JP6416270B2

JP6416270B2 - 透過型液晶レンズを使用するインコヒーレント蛍光デジタルホログラフィック顕微鏡法

Info

Publication number: JP6416270B2
Application number: JP2016546747A
Authority: JP
Inventors: ブルッカー・ゲーリー; シーゲル・ニッサン; ローゼン・ジョセフ
Original assignee: Celloptic Inc
Current assignee: Celloptic Inc
Priority date: 2013-10-03
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2018-10-31
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: US9891585B2; EP3052990A1; JP2016533542A; WO2015050827A1; US20180143587A1; US10228655B2; EP3052990A4; US20160246255A1

Description

関連出願についての相互参照
本出願は、２０１３年１０月３日付けで出願された米国仮特許出願番号第６１／８８６，０６４号に基づく優先権を主張する、アメリカ合衆国を指定し、２０１４年９月２９日付けで出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８１３８国内移行出願である。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８１３８および米国仮特許出願番号第６１／８８６，０６４号のそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

政府の権利
本発明は、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）により授与された認可６０ＮＡＮＢ１０Ｄ００８の下で、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

本明細書は、フレネルインコヒーレント自己相関ホログラフィ（ＦＩＮＣＨ）に関する。

フレネルインコヒーレント自己相関ホログラフィ（ＦＩＮＣＨ）（Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＤｉｇｉｔａｌｓｐａｔｉａｌｌｙｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔＦｒｅｓｎｅｌｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ」，Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３２，９１２〜９１４（２００７））が蛍光顕微鏡法（Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「Ｎｏｎ−ｓｃａｎｎｉｎｇｍｏｔｉｏｎｌｅｓｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ２，１９０〜１９５（２００８））に関するその可能性を示して以来、その技術を有用な高解像度３Ｄ撮像法へと完成させる試みを続けてきた。レーザー、スキャニングまたは軸変換なく、あるいは、３Ｄ画像を生成するために複数の焦点面において画像をキャプチャする必要なく、ホログラフィックプロセスによってインコヒーレント光源から３Ｄ画像が取得され得る概念が魅力的である。この分野は現在のところ、出願人のグループによるさらなる研究（Ｇ．Ｂｒｏｏｋｅｒ、Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｖ．ＷａｎｇおよびＪ．Ｒｏｓｅｎ，「ＯｐｔｉｍａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎＦｒｅｓｎｅｌｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９，５０４７〜５０６２（２０１１）；Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｎ．ＳｉｅｇｅｌおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｂｅｙｏｎｄｔｈｅＲａｙｌｅｉｇｈｌｉｍｉｔｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｉｍａｇｉｎｇ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９，２６２４９〜２６２６８（２０１１）；Ｂ．Ｋａｔｚ、Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｒ．ＫｅｌｎｅｒおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＥｎｈａｎｃｅｄｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｏｆＦｒｅｓｎｅｌｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ（ＦＩＮＣＨ）ｕｓｉｎｇｄｕａｌｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅｌｅｎｓｅｓｏｎａｓｐａｔｉａｌｌｉｇｈｔｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＳＬＭ）」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，９１０９〜９１２１（２０１２）；Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｏｂｊｅｃｔｓａｂｏｖｅａｎｄｂｅｌｏｗｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｏｃａｌｐｌａｎｅｗｉｔｈｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｆｉｄｅｌｉｔｙｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，１９８２２〜１９８３５（２０１２））、ならびに、ＦＩＮＣＨ光学システムが本質的に超解像度であるという立証（Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｎ．ＳｉｅｇｅｌおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｂｅｙｏｎｄｔｈｅＲａｙｌｅｉｇｈｌｉｍｉｔｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｉｍａｇｉｎｇ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９，２６２４９〜２６２６８（２０１１）；Ｂ．Ｋａｔｚ、Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｒ．ＫｅｌｎｅｒおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＥｎｈａｎｃｅｄｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｏｆＦｒｅｓｎｅｌｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ（ＦＩＮＣＨ）ｕｓｉｎｇｄｕａｌｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅｌｅｎｓｅｓｏｎａｓｐａｔｉａｌｌｉｇｈｔｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＳＬＭ）」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，９１０９〜９１２１（２０１２）；Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｏｂｊｅｃｔｓａｂｏｖｅａｎｄｂｅｌｏｗｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｏｃａｌｐｌａｎｅｗｉｔｈｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｆｉｄｅｌｉｔｙｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，１９８２２〜１９８３５（２０１２））を含む他の研究室によるさらなる研究（Ｐ．Ｂｏｕｃｈａｌ、Ｊ．Ｋａｐｉｔａｎ、Ｒ．ＣｈｍｅｌｉｋおよびＺ．Ｂｏｕｃｈａｌ，「Ｐｏｉｎｔｓｐｒｅａｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｔｗｏ−ｐｏｉｎｔｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎＦｒｅｓｎｅｌｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９，１５６０３〜１５６２０（２０１１）；Ｘ．Ｌａｉ、Ｙ．Ｚｈａｏ、Ｘ．Ｌｖ、Ｚ．ＺｈｏｕおよびＳ．Ｚｅｎｇ，「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｈｏｌｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅｒａｔｉｏｂｙｎｅａｒｉｍａｇｅｐｌａｎｅｒｅｃｏｒｄｉｎｇ」，Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３７，２４４５〜２４４７（２０１２）；Ｏ．ＢｏｕｃｈａｌおよびＺ．Ｂｏｕｃｈａｌ，「Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄｃｏｍｍｏｎ−ｐａｔｈｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｗｉｔｈａｐｅｒｆｅｃｔｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｂｅａｍｓ」，Ｊ．Ｅｕｒｏｐ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．−Ｒａｐ．Ｐｕｂ．８，１３０１１（２０１３））の結果として進歩してきた。最近、その理由は、ＦＩＮＣＨがラグランジュの不変量を克服することであることが分かった（Ｘ．Ｌａｉ、Ｓ．Ｚｅｎｇ、Ｘ．Ｌｖ、Ｊ．ＹｕａｎおよびＬ．Ｆｕ，「ＶｉｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬａｇｒａｎｇｅｉｎｖａｒｉａｎｔｉｎａｎｏｐｔｉｃａｌｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍ」，Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３８，１８９６〜１８９８（２０１３）［１０］）。

