JP2020080722A - Cell handling container that can suppress cell contraction, and method for producing cell structure - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、細胞の収縮を抑制できる細胞取扱容器、及び細胞構造体の作製方法に関する。 The present disclosure relates to a cell handling container capable of suppressing cell contraction, and a method for producing a cell structure.
幹細胞研究のような細胞生物学の研究分野、並びに再生医療分野及び臨床検査分野等において、細胞培養は必要不可欠な技術である。例えば、再生医療分野では、患者から採取した細胞を生体外で培養し、シート形状の細胞構造体（以下、「細胞シート」とも記載する）を作製した上で、該細胞シートを患者の生体内へ移植する技術が開発されている。 In the field of cell biology such as stem cell research, the field of regenerative medicine and the field of clinical examination, cell culture is an essential technology. For example, in the field of regenerative medicine, cells collected from a patient are cultured in vitro to prepare a sheet-shaped cell structure (hereinafter, also referred to as “cell sheet”), and then the cell sheet is used in vivo in a patient. The technology to port to is being developed.
細胞シートのような細胞構造体は、通常は、基材の表面、例えば細胞取扱容器の底面に細胞を播種し、次いで該基材の表面上で該細胞を培養して細胞構造体を形成させることによって作製される。前記作製方法の場合、形成された細胞構造体は、細胞から分泌される接着分子を介して基材の表面と強固に結合する。このため、形成された細胞構造体を回収するために、該細胞構造体を基材の表面から剥離する必要がある。 A cell structure such as a cell sheet is usually formed by seeding cells on the surface of a substrate, for example, the bottom surface of a cell handling container, and then culturing the cells on the surface of the substrate to form a cell structure. It is made by In the case of the above-mentioned production method, the formed cell structure is firmly bound to the surface of the substrate via the adhesion molecule secreted from the cell. Therefore, in order to collect the formed cell structure, it is necessary to peel the cell structure from the surface of the base material.
例えば、特許文献1は、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで表面を被覆した細胞培養基材上で、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞から選択される１種類又はそれ以上の種類の細胞を培養し、（1）培養液温度を上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とし、（2）培養した培養細胞シートをキャリアとしての支持膜に密着させ、（3）そのままキャリアと共に剥離し、（4）工程（3）で得られたキャリアに密着した培養細胞シートを、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで表面を被覆した別の細胞培養基材上で培養された別の細胞シート上に密着させ、（5）前記（1）〜（4）の操作を繰り返すことを特徴とする、積層化培養細胞シートの製造方法を記載する。当該文献に記載の方法では、温度応答性ポリマーで表面を被覆した細胞培養基材上で細胞を培養することによって形成された培養細胞シートをキャリアと密着させた後、該温度応答性ポリマーの上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下の温度で処理することによって、該培養細胞シート及びキャリアを該細胞培養基材から剥離する。
For example,
特許文献1に記載の方法のように、温度応答性高分子を含む基材を用いて細胞構造体を形成する場合、基材から細胞構造体を剥離するために、通常は、基材の周囲温度を室温にする、又は細胞の培養液を低温に冷却した培養液に置換する等の方法が実施される。
As in the method described in
特許文献2は、透明な材質からなり、底面に細胞を接着させて培養可能な培養面を有する培養容器であって、前記培養面の一部に、既知の屈折率および厚さ寸法を有する基準物質が固定されている培養容器を記載する。 Patent Document 2 is a culture vessel made of a transparent material and having a culture surface capable of culturing by adhering cells to the bottom surface, and a part of the culture surface has a known refractive index and a thickness standard. Describe the culture vessel in which the substance is immobilized.
特許文献3は、細胞非接着性の表面に複数の細胞接着性領域が所定の間隔で配列された基板を培養液内に配置した状態で細胞の培養を行うための培養容器において、該培養容器の内側面の表面が撥水処理されたことを特徴とする培養容器を記載する。 Patent Document 3 discloses a culture container for culturing cells in a state in which a substrate in which a plurality of cell adhesive regions are arranged at predetermined intervals on a cell non-adhesive surface is placed in a culture medium, Described is a culture container having a water-repellent treatment on the inner surface thereof.
細胞構造体の作製方法において、基材の表面に播種された細胞は、細胞から分泌される接着分子を介して細胞同士が強固に結合して、細胞構造体を形成する。この細胞構造体の形成の間及び／又は後で、細胞構造体を形成する細胞が収縮する場合がある。このような場合、細胞構造体の観察及び評価において、例えば定量的及び／又は定性的な観点で正確な結果が得られない可能性がある。 In the method for producing a cell structure, the cells seeded on the surface of the base material are tightly bound to each other via an adhesion molecule secreted from the cells to form a cell structure. During and/or after the formation of this cell structure, the cells forming the cell structure may contract. In such a case, in observation and evaluation of the cell structure, accurate results may not be obtained, for example, from a quantitative and/or qualitative viewpoint.
それ故、本開示は、細胞構造体の作製に使用し得る細胞取扱容器において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制する手段を提供することを目的とする。 Therefore, it is an object of the present disclosure to provide a means for substantially suppressing contraction of cells forming a cell structure in a cell handling container that can be used for producing the cell structure.
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した。本発明者らは、細胞取扱容器において、側壁の内部表面の少なくとも一部が細胞接着性を有することにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制し得ることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。 The present inventors have studied various means for solving the above problems. In the cell handling container, the present inventors have made it possible for at least a part of the inner surface of the side wall to have cell adhesiveness, so that the contraction of cells forming the cell structure during and/or after the formation of the cell structure. Have been found to be substantially suppressed. The present inventors have completed the present invention based on the above findings.
すなわち、本発明の要旨は、以下の態様及び実施形態を包含する。
（1） 底部と、底部の外縁部に配置された側壁と、底部及び側壁によって形成される細胞収容部とを有する細胞取扱容器であって、側壁の細胞収容部に面する側の表面の少なくとも一部が細胞接着性を有する、細胞取扱容器。
（2） 底部の外縁部と側壁の下端部との接続部をさらに有し、底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部の外縁部における底部の細胞収容部に面する側の表面と側壁の下端部との距離によって定義される接続部の高さが100 μm以下である、前記実施形態（1）に記載の細胞取扱容器。
（3） 底部と側壁との接続部の高さが10 μm以上且つ50 μm以下の範囲である、前記実施形態（2）に記載の細胞取扱容器。
（4） 底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部が、曲率を有する形状である、前記実施形態（1）〜（3）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（5） 底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部が、底部に凹部を有する形状である、前記実施形態（1）〜（3）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（6） 底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、側壁の細胞収容部に面する側の表面と底部の細胞収容部に面する側の表面との角度が、30°以上且つ120°以下の範囲である、前記実施形態（1）〜（5）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（7） 側壁の細胞収容部に面する側の表面において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部以外の領域が細胞接着性を有する、前記実施形態（1）〜（6）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（8） 側壁の細胞収容部に面する側の表面の少なくとも一部が、凹凸構造を有する、前記実施形態（1）〜（7）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（9） 側壁の細胞収容部に面する側の表面の少なくとも一部が、親水化処理又は細胞接着性薬剤のコーティング処理による細胞接着性を有する、前記実施形態（1）〜（8）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（10） 親水化処理が、プラズマ処理、紫外線（UV）照射処理、電子線（EB）照射処理、親水性ポリマーの重合処理、及び刺激応答性ポリマーの重合処理からなる群より選択される1種以上の処理である、前記実施形態（9）に記載の細胞取扱容器。
（11） 細胞接着性薬剤のコーティング処理が、フィブロネクチン、コラーゲン、及びポリエチレンイミンからなる群より選択される1種以上の処理である、前記実施形態（9）に記載の細胞取扱容器。
（12） 底部の細胞収容部に面する側の表面の少なくとも一部が細胞接着性を有する、前記実施形態（1）〜（11）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（13） 側壁の細胞収容部に面する側の表面の少なくとも一部のみが細胞接着性を有する、前記実施形態（1）〜（11）のいずれかに記載の細胞取扱容器。
（14） 前記実施形態（1）〜（13）のいずれかに記載の細胞取扱容器の細胞収容部で細胞を培養して、底部の細胞収容部に面する側の表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程；
を含む、細胞構造体の作製方法。
（15） 細胞構造体形成工程において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部の領域を超える厚さまで細胞構造体を形成させる、前記実施形態（14）に記載の方法。
That is, the gist of the present invention includes the following aspects and embodiments.
(1) A cell handling container having a bottom part, a side wall arranged at an outer edge part of the bottom part, and a cell containing part formed by the bottom part and the side wall, wherein at least a surface of the side wall facing the cell containing part. A cell handling container, part of which has cell adhesiveness.
(2) In the cross section of the cell handling container on the plane that passes through the center of gravity of the bottom and is orthogonal to the bottom, further has a connecting portion between the outer edge of the bottom and the lower end of the side wall, and the cell storage portion of the bottom at the outer edge of the bottom The cell handling container according to the embodiment (1), wherein the height of the connection portion defined by the distance between the surface on the side facing the surface and the lower end portion of the side wall is 100 μm or less.
(3) The cell handling container according to the embodiment (2), wherein the height of the connecting portion between the bottom portion and the side wall is in the range of 10 μm or more and 50 μm or less.
