JP6229503B2 - Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing the same - Google Patents
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本発明は、温度応答性を有する細胞培養基材およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a cell culture substrate having temperature responsiveness and a method for producing the same.
再生医療では細胞をシート状に加工した細胞シートによる治療が行われている。細胞培養基材を用いて培養された細胞を剥離させるためには、酵素処理のような方法で接着性タンパク質を破壊する必要があった。その際、結合していた細胞同士は離れてしまうという課題があった。これに対し、温度応答性を有する細胞培養基材を用いて細胞を培養した場合、低損傷で細胞を剥離させることが可能である。 In regenerative medicine, treatment with a cell sheet obtained by processing cells into a sheet shape is performed. In order to peel cells cultured using a cell culture substrate, it was necessary to destroy the adhesive protein by a method such as enzyme treatment. At that time, there was a problem that the cells that were bound to each other were separated. On the other hand, when cells are cultured using a cell culture substrate having temperature responsiveness, the cells can be detached with low damage.
特許文献１では、細胞培養基材に温度応答性ポリマーの原料であるモノマー水溶液を塗布し、放射線照射によって基材表面に温度応答性ポリマーを固定化している。この方法は、放射線重合で製造することで開始剤の添加が不要になっている点では優れているが、現在汎用的に使われている温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのモノマーには神経毒性があるため製造環境の安全性担保が難しくなるという問題点がある。 In Patent Document 1, a monomer aqueous solution that is a raw material of a temperature-responsive polymer is applied to a cell culture substrate, and the temperature-responsive polymer is immobilized on the surface of the substrate by irradiation with radiation. This method is excellent in that it does not require addition of an initiator by being produced by radiation polymerization, but it is a monomer of poly-N-isopropylacrylamide, which is a temperature-responsive polymer currently used for general purposes. Has a problem that it is difficult to guarantee the safety of the manufacturing environment because of its neurotoxicity.
特許文献２では、基板に架橋性重合開始剤を塗工して重合開始層を形成した後に、アミド基と重合性基を含む化合物を接触させて温度応答性ポリマー層を形成させている。この方法では、重合開始層にエステル結合を有する化合物が使われている場合、加水分解によって温度応答性ポリマーが基材表面から消失する可能性がある。また、重合開始層を塗布する分、工程が増えてしまう問題がある。 In Patent Document 2, a crosslinkable polymerization initiator is applied to a substrate to form a polymerization initiation layer, and then a compound containing an amide group and a polymerizable group is contacted to form a temperature-responsive polymer layer. In this method, when a compound having an ester bond is used in the polymerization initiation layer, the temperature-responsive polymer may disappear from the substrate surface by hydrolysis. In addition, there is a problem that the number of steps increases as the polymerization initiation layer is applied.
特許文献３では、細胞培養基材上にアクリル酸エステル系モノマーと無機材料の複合体の層を形成し、その表面に開始剤層を塗布した後、温度応答性ポリマーの原料であるモノマーの水溶液を塗布してＵＶを照射し、温度応答性ポリマー層を固定化している。この方法では、アクリル酸エステル系モノマーと無機材料の複合体が加水分解を起こし、細胞培養基材上から温度応答性ポリマーが消失する可能性がある。また、細胞培養基材上に温度応答性ポリマー層を固定化するための前段階の工程が煩雑であり、毒性の高いモノマーを使用しているため製造環境の安全性の確保が課題であった。 In Patent Document 3, a layer of a complex of an acrylate monomer and an inorganic material is formed on a cell culture substrate, an initiator layer is applied to the surface, and then an aqueous solution of a monomer that is a raw material for a temperature-responsive polymer Is applied and irradiated with UV to immobilize the temperature-responsive polymer layer. In this method, a complex of an acrylate ester monomer and an inorganic material may be hydrolyzed, and the temperature-responsive polymer may disappear from the cell culture substrate. In addition, the previous steps for immobilizing the temperature-responsive polymer layer on the cell culture substrate are complicated, and the use of highly toxic monomers has made it difficult to ensure the safety of the production environment. .
本発明者は、モノマーの重合による温度応答性ポリマー層の形成方法は効率的である一方で、部位によりモノマーの重合度が異なる場合や、基材間でモノマーの重合度が異なる場合があり、温度応答性等の品質にばらつきが生じるという問題があることを見出した。一方、あらかじめ重合させておいた温度応答性ポリマーはモノマーの二重結合に相当するような反応性官能基が残存していないため、電子線照射のみでは基材への充分な固定化が困難であるという課題があった。 The present inventor, while the method of forming a temperature-responsive polymer layer by polymerization of the monomer is efficient, the degree of polymerization of the monomer differs depending on the site, the degree of polymerization of the monomer may be different between the substrates, It has been found that there is a problem that the quality such as temperature responsiveness varies. On the other hand, since the temperature-responsive polymer that has been polymerized in advance does not have reactive functional groups corresponding to the double bonds of the monomers, it is difficult to sufficiently fix the substrate to the substrate only by electron beam irradiation. There was a problem that there was.
そこで本発明は、細胞培養基材の製造方法において、品質のばらつきと製造上の毒性の課題を解決し、かつ基材への温度応答性ポリマーの固定化を安定的に行う方法を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention provides a method for solving a problem of quality variation and production toxicity in a method for producing a cell culture substrate and stably immobilizing a temperature-responsive polymer on the substrate. With the goal.
