culture sheet having a shape including a curve at least partially in a plan view.
前記シリコンウエハの他方の面上に透明な無機材料を含む第２の層を形成する工程（２）と、
前記第１の層に微小孔を形成する工程（３）と、
前記第２の層にエッチング窓を形成する工程（４）と、
前記第２の層の方向から結晶異方性エッチングを行う工程（５）と、
を含む、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有する、細胞培養シートの製造方法。 Forming a first layer containing a transparent inorganic material on one surface of the silicon wafer;
Forming a second layer containing a transparent inorganic material on the other surface of the silicon wafer (2);
Forming a micropore in the first layer (3);
Forming an etching window in the second layer (4);
Performing crystal anisotropic etching from the direction of the second layer (5);
A method for producing a cell culture sheet having a shape including at least a curve in a plan view.
前記細胞培養シートの外周縁に接触する、または隙間を隔てて向かい合う内壁面を備える筒状部材と、
を含む、細胞培養容器。 The cell culture sheet according to any one of claims 1 to 6 or the cell culture sheet produced by the method according to any one of claims 7 to 9,
A cylindrical member provided with an inner wall surface that is in contact with the outer peripheral edge of the cell culture sheet or facing the gap with a gap;
A cell culture vessel.
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