(4) In the cross section of the cell handling container in a plane that passes through the center of gravity of the bottom portion and is orthogonal to the bottom portion, the connecting portion between the outer edge portion of the bottom portion and the lower end portion of the side wall has a shape having a curvature. The cell handling container according to any one of to (3).
(5) In the cross section of the cell handling container in a plane that passes through the center of gravity of the bottom portion and is orthogonal to the bottom portion, the connecting portion between the outer edge portion of the bottom portion and the lower end portion of the side wall has a shape having a recessed portion in the bottom portion. The cell handling container according to any one of 1) to (3).
(6) In the cross section of the cell handling container in the plane that passes through the center of gravity of the bottom portion and is orthogonal to the bottom portion, the angle between the surface of the side wall facing the cell housing portion and the surface of the bottom surface facing the cell housing portion is The cell handling container according to any one of the embodiments (1) to (5), which has a range of 30° or more and 120° or less.
(7) In the surface of the side wall facing the cell-holding part, a region other than the connection part between the outer edge part of the bottom part and the lower end part of the side wall has cell adhesiveness, in the above embodiments (1) to (6) The cell handling container according to any one of the above.
(8) The cell handling container according to any one of the embodiments (1) to (7), wherein at least a part of the surface of the side wall facing the cell containing portion has an uneven structure.
(9) Any one of the above-mentioned embodiments (1) to (8), wherein at least a part of the surface of the side wall facing the cell-holding portion has cell adhesiveness due to hydrophilic treatment or coating treatment with a cell adhesive agent. The cell handling container according to
(10) The hydrophilic treatment is selected from the group consisting of plasma treatment, ultraviolet (UV) irradiation treatment, electron beam (EB) irradiation treatment, hydrophilic polymer polymerization treatment, and stimuli-responsive polymer polymerization treatment. The cell handling container according to the above embodiment (9), which is the above-described processing.
(11) The cell handling container according to the embodiment (9), wherein the coating treatment with the cell adhesive agent is one or more treatments selected from the group consisting of fibronectin, collagen, and polyethyleneimine.
(12) The cell handling container according to any one of the above embodiments (1) to (11), wherein at least a part of the surface of the bottom portion facing the cell containing portion has cell adhesiveness.
(13) The cell handling container according to any one of the embodiments (1) to (11), wherein at least a part of the surface of the side wall facing the cell containing portion has cell adhesiveness.
(14) Culturing cells in the cell-holding part of the cell-handling container according to any one of the embodiments (1) to (13) to form a cell structure on the surface of the bottom facing the cell-holding part. A cell structure forming step;
A method for producing a cell structure, comprising:
(15) The method according to the above embodiment (14), wherein in the cell structure forming step, the cell structure is formed to a thickness exceeding the region of the connection between the outer edge of the bottom and the lower end of the side wall.
本開示により、細胞構造体の作製に使用し得る細胞取扱容器において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制する手段を提供することが可能となる。 According to the present disclosure, it is possible to provide a means for substantially suppressing the contraction of cells forming a cell structure in a cell handling container that can be used for producing the cell structure.
前記以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。 Problems, configurations, and effects other than the above will be clarified by the following description of the embodiments.
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.
＜1. 細胞取扱容器＞
本明細書では、適宜図面を参照して本発明の特徴を説明する。図面では、明確化のために各部の寸法及び形状を誇張しており、実際の寸法及び形状を正確に描写してはいない。それ故、本発明の各態様の技術的範囲は、これら図面に表された各部の寸法及び形状に限定されるものではない。
<1. Cell handling container>
In the present specification, features of the present invention will be described with reference to the drawings as appropriate. In the drawings, the size and shape of each part are exaggerated for clarity, and the actual size and shape are not accurately drawn. Therefore, the technical scope of each aspect of the present invention is not limited to the size and shape of each part shown in these drawings.
細胞構造体の作製方法において、基材の表面に播種された細胞は、細胞から分泌される接着分子（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン及びビトロネクチン等）を介して細胞同士が強固に結合して、細胞構造体を形成する。この細胞構造体の形成の間及び／又は後で、細胞構造体を形成する細胞が収縮する場合がある。このような場合、細胞構造体の観察及び評価において、例えば定量的及び／又は定性的な観点で正確な結果が得られない可能性がある。 In the method for producing a cell structure, the cells seeded on the surface of the base material are strongly bonded to each other via an adhesion molecule (eg, collagen, fibronectin, vitronectin, etc.) secreted from the cells, resulting in a cell structure. Form the body. During and/or after the formation of this cell structure, the cells forming the cell structure may contract. In such a case, in observation and evaluation of the cell structure, accurate results may not be obtained, for example, from a quantitative and/or qualitative viewpoint.
本発明者らは、細胞取扱容器において、側壁の内部表面の少なくとも一部が細胞接着性を有することにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制し得ることを見出した。それ故、本発明の一態様は、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制し得る、細胞取扱容器に関する。 In the cell handling container, the present inventors have made it possible for at least a part of the inner surface of the side wall to have cell adhesiveness, so that the contraction of cells forming the cell structure during and/or after the formation of the cell structure. Have been found to be substantially suppressed. Therefore, one aspect of the present invention relates to a cell handling container capable of substantially suppressing contraction of cells forming a cell structure.
本態様の細胞取扱容器の形状は、特に限定されず、当該技術分野で通常使用されるディッシュ型、角形プレート型又はフラスコ型等の各種形状から適宜選択することができる。本態様の細胞取扱容器は、ディッシュ型の形状であることが好ましく、円形ディッシュ型の形状であることがより好ましい。例えば、本態様の細胞取扱容器の形状がディッシュ型の場合、その長径は、通常は35〜150 mmの範囲である。 The shape of the cell handling container of this embodiment is not particularly limited, and can be appropriately selected from various shapes such as a dish type, a square plate type, and a flask type that are commonly used in the art. The cell handling container of the present aspect preferably has a dish shape, and more preferably a circular dish shape. For example, when the shape of the cell handling container of this embodiment is a dish type, the major axis is usually in the range of 35 to 150 mm.
本態様の細胞取扱容器の材料は、特に限定されず、当該技術分野で通常使用される各種材料から適宜選択することができる。本態様の細胞取扱容器の材料としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、シリコーン樹脂（例えば、ジメチルポリシロキサン）、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、並びにガラス及び石英等の無機材料を挙げることができる。前記樹脂材料は、所望により、1種以上のさらなる樹脂材料を組み合わせて使用してもよい。本態様の細胞取扱容器を形成する材料は、前記群より選択される少なくとも1種の樹脂材料であることが好ましく、ポリスチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂又はシリコーン樹脂（例えば、ジメチルポリシロキサン）であることがより好ましい。前記で例示した樹脂材料を用いる場合、射出成形等の手段によって低コストで本態様の細胞取扱容器を作製することができる。 The material of the cell handling container of this embodiment is not particularly limited and can be appropriately selected from various materials commonly used in the technical field. Examples of the material of the cell handling container of this embodiment include polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polyethylene terephthalate resin, polypropylene resin, silicone resin (for example, dimethylpolysiloxane), ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, Examples thereof include resin materials such as polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin and vinyl chloride resin, and inorganic materials such as glass and quartz. The resin material may optionally be used in combination with one or more further resin materials. The material forming the cell handling container of this embodiment is preferably at least one resin material selected from the above group, and is polystyrene resin, polyethylene terephthalate resin or silicone resin (for example, dimethylpolysiloxane). More preferable. When the resin material exemplified above is used, the cell handling container of this embodiment can be produced at low cost by means such as injection molding.
本態様の細胞取扱容器の好ましい一実施形態を図1に示す。図1に示すように、本態様の細胞取扱容器1は、底部11と、底部11の外縁部に配置された側壁12と、底部11及び側壁12によって形成される細胞収容部13とを有する。本態様の細胞取扱容器1は、側壁12の細胞収容部13に面する側の表面14（以下、「側壁の内表面」とも記載する）の少なくとも一部が細胞接着性を有する。前記特徴を有する本態様の細胞取扱容器を用いて細胞構造体を作製すると、細胞収容部で形成される細胞構造体の端部の少なくとも一部は、少なくとも一部が細胞接着性を有する側壁の内表面に接着し得る。それ故、前記特徴を有することにより、本態様の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。
A preferred embodiment of the cell handling container of this aspect is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the
図1に示すように、本態様の細胞取扱容器1は、底部11の外縁部と側壁12の下端部との接続部16をさらに有する。接続部16は、底部11の外縁部における、底部11の細胞収容部13に面する側の表面15（以下、「底部の内表面」とも記載する）と、側壁12の下端部とを接続する部分である。接続部の高さは、底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部の外縁部における底部の内表面と側壁の下端部との距離によって定義される。ここで、底部の重心は、本態様の細胞取扱容器の底部と平行な面に底部を投影した図形における重心を意味する。本態様の細胞取扱容器において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部の形状は特に限定されない。以下において説明するように、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部は、様々な形状であることができる。
As shown in FIG. 1, the
接続部の高さは、100 μm以下であることが好ましく、50 μm以下であることがより好ましく、20 μm以下であることがさらに好ましい。接続部の高さは、0 μm以上であることが好ましく、10 μm以上であることがより好ましく、15 μm以上であることがさらに好ましい。接続部の高さは、0 μm以上且つ100 μm以下の範囲であることが好ましく、10 μm以上且つ50 μm以下の範囲であることがより好ましく、15 μm以上且つ20 μm以下の範囲であることがさらに好ましい。接続部の高さが前記上限値を超える場合、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞が収縮する可能性がある。それ故、接続部の高さが前記範囲内である場合、本態様の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 The height of the connecting portion is preferably 100 μm or less, more preferably 50 μm or less, and further preferably 20 μm or less. The height of the connecting portion is preferably 0 μm or more, more preferably 10 μm or more, and further preferably 15 μm or more. The height of the connecting portion is preferably in the range of 0 μm or more and 100 μm or less, more preferably in the range of 10 μm or more and 50 μm or less, and in the range of 15 μm or more and 20 μm or less. Is more preferable. When the height of the connection portion exceeds the upper limit value, the cells forming the cell structure may contract during and/or after the formation of the cell structure. Therefore, when the height of the connection part is within the above range, the cell handling container of the present embodiment substantially contracts the cells forming the cell structure during and/or after the formation of the cell structure. Can be suppressed.
