JP6415850B2 - Brewing yeast culture method and medium - Google Patents
Brewing yeast culture method and medium Download PDFInfo
- Publication number
- JP6415850B2 JP6415850B2 JP2014103742A JP2014103742A JP6415850B2 JP 6415850 B2 JP6415850 B2 JP 6415850B2 JP 2014103742 A JP2014103742 A JP 2014103742A JP 2014103742 A JP2014103742 A JP 2014103742A JP 6415850 B2 JP6415850 B2 JP 6415850B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- yeast
- fed
- culture
- medium
- batch
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 175
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title description 16
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 174
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 46
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 claims description 41
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 40
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 40
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 35
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 27
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 24
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 235000020083 shōchū Nutrition 0.000 claims description 12
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 48
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 8
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 8
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 8
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 5
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 4
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000020094 liqueur Nutrition 0.000 description 3
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 2
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylcyclopentane-1,2-dione Chemical compound CC1CC(C)C(=O)C1=O MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N Mirin Chemical compound S1C(N)=NC(=O)\C1=C\C1=CC=C(O)C=C1 YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000015096 spirit Nutrition 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Description
本発明は、醸造酵母の培養方法および培地に関する。 The present invention relates to a brewing yeast culture method and medium.
ビール製造などの醸造に関して酵母の培養は、回分培養により行なわれてきた。回分培養とは、一定の組成の培地で酵母を増殖させた後に、新たな培地を用意し、ここに得られた酵母を培地ごと接種することを特徴とする培養方法である。培養操作が少なく、コンタミネーションが発生するリスクが低いことからビール酵母の培養に用いられている。 For brewing such as beer production, yeast culture has been performed by batch culture. Batch culture is a culture method characterized in that after a yeast is grown on a medium having a constant composition, a new medium is prepared and the resulting yeast is inoculated with the medium. It is used for culturing brewer's yeast because there are few culturing operations and the risk of contamination is low.
一方、パン製造に関して酵母の培養は、培養中にアルコール発酵が進むことを阻止する目的で、糖濃度を一定値以下に保ち、かつ糖を涸渇させないように酵母を培養する必要がある。このため、パン酵母の培養においては、培養中に糖を適量添加する培養方法、すなわち、流加培養が用いられている（特許文献１および２）。 On the other hand, yeast cultivation for bread production requires culturing yeast so as to keep the sugar concentration below a certain value and not to deplete sugar for the purpose of preventing alcohol fermentation from proceeding during the cultivation. For this reason, in the culture of baker's yeast, a culture method in which an appropriate amount of sugar is added during the culture, that is, fed-batch culture is used (Patent Documents 1 and 2).
パン酵母の培養では、炭素原として廃糖蜜を用いることが一般的である。廃糖蜜は、安価で大量に得られ、かつ酵母の増殖に適しているためである。しかしながら、廃糖蜜の成分は、その産出国、産出年度および起源作物などにより大きく異なるため、培養した酵母の品質および培養経過を一定に保つ観点では、廃糖蜜は培養に適しているとは言いがたい。そこで、特許文献３では、廃糖蜜由来成分から精製して得られた成分を培地に添加する方法を開示する。しかし、特許文献３の方法では、特別なカラムを用いた廃糖蜜成分の精製が必要である。 In culturing baker's yeast, it is common to use molasses as a carbon source. This is because molasses can be obtained at low cost and in large quantities and is suitable for yeast growth. However, since the components of molasses vary greatly depending on the country of origin, year of production, and origin crop, it is not said that molasses is suitable for culturing from the viewpoint of maintaining the quality of cultured yeast and the cultivation process. I want. Therefore, Patent Document 3 discloses a method of adding a component obtained by purifying from a molasses-derived component to a medium. However, the method of Patent Document 3 requires purification of the molasses component using a special column.
本発明は、醸造酵母の効率的な培養方法およびそのための培地を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an efficient method for culturing brewing yeast and a medium therefor.
本発明者らは、醸造酵母を廃糖蜜の代わりに酵母エキスを含む培地を用いて流加培養すると、極めて高濃度の醸造酵母液が得られることを見出した。本発明者らはさらに、アンモニウムイオン濃度を４ｇ／Ｌ以下（特に２ｇ／Ｌ以下）に保って培養することで醸造酵母の増殖速度を高めることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいてなされた発明である。 The present inventors have found that when a brewing yeast is fed-batch cultured using a medium containing yeast extract instead of waste molasses, an extremely high concentration of brewing yeast liquid can be obtained. Furthermore, the present inventors have found that the growth rate of brewing yeast can be increased by culturing while maintaining the ammonium ion concentration at 4 g / L or less (particularly 2 g / L or less). The present invention has been made based on these findings.