本発明者は、温度応答性ポリマーと、ビスアクリルアミド系架橋剤とを基材に配置し、放射線を照射して温度応答性ポリマーを基材に固定化する方法により、毒性のあるモノマーを用いることなく、また品質のばらつきなく、温度応答性ポリマーを長期にわたり安定的に基材に固定化できることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventor uses a toxic monomer by a method in which a temperature-responsive polymer and a bisacrylamide-based cross-linking agent are disposed on a base material, and the temperature-responsive polymer is immobilized on the base material by irradiation with radiation. Thus, the present inventors have found that a temperature-responsive polymer can be stably fixed to a substrate over a long period of time without any variation in quality.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法であって、
温度応答性ポリマーとビスアクリルアミド系架橋剤とを基材に配置する工程、および
基材に配置された温度応答性ポリマーと架橋剤に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程
を含む、前記方法。
（２）温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、（１）に記載の方法。
（３）ビスアクリルアミド系架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）細胞培養基材上に温度応答性層を形成するための、温度応答性ポリマーとビスアクリルアミド系架橋剤とを含む放射線重合性組成物。
（５）温度応答性ポリマーがビスアクリルアミド系架橋剤を介して基材上に固定化されてなる細胞培養基材。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for producing a cell culture substrate having temperature responsiveness,
The step of placing the temperature-responsive polymer and the bisacrylamide-based crosslinking agent on the substrate, and immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate by irradiating the temperature-responsive polymer and crosslinking agent placed on the substrate with radiation. The method comprising the steps of:
(2) The method according to (1), wherein the temperature-responsive polymer is poly-N-isopropylacrylamide.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the bisacrylamide-based crosslinking agent is N, N′-methylenebisacrylamide.
(4) A radiation-polymerizable composition comprising a temperature-responsive polymer and a bisacrylamide-based crosslinking agent for forming a temperature-responsive layer on a cell culture substrate.
(5) A cell culture substrate in which a temperature-responsive polymer is immobilized on a substrate via a bisacrylamide-based crosslinking agent.
本発明によれば、毒性の高いモノマーを使用しないため、製造上の安全性が高い。また、ビスアクリルアミド系架橋剤は化学的に安定な架橋構造を形成することができ、長期保存に適した安定な細胞培養基材を提供することが可能になる。 According to the present invention, since a highly toxic monomer is not used, production safety is high. In addition, the bisacrylamide-based crosslinking agent can form a chemically stable crosslinked structure, and can provide a stable cell culture substrate suitable for long-term storage.
本発明は、細胞を培養して細胞シートを形成し、これを非浸襲的に回収するのに好適な、温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法に関する。本発明の細胞培養基材の製造方法は、温度応答性ポリマーとビスアクリルアミド系架橋剤とを基材に配置する工程、および基材に配置された温度応答性ポリマーと架橋剤に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程を含む。 The present invention relates to a method for producing a temperature-responsive cell culture substrate suitable for culturing cells to form a cell sheet and collecting it noninvasively. The method for producing a cell culture substrate of the present invention includes a step of arranging a temperature-responsive polymer and a bisacrylamide-based crosslinking agent on a substrate, and irradiating the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent arranged on the substrate with radiation. A step of immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate.
本発明は温度応答性ポリマーを基材表面に固定化するためにエステル結合を有しない架橋剤を用いているため長期保存安定性に優れ、また、塗布工程が複数回に及ぶことはなく生産性が改善される。さらに、加水分解による温度応答性ポリマー層の消失を防ぐことができる。 The present invention uses a cross-linking agent that does not have an ester bond to immobilize the temperature-responsive polymer on the substrate surface, so it has excellent long-term storage stability, and the coating process does not take place multiple times. Is improved. Furthermore, disappearance of the temperature-responsive polymer layer due to hydrolysis can be prevented.
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞シートの回収時の温度下において親水性を示すものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞シートの回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞シートの回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞シートを細胞培養基材から分離させることで、細胞シートの回収をより一層容易にすることができる。特に所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。 The temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention is hydrophobic at the cell culture temperature (usually about 37 ° C.) and hydrophilic at the temperature at the time of recovering the cultured cell sheet. The temperature at which the temperature-responsive polymer changes from hydrophobic to hydrophilic (critical solution temperature in water (T)) is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of recovery of the cell sheet after culture, The temperature is preferably lower than the cell culture temperature. By including such a temperature-responsive polymer component, since cell scaffolds (cell adhesion surfaces) are sufficiently secured during cell culture, cell culture can be performed efficiently. On the other hand, at the time of collecting the cell sheet after culturing, the hydrophobic part is changed to hydrophilic, and the cultured cell sheet is separated from the cell culture substrate, thereby making it easier to collect the cell sheet. be able to. In particular, a temperature-responsive polymer that exhibits hydrophilicity at a temperature lower than a predetermined critical dissolution temperature and exhibits hydrophobicity at a temperature equal to or higher than the same temperature is preferable. The critical solution temperature in such a temperature-responsive polymer is particularly called the lower critical solution temperature.