本態様の細胞取扱容器の別の好ましい一実施形態を図2に示す。図2に示すように、本実施形態の場合、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部11の外縁部と側壁12の下端部との接続部16は、細胞収容部13に面する側の表面（以下、「接続部の内表面」とも記載する）が実質的に平面であり、且つ該平面が底部の内表面及び側壁の内表面のいずれに対しても傾斜している形状である。本実施形態において、接続部16の高さH0は、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部11の内表面15から、側壁12の内表面14と接続部16の細胞収容部13に面する側の平面との境界までの最短距離である。
Another preferred embodiment of the cell handling container of this aspect is shown in FIG. As shown in FIG. 2, in the case of the present embodiment, in the cross section of the cell handling container in the plane that passes through the center of gravity of the
本態様の細胞取扱容器の別の好ましい一実施形態を図3に示す。図3に示すように、本実施形態の場合、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部11の外縁部と側壁12の下端部との接続部16の内表面が実質的に曲率を有する形状である。本実施形態において、接続部16の高さH0は、接続部16の曲率半径と同一の値である。すなわち、接続部16の曲率半径は、100 μm以下であることが好ましく、50 μm以下であることがより好ましく、20 μm以下であることがさらに好ましい。接続部16の曲率半径は、0 μm超であることが好ましく、10 μm以上であることがより好ましく、15 μm以上であることがさらに好ましい。接続部16の曲率半径は、0 μm超且つ100 μm以下の範囲であることが好ましく、10 μm以上且つ50 μm以下の範囲であることがより好ましく、15 μm以上且つ20 μm以下の範囲であることがさらに好ましい。前記特徴を有することにより、本実施形態の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。
Another preferred embodiment of the cell handling container of this aspect is shown in FIG. As shown in FIG. 3, in the case of the present embodiment, in a cross section of the cell handling container in a plane that passes through the center of gravity of the
本態様の細胞取扱容器の別の好ましい一実施形態を図4に示す。図4に示すように、本実施形態の場合、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部11の外縁部と側壁12の下端部との接続部16は、底部11の内表面15と実質的に平行な平面の形状である。本実施形態において、底部11の外縁部と側壁12の下端部との接続部16の高さH0は、0である。
Another preferred embodiment of the cell handling container of this aspect is shown in FIG. As shown in FIG. 4, in the case of the present embodiment, in the cross section of the cell handling container in a plane that passes through the center of gravity of the
本態様の細胞取扱容器の別の好ましい一実施形態を図5に示す。図5に示すように、本実施形態の場合、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部11の外縁部と側壁12の下端部との接続部16は、底部11に凹部を有する形状である。本実施形態において、接続部16の高さH0は、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部11の内表面15から凹部の底部までの深さと同一の値である。すなわち、凹部の深さは、100 μm以下であることが好ましく、50 μm以下であることがより好ましく、20 μm以下であることがさらに好ましい。凹部の深さは、0 μm超であることが好ましく、10 μm以上であることがより好ましく、15 μm以上であることがさらに好ましい。凹部の深さは、0 μm超且つ100 μm以下の範囲であることが好ましく、10 μm以上且つ50 μm以下の範囲であることがより好ましく、15 μm以上且つ20 μm以下の範囲であることがさらに好ましい。本実施形態の細胞取扱容器を用いて細胞構造体を作製すると、細胞収容部で形成される細胞構造体の端部の少なくとも一部は、少なくとも一部が細胞接着性を有する側壁の内表面に接着し得るだけでなく、接続部の凹部にも侵入し、嵌合し得る。それ故、前記特徴を有することにより、本実施形態の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。
Another preferred embodiment of the cell handling container of this aspect is shown in FIG. As shown in FIG. 5, in the case of the present embodiment, in the cross section of the cell handling container in a plane that passes through the center of gravity of the
本態様の細胞取扱容器の別の好ましい一実施形態を図6に示す。図6に示すように、本実施形態の場合、側壁の内表面に少なくとも1個の保持部17を有する。保持部は、本実施形態の細胞取扱容器を用いて細胞構造体を作製する際、細胞構造体のめくれ上がり、皺寄り又は折れ曲がり等によって細胞構造体が部分的に変形又は破損することを実質的に抑制し得る。本実施形態の細胞取扱容器において、保持部の個数は、1〜10個の範囲であることが好ましく、2〜3個の範囲であることがより好ましい。保持部の長さは、通常は、底部の最大長さ（例えば、本実施形態の細胞取扱容器が円形ディッシュ型の形状の場合、長径）の1〜5％の範囲である。保持部の長さは、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、10 μm以上であることが好ましく、100 μm以上であることがより好ましい。また、保持部の長さは、底部11の重心を通り且つ底部11と直交する面における細胞取扱容器の断面において、2000 μm以下であることが好ましく、1000 μm以下であることがより好ましく、500 μm以下であることがさらに好ましい。保持部の形状としては、限定するものではないが、例えば、錐体、錐台、柱体及びランダムな異方性凹凸状等を挙げることができる。保持部の形状は、錐体状、錐台状又は柱体状であることが好ましい。前記特徴を有することにより、本実施形態の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体が部分的に変形又は破損することを実質的に抑制しつつ、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。
Another preferred embodiment of the cell handling container of this aspect is shown in FIG. As shown in FIG. 6, in this embodiment, at least one holding
本態様の細胞取扱容器において、側壁の内表面の少なくとも一部が、凹凸構造を有することが好ましい。この場合、凹部の深さ及び凸部の高さは、0.1 μm以上であることが好ましく、1 μm以上であることがより好ましく、5 μm以上であることがさらに好ましい。また、凹部の深さ及び凸部の高さは、50 μm以下であることが好ましく、25 μm以下であることがより好ましく、10 μm以下であることがさらに好ましい。凹凸構造の形状としては、限定するものではないが、例えば、錐体、錐台、柱体及びランダムな異方性凹凸状等を挙げることができる。凹凸構造の形状は、錐体状、錐台状又は柱体状であることが好ましい。前記特徴を有することにより、本態様の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In the cell handling container of this aspect, it is preferable that at least a part of the inner surface of the side wall has an uneven structure. In this case, the depth of the concave portion and the height of the convex portion are preferably 0.1 μm or more, more preferably 1 μm or more, and further preferably 5 μm or more. The depth of the concave portion and the height of the convex portion are preferably 50 μm or less, more preferably 25 μm or less, and further preferably 10 μm or less. The shape of the concavo-convex structure is not limited, but examples thereof include a cone, a frustum, a column, and a random anisotropic concavo-convex shape. The shape of the concavo-convex structure is preferably a cone shape, a truncated cone shape, or a column shape. By having the above-mentioned characteristics, the cell handling container of the present embodiment can substantially suppress contraction of cells forming the cell structure during and/or after the formation of the cell structure.
本態様の細胞取扱容器において、側壁は、底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部の内表面に対して垂直に配置されていてもよく、底部の内表面に直交する直線に対して傾斜して配置されていてもよい。側壁は、底部の重心を通り且つ底部と直交する面における細胞取扱容器の断面において、底部の内表面に直交する直線に対して傾斜して配置されていることが好ましい。前記特徴を有することにより、本態様の細胞取扱容器を射出成形等で作製する際に、金型から容易に取り外すことができる。 In the cell handling container of this aspect, the side wall may be arranged perpendicular to the inner surface of the bottom portion in the cross section of the cell handling container in a plane that passes through the center of gravity of the bottom portion and is orthogonal to the bottom portion. It may be arranged so as to be inclined with respect to a straight line orthogonal to. The side wall is preferably arranged to be inclined with respect to a straight line orthogonal to the inner surface of the bottom in the cross section of the cell handling container in a plane passing through the center of gravity of the bottom and orthogonal to the bottom. By having the above-mentioned characteristics, when the cell handling container of this embodiment is produced by injection molding or the like, it can be easily removed from the mold.