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）廃糖蜜の代替としての酵母エキスと、アンモニウムイオンと、を含むことを特徴とする、醸造酵母の流加培養用培地組成物。
（２）廃糖蜜を含まないことを特徴とする、上記（１）に記載の培地組成物。
（３）醸造酵母がビール酵母、ワイン酵母または焼酎酵母である、上記（１）または（２）に記載の培地組成物。
（４）アンモニウムイオン濃度が、２ｇ／Ｌ以下である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の培地組成物。
（５）醸造酵母を流加培養する方法であって、
（ａ）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の培地組成物および流加基質を調製すること（ここで、流加基質は液糖を含んでなる）、
（ｂ）該培地組成物に醸造酵母を接種すること、
（ｃ）醸造酵母を培養すること、および
（ｄ）培養中に培地組成物に流加基質を添加すること、
を含んでなる方法。
（６）流加基質が、アンモニウムイオンをさらに含んでなる、上記（５）に記載の方法。
（７）前記（ｄ）において培養液中のアンモニウムイオン濃度が２ｇ／Ｌ以下に維持されるように流加基質を添加する、上記（６）に記載の方法。
（８）醸造酵母がビール酵母、ワイン酵母または焼酎酵母である、上記（５）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）前記（ａ）における培地組成物の調製および／または流加基質の調製が、少なくとも酵母エキスとアンモニウム塩と水とを混合することを含んでなる、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記（ａ）における流加基質の調製が、少なくとも糖液とアンモニウム塩とを混合することを含んでなる、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）上記（５）〜（１０）のいずれかに記載の方法により醸造酵母を調製し、該醸造酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、発酵アルコール飲料の製造方法。
（１２）上記（５）〜（１０）のいずれかに記載の方法によりビール酵母を調製し、該ビール酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A medium composition for fed-batch culture of brewing yeast, comprising yeast extract as an alternative to molasses and ammonium ions.
(2) The medium composition according to (1) above, which does not contain waste molasses.
(3) The medium composition according to (1) or (2) above, wherein the brewer's yeast is beer yeast, wine yeast or shochu yeast.
(4) The medium composition according to any one of (1) to (3), wherein the ammonium ion concentration is 2 g / L or less.
(5) A method of fed-batch culture of brewing yeast,
(A) preparing a medium composition and a fed-batch substrate according to any one of (1) to (4) above (where the fed-batch substrate comprises liquid sugar);
(B) inoculating the brewing yeast into the medium composition;
(C) culturing brewing yeast; and (d) adding a fed-batch substrate to the medium composition during the culturing;
Comprising a method.
(6) The method according to (5) above, wherein the fed-batch substrate further comprises ammonium ions.
(7) The method according to (6) above, wherein a fed-batch substrate is added so that the ammonium ion concentration in the culture solution is maintained at 2 g / L or less in (d).
(8) The method according to any one of (5) to (7) above, wherein the brewing yeast is beer yeast, wine yeast or shochu yeast.
(9) The above-mentioned (5) to (8), wherein the preparation of the medium composition and / or the preparation of a fed-batch substrate in (a) comprises mixing at least a yeast extract, an ammonium salt and water. The method according to any one.
(10) The method according to any one of (5) to (9) above, wherein the preparation of the fed-batch substrate in (a) comprises mixing at least a sugar solution and an ammonium salt.
(11) A method for producing a fermented alcoholic beverage, comprising a step of preparing brewing yeast by the method according to any one of (5) to (10) and fermenting a pre-fermentation solution using the brewing yeast.
(12) Production of a beer-taste fermented alcoholic beverage comprising the steps of preparing brewer's yeast by the method according to any one of (5) to (10) and fermenting a pre-fermentation solution using the brewer's yeast. Method.
本明細書では、「醸造酵母」とは、発酵作用を利用した発酵アルコール飲料や液体調味料の製造に用いられる酵母をいう。それぞれの発酵アルコール飲料の製造工程において発酵前液の発酵に用いられる様々な酵母が知られており、本発明の培地および方法で流加培養することができる。醸造酵母のうち、特にアルコール飲料の製造に用いるものを本明細書では酒造酵母という。醸造酵母としては、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母およびビール酵母などが挙げられ、本発明で培養することができる。「ビール酵母」とは、醸造酵母の一種であり、ビールなどのビールテイスト発酵アルコール飲料の製造に用いられる酵母をいう。ビール酵母は、サッカロミセス属に属する上面酵母（Saccharomyces cerevisiae）または下面酵母（Saccharomyces pastorianus）であり、アルコール生成能などを指標に選択され、育種されてきた酵母である。本明細書では、「パン酵母」とは、パン製造に用いられる酵母をいう。パン酵母の菌株は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属し、パン特有の風味をパンに与える性質を有し、パン生地中での発酵能などを指標に選択され、育種されてきた酵母である。 In the present specification, “brewing yeast” refers to a yeast used for producing a fermented alcoholic beverage or a liquid seasoning utilizing a fermentation action. Various yeasts used for fermentation of a pre-fermentation solution in the production process of each fermented alcoholic beverage are known, and can be fed-batch culture using the medium and method of the present invention. Among the brewing yeasts, those used particularly for the production of alcoholic beverages are referred to herein as brewing yeasts. Examples of the brewer's yeast include sake yeast, shochu yeast, wine yeast, and brewer's yeast, which can be cultured according to the present invention. “Beer yeast” is a kind of brewer's yeast and refers to a yeast used for producing beer-taste fermented alcoholic beverages such as beer. The brewer's yeast is a top surface yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) or a bottom surface yeast ( Saccharomyces pastorianus ) belonging to the genus Saccharomyces , and is a yeast that has been selected and bred based on the ability to produce alcohol. In this specification, “baking yeast” refers to yeast used for bread production. The strain of baker's yeast belongs to Saccharomyces cerevisiae , has the property of giving bread a unique flavor, and has been bred by being selected based on the fermentability in bread dough as an index.