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃であるポリマーが好ましい。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低いと、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適なポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。さらに、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。これらのポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは他のポリマーとの混合物を用いてもよい。 Specifically, the temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention is preferably a polymer having a lower critical solution temperature T of 0 to 80 ° C, preferably 0 to 50 ° C. If T exceeds 80 ° C., the cells may die, which is not preferable. If T is lower than 0 ° C., the cell growth rate is generally extremely reduced, or the cells are killed, which is not preferable. Such suitable polymers include acrylic polymers or methacrylic polymers. Specific suitable polymers include, for example, poly-N-isopropylacrylamide (T = 32 ° C.), poly-Nn-propyl acrylamide (T = 21 ° C.), poly-Nn-propyl methacrylamide (T = 32 ° C.), poly-N-ethoxyethyl acrylamide (T = about 35 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (T = about 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T = about 35 ° C.) ), And poly-N, N-diethylacrylamide (T = 32 ° C.). Furthermore, poly-N-ethylacrylamide, poly-N-isopropylmethacrylamide, poly-N-cyclopropylacrylamide, poly-N-cyclopropylmethacrylamide, poly-N-acryloylpyrrolidine, poly-N-acryloylpiperidine, polymethyl Examples include alkyl-substituted cellulose derivatives such as vinyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyalkylene oxide block copolymers represented by block copolymers of polypropylene oxide and polyethylene oxide, and polyalkylene oxide block copolymers. Can be mentioned. Graft or block copolymers of these polymers with other polymers, or mixtures with other polymers may be used.
温度応答性ポリマーの重量平均分子量は、特に制限されないが、１００万以下であることが好ましく、６０万以下であることがより好ましく、４０万以下であることが特に好ましく、かつ５０００以上であることが好ましい。分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、１〜６程度であることが好ましい。重量平均分子量が１００万を超えると粘度が著しく高くなるため、ポリマーの重合中の溶剤の撹拌や再沈殿などのポリマーの精製作業に支障がでる、あるいは希釈剤として用いる水や有機溶媒が多量に必要となる場合があり、また、重量平均分子量が５０００を下回ると耐水性や耐熱性が低下する場合がある。 The weight average molecular weight of the temperature-responsive polymer is not particularly limited, but is preferably 1,000,000 or less, more preferably 600,000 or less, particularly preferably 400,000 or less, and 5000 or more. Is preferred. The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) is preferably about 1 to 6. When the weight average molecular weight exceeds 1,000,000, the viscosity becomes extremely high, which may hinder the purification of the polymer such as stirring and reprecipitation of the solvent during polymerization of the polymer, or a large amount of water or organic solvent used as a diluent. It may be necessary, and when the weight average molecular weight is less than 5000, water resistance and heat resistance may be lowered.
温度応答性ポリマーは、分子量に応じてグラフト密度を調整することが好ましい。例えば、比較的分子量の小さいポリマーは密に固定化し、比較的分子量の大きいポリマーは疎に固定化することが好ましい。 The temperature-responsive polymer preferably adjusts the graft density according to the molecular weight. For example, it is preferable to fix a polymer having a relatively small molecular weight densely and to fix a polymer having a relatively large molecular weight loosely.
ビスアクリルアミド系架橋剤は、（メタ）アクリルアミド基を２つ有する２官能性架橋剤である。（メタ）アクリルアミド基には、アクリルアミド基とメタクリルアミド基が含まれる。ビスアクリルアミド系架橋剤の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−１，２−ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。特に、溶剤への溶解性の観点から、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが好ましい。３官能性以上の多官能性架橋剤では、架橋構造が複雑になりすぎて制御が難しい、基材に固定化された温度応答性ポリマー層が厚膜になる、もしくは密に固定化されるために細胞接着性が損なわれる、といった問題が生じる。一方、単官能性化合物を架橋剤として添加しても反応性が乏しく、十分な温度応答性ポリマーの固定化量が確保できない問題がある。そのため、架橋剤として用いる化合物は２官能性が望ましい。 The bisacrylamide-based crosslinking agent is a bifunctional crosslinking agent having two (meth) acrylamide groups. The (meth) acrylamide group includes an acrylamide group and a methacrylamide group. Specific examples of the bisacrylamide-based crosslinking agent include N, N′-methylenebisacrylamide, N, N′-methylenebismethacrylamide, N, N′-ethylenebisacrylamide, N, N′-ethylenebismethacrylamide, N , N′-1,2-dihydroxyethylenebisacrylamide, N, N′-hexamethylenebisacrylamide and the like. In particular, N, N′-methylenebisacrylamide is preferable from the viewpoint of solubility in a solvent. In the case of a polyfunctional cross-linking agent having three or more functionalities, the cross-linking structure is too complicated to control, and the temperature-responsive polymer layer fixed to the base material becomes thick or is fixed densely. In other words, cell adhesion is impaired. On the other hand, there is a problem that even when a monofunctional compound is added as a crosslinking agent, the reactivity is poor and a sufficient amount of immobilization of the temperature-responsive polymer cannot be ensured. Therefore, the compound used as the crosslinking agent is desirably bifunctional.
ビスアクリルアミド系架橋剤は、高エネルギー照射下でラジカルを形成することができ、放射線源にさらされるとフリーラジカルを発生し、架橋およびグラフトを達成する。ビスアクリルアミド系架橋剤を用いることにより、放射線照射により、架橋剤が、温度応答性ポリマーと基材の双方と共有結合を形成することができ、温度応答性ポリマーを基材に対し強固に固定化することができる。また、複数の分岐を持たない、より制御された表面を作製することが可能となる。 Bisacrylamide-based crosslinkers can form radicals under high energy irradiation, generate free radicals when exposed to a radiation source, and achieve crosslinking and grafting. By using a bisacrylamide-based cross-linking agent, the cross-linking agent can form a covalent bond with both the temperature-responsive polymer and the substrate by irradiation, and the temperature-responsive polymer is firmly fixed to the substrate. can do. It is also possible to produce a more controlled surface that does not have a plurality of branches.