本態様の細胞取扱容器は、底部の重心を通り且つ底部と直交する面における本態様の細胞取扱容器の断面において、側壁の内表面と底部の内表面との角度は、15°以上であることが好ましく、30°以上であることがより好ましく、90°以上であることがさらに好ましい。側壁の内表面と底部の内表面との角度は、150°以下であることが好ましく、120°以下であることがより好ましく、90°以下であることがさらに好ましい。側壁の内表面と底部の内表面との角度は、15°以上且つ150°以下の範囲であることが好ましく、30°以上且つ120°以下の範囲であることがより好ましい。側壁の内表面と底部の内表面との角度が前記上限値を超える場合、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞が収縮する可能性がある。それ故、側壁の内表面と底部の内表面との角度が前記範囲内である場合、本態様の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In the cell handling container of the present embodiment, in the cross section of the cell handling container of the present embodiment in a plane that passes through the center of gravity of the bottom and is orthogonal to the bottom, the angle between the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom is 15° or more. Is preferable, 30° or more is more preferable, and 90° or more is further preferable. The angle between the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom is preferably 150° or less, more preferably 120° or less, and further preferably 90° or less. The angle between the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom is preferably in the range of 15° or more and 150° or less, more preferably in the range of 30° or more and 120° or less. If the angle between the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom exceeds the upper limit, the cells forming the cell structure may contract during and/or after the formation of the cell structure. Therefore, when the angle between the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom is within the above range, the cell handling container of the present embodiment forms the cell structure during and/or after the formation of the cell structure. Cell contraction can be substantially suppressed.
本態様の細胞取扱容器は、底部の重心を通り且つ底部と直交する面における本態様の細胞取扱容器の断面において、底部の外部に面する側の表面（以下、「底部の外表面」とも記載する）と側壁の外部に面する側の表面（以下、「側壁の外表面」とも記載する）との傾斜角度は、通常は70〜110°の範囲であり、例えば80〜100°の範囲である。底部の内表面と側壁の内表面との傾斜角度、及び底部の外表面と側壁の外表面との傾斜角度は、実質的に同一の値であってもよく、実質的に異なる値であってもよい。本態様の細胞取扱容器において、底部の外表面と側壁の外表面との傾斜角度が前記範囲内である場合、本態様の細胞取扱容器を射出成形等で作製する際に、金型から容易に取り外すことができる。 The cell handling container of the present aspect has a surface on the side facing the outside of the bottom portion in the cross section of the cell handling container of the present aspect in a plane that passes through the center of gravity of the bottom portion and is orthogonal to the bottom portion (hereinafter, also referred to as “outer surface of bottom portion”). Angle) between the outer surface of the side wall (hereinafter also referred to as “the outer surface of the side wall”) is in the range of 70 to 110°, for example in the range of 80 to 100°. is there. The inclination angle between the inner surface of the bottom portion and the inner surface of the side wall and the inclination angle between the outer surface of the bottom portion and the outer surface of the side wall may be substantially the same value or substantially different values. Good. In the cell handling container of the present aspect, when the inclination angle between the outer surface of the bottom portion and the outer surface of the side wall is within the above range, when the cell handling container of the present aspect is produced by injection molding or the like, the cell handling container can be easily molded. It can be removed.
本態様の細胞取扱容器は、側壁の内表面において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部以外の領域が細胞接着性を有することが好ましい。本実施形態の場合、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部の内表面は、実質的に細胞接着性を有していない。前記特徴を有することにより、本態様の細胞取扱容器は、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In the cell handling container of this aspect, it is preferable that a region other than a connecting portion between the outer edge portion of the bottom portion and the lower end portion of the side wall has cell adhesiveness on the inner surface of the side wall. In the case of this embodiment, the inner surface of the connecting portion between the outer edge portion of the bottom portion and the lower end portion of the side wall does not substantially have cell adhesiveness. By having the above-mentioned characteristics, the cell handling container of the present embodiment can substantially suppress contraction of cells forming the cell structure during and/or after the formation of the cell structure.
本態様の細胞取扱容器において、底部の内表面は、細胞接着性を有していてもよく、有していなくてもよい。本態様の細胞取扱容器において、底部の内表面が実質的に細胞接着性を有していない場合、例えば、遠心力の付与等の手段によって、底部の内表面に細胞構造体を形成させることができる。本態様の細胞取扱容器の一実施形態において、底部の内表面の少なくとも一部が、細胞接着性を有することが好ましい。前記特徴を有することにより、細胞構造体の形成の間において、細胞構造体を底部の内表面に実質的に保持することができる。 In the cell handling container of this aspect, the inner surface of the bottom may or may not have cell adhesiveness. In the cell handling container of this aspect, when the inner surface of the bottom portion does not substantially have cell adhesiveness, a cell structure can be formed on the inner surface of the bottom portion by, for example, applying a centrifugal force. it can. In one embodiment of the cell handling container of this aspect, it is preferable that at least a part of the inner surface of the bottom has cell adhesiveness. Due to the above characteristics, the cell structure can be substantially retained on the inner surface of the bottom portion during the formation of the cell structure.
本態様の細胞取扱容器の特定の一実施形態において、側壁の内表面の少なくとも一部のみが、細胞接着性を有することが好ましい。本実施形態の場合、底部の内表面は、実質的に細胞接着性を有していない。前記特徴を有することにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In one specific embodiment of the cell handling container of this aspect, it is preferable that at least a part of the inner surface of the side wall has cell adhesiveness. In the case of this embodiment, the inner surface of the bottom portion has substantially no cell adhesiveness. By having the said characteristic, contraction of the cell which forms a cell structure can be substantially suppressed during and/or after formation of a cell structure.
本発明の各態様において、細胞構造体を構成する細胞は、特に限定されない。生体に存在するあらゆる組織若しくは器官自体、又はそれに由来する各種の細胞を用いることができる。本発明の各態様に使用される細胞は、接着性の組織又は細胞であることが好ましい。例えば、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞若しくは内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞、神経系を構成するニューロン若しくはグリア細胞、線維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞、又は脂肪細胞等を使用することができる。或いは、本発明の各態様に使用される細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）等であってもよく、分化が終了した細胞であってもよい。本発明の各態様に使用される細胞は、前記組織又は器官から直接採取した初代細胞系でもよく、該初代細胞を何代か継代させた継代細胞系であってもよい。前記細胞は、1種類のみを使用してもよく、2種類以上を同時に使用してもよい。細胞が由来する動物も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ又はヒツジ等の動物に由来する細胞を使用することができる。 In each aspect of the present invention, the cells constituting the cell structure are not particularly limited. Any tissue or organ present in the living body itself or various cells derived therefrom can be used. The cells used in each aspect of the present invention are preferably adherent tissues or cells. For example, each tissue in vivo, epithelial cells or endothelial cells constituting an organ, skeletal muscle cells exhibiting contractility, smooth muscle cells, cardiomyocytes, chondrocytes, neurons or glial cells constituting nervous system, fibroblasts, Liver parenchymal cells, non-liver parenchymal cells, adipocytes and the like that are involved in the metabolism of the living body can be used. Alternatively, the cells used in each embodiment of the present invention include embryonic stem cells (ES cells), pluripotent stem cells such as mesenchymal stem cells having pluripotency, and vascular endothelial progenitor cells having unipotency. It may be a pluripotent stem cell, an induced pluripotent stem cell (iPS cell), or the like, or a differentiated cell. The cells used in each aspect of the present invention may be primary cell lines directly collected from the tissue or organ, or may be passage cell lines obtained by subculturing the primary cells for several passages. Only one type of the cells may be used, or two or more types may be used simultaneously. The animal from which the cells are derived is not particularly limited, and cells derived from animals such as humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, or sheep can be used.
本発明の各態様において、「細胞構造体」は、細胞同士が細胞外マトリクスを介して細胞間接着を形成することによって生じる、複数の細胞からなる細胞の集合体を意味する。本発明の各態様において、細胞構造体は、特定の組織又は器官に分化した形態であってもよく、未分化の形態であってもよい。また、本発明の各態様において、細胞構造体は、本発明の一態様の細胞取扱容器における底部の内表面に複数の細胞が配列することによって形成される二次元構造の一層形態であってもよく、底部の内表面に配列した複数の細胞の上部にさらに複数の細胞が配列することによって形成される三次元構造の多層形態であってもよい。本発明の各態様において、細胞構造体としては、例えば、シート状の形態の細胞シートを挙げることができる。本発明の各態様において、細胞構造体、例えば、シート状の形態の細胞シートの厚さは、通常は10 μm以上であり、例えば20 μm以上であり、特に40 μm以上である。本発明の各態様において、細胞構造体、例えば、シート状の形態の細胞シートの厚さは、通常は200 μm以下であり、例えば100 μm以下であり、特に80 μm以下である。本発明の各態様において、細胞構造体、例えば、シート状の形態の細胞シートの厚さは、通常は10〜200 μmの範囲であり、例えば20〜100 μmの範囲であり、特に40〜80 μmの範囲である。 In each aspect of the present invention, “cell structure” means a cell aggregate composed of a plurality of cells, which is generated by the formation of intercellular adhesion between cells via an extracellular matrix. In each aspect of the present invention, the cell structure may have a form differentiated into a specific tissue or organ, or may have an undifferentiated form. Further, in each of the aspects of the present invention, the cell structure may be a one-dimensional form of a two-dimensional structure formed by arranging a plurality of cells on the inner surface of the bottom of the cell handling container of the aspect of the present invention. It may well be a multi-layered form of a three-dimensional structure formed by arranging a plurality of cells on top of a plurality of cells arranged on the inner surface of the bottom. In each aspect of the present invention, examples of the cell structure include a cell sheet in a sheet form. In each aspect of the invention, the thickness of the cell structure, eg the cell sheet in sheet form, is usually 10 μm or more, for example 20 μm or more, in particular 40 μm or more. In each aspect of the invention, the thickness of the cell structure, eg the cell sheet in sheet form, is usually 200 μm or less, eg 100 μm or less, especially 80 μm or less. In each aspect of the invention, the thickness of the cell structure, e.g. the cell sheet in sheet form, is usually in the range 10 to 200 μm, for example in the range 20 to 100 μm, in particular 40 to 80 μm. It is in the range of μm.