ＦＩＮＣＨ技術に関係する全ての従来の研究に共通するのは、ＦＩＮＣＨのように動作するがＳＬＭのないマイケルソン様の干渉計に基づくＫｉｍにより提案されたシステム（Ｍ．Ｋ．Ｋｉｍ，「Ｆｕｌｌｃｏｌｏｒｎａｔｕｒａｌｌｉｇｈｔｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃｃａｍｅｒａ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ，２１，９６３６〜９６４２（２０１３））を除いて、単一の軸内で一致する基準ビームとサンプルビームを分離するように直列ビームスプリッタとして作用する空間光変調器（ＳＬＭ）デバイスを使用することであった。残念ながら、この配列はセットアップが難しく、また、基準ビーム経路とサンプルビーム経路の両方が一致する光路を横断するシングルビームＦＩＮＣＨ概念ではなく２光学ビーム干渉計に基づくので振動に敏感である。さらに、Ｋｉｍの手法は、高品質画像を生成することを示していない。

ＳＬＭデバイスは通常、反射型半導体ピクセルマトリックス上に蒸着した液晶である。デバイスの反射する性質を理由に、デバイスは、処理されたビームを反射するために、ある角度で使用されなければならず、光学配置が複雑になる。さらに、それらの解像度は、デバイスのピクセル密度に依存し、それらがピクセル化されるので、光は、著しく光効率を低減し、不要な画像反射を生じる多くの次数へと回析される。これらの限界の一部を克服しようとするためにビームスプリッティングキューブとともに軸上でデバイスが使用される場合、さらに大きな光損失が観察される（Ｇ．Ｂｒｏｏｋｅｒ、Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｖ．ＷａｎｇおよびＪ．Ｒｏｓｅｎ，「ＯｐｔｉｍａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎＦｒｅｓｎｅｌｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９，５０４７〜５０６２（２０１１）；Ｏ．ＢｏｕｃｈａｌおよびＺ．Ｂｏｕｃｈａｌ，「Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄｃｏｍｍｏｎ−ｐａｔｈｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｗｉｔｈａｐｅｒｆｅｃｔｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｂｅａｍｓ」，Ｊ．Ｅｕｒｏｐ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．−Ｒａｐ．Ｐｕｂ．８，１３０１１（２０１３））。他の画像を劣化させる特徴として、たとえば、デバイスの小さい開口サイズ、非点収差特性およびそれらの制限されたダイナミックレンジが挙げられる。したがって、ＳＬＭデバイスは、光スループットおよびフィデリティーを本質的に低減し、ホログラムの最終的な解像度に、したがって再生像に影響を及ぼす。