ビスアクリルアミド系架橋剤は、エステル結合を持たず、加水分解に対して安定な架橋構造を形成することから、長期保存に適した安定な温度応答性ポリマー層を形成することができる。また、ビスアクリルアミド系架橋剤は低分子架橋剤であるため、長鎖の架橋剤に比べて反応性がゆるやかであり、良好な基材を製造するための濃度範囲を広く設定でき、製造管理がしやすくなる利点がある。これは、ポリエチレングリコールジアクリレートのような主鎖の長い架橋剤に比べると架橋反応の自由度が低いためである。 Since the bisacrylamide-based crosslinking agent does not have an ester bond and forms a crosslinked structure that is stable against hydrolysis, a stable temperature-responsive polymer layer suitable for long-term storage can be formed. In addition, since bisacrylamide-based cross-linking agents are low molecular cross-linking agents, their reactivity is moderate compared to long-chain cross-linking agents, and a wide concentration range can be set for manufacturing a good base material. There is an advantage that it becomes easy to do. This is because the degree of freedom of the crosslinking reaction is lower than that of a crosslinking agent having a long main chain such as polyethylene glycol diacrylate.
温度応答性ポリマーおよび架橋剤を基材に配置する工程においては、温度応答性ポリマーおよび架橋剤の混合物を調製して基材に配置してもよいし、温度応答性ポリマーと架橋剤をそれぞれ別々に基材に配置してもよい。別々に配置する場合は、同時に配置する必要はなく、例えば、架橋剤を基材に配置した後に、温度応答性ポリマーを重ねて配置してもよい。この場合、架橋剤と温度応答性ポリマーは、それぞれ好適な溶媒に溶解した上で基材に配置することが好ましい。架橋剤を基材に配置した後に、温度応答性ポリマーを重ねる場合では、架橋剤と温度応答性ポリマーの反応の場が界面に限定されてしまうため、温度応答性ポリマーおよび架橋剤を含む混合物としての放射線重合性組成物を調製し、基材に配置することが好ましい。放射線重合性組成物は、温度応答性ポリマーと、ビスアクリルアミド系架橋剤とを、好ましくは適当な溶媒に溶解することにより調製できる。 In the step of placing the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent on the substrate, a mixture of the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent may be prepared and placed on the substrate, or the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent may be separately provided. You may arrange | position to a base material. When arranging separately, it is not necessary to arrange simultaneously, for example, after arrange | positioning a crosslinking agent to a base material, you may arrange | position a temperature-responsive polymer in piles. In this case, it is preferable that the crosslinking agent and the temperature-responsive polymer are each dissolved in a suitable solvent and then disposed on the substrate. In the case where the temperature-responsive polymer is stacked after the cross-linking agent is arranged on the substrate, the reaction field of the cross-linking agent and the temperature-responsive polymer is limited to the interface, so that the mixture containing the temperature-responsive polymer and the cross-linking agent is used. It is preferable to prepare a radiation-polymerizable composition of and arrange on a substrate. The radiation-polymerizable composition can be prepared by dissolving a temperature-responsive polymer and a bisacrylamide-based crosslinking agent, preferably in an appropriate solvent.
温度応答性ポリマーおよび／または架橋剤を溶解する溶媒は、温度応答性ポリマーおよび／または架橋剤を溶解できるものであれば特に制限はないが、常庄下において沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、および水等が挙げられ、これらは組み合わせて使用してもよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン（もしくはジエチレン）グリコールまたはそのモノエチルエーテル等も使用可能であるが、好ましくはメタノール、エタノール、ｉ−プロパノールを用いる。メタノール、エタノール、ｉ−プロパノールは、基材として細胞培養に汎用されるポリスチレンを選択した場合において表面を侵さないため好ましい。必要であれば、上記溶液にはその他添加剤として、硫酸等で代表される酸類、モール塩等を配合してよい。 The solvent for dissolving the temperature-responsive polymer and / or the crosslinking agent is not particularly limited as long as it can dissolve the temperature-responsive polymer and / or the crosslinking agent. C. is preferred. Specific examples of preferred solvents include methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, 2-butanol, and water, and these may be used in combination. Other solvents such as 1-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 2-butoxyethanol, and ethylene (or diethylene) glycol or monoethyl ether thereof can be used, but preferably methanol, ethanol, i -Propanol is used. Methanol, ethanol, and i-propanol are preferable because they do not attack the surface when polystyrene, which is widely used for cell culture, is selected as the base material. If necessary, an acid represented by sulfuric acid or the like, a Mole salt, or the like may be added to the above solution as other additives.