本発明の各態様において、「細胞接着性」及び「細胞非接着性」は、通常は、一の表面領域と他の表面領域とにおける細胞の接着度合いの相対的な強さを意味し、典型的には、「細胞接着性」は、細胞が接着しやすい表面特性を意味する。細胞接着性は、通常は、表面の化学的性質及び／又は物理的性質等に起因して、細胞の接着及び／又は伸展が起こりやすいか否かに基づき、決定される。本発明の各態様において、細胞取扱容器の側壁の内表面及び底部の内表面の細胞接着性を判断する指標としては、例えば、実際に該内表面で細胞を培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。或いは、対象となる内表面と同一の材質の基材を準備し、該基材の表面で細胞を培養した際の細胞接着伸展率を用いることもできる。本態様の細胞取扱容器において、側壁の内表面及び場合により底部の内表面の少なくとも一部が細胞接着性である場合、側壁の内表面及び場合により底部の内表面の少なくとも一部は、細胞接着伸展率が60％以上であることが好ましく、細胞接着伸展率が80％以上であることがより好ましい。側壁の内表面及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の細胞接着伸展率が前記範囲内である場合、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。また、側壁の内表面及び場合により底部の内表面の少なくとも一部が細胞非接着性である場合、側壁の内表面及び場合により底部の内表面の少なくとも一部は、細胞接着伸展率が60％未満であることが好ましく、40％未満であることがより好ましく、5％以下であることがさらに好ましく、2％以下であることが特に好ましい。 In each aspect of the present invention, "cell adhesiveness" and "cell non-adhesiveness" usually mean the relative strength of the degree of cell adhesion between one surface area and another surface area, and In general, "cell adhesiveness" means a surface property to which cells are likely to adhere. Cell adhesiveness is usually determined based on whether cell adhesion and/or extension is likely to occur due to chemical and/or physical properties of the surface. In each aspect of the present invention, as an index for determining the cell adhesiveness of the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom of the cell handling container, for example, the cell adhesion spreading rate when the cells are actually cultured on the inner surface. Can be used. Alternatively, it is also possible to prepare a base material of the same material as the target inner surface and use the cell adhesion extension rate when cells are cultured on the surface of the base material. In the cell handling container of the present aspect, when at least a part of the inner surface of the side wall and optionally the inner surface of the bottom part is cell-adhesive, at least a part of the inner surface of the side wall and optionally the inner surface of the bottom part is cell-adhesive. The extension rate is preferably 60% or more, and more preferably the cell adhesion extension rate is 80% or more. When the cell adhesion spreading rate of at least a part of the inner surface of the side wall and optionally the inner surface of the bottom is within the range, contraction of cells forming the cell structure during and/or after formation of the cell structure. Can be substantially suppressed. In addition, when at least a part of the inner surface of the side wall and optionally the inner surface of the bottom part is non-cell-adhesive, the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom part have a cell adhesion spreading rate of 60%. It is preferably less than 40%, more preferably less than 40%, further preferably 5% or less, particularly preferably 2% or less.
本発明の各態様において、細胞接着性の指標となる細胞接着伸展率は、例えば、以下の方法で決定することができる。培養しようとする細胞を、4000〜30000 cells/cm2の範囲の初期播種密度で測定対象表面に播種した後、37℃、5％のCO2濃度の条件下で培養する。培養開始3時間後に、培地交換を行い、接着していない細胞を除去した後、細胞が接着している数箇所を観察する。細胞接着伸展率を、次の式：（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×100（％））に基づき算出する。 In each aspect of the present invention, the cell adhesion extension rate, which is an index of cell adhesiveness, can be determined, for example, by the following method. The cells to be cultivated are seeded on the surface to be measured at an initial seeding density in the range of 4000 to 30,000 cells/cm 2 , and then cultivated under conditions of 37° C. and 5% CO 2 concentration. After 3 hours from the start of the culture, the medium is exchanged to remove the non-adherent cells, and then the several areas where the cells adhere are observed. The cell adhesion spreading rate is calculated based on the following formula: ({(number of adhered cells)/(number of seeded cells)}×100(%)).
本態様の細胞取扱容器において、側壁の内表面及び場合により底部の内表面は、当該技術分野で通常使用される各種の処理によって、少なくとも一部が細胞接着性を有するように改変することができる。本態様の細胞取扱容器において、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の細胞接着性は、親水化処理又は細胞接着性薬剤のコーティング処理によって付与されることが好ましく、親水化処理によって付与されることがより好ましい。前記処理によって側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部に細胞接着性を付与することにより、本態様の細胞取扱容器を用いる細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In the cell handling container of this embodiment, the inner surface of the side wall and optionally the inner surface of the bottom portion can be modified so that at least a part thereof has cell adhesiveness by various treatments commonly used in the art. .. In the cell handling container of this aspect, at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom may be imparted with cell adhesion by a hydrophilic treatment or a coating treatment with a cell adhesive agent. It is more preferably imparted by hydrophilic treatment. By imparting cell adhesiveness to at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom by the treatment, during the formation of the cell structure using the cell handling container of the present embodiment and/or Later, the contraction of cells forming the cell structure can be substantially suppressed.
本明細書において、「親水性」は、基材の表面が水に対して高い親和性を有する物理化学的性質を意味する。また、本明細書において、「親水化処理」は、基材の表面を親水性に改変する処理を意味し、特に、基材の表面にヒドロキシル基又はカルボニル基等の親水性官能基を導入する化学反応を意味する。基材の表面の親水性は、限定するものではないが、例えば、常温（例えば23℃）における該材料の表面の水接触角を測定することにより、決定することができる。材料の表面が親水性である場合、該材料の表面の水接触角は、通常は120°以下であり、例えば90°以下であり、特に70°以下、とりわけ50°以下である。また、材料の表面の水接触角は、通常は30°以上であり、例えば40°以上である。当該技術分野において、接着性の細胞を培養する場合、細胞培養に使用する基材の表面は、一定の親水性を有する必要があることが知られている。親水性の基材の表面で接着性の細胞を培養することにより、細胞から分泌される接着分子と基材の表面の親水性官能基とが相互作用して、基材の表面に細胞が接着し得る。本態様の細胞取扱容器において、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の細胞接着性が親水化処理によって付与される場合、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の常温（例えば23℃）における水接触角は、120°以下であることが好ましく、90°以下であることがより好ましく、70°以下であることがさらに好ましく、50°以下であることが特に好ましい。また、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の常温（例えば23℃）における水接触角は、30°以上であることが好ましく、40°以上であることがより好ましい。前記範囲内の水接触角を有するように、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部が親水化処理されることにより、本態様の細胞取扱容器を用いる細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 As used herein, "hydrophilic" means a physicochemical property that the surface of the substrate has a high affinity for water. Further, in the present specification, the “hydrophilization treatment” means a treatment for modifying the surface of the base material to be hydrophilic, and particularly, a hydrophilic functional group such as a hydroxyl group or a carbonyl group is introduced on the surface of the base material. Means a chemical reaction. The hydrophilicity of the surface of the base material is not limited, but can be determined, for example, by measuring the water contact angle of the surface of the material at room temperature (for example, 23° C.). If the surface of the material is hydrophilic, the water contact angle of the surface of the material is usually 120° or less, for example 90° or less, especially 70° or less, especially 50° or less. The water contact angle of the surface of the material is usually 30° or more, for example 40° or more. It is known in the art that, when culturing adherent cells, the surface of the substrate used for cell culture needs to have a certain hydrophilicity. By culturing the adhesive cells on the surface of the hydrophilic substrate, the adhesion molecules secreted from the cells interact with the hydrophilic functional groups on the surface of the substrate, and the cells adhere to the surface of the substrate. You can In the cell handling container of this embodiment, at least a part of the inner surface of the side wall and at least a part of the inner surface of the side wall and, if necessary, at least a part of the inner surface of the bottom are provided with the cell adhesiveness by the hydrophilization treatment. In some cases, at least part of the inner surface of the bottom has a water contact angle at room temperature (for example, 23° C.) of preferably 120° or less, more preferably 90° or less, and further preferably 70° or less. It is preferably 50° or less, and particularly preferably 50° or less. Further, the water contact angle of at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom portion at room temperature (for example, 23° C.) is preferably 30° or more, and 40° or more. More preferable. A cell structure using the cell handling container of the present embodiment, by hydrophilizing at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom so as to have a water contact angle within the above range. During and/or after formation of the body, contraction of cells forming the cell structure can be substantially suppressed.