本明細書において、これらの制限を克服するために、出願人はＦＩＮＣＨの新たな高性能光学システムを発明し、このシステムは、サンプルビーム及び基準ビームの生成時に約９０％の透過効率で直線光路において動作し、ピクセルがなく、ＳＬＭの他の制限が全くない。この新しいＦＩＮＣＨ構成では、ＳＬＭは、アクロマチックガラスレンズと組み合わせて、偏光感応性透過液晶ＧＲＩＮレンズ（ＴＬＣＧＲＩＮ）（Ｎ．ＨａｓｉｍｏｔｏおよびＭ．Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｐｒｏｃ．ｏｆＳＰＩＥ７２３２、７２３２０Ｎ−１−８（２００９））と置換される。インライン基準ビームとサンプルビームとが干渉し、したがって、ホログラムを生成し得るように、この液晶ＧＲＩＮレンズをガラスレンズと組み合わせて、各インコヒーレントサンプルポイントから、２つの収束する直交偏波を生成することができる。ＴＬＣＧＲＩＮレンズは、高解像度レンズを生成する偏光感応性アナログ電気光学デバイスであるので、出願人は、それらをこの新たなＦＩＮＣＨ構成に適合し、ＳＬＭベースのＦＩＮＣＨデバイスの以前の機能的制限を克服することができた。この構成のいくつかのバージョンでは、透過型液晶フレネルレンズがＴＬＣＧＲＩＮレンズと置換され得るが、ＴＬＣＧＲＩＮレンズの同調性および優れた光学的性質を理由に、ＴＬＣＧＲＩＮレンズが好適である。

透過型液晶ＧＲＩＮ（ＴＬＣＧＲＩＮ）回折レンズを使用する、高性能で高品質なフレネルインコヒーレント自己相関ホログラフィ（ＦＩＮＣＨ）ホログラムを生成する新しい光学的配列を発明した。これは、サンプルビームと参照ビームとを分離するために、反射型空間光変調器（ＳＬＭ）を使用する分野の普遍的な実施とは対照的である。偏光感応性ＴＬＣＧＲＩＮレンズは、直線光路を可能にし、９５％の伝送効率を有し、ピクセルのないアナログ素子であり、反射型ＳＬＭデバイスの多くの制限がない。さらなる利点は、それらが、広帯域幅を通じてアクロマティックであるインコヒーレントホログラフィックシステムを生成するということである。ガラスと偏光感応性ＴＬＣＧＲＩＮレンズとの組合せにより生成される２つの球状ビームは干渉し、ホログラムは、デジタルカメラにより記録される。

一実施形態では、ホログラムを生成するための装置は、オブジェクトから射出されるインコヒーレント光を受けるように構成されるコリメートレンズと、コリメートレンズからインコヒーレント光を受け、インコヒーレント光を互いに干渉する２つのビームに分割するように構成される少なくとも１つの回折レンズを含むＴＬＣＧＲＩＮレンズと、ホログラムを生成するために、２つのビームの干渉パターンを記録するように構成されるカメラとを含み、ＴＬＣＧＲＩＮレンズからカメラまでの距離と回折レンズの焦点距離と間の比は、１よりも大きい。

別の実施形態では、通常の顕微鏡法およびフレネルインコヒーレント自己相関ホログラフィ（ＦＩＮＣＨ）によって試料を検査するように構成されるシステムは、システムが通常の顕微鏡法およびホログラフィック顕微鏡法を同時に実行することができるように、（混合偏光を射出する）インコヒーレント光を射出するオブジェクトから射出された光の経路に偏光感応性ビームスプリッタを含み、１つの偏光状態は、ＴＬＣＧＲＩＮレンズシステムを通過し、１つのカメラにホログラフ像を記録し、他の偏光状態は、通常の顕微鏡画像を記録するために、他のカメラを対象とする。