放射線重合性組成物における温度応答性ポリマーの含有量は、好ましくは放射線照射の直前における濃度が４重量％以上、好ましくは６重量％以上であり、好ましくは１０重量％以下である。温度応答性ポリマーの含有量を４重量％以上とすることで、ポリマーのグラフト不足によって細胞が接着したものの剥離しない状況を回避でき、剥離性の良好な温度応答性ポリマー層を得ることができる。温度応答性ポリマーの含有量を１０重量％以下とすることで、ポリマーのグラフト過多による細胞の接着不良が生じるのを防止できる。すなわち、基材に塗布する放射線重合性組成物における温度応答性ポリマーの濃度を適切な範囲とすることで、適切な温度応答性能を付与することができ、細胞を接着させるとともに、温度変化により細胞を剥離することができる。 The content of the temperature-responsive polymer in the radiation-polymerizable composition is preferably such that the concentration immediately before irradiation is 4% by weight or more, preferably 6% by weight or more, and preferably 10% by weight or less. By setting the content of the temperature-responsive polymer to 4% by weight or more, it is possible to avoid a situation where cells adhere to each other due to insufficient grafting of the polymer but do not peel, and a temperature-responsive polymer layer with good peelability can be obtained. By setting the content of the temperature-responsive polymer to 10% by weight or less, it is possible to prevent poor cell adhesion due to excessive polymer grafting. That is, by setting the concentration of the temperature-responsive polymer in the radiation-polymerizable composition to be applied to the substrate to an appropriate range, it is possible to impart an appropriate temperature-responsive performance, adhere the cells, and change the temperature by changing the temperature. Can be peeled off.
放射線重合性組成物におけるビスアクリルアミド系架橋剤の含有量は、好ましくは放射線照射の直前における濃度が０．４重量％以上であり、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下である。ビスアクリルアミド系架橋剤の含有量を０．４重量％以上とすることで、温度応答性ポリマーを十分グラフトさせることができる。ビスアクリルアミド系架橋剤の含有量を１．０重量％以下とすることで、過剰量の架橋剤による表面荒れを防ぐと同時に、温度応答性ポリマー層のグラフト過多による親水性の向上と細胞の接着不良を防止できる。 The content of the bisacrylamide-based crosslinking agent in the radiation-polymerizable composition is preferably 0.4% by weight or more, preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight immediately before irradiation. % Or less. By setting the content of the bisacrylamide-based crosslinking agent to 0.4% by weight or more, the temperature-responsive polymer can be sufficiently grafted. By controlling the content of the bisacrylamide cross-linking agent to 1.0% by weight or less, surface roughness due to an excessive amount of the cross-linking agent is prevented, and at the same time, hydrophilicity is improved and cell adhesion is caused by excessive grafting of the temperature-responsive polymer layer. Defects can be prevented.
特に、温度応答性ポリマーを４〜１０重量％の濃度で含み、ビスアクリルアミド系架橋剤を０．４〜１．０重量％の濃度で含む放射線重合性組成物が好ましい。このような放射線重合性組成物を用いることにより、細胞培養時には細胞接着性に優れ、下限臨界溶解温度未満では剥離性に優れた温度応答性ポリマー層を得ることができる。 Particularly preferred is a radiation-polymerizable composition containing a temperature-responsive polymer at a concentration of 4 to 10% by weight and a bisacrylamide-based crosslinking agent at a concentration of 0.4 to 1.0% by weight. By using such a radiation-polymerizable composition, it is possible to obtain a temperature-responsive polymer layer that is excellent in cell adhesion at the time of cell culture and excellent in peelability at a temperature lower than the lower critical solution temperature.
基材は、その表面が、架橋剤の（メタ）アクリルアミド基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであることが好ましい。表面のみが、（メタ）アクリルアミド基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面または中間層に本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、基材表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。 The base material preferably contains a material whose surface can be covalently bonded to the (meth) acrylamide group of the cross-linking agent by irradiation. Only the surface may contain a material that can be covalently bonded to the (meth) acrylamide group by irradiation, or the entire substrate may contain such a material. Examples of the material for the base material include glasses, plastics, ceramics, metals, and the like that are usually used for cell culture, but are not particularly limited as long as the material can be used for cell culture. An arbitrary layer may be provided on the surface of the substrate or the intermediate layer as long as the object of the present invention is not hindered, and an arbitrary treatment may be performed. For example, the substrate surface can be hydrophilized using a treatment technique such as ozone treatment, plasma treatment, sputtering, or the like.
基材を構成する材料であって、それ自体が（メタ）アクリルアミド基と共有結合を形成し得るものとしては、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。 Materials that constitute the base material and can themselves form a covalent bond with a (meth) acrylamide group include polystyrene, low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, polyurethane, urethane acrylate, polymethyl Examples thereof include acrylic resins such as methacrylate, polyamide (nylon), polycarbonate, natural rubber having a conjugated bond, synthetic rubber having a conjugated bond, and silicon rubber containing polysilicon. The substrate may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials.
（メタ）アクリルアミド基と共有結合するように表面処理された基材としては、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、表面がウレタンアクリレート等のアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。合成樹脂としてはナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。合成樹脂はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。 The base material surface-treated so as to be covalently bonded to the (meth) acrylamide group includes polyethylene terephthalate whose surface is easily adhered, synthetic resin whose surface is corona-treated or plasma-treated, and acrylic surface such as urethane acrylate. Examples thereof include a synthetic resin coated with a resin. The substrate may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials. Examples of the synthetic resin include nylon, low density polyethylene, medium density polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene, and the like. The synthetic resin may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials.