本態様の細胞取扱容器において、親水化処理は、プラズマ処理、紫外線（UV）照射処理、電子線（EB）照射処理、親水性ポリマーの重合処理、及び刺激応答性ポリマーの重合処理からなる群より選択される１種以上の処理であることが好ましく、プラズマ処理又はUV照射処理であることがより好ましい。プラズマ処理又はUV照射処理によって親水化処理する場合、長期に亘って親水化処理の効果を持続し得る。前記処理によって親水化処理を実施する場合、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の、常温（例えば23℃）における水接触角が、前記で例示した範囲内となるように各処理を実施することが好ましい。前記処理によって側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部が親水化処理されることにより、本態様の細胞取扱容器を用いる細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In the cell handling container of the present aspect, the hydrophilic treatment is selected from the group consisting of plasma treatment, ultraviolet (UV) irradiation treatment, electron beam (EB) irradiation treatment, hydrophilic polymer polymerization treatment, and stimulus-responsive polymer polymerization treatment. The treatment is preferably one or more types selected, and more preferably plasma treatment or UV irradiation treatment. When the hydrophilic treatment is performed by plasma treatment or UV irradiation treatment, the effect of the hydrophilic treatment can be maintained for a long period of time. When the hydrophilic treatment is carried out by the above treatment, the water contact angle at room temperature (for example, 23° C.) of at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom is within the range exemplified above. It is preferable to carry out each treatment so that During and/or after the formation of the cell structure using the cell handling container of the present embodiment, at least part of the inner surface of the side wall and optionally at least part of the inner surface of the bottom part are hydrophilized by the treatment. In, the contraction of cells forming the cell structure can be substantially suppressed.
プラズマ処理としては、不活性ガスを用いたプラズマ処理を挙げることができる。不活性ガスとしては、ヘリウム（He）、ネオン（Ne）、アルゴン（Ar）及びキセノン（Xe）等の希ガス、窒素（N2）、並びに酸素（O2）等を挙げることができる。長期に亘って親水化処理の効果を持続し得ることから、酸素ガス又はアルゴンガスを用いたプラズマ処理が好ましい。また、プラズマ処理に起因する表面の劣化（例えば、分解又はエッチング等）を実質的に抑制し得ることから、大気圧下で発生させる低温プラズマ処理が好ましい。 Examples of plasma treatment include plasma treatment using an inert gas. Examples of the inert gas include rare gases such as helium (He), neon (Ne), argon (Ar), and xenon (Xe), nitrogen (N 2 ), oxygen (O 2 ), and the like. Plasma treatment using oxygen gas or argon gas is preferable because the effect of the hydrophilic treatment can be maintained for a long period of time. Further, the low-temperature plasma treatment generated under atmospheric pressure is preferable because deterioration of the surface (for example, decomposition or etching) due to the plasma treatment can be substantially suppressed.
真空下でプラズマ処理する場合、真空下でのプラズマ発生時の圧力は、1 Pa以下であることが好ましく、また、0.2 Pa以上であることが好ましく、0.4 Pa以上であることがより好ましい。プラズマ発生時のガス総流量は、特に限定されず、通常は5〜50 ml/分の範囲であり、例えば10〜30 ml/分の範囲である。前記範囲内のガス流量でプラズマ処理することにより、プラズマ発生時の圧力の変動を実質的に抑制することができる。プラズマの照射時間は、10分間以下であることが好ましく、5分間以下であることがより好ましく、1分間以下であることがさらに好ましい。また、プラズマの照射時間は、2秒間以上であることが好ましく、10秒間以上であることがより好ましい。プラズマの照射時間が前記下限値未満の場合、プラズマ処理の効果が十分に得られない可能性がある。プラズマの発生のために付与される電力は、100 W以上であることが好ましく、200 W以上であることがより好ましく、300 W以上であることがさらに好ましい。また、プラズマの発生のために付与される電力は、500 W以下であることが好ましい。前記範囲内の電力でプラズマを発生させることにより、プラズマの変動を実質的に抑制することができる。 When plasma treatment is performed under vacuum, the pressure at which plasma is generated under vacuum is preferably 1 Pa or lower, more preferably 0.2 Pa or higher, and even more preferably 0.4 Pa or higher. The total gas flow rate at the time of plasma generation is not particularly limited and is usually in the range of 5 to 50 ml/min, for example, in the range of 10 to 30 ml/min. By performing the plasma treatment with the gas flow rate within the above range, it is possible to substantially suppress the fluctuation of the pressure when the plasma is generated. The plasma irradiation time is preferably 10 minutes or less, more preferably 5 minutes or less, and further preferably 1 minute or less. The plasma irradiation time is preferably 2 seconds or more, more preferably 10 seconds or more. If the plasma irradiation time is less than the lower limit value, the effect of plasma treatment may not be sufficiently obtained. The electric power applied to generate plasma is preferably 100 W or more, more preferably 200 W or more, and further preferably 300 W or more. Further, the electric power applied to generate plasma is preferably 500 W or less. By generating the plasma with the electric power within the above range, the fluctuation of the plasma can be substantially suppressed.
大気圧下でプラズマ処理する場合、プラズマ発生時のガス総流量は、特に限定されず、例えばアルゴンガスを使用する場合、通常は1〜10 L/分の範囲であり、例えば3〜7 L/分の範囲である。前記範囲内のガス流量でプラズマ処理することにより、プラズマ発生時の圧力の変動を実質的に抑制することができる。プラズマの照射時間は、10分間以下であることが好ましく、5分間以下であることがより好ましく、1分間以下であることがさらに好ましい。また、プラズマの照射時間は、2秒間以上であることが好ましく、10秒間以上であることがより好ましい。前記範囲内の照射時間でプラズマ処理することにより、プラズマ処理による親水化処理を確実に実施することができる。 When performing plasma treatment under atmospheric pressure, the total gas flow rate during plasma generation is not particularly limited, and for example, when using argon gas, it is usually in the range of 1 to 10 L/min, for example, 3 to 7 L/min. It is in the range of minutes. By performing the plasma treatment with the gas flow rate within the above range, it is possible to substantially suppress the fluctuation of the pressure when the plasma is generated. The plasma irradiation time is preferably 10 minutes or less, more preferably 5 minutes or less, and further preferably 1 minute or less. The plasma irradiation time is preferably 2 seconds or more, more preferably 10 seconds or more. By performing the plasma treatment for the irradiation time within the above range, the hydrophilic treatment by the plasma treatment can be surely performed.
親水性ポリマーの重合処理としては、例えば、炭素成分を含み、且つポリマーの主鎖又は側鎖に親水性の官能基を含むポリマー、特に、水溶性又は水膨潤性を有する、炭素−酸素結合を含む水溶性ポリマーのような親水性ポリマーの重合処理を挙げることができる。親水性ポリマーとしては、限定するものではないが、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、ポリ（メタ）アクリルアミド、及びポリ-N-イソプロピルアクリルアミド等のヒドロゲルポリマー、並びにこれらと他のモノマーとの共重合体又はグラフト重合体等を挙げることができる。様々な分子量の製品が市販されており、且つ生体適合性に優れることから、ポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、限定するものではないが、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、及びエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー等を挙げることができ、PEGが好ましい。 Examples of the polymerization treatment of the hydrophilic polymer include, for example, a polymer containing a carbon component and a hydrophilic functional group in the main chain or side chain of the polymer, particularly a water-soluble or water-swellable carbon-oxygen bond. Polymerization treatment of a hydrophilic polymer such as a water-soluble polymer may be mentioned. Examples of the hydrophilic polymer include, but are not limited to, polyalkylene glycol, polyvinylpyrrolidone, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, polyethyleneimine, polyallylamine, polyvinylamine, polyvinyl acetate, polyacrylic acid, poly(meth)acrylamide. , And hydrogel polymers such as poly-N-isopropylacrylamide, and copolymers or graft polymers of these with other monomers. Polyalkylene glycols are preferable because products of various molecular weights are commercially available and they are excellent in biocompatibility. Examples of the polyalkylene glycol include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, and a copolymer of ethylene glycol and propylene glycol. PEG is preferable.