本明細書では、「流加培養」とは、半回分培養ともよばれ、培養系に培地成分を供給しながら細胞を培養することをいう。流加培養では、一般的には、培養液の抜き出しは行なわれず、培養中の培養液に必要な成分を含む新たな培地成分を供給することにより行なわれる。流加培養は、培地成分の供給を連続的に行なう連続流加培養と、一定時間間隔で培地成分を供給する間欠流加培養とに大別される。本明細書では、流加培養には、連続流加培養と間欠流加培養の両方が含まれる。また、本明細書では、流加培養には、培養液量一定流加培養と培養液量可変流加培養の両方が含まれる。 In this specification, “fed-batch culture” is also called semi-batch culture, and refers to culturing cells while supplying medium components to the culture system. In fed-batch culture, the culture medium is generally not extracted, but is supplied by supplying new medium components including necessary components in the culture medium being cultured. Fed-batch culture is roughly classified into continuous fed-batch culture that continuously supplies medium components and intermittent fed-batch culture that supplies medium components at regular time intervals. In this specification, fed-batch culture includes both continuous fed-batch culture and intermittent fed-batch culture. In the present specification, the fed-batch culture includes both a constant culture volume fed-batch culture and a variable culture volume fed-batch culture.
本明細書では、培地組成物は、流加培養における流加前の培地（以後、「初発培地」ともいう）を意味する。本発明の培地組成物は、流加培養に用いられるものであるため、培養の全工程で必要な培地成分を全て含まないものであってよい。なぜなら、培養中に必要とされる培地成分は、培養中に培地に供給することができるからである。本明細書では、「流加基質」とは、流加培養において培養系に供給される培地成分を含む基質をいう。本明細書では、流加基質をフィード液ということがある。 In the present specification, the medium composition means a medium before fed in fed-batch culture (hereinafter also referred to as “initial medium”). Since the medium composition of the present invention is used for fed-batch culture, it may not contain all the medium components necessary for all the steps of the culture. This is because the medium components required during the culture can be supplied to the medium during the culture. As used herein, “fed-batch substrate” refers to a substrate containing medium components supplied to the culture system in fed-batch culture. In the present specification, the fed-batch substrate may be referred to as a feed liquid.
本発明は、発酵アルコール飲料の製造工程における発酵前液の発酵に用いる醸造酵母を得るための醸造酵母の培養方法および培地組成物に関するものである。醸造酵母は、例えば、ビール酵母、ワイン酵母または焼酎酵母とすることができ、この場合、それぞれ、発酵アルコール飲料は、ビールテイスト発酵アルコール飲料、ワインまたは焼酎である。すなわち、本発明はまた、ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造工程における発酵前液の発酵に用いるビール酵母を得るためのビール酵母の培養方法および培地組成物に関するものである。本発明はまた、ワインの製造工程における発酵前液の発酵に用いるワイン酵母を得るためのワイン酵母の培養方法および培地組成物に関するものである。本発明はまた、焼酎の製造工程における発酵前液の発酵に用いる焼酎酵母を得るための焼酎酵母の培養方法および培地組成物に関するものである。本発明の培地組成物および流加基質は、ある態様では、液体の形態で提供される。 The present invention relates to a brewing yeast culture method and a medium composition for obtaining a brewing yeast used for fermentation of a pre-fermentation solution in a production process of a fermented alcoholic beverage. The brewing yeast can be, for example, beer yeast, wine yeast or shochu yeast, in which case the fermented alcoholic beverage is a beer-taste fermented alcoholic beverage, wine or shochu, respectively. That is, the present invention also relates to a brewer's yeast culture method and a medium composition for obtaining brewer's yeast used for fermentation of a pre-fermentation solution in the production process of a beer-taste fermented alcoholic beverage. The present invention also relates to a wine yeast culture method and a medium composition for obtaining wine yeast used for fermentation of a pre-fermentation solution in a wine production process. The present invention also relates to a method for culturing shochu yeast and a medium composition for obtaining shochu yeast used for fermentation of a pre-fermentation solution in the manufacturing process of shochu. The media compositions and fed-batch substrates of the present invention are provided in liquid form in some embodiments.