基材の形状としては、ディッシュ形状、フィルム形状、多孔質形状などが挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面に温度応答性ポリマーと架橋剤の層を形成した後、細胞培養に適した形状（例えばディッシュ形状）に加工することができる。また、ディッシュ形状の容器の細胞培養面に、フィルム形状の基材を接着剤などにより貼り付けてもよい。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組み合わせて使用することもできる。ディッシュ形状基材を用いる場合、少なくとも細胞接着面となるディッシュ内底面部分が温度応答性ポリマーと架橋剤の層により被覆されればよい。 Examples of the shape of the substrate include a dish shape, a film shape, and a porous shape. When a film-shaped substrate is used, a layer of a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent is formed on the surface of the film-shaped substrate, and then processed into a shape suitable for cell culture (for example, a dish shape). Further, a film-shaped substrate may be attached to the cell culture surface of the dish-shaped container with an adhesive or the like. In processing, a member made of another material can be used in combination with the base material as necessary. When using a dish-shaped substrate, it is only necessary that at least the inner bottom portion of the dish serving as the cell adhesion surface is covered with a layer of a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent.
本発明で用いる基材としては、細胞培養において実績のある、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、多孔質ポリエチレンテレフタレート、多孔質ポリカーボネートが特に適している。 As the substrate used in the present invention, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, porous polyethylene terephthalate, and porous polycarbonate, which have a proven record in cell culture, are particularly suitable.
温度応答性ポリマーおよび架橋剤を配置することにより基材上に形成する塗膜の塗布量は温度応答性ポリマーが機能（例えば温度応答性）を発揮するのに必要な塗布量である５０ｍｇ／ｍ２以上あればよいが、より好ましくは３ｇ／ｍ２以上が望ましい。塗布量の上限は特にないが、４０ｇ／ｍ２未満が好ましく、２０ｇ／ｍ２以下がより好ましい。塗布量が４０ｇ／ｍ２以上である場合には、厚みが増して塗膜厚が安定しないこと、厚みが増して放射線の貫通・照射量が安定しないこと、並びに照射エネルギーに由来する膜内の対流によりポリマーの被覆量にムラが生じる場合がある。また、遊離のポリマーを洗浄するための洗浄時間を短くするためには塗膜量は２０ｇ／ｍ２以下が望ましい。 The coating amount of the coating film formed on the substrate by arranging the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent is 50 mg / m, which is a coating amount necessary for the temperature-responsive polymer to exhibit its function (for example, temperature responsiveness). Two or more are sufficient, but more preferably 3 g / m 2 or more. The upper limit of the coating amount is not particularly, but preferably less than 40g / m 2, 20g / m 2 or less is more preferable. When the coating amount is 40 g / m 2 or more, the thickness is increased and the coating thickness is not stable, the thickness is increased and the radiation penetration / irradiation amount is not stable, and in the film derived from the irradiation energy Convection may cause unevenness in the coating amount of the polymer. Moreover, in order to shorten the washing time for washing the free polymer, the coating amount is desirably 20 g / m 2 or less.
温度応答性ポリマーおよび架橋剤の基材への小面積への塗布方法としては公知のいずれの方法でもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。大面積への塗布方法としてはブレードコーティング法、グラビアコーティング法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。 As a method for applying the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent to the substrate on a small area, any known method may be used, and examples thereof include a coating method using a spin coater, a bar coater, and the like, and a spray coating method. As a coating method for a large area, a blade coating method, a gravure coating method, a rod coating method, a knife coding method, a reverse roll coating method, an offset gravure coating method and the like can be used.
ベタ形成においては、グラビアコート法、ロールコート法、スロットコート法、キスコート法、スプレーコート法、ファウンテンコーティング法等公知のコーティング法を用いることが出来る。又、絵柄層のパターン形成においては、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法等公知の印刷法を用いることが出来る。塗布方法として連続のコート法または印刷法を使用することもできる。連続のコート法または印刷法としては、具体的にはホットメルトコート、ホットラッカーコート、グラビアダイレクトコート、グラビアリバースコート、ダイコート、マイクログラビアコート、スライドコート、スリットリバースコート、カーテンコート、ナイフコート、エアコート、ロールコート等の塗布方法が使用できるが、これらは例示に過ぎず、当業者であれば適用可能なものを使用することができる。 In the solid formation, a known coating method such as a gravure coating method, a roll coating method, a slot coating method, a kiss coating method, a spray coating method, or a fountain coating method can be used. In the pattern formation of the pattern layer, a known printing method such as a gravure printing method, a screen printing method, or an offset printing method can be used. As a coating method, a continuous coating method or a printing method can also be used. Specifically, the continuous coating method or printing method includes hot melt coating, hot lacquer coating, gravure direct coating, gravure reverse coating, die coating, micro gravure coating, slide coating, slit reverse coating, curtain coating, knife coating, and air coating. Application methods such as roll coating can be used, but these are merely examples, and those skilled in the art can use those applicable.
本発明の方法は、基材上に配置した温度応答性ポリマーおよび架橋剤に放射線を照射して、基材表面と温度応答性ポリマーとの架橋剤を介した結合反応を進行させる放射線照射工程を含む。ここでいう結合反応は、放射線照射によって、基材と架橋剤との間の共有結合や、架橋剤と温度応答性ポリマーとの間の共有結合が、（メタ）アクリルアミド基を介して形成される反応をさす。 The method of the present invention includes a radiation irradiation step of irradiating a temperature-responsive polymer and a cross-linking agent disposed on a substrate with radiation to advance a binding reaction between the substrate surface and the temperature-responsive polymer via the cross-linking agent. Including. As for the coupling reaction here, a covalent bond between the substrate and the crosslinking agent and a covalent bond between the crosslinking agent and the temperature-responsive polymer are formed via the (meth) acrylamide group by irradiation. Refers to a reaction.