本明細書において、「刺激応答性ポリマー」は、温度、光又はpH等の所定の刺激に応答して物理化学的性質が変化するポリマーを意味する。刺激応答性高分子における物理化学的性質の変化は、以下のように説明することができる。但し、本発明の各態様の作用効果は、以下の説明に制限されるものではない。例えば、温度応答性ポリマーの温度を特定の温度未満に変化させることにより、該温度応答性ポリマーの周囲の水分子に対する親和性、すなわち親水性が向上する。これにより、温度応答性ポリマーは、水分子を取り込んで膨張し得る。膨張した温度応答性ポリマーは、該ポリマー間の網目構造が粗となるため、その表面に細胞が接着し難くなる。これに対し、温度応答性ポリマーの温度を特定の温度以上に変化させることにより、該ポリマーの周囲の親水性が低下する。これにより、温度応答性ポリマーは、取り込んでいる水分子を放出して収縮し得る。収縮した温度応答性ポリマーは、該ポリマー間の網目構造が密となるため、その表面に細胞が接着し易くなる。本明細書において、温度応答性ポリマーにおける前記のような変化の閾値となる温度を、「下限臨界溶解温度（Tc）」と記載する。 As used herein, a “stimulus-responsive polymer” means a polymer whose physicochemical properties change in response to a predetermined stimulus such as temperature, light or pH. Changes in physicochemical properties in stimuli-responsive polymers can be explained as follows. However, the function and effect of each aspect of the present invention are not limited to the following description. For example, by changing the temperature of the temperature-responsive polymer below a specific temperature, the affinity of the temperature-responsive polymer for water molecules around it, that is, the hydrophilicity, is improved. This allows the temperature responsive polymer to take up water molecules and expand. In the expanded temperature-responsive polymer, the network structure between the polymers becomes rough, so that it becomes difficult for cells to adhere to the surface thereof. On the other hand, by changing the temperature of the temperature responsive polymer to a certain temperature or higher, the hydrophilicity around the polymer decreases. This allows the temperature responsive polymer to release entrapped water molecules and contract. In the contracted temperature-responsive polymer, the network structure between the polymers becomes dense, so that cells easily adhere to the surface thereof. In the present specification, the temperature which becomes the threshold value of the above-mentioned change in the temperature responsive polymer is described as "lower limit critical solution temperature ( Tc )".
本発明の各態様において、温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度（Tc）は、細胞培養に通常適用される温度範囲内であることが好ましい。例えば、Tcは、5〜40℃の範囲であることが好ましく、10〜37℃の範囲であることがより好ましく、20〜35℃の範囲であることがさらに好ましい。前記範囲のTcを有する温度応答性ポリマーを用いて重合処理する場合、本態様の細胞取扱容器を用いて細胞を培養する際に、細胞の損傷を可能な限り少なくすることができる。 In each aspect of the present invention, the lower critical solution temperature (T c ) of the temperature-responsive polymer is preferably within the temperature range normally applied to cell culture. For example, T c is preferably in the range of 5 to 40°C, more preferably in the range of 10 to 37°C, and even more preferably in the range of 20 to 35°C. When the polymerization treatment is performed using the temperature-responsive polymer having a T c in the above range, cell damage can be minimized when the cells are cultured using the cell handling container of the present embodiment.
温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマー及びメタクリル系ポリマーを挙げることができ、例えば、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAAm）（Tc=32℃）、ポリ-N-n-プロピルアクリルアミド（Tc=21℃）、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド（Tc=32℃）、ポリ-N-エトキシエチルアクリルアミド（Tc=約35℃）、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Tc=約28℃）、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Tc=約35℃）及びポリ-N,N-ジエチルアクリルアミド（Tc=32℃）等を挙げることができる。温度応答性ポリマーは、前記ポリマーを形成し得るモノマーの2種以上を共重合させることによって形成される共重合体であってもよい。温度応答性ポリマーは、PNIPAAm、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド又はポリ-N,N-ジエチルアクリルアミドであることが好ましく、PNIPAAmであることがより好ましい。前記で例示した温度応答性ポリマーは、前記で説明した好ましい範囲のTcを有する。それ故、前記温度応答性ポリマーを用いて重合処理する場合、本態様の細胞取扱容器を用いて細胞を培養する際に、細胞の損傷を可能な限り少なくすることができる。 Examples of the temperature responsive polymer include acrylic polymers and methacrylic polymers, and examples thereof include poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm) (T c =32°C) and poly-Nn-propyl acrylamide (T c =21 ℃), poly-Nn-propylmethacrylamide (T c = 32 ℃), poly-N-ethoxyethyl acrylamide (T c = about 35 ℃), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (T c = about 28 ℃), Examples thereof include poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T c =about 35° C.) and poly-N,N-diethyl acrylamide (T c =32° C.). The temperature responsive polymer may be a copolymer formed by copolymerizing two or more kinds of monomers capable of forming the polymer. The temperature responsive polymer is preferably PNIPAAm, poly-Nn-propylmethacrylamide or poly-N,N-diethylacrylamide, more preferably PNIPAAm. The temperature-responsive polymers exemplified above have Tc in the preferable range described above. Therefore, in the case where the temperature-responsive polymer is used for the polymerization treatment, damage to the cells can be minimized when the cells are cultured using the cell handling container of this embodiment.
温度応答性ポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることが好ましい。前記モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、N-（若しくはN,N-ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体及びビニルエーテル誘導体等を挙げることができる。前記モノマーを単独で使用して重合する場合、得られる温度応答性ポリマーはホモポリマーの形態となり、前記モノマーの2種以上を使用して共重合する場合、得られる温度応答性ポリマーは共重合体（コポリマー又はヘテロポリマー）の形態となる。いずれの形態の温度応答性ポリマーであっても、本態様の細胞取扱容器に使用することができる。 As the monomer for forming the temperature responsive polymer, it is preferable to use a monomer that can be polymerized by irradiation with radiation. Examples of the monomer include (meth)acrylamide compounds, N-(or N,N-di)alkyl-substituted (meth)acrylamide derivatives, (meth)acrylamide derivatives having a cyclic group, and vinyl ether derivatives. When the monomers are used alone to polymerize, the resulting temperature responsive polymer is in the form of a homopolymer, and when the monomers are copolymerized using two or more of the monomers, the resulting temperature responsive polymer is a copolymer. (Copolymer or heteropolymer). Any form of temperature-responsive polymer can be used in the cell handling container of the present embodiment.
前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した1種以上のモノマーと、前記以外のさらなるモノマーとを共重合することによって形成される共重合体であってもよい。或いは、前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した1種以上のモノマーを重合又は共重合することによって形成される重合体又は共重合体と、さらなる重合体又は共重合体とをグラフト重合又はブロック重合することによって形成される、グラフト共重合体又はブロック共重合体であってもよい。或いは、前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した1種以上の重合体又は共重合体の混合物の形態であってもよい。これらの形態の場合、使用される材料を適宜選択することにより、Tcを所望の範囲に調整することができる。 The temperature responsive polymer may be a copolymer formed by copolymerizing one or more kinds of the monomers described above and a further monomer other than the above. Alternatively, the temperature responsive polymer is a polymer or copolymer formed by polymerizing or copolymerizing one or more kinds of the monomers described above, and a further polymer or copolymer by graft polymerization or block. It may be a graft copolymer or a block copolymer formed by polymerization. Alternatively, the temperature responsive polymer may be in the form of a mixture of one or more polymers or copolymers described above. In the case of these forms, T c can be adjusted to a desired range by appropriately selecting the material used.
本態様の細胞取扱容器において、細胞接着性薬剤のコーティング処理は、細胞接着分子（例えば、フィブロネクチン及びコラーゲン）、及び正電荷を有する分子（例えば、ポリエチレンイミン）からなる群より選択される1種以上の処理であることが好ましい。フィブロネクチン及びコラーゲンのような細胞接着分子をコーティングすることにより、該細胞接着分子を介して細胞と結合させることができる。また、ポリエチレンイミンのような正電荷を有する分子をコーティングすることにより、側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部の表面を正に帯電させ、通常は負に帯電している細胞の表面と静電的に結合させることができる。それ故、前記細胞接着性薬剤によって側壁の内表面の少なくとも一部及び場合により底部の内表面の少なくとも一部がコーティング処理されることにより、本態様の細胞取扱容器を用いる細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In the cell handling container of this embodiment, the coating treatment with the cell adhesive agent is one or more selected from the group consisting of cell adhesion molecules (eg, fibronectin and collagen) and molecules having a positive charge (eg, polyethyleneimine). It is preferable that the treatment is A cell adhesion molecule such as fibronectin and collagen can be coated to bind to cells via the cell adhesion molecule. Further, by coating a molecule having a positive charge such as polyethyleneimine, at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom part are positively charged, and usually negatively charged. It can be electrostatically bound to the surface of living cells. Therefore, at least a part of the inner surface of the side wall and optionally at least a part of the inner surface of the bottom portion are coated with the cell adhesive agent to form a cell structure using the cell handling container of the present embodiment. Between and/or after, contraction of cells forming the cell structure can be substantially suppressed.
＜2. 細胞構造体の作製方法＞
本発明の一態様の細胞取扱容器を用いて細胞構造体を形成することにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。それ故、本発明の別の一態様は、細胞構造体の作製方法に関する。
<2. Method for producing cell structure>
By forming a cell structure using the cell handling container of one embodiment of the present invention, substantially suppressing contraction of cells forming the cell structure during and/or after formation of the cell structure. You can Therefore, another aspect of the present invention relates to a method for producing a cell structure.
本態様の細胞構造体の作製方法は、細胞構造体形成工程を含む。また、本態様の細胞構造体の作製方法は、場合により細胞構造体剥離工程を含む。本態様の方法に含まれる各工程について、以下において詳細に説明する。 The method for producing a cell structure according to this embodiment includes a cell structure forming step. In addition, the method for producing a cell structure of the present embodiment optionally includes a cell structure peeling step. Each step included in the method of this embodiment will be described in detail below.