本発明は、より具体的には、廃糖蜜の代替としての酵母エキスと、アンモニウムイオンと、を含むことを特徴とする、醸造酵母の流加培養用培地組成物に関する。本発明は、成分や品質が安定しない廃糖蜜を用いなくてもよい点で、酵母の安定的な生産に適している。すなわち、廃糖蜜を用いないことにより、品質の安定した酵母を生産することが可能となり、得られた酵母をその後の発酵アルコール飲料の製造における発酵前液の発酵に用いると、発酵前液の安定的な発酵が可能となる。しかも、酵母は培養中、安定した培養経過をたどるため、培養工程の管理が容易である。従って、本発明のある態様では、本発明の培地組成物は、廃糖蜜の一部または全部が酵母エキスにより代替されている。すなわち、本発明のある態様では、廃糖蜜の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％が酵母エキスにより代替されている。本発明のある態様では、本発明の培地組成物は、廃糖蜜は全部が酵母エキスにより代替されており、廃糖蜜を含有しない。本明細書では、「廃糖蜜の代替として」とは、廃糖蜜の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％が酵母エキスにより代替されていることを意味する。 More specifically, the present invention relates to a medium composition for fed-batch culture of brewing yeast comprising yeast extract as an alternative to molasses and ammonium ions. The present invention is suitable for stable production of yeast in that it does not require use of molasses whose components and quality are not stable. That is, by not using molasses, it becomes possible to produce a yeast of stable quality, and when the obtained yeast is used for fermentation of the pre-fermentation liquid in the subsequent production of a fermented alcoholic beverage, Fermentation becomes possible. In addition, since yeast follows a stable culture process during culture, the management of the culture process is easy. Therefore, in one aspect of the present invention, in the medium composition of the present invention, a part or all of the molasses is replaced by yeast extract. That is, in one aspect of the present invention, yeast extract replaces 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more or 100% of molasses. In a certain aspect of the present invention, in the medium composition of the present invention, the molasses is entirely replaced by yeast extract and does not contain molasses. As used herein, “as an alternative to molasses” means that 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more or 100% of the molasses is replaced by yeast extract. Means that
本発明では、酵母エキスとしては、ビール酵母エキスおよびパン酵母エキスのいずれも好ましく用いることができる。 In the present invention, as the yeast extract, any of beer yeast extract and baker's yeast extract can be preferably used.
通常の発酵アルコール飲料、特にビールテイスト発酵アルコール飲料の製造では、発酵した発酵液等から得られた酵母を増やして次の発酵アルコール飲料の製造工程に用いるが、本発明の培地組成物は、発酵液から得られた酵母を用いる必要は無い。本発明の培地組成物は、フリーズストックなどの保存元株を培養することに適しており、従って、少量多品種のアルコール飲料を製造することに適しており、特に、製造計画の変更等に伴って急に特定の醸造酵母が必要とされたときに、酵母の保存元株から特定の酵母を増殖させる場合などに有利に用いられる。また、所望の発酵アルコール飲料の製造に適した酵母をスクリーニングする際などに、発酵前液の発酵を経ることなく酵母を増殖させることができるため、時間的に有利である。 In the production of ordinary fermented alcoholic beverages, especially beer-taste fermented alcoholic beverages, the yeast obtained from the fermented fermentation liquor is increased and used in the production process of the next fermented alcoholic beverage. It is not necessary to use yeast obtained from the liquid. The medium composition of the present invention is suitable for culturing a storage source strain such as freeze stock, and is therefore suitable for producing a small amount of a variety of alcoholic beverages. Thus, when a specific brewing yeast is suddenly needed, it is advantageously used for growing a specific yeast from a yeast storage source strain. In addition, when screening for a yeast suitable for producing a desired fermented alcoholic beverage, the yeast can be proliferated without undergoing fermentation of the pre-fermentation solution, which is advantageous in terms of time.
本発明の培地組成物は、ある態様では、ビール酵母の培養のためのものであり、麦汁を含有しない。通常のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造では、発酵した麦汁等から得られた酵母を増やして次のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造工程に用いるが、本発明の培地組成物は、発酵した麦汁から得られた酵母を用いる必要は無い。本発明の培地組成物は、フリーズストックなどの保存元株を培養することに適しており、従って、少量多品種のビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することに適しており、特に、製造計画の変更等に伴って急にビール酵母が必要とされたときに、酵母の保存元株から酵母を増殖させる場合などに有利に用いられる。また、ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造に適した酵母をスクリーニングする際などに、発酵前液の発酵を経ることなく酵母を増殖させることができるため、時間的に有利である。 In one embodiment, the medium composition of the present invention is for culturing beer yeast and does not contain wort. In the production of normal beer-taste fermented alcoholic beverages, yeast obtained from fermented wort and the like is increased and used in the production process of the next beer-taste fermented alcoholic beverage, but the medium composition of the present invention is fermented wort. It is not necessary to use the yeast obtained from The medium composition of the present invention is suitable for culturing a storage source strain such as freeze stock, and is therefore suitable for producing a small amount of a variety of beer-taste fermented alcoholic beverages. When brewer's yeast is suddenly needed due to the above, etc., it is advantageously used for growing yeast from a yeast storage source strain. In addition, when screening for yeast suitable for producing a beer-taste fermented alcoholic beverage, the yeast can be grown without undergoing fermentation of the pre-fermentation solution, which is advantageous in terms of time.