ＴＬＣＧＲＩＮレンズを使用しているＦＩＮＣＨ蛍光顕微鏡１０２の模式図である。図の左側には、あるポイントのＦＩＮＣＨホログラムの光路図１０４が示されている。ＢＳは、偏光ビームスプリッタを表し、ｆ_０〜ｆ_４はそれぞれ、対物レンズ、第１のリレーレンズ、第２のリレーレンズ、チューブレンズ、およびＴＬＣＧＲＩＮレンズ１の焦点距離である。ＴＬＣＧＲＩＮレンズ２は非アクティブであり、アクティブなＴＬＣＧＲＩＮレンズ１に直交して配置される。本明細書に記載されるように、試料は、対物レンズから距離ｚ_ｓに位置し、ホログラフィカメラＣＡＭ１は、チューブレンズから距離ｚ_ｈに位置する。広視野カメラＣＡＭ２は、第１のリレーレンズから距離ｆ_１に位置し、ＢＳ１キューブからの拒絶された偏光成分（ｓ偏光軸）が見える。距離は、ＢＳキューブのガラスを通って光路を占めるように補正される。ホログラム面は、ＴＬＣＧＲＩＮレンズの偏光成分との組合せに起因して、ガラスチューブレンズの焦点とその低減された焦点距離の中間にある。軸配向値（度）は、第１のＢＳのＰ偏光に関して与えられる。２０ｘ、０．７５ＮＡ対物−ＧＦＰフィルタセット（５２５ｎｍ射出）を用いた、広視野により撮像された蛍光ＵＳＡＦ解像度パターン（上の行）と、ＴＬＣＧＲＩＮレンズシステムを使用したＦＩＮＣＨ蛍光顕微鏡法（下の行）を示す図である。左のパネルは、視野全体（側部が２８５ミクロン）であり、中央のパネルは、拡大したグループ８および９のフィーチャを示しており、グループ９における最も小さいフィーチャは、解像限界に近づいている。右端のパネルは、最も小さいグループ９のフィーチャを通るラインプロファイル輝度を示す。ＴＬＣＧＲＩＮレンズシステムを使用したＦＩＮＣＨによる視認性は、広視野撮像と比較した時に約２倍に増大する。２０ｘ（０．７５ＮＡ）対物レンズを使用してキャプチャされた花粉粒の（ａ）広視野画像、および（ｂ〜ｄ）再現ＴＬＣＧＲＩＮレンズＦＩＮＣＨ画像を示し、広視野状態では焦点が合わない深さで再び集束するためのＴＬＣＧＲＩＮレンズＦＩＮＣＨの能力を示す。各全視野像は、２８５ミクロン平方である。アクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズに直交して配置された補正ＴＬＣＧＲＩＮレンズがある場合とない場合のＵＳＡＦテストスライドにおけるグループ９フィーチャの視認性に対する帯域幅の影響を示す。１ｎｍ、１０ｎｍおよび４０ｎｍの帯域幅で補正した上の行では、視認性はそれぞれ０．７３、０．６５および０．６９であった。１ｎｍ、１０ｎｍおよび４０ｎｍの帯域幅で補正なしの下の行では、視認性はそれぞれ０．５６、０．２６および０であった。