［2-1. 細胞構造体形成工程］
本態様の方法は、本発明の一態様の細胞取扱容器の細胞収容部で細胞を培養して、底部の内表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程を含む。
[2-1. Cell structure forming step]
The method of the present aspect includes a cell structure forming step of culturing cells in the cell containing portion of the cell handling container of the present invention to form a cell structure on the inner surface of the bottom.
本工程において、底部の外縁部と側壁の下端部との接続部の領域を超える厚さまで細胞構造体を形成させることが好ましい。この場合、形成される細胞構造体の厚さは、細胞の種類、細胞構造体の用途、及び使用される本発明の一態様の細胞取扱容器における接続部の高さ等に基づき所望の範囲に設定することができる。例えば、形成される細胞構造体の厚さは、10 μm以上であることが好ましく、20 μm以上であることがより好ましく、40 μm以上であることがさらに好ましい。例えば、形成される細胞構造体の厚さは、200 μm以下であることが好ましく、100 μm以下であることがより好ましく、80 μm以下であることがさらに好ましい。例えば、形成される細胞構造体の厚さは、10〜200 μmの範囲であることが好ましく、20〜100 μmの範囲であることがより好ましく、40〜80 μmの範囲であることがさらに好ましい。本工程において、前記範囲内の厚さまで細胞構造体を形成させることにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 In this step, it is preferable to form the cell structure to a thickness exceeding the region of the connection between the outer edge of the bottom and the lower end of the side wall. In this case, the thickness of the cell structure to be formed is within a desired range based on the type of cell, the application of the cell structure, the height of the connection portion in the cell handling container of one embodiment of the present invention used, and the like. Can be set. For example, the thickness of the cell structure formed is preferably 10 μm or more, more preferably 20 μm or more, still more preferably 40 μm or more. For example, the thickness of the cell structure formed is preferably 200 μm or less, more preferably 100 μm or less, and further preferably 80 μm or less. For example, the thickness of the cell structure formed is preferably in the range of 10 to 200 μm, more preferably in the range of 20 to 100 μm, and even more preferably in the range of 40 to 80 μm. .. In this step, by forming the cell structure to a thickness within the above range, it is possible to substantially suppress the contraction of cells forming the cell structure during and/or after the formation of the cell structure. ..
本工程において、本発明の一態様の細胞取扱容器の細胞収容部で細胞を培養する条件、例えば、培地の種類及び外部環境（例えば、温度、湿度、光周期又はCO2濃度）等は、使用される細胞の種類に基づき、当該技術分野で通常使用される培養条件を適宜適用することができる。 In this step, the conditions for culturing the cells in the cell accommodation part of the cell handling container of one aspect of the present invention, such as the type of medium and the external environment (for example, temperature, humidity, photoperiod or CO 2 concentration), etc. are used. Based on the type of cells to be used, culture conditions usually used in the art can be appropriately applied.
前記条件で本工程を実施することにより、本発明の一態様の細胞取扱容器の底部の内表面に、所望の細胞構造体を形成させることができる。本工程において、本発明の一態様の細胞取扱容器を用いて細胞構造体を形成させることにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。 By carrying out this step under the above conditions, a desired cell structure can be formed on the inner surface of the bottom of the cell handling container of one embodiment of the present invention. In this step, by forming the cell structure using the cell handling container of one embodiment of the present invention, the contraction of the cells forming the cell structure is substantially reduced during and/or after the formation of the cell structure. Can be suppressed to.
［2-2. 細胞構造体形成工程］
本態様の方法は、場合により、形成された細胞構造体を、本発明の一態様の細胞取扱容器の細胞収容部の表面から剥離させる、細胞構造体剥離工程を含む。
[2-2. Cell structure formation step]
The method of the present aspect optionally includes a cell structure detaching step of detaching the formed cell structure from the surface of the cell containing portion of the cell handling container of the aspect of the present invention.
本工程において、形成された細胞構造体を細胞収容部の表面から剥離させる手段は特に限定されず、当該技術分野で通常使用される各種の手段から適宜選択することができる。剥離手段としては、限定するものではないが、例えば、物理的刺激の付与（例えば、水流の接触）、刺激応答性ポリマーに対する刺激の付与（例えば、温度変化、pH変化）、並びに酵素等による接着タンパク質の分解（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、ディスパーゼ、エラスターゼ、及びヒアルロニダーゼ等のタンパク質分解酵素）を挙げることができる。前記手段を用いることにより、形成された細胞構造体に実質的な損傷を生じることなく、該細胞構造体を細胞収容部の表面から剥離させることができる。 In this step, the means for peeling the formed cell structure from the surface of the cell containing portion is not particularly limited and can be appropriately selected from various means commonly used in the art. The peeling means includes, but is not limited to, physical stimulus (eg, contact with water stream), stimulus to the stimuli-responsive polymer (eg, temperature change, pH change), and adhesion by enzyme or the like. Examples thereof include protein degradation (for example, proteolytic enzymes such as trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, dispase, elastase, and hyaluronidase). By using the above means, the cell structure can be peeled from the surface of the cell containing portion without causing substantial damage to the formed cell structure.
以上、詳細に説明したように、本発明の一態様の細胞取扱容器を用いることにより、細胞構造体の形成の間及び／又は後において、細胞構造体を形成する細胞の収縮を実質的に抑制することができる。それ故、本発明の一態様の細胞構造体の作製方法により、細胞構造体の観察及び評価において、定量的及び／又は定性的な観点で正確な結果を得ることができる。 As described above in detail, by using the cell handling container of one embodiment of the present invention, the contraction of cells forming the cell structure is substantially suppressed during and/or after the formation of the cell structure. can do. Therefore, according to the method for producing a cell structure of one embodiment of the present invention, accurate results can be obtained from a quantitative and/or qualitative viewpoint in observation and evaluation of the cell structure.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
＜I：細胞構造体の作製＞
下記表1に記載の特徴を有する円形ディッシュ型（直径：3.5 cm）のジメチルポリシロキサン（PDMS）製容器を準備した。これらの容器の側壁の内表面及び底部の内表面の全体を、大気中でUV照射して、側壁の内表面及び底部の内表面を親水化した（UV照射条件、照射時間：1分間、波長：184.9 nm・253.7 nm、照射装置：ASM1101N（あすみ技研））。これらの容器に、マウス筋芽細胞（C2C12）を、1×106細胞/cm2の細胞密度で播種し、37℃の温度で培養して、約150 μmの厚さの細胞シートを形成させた。1日間培養後、細胞シートを観察して、細胞の収縮による、容器の側壁からの細胞シートの剥離の発生の有無を確認した。
<I: Preparation of cell structure>
A circular dish type (diameter: 3.5 cm) dimethylpolysiloxane (PDMS) container having the characteristics described in Table 1 below was prepared. The entire inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom of these containers were irradiated with UV in the atmosphere to make the inner surface of the side wall and the inner surface of the bottom hydrophilic (UV irradiation condition, irradiation time: 1 minute, wavelength. : 184.9 nm・253.7 nm, Irradiator: ASM1101N (Asumi Giken). Mouse myoblasts (C2C12) were seeded in these vessels at a cell density of 1×10 6 cells/cm 2 and cultured at a temperature of 37° C. to form a cell sheet with a thickness of approximately 150 μm. It was After culturing for 1 day, the cell sheet was observed to confirm whether or not peeling of the cell sheet from the side wall of the container occurred due to contraction of cells.
各試験について、試料の総数に対する剥離が確認されなかった試料の数の百分率を、細胞保持率（％）とした。各試験における剥離の発生数及び細胞保持率の結果を表2に示す。 For each test, the cell retention rate (%) was defined as the percentage of the number of samples in which peeling was not confirmed with respect to the total number of samples. Table 2 shows the results of the number of exfoliations and the cell retention rate in each test.
なお、本発明は、前記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加、削除及び／又は置換をすることが可能である。 It should be noted that the present invention is not limited to the above-described embodiments, but includes various modifications. For example, the above-described embodiments have been described in detail in order to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and are not necessarily limited to those having all the configurations described. Further, it is possible to add, delete, and/or replace another configuration with respect to a part of the configuration of each embodiment.
1…本発明の一態様の細胞取扱容器
11…底部
12…側壁
13…細胞収容部
14…側壁の細胞収容部に面する側の表面（側壁の内表面）
15…底部の細胞収容部に面する側の表面（底部の内表面）
16…底部の外縁部と側壁の下端部との接続部
17…保持部
H0…接続部の高さ
1... Cell handling container of one embodiment of the present invention
11...bottom
12... Side wall
13... Cell housing
14…Surface on the side of the side wall that faces the cell housing (inner surface of the side wall)
15... Surface on the side facing the cell containing part of the bottom (inner surface of the bottom)
16... Connection between the outer edge of the bottom and the bottom of the side wall
17...Holding part
H 0 …Height of connecting part
Claims (15)
を含む、細胞構造体の作製方法。 Cell structure formation by culturing cells in the cell containing part of the cell handling container according to any one of claims 1 to 13 to form a cell structure on the surface of the bottom facing the cell containing part. Process;
A method for producing a cell structure, comprising:
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- 2018-11-26 JP JP2018220035A patent/JP2020080722A/en active Pending
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