本発明の培地組成物は、ある態様では、培地中のアンモニウムイオン濃度が、好ましくは４ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２ｇ／Ｌ以下、さらにより好ましくは１．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは１ｇ／Ｌ以下である。培地中のアンモニウム濃度を上記濃度以下に維持することで酵母の増殖速度を高めることができる。 In a certain aspect, the medium composition of the present invention has an ammonium ion concentration in the medium of preferably 4 g / L or less, more preferably 3 g / L or less, still more preferably 2 g / L or less, and even more preferably 1.5 g. / L or less, most preferably 1 g / L or less. By maintaining the ammonium concentration in the medium below the above concentration, the growth rate of the yeast can be increased.
本発明の培地組成物は、上述の通り、発酵アルコール飲料の製造過程において発酵前液を発酵させることに用いるための酵母を調製することを意図して流加培養することに用いることができる。本発明の培地組成物はまた、上述の通り、ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造過程において発酵前液を発酵させることに用いるための酵母を調製することを意図して流加培養することに用いることができる。さらに、流加培養においては、麦汁を一切用いなくてもよい。従って、本発明の培地組成物は、麦汁を用いずに酵母を流加培養するために用いることができる。 As described above, the medium composition of the present invention can be used for fed-batch culture with the intention of preparing yeast for use in fermenting a pre-fermentation solution in the process of producing a fermented alcoholic beverage. As described above, the medium composition of the present invention is also used for fed-batch culture with the intention of preparing yeast for use in fermenting a pre-fermentation solution in the process of producing a beer-taste fermented alcoholic beverage. Can do. Furthermore, wort may not be used at all in fed-batch culture. Therefore, the culture medium composition of the present invention can be used for fed-batch culture of yeast without using wort.
本発明の培地組成物としては、パン酵母の流加培養の初発培地として知られる様々な培地を用いることができるが、廃糖蜜の代替としての酵母エキスを含んでなる。本発明の培地組成物は、酵母エキスとアンモニウムイオンの他には、塩類、ミネラル類およびビタミン類などを含んでいてもよい。当業者であれば、酵母エキスとアンモニウムイオン以外の適宜培地組成を決定して、流加培養に用いる培地組成物を作製することができる。当業者であればまた、既存のパン酵母の流加培養の初発培地の廃糖蜜を酵母エキスで代替して本発明の培地組成物を調製することができる。 As the medium composition of the present invention, various media known as the initial medium for fed-batch culture of baker's yeast can be used, and it comprises yeast extract as an alternative to molasses. The medium composition of the present invention may contain salts, minerals, vitamins and the like in addition to the yeast extract and ammonium ions. A person skilled in the art can determine a medium composition other than the yeast extract and ammonium ions and prepare a medium composition used for fed-batch culture. A person skilled in the art can also prepare the medium composition of the present invention by substituting the yeast molasses with the molasses of the initial medium of the existing baker's yeast fed-batch culture.
本発明によれば、本発明の培地組成物を用いた醸造酵母の流加培養方法が提供される。具体的には、本発明によれば、醸造酵母を流加培養する方法であって、
（ａ）本発明の培地組成物および流加基質を調製すること（ここで、流加基質は液糖を含んでなる）、
（ｂ）培地組成物に醸造酵母を接種すること、
（ｃ）醸造酵母を培養すること、
（ｄ）培養中に培地組成物に流加基質を添加すること、
を含んでなる方法が提供される。
According to the present invention, there is provided a fed-batch culture method for brewing yeast using the medium composition of the present invention. Specifically, according to the present invention, a method for fed-batch brewing yeast, comprising:
(A) preparing the medium composition and fed-batch substrate of the present invention (where the fed-batch substrate comprises liquid sugar);
(B) inoculating the culture composition with brewing yeast;
(C) culturing brewing yeast;
(D) adding a fed-batch substrate to the medium composition during culture;
A method comprising is provided.
以下、本発明の酵母を流加培養する方法について具体的に説明する。 Hereinafter, the method of fed-batch culture of the yeast of the present invention will be specifically described.