この透過型ＦＩＮＣＨ顕微鏡の光学セットアップは、直線光学セットアップの高い光学効率によりホログラムをキャプチャすることができると同時に、顕微鏡広視野画像をリアルタイムで同時に見ることができるように、以前の反射モデルとは顕著に異なる。反射型ＳＬＭ機能は、ガラスレンズと偏光感応性ＴＬＣＧＲＩＮレンズとの組合せによって置換される。非効率的なプレート偏光フィルタは、偏光ビームスプリッタ（ＢＳ）キューブ（たとえば、図１の１１８、１２４）（ＴｈｏｒｌａｂｓＣＭ１−ＰＢＳ２５１）により置換される。偏光ＢＳキューブは、各偏光軸のほぼ１００％の透過を提供し、したがって、所望の偏光の著しく高い光スループットを産生する。ホログラムは、ｐ偏光軸の端部で、ＣＡＭ１（たとえば、図１の１０２）によりキャプチャされ、前に無駄になったｓ偏光ビームは、第２のカメラ（ＣＡＭ２、たとえば、図１の１１４）（または、第１の偏光ビームスプリッティングキューブに装着された双眼鏡）を通して広視野顕微鏡画像を見るために使用された。この配列により、顕微鏡試料のリアルタイム閲覧またはキャプチャが、顕微鏡を合焦させる、または図１に示すように匹敵する広視野画像をキャプチャすることが可能になる。ホログラムを記録するｐ偏光経路において、対物レンズの後方開口は、４ｆリレー（Ｏ．Ｂｏｕｃｈａｌ及びＺ．Ｂｏｕｃｈａｌ，「Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄｃｏｍｍｏｎ−ｐａｔｈｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｗｉｔｈａｐｅｒｆｅｃｔｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｂｅａｍｓ」，Ｊ．Ｅｕｒｏｐ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．−Ｒａｐ．Ｐｕｂ．８，１３０１１（２０１３））を用いてチューブレンズ（たとえば、１２２）上に直接的に投影される。この実装形態において、本願出願人は、第１のリレーレンズ（たとえば、図１の１１６）がｆ_１＝８０ｍｍ焦点距離を有し、第２のリレーレンズ（たとえば、図１の１２６）がｆ_２＝５０ｍｍ焦点距離を有する拡大リレーを使用する追加ステップを取った。この拡大ステップは、オブジェクトピクセルサイズを減少させると共に、ポイントホログラムサイズも縮小し、ホログラム記録の信号対雑音比も高める。リレーユニットのないＦＩＮＣＨ画像倍率は、ｚ_ｈ／ｆ_ｏであり（Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｎ．ＳｉｅｇｅｌおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｂｅｙｏｎｄｔｈｅＲａｙｌｅｉｇｈｌｉｍｉｔｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｉｍａｇｉｎｇ」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９、２６２４９−２６２６８（２０１１）；Ｂ．Ｋａｔｚ、Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｒ．ＫｅｌｎｅｒおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＥｎｈａｎｃｅｄｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｏｆＦｒｅｓｎｅｌｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ（ＦＩＮＣＨ）ｕｓｉｎｇｄｕａｌｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅｌｅｎｓｅｓｏｎａｓｐａｔｉａｌｌｉｇｈｔｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＳＬＭ）」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，９１０９−９１２１（２０１２）；Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｏｂｊｅｃｔｓａｂｏｖｅａｎｄｂｅｌｏｗｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｏｃａｌｐｌａｎｅｗｉｔｈｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｆｉｄｅｌｉｔｙｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，１９８２２−１９８３５（２０１２））、システムの現在の全体的な拡大率は、（ｆ_１ｚ_ｈ）／（ｆ_２ｆ_ｏ）であり、ｚ_ｈは、チューブレンズ（たとえば、図１の１２２）と画像面（たとえば、図１の１２０）の間の距離である。リレーレンズ（例えば、図１の１１６および１２６）は、リレーを通る画像の平坦度を維持するように選択されるアクロマティック撮像レンズ（それぞれＲｏｄａｇｏｎ（登録商標）４５２３４１、４５２３１５）であった。第１の偏光ＢＳキューブ（たとえば、図１の１１８）は、リレーに対して内的であり、拒絶したｓ偏光を、第１のリレーレンズ（たとえば、図１の１１６）の焦点にある第２の広視野カメラ（たとえば、図１の１１４）（ＩｍａｇｉｎｇＳｏｕｒｃｅ社のＤＭＫ２３ＧＰ０３１）上に向けた。リレーレンズ間の距離（たとえば、図１の１１６と１２６）は、システムのレーザアライメント中にＢＳガラスの存在について補正された。チューブレンズ（たとえば、図１の１２２）は、４ｆリレーの出力焦点で配置された。図１を参照すると、サンプルビームは距離ｆ_ｄ１で焦束するが、参照ビームはｆ_ｄ２で焦束する。チューブレンズは、ｆ_ｄ1面で画像を収束させるために、アクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズ（たとえば、図１の１０８）と組み合わさり、ここで、ｆ_ｄ１＝ｆ_３ｆ_４／（ｆ_３＋ｆ_４）であるが、ｆ_ｄ２面は、距離ｆ_３でチューブレンズのみにより収束する。サンプルビームと参照ビームとのの最大重複値ｚ_ｈは、以下のように、ｆ_ｄ１およびｆ_ｄ２により決定される。ｚ_ｈ＝ｆ_ｄ１（１＋ｓ_ｆａｃ）＝ｆ_ｄ２（１−ｓ_ｆａｃ）、ただし、ｓ_ｆａｃ＝（ｆ_ｄ２−ｆ_ｄ１）／（ｆ_ｄ２＋ｆ_ｄ１）本願出願人は、５０００ｍｍから無限大までの収束範囲を有する可変焦点距離ＴＬＣＧＲＩＮレンズ（Ｎ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ及びＭ．Ｋｕｒｉｈａｒａ、「ＬｉｑｕｉｄｃｒｙｓｔａｌｑｕａｎｔｉｚｅｄＧＲＩＮｌｅｎｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏＡＦｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｐｒｏｃ．ｏｆＳＰＩＥ７２３２，７２３２０Ｎ−１−８（２００９））を使用した。本願出願人は、約２ｖＲＭＳの１ｋＨＺ方形波パルスでそれを駆動することによって、その最短焦点距離５０００ｍｍでＴＬＣＧＲＩＮレンズを操作し、３００ｍｍ２”アクロマティックレンズ（ＴｈｏｒｌａｂｓＡＣ５０８―３００‐Ａ）をチューブレンズとして使用し、その結果、２８３ｍｍのｆ_ｄ１、３００ｍｍのｆ_ｄ２および２９１．３ｍｍのｚ_ｈとなった。これは、０．０３の間隔ファクタｓ_ｆａ（Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｏｂｊｅｃｔｓａｂｏｖｅａｎｄｂｅｌｏｗｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｏｃａｌｐｌａｎｅｗｉｔｈｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｆｉｄｅｌｉｔｙｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ２０，１９８２２−１９８３５（２０１２））に対応し、これは、十分に、焦点面およびホログラム面の最適な間隔範囲内である。ホログラムを生成するために使用されるＴＬＣＧＲＩＮレンズ（たとえば、図１の１０８）に加えて、以下に論じるようにＴＬＣＧＲＩＮレンズの光路差（ＯＰＤ）を補正するために、偏光軸をアクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズに直交させて、他の（非アクティブ）補償ＴＬＣＧＲＩＮレンズ（たとえば、図１の１１０）を使用した。アクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズ（Ｐ偏光）と平行して偏光した電子的可変波長板は、二重像およびゼロ次排除に必要な２π／３移相に影響を与えるために使用された（Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＤｉｇｉｔａｌｓｐａｔｉａｌｌｙｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔＦｒｅｓｎｅｌｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ」Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３２，９１２−９１４（２００７））。第２の偏光ＢＳキューブ（たとえば、図１の１２４）は、波長板（たとえば、図１の１２８）の後ろに配置され、第１のＢＳキューブ（たとえば、図１の１１８）と並列で偏光された。ホログラム記録カメラ（たとえば、図１の１１２）、浜松ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４ＣＭＯＳカメラは、チューブレンズ（たとえば、図１の１２２）からｚ_ｈ距離２９１．３ｍｍであった。使用した対物レンズは、ニコン（登録商標）２０Ｘ０．７５ＮＡであった。ＳｅｍｒｏｃｋまたはＴｈｏｒｌａｂｓ（登録商標）など、種々の標準的な顕微鏡フィルタセットが図に示すように使用され、蛍光照明は、励起フィルタが内部フィルターホイールに配置され、励起光が液体ライトガイドを通って顕微鏡に送達されるＰｈｏｔｏｆｌｕｏｒ（登録商標）ＩＩイルミネータ（８９ノース）からであった。信号発生器、励起光源およびカメラは、計算が同様行われるＬａｂＶｉｅｗ（登録商標）（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に書かれるソフトウェアによって制御された。ＴＬＣＧＲＩＮレンズ電圧は、所定の焦点距離を生成するために一定に保たれ、液位相板に対する電圧は、各ホログラムキャプチャルーチンの間に要求される２π／３移相を生成するために、３回、変えられた。画像は、再構築距離への伝搬のためのハミングウインドウ型点像分布関数を使用して、ホログラムから再構築された（Ｎ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｊ．ＲｏｓｅｎおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３８，３９２２−３９２５（２０１３））。