使用する放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等がある。本発明においては、γ線と電子線がエネルギー効率がよく、特に生産性の面から電子線が好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤や基材とのアンカー剤を組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば５０ｋＧｙ〜５００ｋＧｙが好ましく、γ線であれば５ｋＧｙ〜５０ｋＧｙが好ましい。 Examples of the radiation used include α rays, β rays, γ rays, electron beams, ultraviolet rays, and the like. In the present invention, γ rays and electron beams are energy efficient, and electron beams are particularly preferable from the viewpoint of productivity. With respect to ultraviolet rays, it can be used by combining an appropriate polymerization initiator and an anchor agent with a substrate. The range of radiation dose is preferably 50 kGy to 500 kGy for electron beams, and 5 kGy to 50 kGy for γ rays.
放射線照射後は、塗膜を乾燥させて溶媒を除去することが好ましい。乾燥方法としては特に限定されないが、典型的にはドライエア乾燥法、熱風（温風）乾燥法、（遠）赤外乾燥法などが挙げられる。乾燥前の塗膜に放射線を照射した後、乾燥を行ってもよいし、塗膜を乾燥した後に放射線を照射してもよい。ただし、塗膜を乾燥した後に放射線を照射すると、乾燥ムラが生じ、得られる温度応答性ポリマー層の細胞接着性や細胞剥離性において製品間にばらつきが生じる場合がある。したがって、塗膜が乾燥して乾固する前に放射線を照射することが好ましい。 After irradiation, it is preferable to dry the coating film and remove the solvent. Although it does not specifically limit as a drying method, Typically, a dry air drying method, a hot air (warm air) drying method, a (far) infrared drying method etc. are mentioned. Drying may be performed after irradiating the coating film before drying, or radiation may be irradiated after drying the coating film. However, when radiation is irradiated after the coating film is dried, drying unevenness occurs, and there may be variations among products in the cell adhesiveness and cell detachability of the resulting temperature-responsive polymer layer. Therefore, it is preferable to irradiate the radiation before the coating film is dried and solidified.
上述の各工程を経て形成された細胞培養基材には、基材表面上に共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応の架橋剤等が存在している。そこでこれらの遊離ポリマーや未反応物を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。 The cell culture substrate formed through the above-mentioned steps includes not only polymer molecules immobilized by covalent bonds on the substrate surface, but also free polymer molecules that are not immobilized and unreacted crosslinking agents. Etc. exist. Therefore, it is preferable to further include a washing step for washing in order to remove these free polymers and unreacted substances.
洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは洗浄される細胞培養基材に応じて適宜選択すればよい。 Although it does not specifically limit as a washing | cleaning method, Typically, immersion washing | cleaning, swing washing | cleaning, shower washing | cleaning, spray washing | cleaning, ultrasonic washing | cleaning, etc. are mentioned. The cleaning liquid typically includes various water-based, alcohol-based, hydrocarbon-based, chlorine-based, acid / alkali cleaning liquids. The combination of the washing method and the washing solution may be appropriately selected according to the cell culture substrate to be washed.
本発明の方法により製造された細胞培養基材においては、温度応答性等の品質のばらつきがなく、温度応答性ポリマーが基材上に安定的に固定化されており、長期の保存にも適している。本発明の細胞培養基材においては、その表面に固定化された温度応答性ポリマーおよび架橋剤の層の乾燥時の厚さが０．００１〜１０μｍであることが好ましい。 In the cell culture substrate produced by the method of the present invention, there is no variation in quality such as temperature responsiveness, and the temperature responsive polymer is stably immobilized on the substrate, which is suitable for long-term storage. ing. In the cell culture substrate of the present invention, it is preferable that the thickness of the layer of the temperature-responsive polymer and cross-linking agent immobilized on the surface when dried is 0.001 to 10 μm.
また細胞培養基材表面における温度応答性ポリマーの被覆量は、０．２〜６．０μｇ／ｃｍ２であることが好ましく、１．０〜４．０μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。被覆量が６．０μｇ／ｃｍ２を超過すると細胞は細胞培養基材表面上に付着せず、逆に被覆量が０．２μｇ／ｃｍ２未満だと培養細胞を基材から剥離回収することが困難となる。このようなポリマー被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆部若しくは非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、更に接触角測定等による表面分析を単独或は併用して求めることができる。 The coverage of the temperature responsive polymer in cell culture substrate surface is preferably 0.2~6.0μg / cm 2, more preferably 1.0~4.0μg / cm 2. If the coating amount exceeds 6.0 μg / cm 2 , the cells do not adhere to the surface of the cell culture substrate, and conversely, if the coating amount is less than 0.2 μg / cm 2 , the cultured cells can be detached and collected from the substrate. It becomes difficult. Such a polymer coating amount is, for example, the surface by Fourier transform infrared spectrometer total reflection method (FT-IR-ATR method), analysis by coating or non-coating dyeing or fluorescent substance dyeing, and contact angle measurement. Analysis can be determined alone or in combination.
本発明の細胞培養基材は、接着性細胞の培養に、特に好適に使用される。接着性細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞などの骨細胞などが挙げられる。 The cell culture substrate of the present invention is particularly preferably used for culturing adherent cells. Examples of adherent cells include liver cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, epidermis Epidermal cells such as keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, mammary cells, pericytes, muscle cells such as smooth muscle cells and cardiomyocytes, kidney cells , Pancreatic islets of Langerhans, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, and bone cells such as chondrocytes.
これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。本発明の細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞シートを作製することができる。こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。 These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one generation to another. Furthermore, these cells are undifferentiated embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells that have unipotency, and differentiation has ended. Any of cells may be sufficient. In addition, the cells may be cultivated as a single species, or two or more types of cells may be co-cultured. A cell sheet can be produced by culturing cells using the cell culture substrate of the present invention. The cell sheet thus prepared is suitable for use in regenerative medicine and the like because the adhesion factor on the surface is not impaired and the portion in contact with the cell culture surface has a uniform quality. In addition, the cell sheet can be applied to detection devices such as biosensors.
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.
（温度応答性ポリマーの合成）
３００ｍｌ三口フラスコにＮ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）２２．６ｇと開始剤Ｎ，Ｎ’‐アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．０８２１ｇを入れ、メタノール１００ｍｌを加えて溶解させた。フラスコ内をアルゴン雰囲気下にし、６０℃で２４時間撹拌した。生成物を透析チューブによって３日間透析し、４日間凍結乾燥させ、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）を得た。
(Synthesis of temperature-responsive polymer)
A 300 ml three-necked flask was charged with 22.6 g of N-isopropylacrylamide (NIPAAm) and 0.0821 g of initiator N, N′-azobisisobutyronitrile (AIBN), and dissolved by adding 100 ml of methanol. The flask was placed in an argon atmosphere and stirred at 60 ° C. for 24 hours. The product was dialyzed through a dialysis tube for 3 days and lyophilized for 4 days to obtain poly (NIPAAm).
（温度応答性細胞培養基材の作製）
ポリスチレン製細胞培養ペトリディッシュ（Ｎｕｎｃ社製、培養面積８．８ｃｍ２）を基材とした。ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）が４〜１０ｗｔ％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが０．４〜１．０ｗｔ％になるようにｉ−プロパノール（ＩＰＡ）に溶解させ、インキとした。このインキを２００μｌ滴下し、加速電圧２００ｋＶ、照射線量２５０ｋＧｙの電子線を照射し、温度応答性ポリマー層を基材に固定化した。高圧水洗によって固定化されていないポリマーを除去した。
(Preparation of temperature-responsive cell culture substrate)
A cell culture petri dish made of polystyrene (manufactured by Nunc, culture area 8.8 cm 2 ) was used as a base material. An ink was prepared by dissolving in i-propanol (IPA) so that poly (NIPAAm) was 4 to 10 wt% and N, N′-methylenebisacrylamide was 0.4 to 1.0 wt%. 200 μl of this ink was dropped and irradiated with an electron beam having an acceleration voltage of 200 kV and an irradiation dose of 250 kGy, and the temperature-responsive polymer layer was fixed to the substrate. The non-immobilized polymer was removed by high pressure water washing.
（細胞培養評価）
細胞培養基材に対し、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように調整したウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢより入手）を播種した。使用培地は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ製）を採用した。培養は、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件にて行い、培養１日経過後に顕微鏡観察を行い、細胞培養基材に細胞が接着しているかどうかを観察した。その後、細胞培養基材を２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。３０分後、インキュベーターから出庫し、接着していた細胞が剥離しているかどうかを観察した。結果を「接着性−剥離性」で、以下の表１に示す。いずれの条件でも、細胞の接着と剥離が確認された。
(Cell culture evaluation)
Bovine vascular endothelial cells (obtained from JCRB) adjusted to 4.0 × 10 4 cells / cm 2 were seeded on the cell culture substrate. The medium used was DMEM containing 10% FBS (manufactured by Sigma). The culture was performed in a CO 2 incubator under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. Microscopic observation was performed after 1 day of culture, and it was observed whether cells were adhered to the cell culture substrate. Thereafter, the cell culture substrate was stored in an incubator under 20 ° C. and 5% CO 2 conditions. After 30 minutes, the product was removed from the incubator, and it was observed whether the adhered cells were detached. The result is “Adhesiveness-Peelability” and is shown in Table 1 below. Under either condition, cell adhesion and detachment were confirmed.
表１における接着性の評価基準は以下のとおりである。
○：播種されて基材に接着した細胞のうち、９０％以上に伸展している様子が観察された。
△：播種されて基材に接着した細胞のうち、５０％程度に伸展している様子が観察された。
The evaluation criteria for adhesiveness in Table 1 are as follows.
◯: It was observed that 90% or more of the cells seeded and adhered to the substrate were extended.
(Triangle | delta): A mode that it extended to about 50% among the seed | inoculated cells and adhere | attached on the base material was observed.
表１における剥離性の評価基準は以下のとおりである。
○：基材に接着していた細胞のうち、９０％以上の細胞が低温処理によって剥離した。
△：基材に接着していた細胞のうち、５０％程度の細胞が低温処理によって剥離した。
The evaluation criteria for peelability in Table 1 are as follows.
○: 90% or more of the cells adhered to the substrate were detached by the low temperature treatment.
Δ: About 50% of the cells adhered to the substrate were detached by the low temperature treatment.
Claims (5)
温度応答性ポリマーとビスアクリルアミド系架橋剤とを基材に配置する工程、および
基材に配置された温度応答性ポリマーと架橋剤に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程
を含む、前記方法。 A method for producing a cell culture substrate having temperature responsiveness, comprising:
The step of placing the temperature-responsive polymer and the bisacrylamide-based crosslinking agent on the substrate, and immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate by irradiating the temperature-responsive polymer and crosslinking agent placed on the substrate with radiation. The method comprising the steps of:
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