（ａ）流加培養のための培地組成物および流加基質を調製すること
流加培養のための培地組成物としては、本発明の培地組成物を用いることができる。培地組成物は、好ましくは、アンモニウム塩、例えば、窒素源である硫酸アンモニウム若しくはリン酸アンモニウムまたはこれらの混合物を用いて調製され、より好ましくは、アンモニア水を用いないで調製される。そして、リン酸アンモニウムとしては、（ＮＨ４）３ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４および／またはＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を用いることができる。従って、本発明のある態様では、培地組成物は、少なくとも酵母エキスとアンモニウム塩と水とを混合することにより調製される。ある態様では、本発明の培地組成物中のアンモニウムイオン濃度は、好ましくは４ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２ｇ／Ｌ以下、さらにより好ましくは１．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは１ｇ／Ｌ以下である。
(A) Preparation of medium composition and fed-batch substrate for fed-batch culture The medium composition of the present invention can be used as a medium composition for fed-batch culture . The medium composition is preferably prepared using an ammonium salt, such as ammonium sulfate or ammonium phosphate as a nitrogen source, or a mixture thereof, and more preferably prepared without using aqueous ammonia. As the ammonium phosphate, (NH 4 ) 3 PO 4 , (NH 4 ) 2 HPO 4 and / or NH 4 H 2 PO 4 can be used. Accordingly, in one embodiment of the present invention, the medium composition is prepared by mixing at least a yeast extract, an ammonium salt, and water. In some embodiments, the ammonium ion concentration in the medium composition of the present invention is preferably 4 g / L or less, more preferably 3 g / L or less, even more preferably 2 g / L or less, and even more preferably 1.5 g / L or less. Most preferably, it is 1 g / L or less.
また、流加培養のための流加基質としては、液糖を含んでなる基質を用いることができる。流加培養のための流加基質は、窒素源としてアンモニウムイオンを含んでいてもよい。下記（ｄ）で説明するように、培養中の培地のアンモニウムイオン濃度は一定値以下に維持することが好ましいが、培養中の培養液のアンモニウムイオンを欠乏させないためには、流加基質にはアンモニウムイオンが含まれていることが好ましい。流加基質は、好ましくは、窒素源である硫酸アンモニウム若しくはリン酸アンモニウムまたはこれらの混合物を用いて調製され、より好ましくは、アンモニア水を用いないで調製される。 In addition, as a fed-batch substrate for fed-batch culture, a substrate containing liquid sugar can be used. A fed-batch substrate for fed-batch culture may contain ammonium ions as a nitrogen source. As described in (d) below, it is preferable to maintain the ammonium ion concentration of the medium during culture below a certain value, but in order not to deplete ammonium ions in the culture medium during culture, It is preferable that ammonium ions are contained. The fed-batch substrate is preferably prepared using a nitrogen source such as ammonium sulfate or ammonium phosphate or a mixture thereof, and more preferably prepared without using aqueous ammonia.
ある態様では、培地組成物および流加基質のいずれにも麦汁が実質的に含まれていないか、全く含まれていない。 In some embodiments, neither the medium composition nor the fed-batch substrate is substantially free of wort at all.
（ｂ）培地組成物に醸造酵母を接種すること
培地を調製した後は、醸造酵母を培地組成物に接種することができる。本発明では、必ずしも発酵した麦汁から得られた酵母を接種する必要は無く、酵母の保存元株を培地組成物に接種することが可能である。従って、醸造酵母は、発酵した麦汁から得たものとしてもよいが、好ましくは、保存元株から得たものとしてもよいし、乾燥されたものであってもよい。本発明のある態様では、醸造酵母は、麦汁由来の成分を含まない。本発明では、保存元株は、例えば、酵母株のフリーズストックであり得る。
(B) Inoculating the brewing yeast into the medium composition After preparing the medium, the brewing yeast can be inoculated into the medium composition. In the present invention, it is not always necessary to inoculate yeast obtained from fermented wort, and it is possible to inoculate a culture composition with a yeast stock. Therefore, the brewer's yeast may be obtained from fermented wort, but may preferably be obtained from a storage source strain or may be dried. In a certain aspect of the present invention, the brewer's yeast does not contain a component derived from wort. In the present invention, the storage source strain can be, for example, a freeze stock of a yeast strain.
（ｃ）酵母を培養することと、および（ｄ）培地に流加基質を添加すること
以下では（ｃ）および（ｄ）、すなわち流加培養について説明する。
(C) culturing yeast and (d) adding a fed-batch substrate to the medium (c) and (d), that is, fed-batch culture will be described below.