この新しいＦＩＮＣＨ構成の性能について、図２および図３に示した画像において実証する。蛍光バッキングに起因して蛍光である標準的なＵＳＡＦ解像度スライドは、新しいセットアップで図２に示すように撮像された。最小グループ９フィーチャの広視野画像は、以前に報告されたものと類似する視認性を有する（Ｊ．Ｒｏｓｅｎ、Ｎ．ＳｉｅｇｅｌおよびＧ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，「ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｂｅｙｏｎｄｔｈｅＲａｙｌｅｉｇｈｌｉｍｉｔｂｙＦＩＮＣＨｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｉｍａｇｉｎｇ」，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１９，２６２４９−２６２６８（２０１１））。新しい方法により得られるホログラムの再構築は、以前のバージョンのＦＩＮＣＨについて報告されるようなコヒーレントホログラフィよりも、視認性についておよそ２倍の改良を示した。ただし、画像を精密に検査することにより、よりはるかに明快になり、ホログラフィ露光時間は、システム全体の光効率が高くなるので、約４分の１に低減された。花粉粒は、より複雑なオブジェクトであり、試料の３Ｄ性質を観察するために、広視野とホログラフィの双方によって新しいＦＩＮＣＨ構成を用いて確実に撮像された。図３ａは、１つの広視野面を示し、図３ｂ〜図３ｄは、ＦＩＮＣＨによって観察される複数の焦点面を示している。ＦＩＮＣＨ画像の質は、観察された全ての面の広視野画像と比較したとき、等しいか、それよりもより良好である。