酵母は、通常の培養条件下で培養することができる。例えば、培養温度２０〜３０℃、０．２ｖｖｍ（体積／体積／分）〜５ｖｖｍの通気条件下で培養が可能である。流加培養は、連続流加培養と間欠流加培養のいずれにて行なってもよい。すなわち、上記（ｄ）は、上記（ｃ）における培養中連続して行なってもよいし、上記（ｃ）における培養中に少なくとも１回以上、好ましくは複数回おこなってもよい。流加培養は、培養液量一定流加培養と培養液量可変流加培養のいずれにておこなってもよい。すなわち、上記（ｄ）では、添加量は一定でも可変でもよいが、酵母の増殖に伴って添加量を増大させることが好ましい。流加基質は、エタノールの生産量または有無を指標として培地に添加することができる。流加時期および流加量は、流加基質の組成と培養中のエタノールの生産量または有無に基づいて当業者であれば適宜決定することができる。細胞の増殖速度を低下させないためには、例えば、培養液中のエタノール濃度をモニターしながらエタノールを実質的に生成させない範囲で流加量を最大限とするのが好ましい。エタノールは培地中の糖濃度が高いと産生されることが知られている。従って、エタノール産生量および濃度は、糖の添加量により制御することができる。例えば、ある態様では、流加時期および流加量は、培養中の培地のエタノール濃度が１．０容積％以下、０．５容積％以下、または０．１容積％以下に維持されることを指標として決定することができる。流加基質は、培地中の糖の濃度を指標として培地に添加することができる。 Yeast can be cultured under normal culture conditions. For example, the culture can be performed under aeration conditions of 20 to 30 ° C. and 0.2 vvm (volume / volume / min) to 5 vvm. The fed-batch culture may be performed by either continuous fed-batch culture or intermittent fed-batch culture. That is, (d) may be performed continuously during the culture in (c), or may be performed at least once, preferably multiple times during the culture in (c). The fed-batch culture may be performed by either a constant culture volume fed-batch culture or a culture volume variable fed-batch culture. That is, in (d) above, the addition amount may be constant or variable, but it is preferable to increase the addition amount as the yeast grows. The fed-batch substrate can be added to the medium using the amount of ethanol produced or the presence or absence of it as an index. A person skilled in the art can appropriately determine the fed-batch timing and the fed-batch amount based on the composition of the fed-batch substrate and the amount of ethanol produced or not during cultivation. In order not to reduce the cell growth rate, for example, it is preferable to maximize the fed amount within a range in which ethanol is not substantially generated while monitoring the ethanol concentration in the culture solution. It is known that ethanol is produced when the sugar concentration in the medium is high. Therefore, the amount and concentration of ethanol produced can be controlled by the amount of sugar added. For example, in one embodiment, the fed-batch timing and fed-batch amount are such that the ethanol concentration of the culture medium during culture is maintained at 1.0% or less, 0.5% or less, or 0.1% or less by volume. It can be determined as an indicator. The fed-batch substrate can be added to the medium using the sugar concentration in the medium as an index.
ある態様では、流加基質はアンモニウムイオンを含んでなり、培養中の培養液のアンモニウムイオン濃度が、好ましくは４ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２ｇ／Ｌ以下、さらにより好ましくは１．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは１ｇ／Ｌ以下に維持されるように培養液に添加することができる。流加培養は、連続流加培養と間欠流加培養のいずれとしてもよく、培養液量一定流加培養と培養液量可変流加培養のいずれとしてもよい。 In some embodiments, the fed-batch substrate comprises ammonium ions, and the ammonium ion concentration in the culture medium during culture is preferably 4 g / L or less, more preferably 3 g / L or less, even more preferably 2 g / L or less, More preferably, it can be added to the culture solution so that it is maintained at 1.5 g / L or less, and most preferably at 1 g / L or less. The fed-batch culture may be either a continuous fed-batch culture or an intermittent fed-batch culture, or may be a fed-batch culture with a constant culture fluid amount or a variable-batch fed-batch culture.
本発明のある態様では、醸造酵母がビール酵母である。 In one embodiment of the present invention, the brewer's yeast is a brewer's yeast.
上記方法により培養して得られた醸造酵母は、発酵アルコール飲料の製造における発酵前液の発酵に用いることができる。また、上記方法により培養して得られた醸造酵母は、１０９細胞／ｍＬ以上の濃度で得ることができる。この酵母の濃度は、例えば、従来のビール酵母の回分培養（１０８細胞／ｍＬ程度）の場合よりも１桁濃い濃度であることから、少量の培養で大量の酵母を回収することができる。そのため、小規模培養設備を用いても大量の酵母を得ることができ、あるいは、培養時間の大幅な短縮が可能であると言える。また、小規模培養設備は多数設置することが容易である。そのため、本発明によれば、少量多品種の発酵アルコール飲料の製造が容易となる。これは、商品の多様性を確保する上で、極めて有利な特徴であると言える。 The brewer's yeast obtained by culturing by the above method can be used for fermentation of a pre-fermentation solution in the production of a fermented alcoholic beverage. Moreover, the brewing yeast obtained by culturing by the above method can be obtained at a concentration of 10 9 cells / mL or more. The concentration of this yeast is, for example, an order of magnitude higher than that in the case of conventional batch culture (about 10 8 cells / mL) of brewer's yeast, so that a large amount of yeast can be recovered with a small amount of culture. Therefore, it can be said that a large amount of yeast can be obtained even using a small-scale culture facility, or that the culture time can be greatly shortened. Moreover, it is easy to install many small-scale culture facilities. Therefore, according to the present invention, it is easy to produce a small amount and a variety of fermented alcoholic beverages. This can be said to be a very advantageous feature in ensuring the diversity of products.