上記したように、現在のＦＩＮＣＨ構成において使用されるＴＬＣＧＲＩＮレンズは、システムの有用な帯域幅を制限することができる複屈折性を有する。２つの干渉ビームが互いに直交偏波を有する干渉計の複屈折の構成成分は、２つの干渉ビーム間に固有のＯＰＤを生成する。このＯＰＤは、ＦＩＮＣＨにおいて使用することができるソース帯域幅を制限する。ただし、本願出願人がここに示すように、この固有のＯＰＤは、非常に簡単に除去することができる。各複屈折構成要素、ＴＬＣＧＲＩＮレンズまたは位相板について、通常屈折率ｎ_ｏ、異常屈折率ｎ_ｅおよびアクティブＬＣ深さｄで、通常ビームと異常ビームとの間のＯＰＤは、｜ｎ_ｅ−ｎ_ｏ｜ｄとなる。ウィーナー−ヒンチン定理によれば、複素コヒーレンス度およびソーススペクトルは、フーリエ対である（Ｍ．ＢｏｒｎおよびＥ．Ｗｏｌｆ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｏｐｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９９），Ｃｈａｐ．１０．３．２，ｐ５６６）。ＯＰＤは、コヒーレンス時間と光速度との積に等しいので、より小さいＯＰＤにより、干渉視認性の同じ値について、または、同じレベルのホログラム品質について、より広い帯域幅光源を使用することが可能になることが明らかである。換言すると、（波長に関して）帯域幅Δλの光源でその区域全体でしま可視度が良好であるホログラムを得るためには、最大ＯＰＤは、条件ＯＰＤ≦λ^２／Δλを満たさなければならない。したがって、所与のＯＰＤ場合、ＦＩＮＣＨの訂正されてない構成は、λ^２／ＯＰＤよりも広くない帯域幅を有する光源に制限される。｜ｎ_ｅ−ｎ_ｏ｜＝０．２２およびｄ＝５６μｍである、ここで使用するＴＬＣＧＲＩＮレンズの複屈折の特徴について考察すると、ソース帯域幅は、２５ｎｍ以下となるように制限される。より広い帯域幅ソースでＦＩＮＣＨを動作させるためには、本出願人は、アクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズへと９０°回転させた追加の同一の非アクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズをセットアップに導入することによって、ＴＬＣＧＲＩＮに起因するＯＰＤを補償する、あるいは実際に除去する。その場合、２つの直交偏波を有する２つのビームは、２つのＴＬＣＧＲＩＮレンズを通過した後、ほとんど同じ光路を通過する。これは、「ほぼ」、通常ビームはアクティブＴＬＣＧＲＩＮレンズを通過するときに屈折率の微小摂動によって調整されるが、この摂動の最大振幅は、ｎ_ｏと比較してごくわずかであるからである。また、位相板に起因したＯＰＤも補正されなければならない。ただし、位相板はより薄い（｜ｎ_ｅ−ｎ_ｏ｜）の同一値６．４μｍ）ので、位相板によって生成されるＯＰＤは約９倍、より短く、したがって、システム性能に対する効果はＴＬＣＧＲＩＮレンズよりもはるかに小さい。ＦＩＮＣＨの帯域幅を増大させるために直交偏光されたＴＬＣＧＲＩＮレンズ（図１のＧＲＩＮレンズ２）を加える効果を図４に示す。この帯域幅補償がない場合、ＵＳＡＦスライドのグループ９の最小フィーチャの視認性は、ちょうど１ｎｍよりも大きい帯域幅で低下を開始した。ただし、この補償の場合、有効帯域幅は、蛍光顕微鏡法のために適切であるよりも、少なくとも４０ｎｍまで増大した。説明を簡単にするため、本願出願人は、アクティブＧＲＩＮレンズの複屈折を補償するために、非アクティブＧＲＩＮレンズを加えた。ただし、類似の複屈折および厚みを有する任意の光学部品を使用してもよい。

図１に示した現在の構成では、チューブレンズから距離ｚ_ｈにおいて、ＢＳ２のｓ偏光出力に他のホログラフィカメラ（たとえば、図１には示されていないＣＡＭ３）を加えるための機会が提示され、それにより、一例では、複雑なＦＩＮＣＨホログラムを取得するための露出回数を３から２に低減し、システムの時間分解能を増大することが可能になり、他の例においてでは、信号対雑音比が増大する。時間分解能が増大した場合、両方のホログラフィカメラは、２回のみのイメージキャプチャおよび２回のみの位相シフトステップの後に、４つのホログラムを生成するために、同時にホログラムをキャプチャし、キャプチャされたホログラムはそれぞれ、互いに異なるπ／２の位相シフトを有し、それにより、４つのホログラムは、総計２π位相シフトを有する。これは、ビームスプリッティングプリズムが、普通軸および異常軸からのベクトル成分を伝達し、２つがｐ軸に投影され、２つがｓ軸に投影されるので、可能である。ｐ軸が通常成分と異常成分との合計を含む場合、ｓ軸はそれらの成分の相違を含み、逆もまた同じであることが容易に分かる。最終的な効果は、同時にキャプチャされた２つのホログラムが互いからπ位相シフトされていることである。両方のカメラに記録された干渉縞パターンは、それらの間のπの位相差を除いて同一である。したがって、位相板上の位相角が０であるときに、ＣＡＭ３のホログラムはＣＡＭ２によって記録されたホログラムと比較して、π（縞の半サイクル）だけシフトしている。ただし、位相板上の位相角がπ／２であるとき、ＣＡＭ２のホログラムは、第１の露光において同じカメラが記録したホログラムと比較して、π／２（縞の４分の１サイクル）だけシフトしている。ＣＡＭ３上のホログラムは、第１の露光においてＣＡＭ２に記録された同じホログラムと比較して、３π／２だけシフトしている。結論として時間分解能が増大した場合、２回の露光からのみ取られた位相シフト、０、π／２、π、３π／２の４つのステップの４つの生ホログラムがあるが、それは一緒に、単純な周知のデジタル重畳の後に、３回の露光および３つの位相シフトによって得られたホログラムと同程度良好である複素数値ホログラムを産生する。こうすることによって、本願出願人は、ホログラム品質を損なうことなく、露光時間を１／３だけ短縮し、消費電力の１／３を節約する。単に、露光時間を増大することなく、同時に２つのカメラの各々から取得された複素ホログラムを平均化することによって、ホログラムをキャプチャするために単一のホログラムカメラを使用することよりも信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を増大させることができる。この場合、第２のカメラを使用することで、２倍光効率が増大し、複素ホログラムの数の平方根によってＳ／Ｎが増大することができる。

本発明の他の構成では、ＢＳ１から発するｓ偏光ビーム経路の、あと１つのカメラか、あるいはあと２つのカメラのいずれかを有する他の同一のホログラフィ検出システムを確立することによって、図１に示したシステムのｐ軸上のホログラフィ検出システムを複製することが可能である。この場合、広視野画像を見るために通常使用されるＣＡＭ２は、ｐ偏光経路のホログラムと同様のホログラムを取得するために、光学セットアップにより置換される。４つのカメラの構成の場合、顕微鏡からのホログラムをわずか１回のイメージキャプチャで生成することができ、３つのホログラムを単一のカメラによりキャプチャして複素ホログラムを生成しなければならない図１に構成されたシステムに対して、システムのスループットを３倍増大させる。これは、観察中のサンプルが、著しく少ない励起光（１露光対３露光）に暴露されるという点で、かなり有利である。

上記の教示に照らして、本発明の数多くの修正形態および変形形態が可能である。したがって、添付の請求の範囲内で、本発明は、本明細書で具体的に記載したのとは別様に実施することができることを、理解すべきである。

Claims

電磁放射を射出するオブジェクトのフレネルホログラムを生成するように構成される装置であって、前記装置が、偏光感応性の透過型液晶の屈折または回折素子を備え、
前記透過型液晶の屈折または回折素子が、２つの偏光感応性透過液晶ＧＲＩＮレンズであり、該２つの偏光感応性透過液晶ＧＲＩＮレンズは、互いに直交して配置されており、
前記電磁放射が、偏光感応性液晶素子に入った後に別個のｐ偏光ビームとｓ偏光ビームとに分割され、各ビームが、別個のカメラによりキャプチャされる、装置。
非偏光光学素子と組み合わせたときに、前記ホログラムが形成される、請求項１に記載の装置。
前記電磁放射が可視光である、請求項１に記載の装置。
前記電磁放射が蛍光である、請求項１に記載の装置。
前記電磁放射がＸ線である、請求項１に記載の装置。
反射型光学部品がない、請求項１に記載の装置。
前記ビームのうちの１つが広視野画像を生成し、他のビームが前記ホログラムを生成する、請求項１に記載の装置。
前記ビームの各々がそれぞれ対応するホログラムを生成する、請求項１に記載の装置。
前記他のビームにより生成された前記ホログラムの信号対雑音比を高めるために、各カメラからの前記ホログラムが合成される、請求項７に記載の装置。
前記ホログラムを生成するためにインライン参照ビームとサンプルビームとが干渉するように、前記透過型液晶の屈折または回折素子と、非偏光光学素子とが、各インコヒーレントサンプルポイントから２つの収束する直交偏波を生成するように配列されている、請求項１に記載の装置。
電磁放射を射出するオブジェクトのホログラムを生成するように構成される装置であって、前記装置が、偏光感応性の透過型液晶の屈折または回折素子と、入力および出力偏光ビームスプリッタとを備え、
前記透過型液晶の屈折または回折素子が、２つの偏光感応性透過液晶ＧＲＩＮレンズであり、該２つの偏光感応性透過液晶ＧＲＩＮレンズは、互いに直交して配置されている、装置。
別個のホログラムが、各ビームスプリッタからのビームによって生成される、請求項１１に記載の装置。
同一のホログラムが、各前記ホログラムに関連する信号対雑音比を増大させるために、各ビームスプリッタで生成される、請求項１２に記載の装置。
異なる位相のホログラムが、ホログラムイメージング速度を増大させるために、各ビームスプリッタで生成される、請求項１２に記載の装置。