本発明の培養方法のある態様では、廃糖蜜を用いない。この態様では、安定した品質の酵母を得ることが可能となる。 In some embodiments of the culture method of the present invention, no molasses is used. In this embodiment, it is possible to obtain stable quality yeast.
本発明の培養方法のある態様では、アンモニア水を用いない。この態様では、刺激臭を発するアンモニア水の代わりに、窒素源として刺激臭のないアンモニウム塩を用いることができ、培養操作全般の実施が容易となる。 In an embodiment of the culture method of the present invention, ammonia water is not used. In this embodiment, an ammonium salt having no irritating odor can be used as a nitrogen source in place of the ammonia water that emits an irritating odor, and the overall culture operation is facilitated.
本発明によれば、本発明の培養方法により醸造酵母を調製し、該醸造酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、発酵アルコール飲料の製造方法が提供される。本発明において「発酵アルコール飲料」とは、酒類を意味し、日本酒、焼酎、みりん、ビールテイスト発酵アルコール飲料、ワインなどの果実酒類、ウイスキー類、スピリッツ類およびリキュール類などが挙げられる。本発明において発酵アルコール飲料は、炭素源、窒素源、および水などを原料として酵母により発酵させて得たアルコールを含むアルコール飲料である。発酵アルコール飲料の製造方法は当業者に周知であり、公知の製法に従って製造することができる。 According to the present invention, there is provided a method for producing a fermented alcoholic beverage comprising the steps of preparing brewing yeast by the culture method of the present invention and fermenting a pre-fermentation solution using the brewing yeast. In the present invention, “fermented alcoholic beverage” means alcoholic beverages, and examples include sake, shochu, mirin, beer-taste fermented alcoholic beverages, wine and other fruit liquors, whiskeys, spirits, and liqueurs. In the present invention, the fermented alcoholic beverage is an alcoholic beverage containing alcohol obtained by fermentation with yeast using a carbon source, a nitrogen source, water, and the like as raw materials. A method for producing a fermented alcoholic beverage is well known to those skilled in the art, and can be produced according to a known production method.
本発明によればまた、本発明の培養方法によりビール酵母を調製し、該ビール酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法が提供される。本発明において「ビールテイスト発酵アルコール飲料」とは、炭素源、窒素源、および水などを原料として酵母により発酵させた飲料であって、ビール風味を有するアルコール飲料を意味する。「ビールテイスト発酵アルコール飲料」としては、原料として麦および麦芽を使用しないビールテイスト発酵飲料（例えば、酒税法上、「その他の醸造酒（発泡性）（１）」に分類される飲料）や、原料として麦芽を使用するビール、発泡酒、リキュール（例えば、酒税法上、「リキュール（発泡性）（１）」に分類される飲料）が挙げられる。 The present invention also provides a method for producing a beer-taste fermented alcoholic beverage comprising the steps of preparing brewer's yeast by the culture method of the present invention and fermenting a pre-fermentation solution using the brewer's yeast. In the present invention, the “beer-taste fermented alcoholic beverage” refers to an alcoholic beverage having a beer flavor, which is a beverage fermented with yeast using a carbon source, a nitrogen source, and water as raw materials. As “beer-taste fermented alcoholic beverages”, beer-taste fermented beverages that do not use wheat and malt as raw materials (for example, beverages classified as “other brewed liquors (foaming) (1)” under the liquor tax law), Examples include beer, malt liquor, and liqueur (for example, beverages classified as “liqueur (foaming) (1)” under the liquor tax law) using malt as a raw material.
ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法は当業者に周知であり、公知の製法に従って実施することができる。例えば、麦および麦芽を原料として使用しないビールテイスト発酵アルコール飲料は、少なくとも水および液糖から調製された発酵前液を発酵させることにより製造することができる。すなわち、水および液糖から調製された発酵前液（仕込液）に本発明の培養方法により得られた発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、得られた発酵液（酒下し液）を、所望により低温にて貯蔵した後、ろ過工程により酵母を除去することにより、ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。また、麦芽を原料として使用するビールテイスト発酵アルコール飲料は、少なくとも水および麦芽から調製された発酵前液（麦汁）を発酵させることにより製造することができる。すなわち、水および麦芽から調製された発酵前液（仕込液）に本発明の培養方法により得られた発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、得られた発酵液（酒下し液）を、所望により低温にて貯蔵した後、ろ過工程により酵母を除去することにより、ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。いずれの製造方法においても、酒税法等の規定に従って、炭素源および窒素源として麦、米、とうもろこし、でんぷん等の副原料を添加することができる。また、同様に、ホップ、香料、着色料（カラメル）、水質調整剤、発酵助成剤等のその他の添加物等を添加することができる。 A method for producing a beer-taste fermented alcoholic beverage is well known to those skilled in the art and can be carried out according to a known production method. For example, a beer-taste fermented alcoholic beverage that does not use wheat and malt as raw materials can be produced by fermenting a pre-fermentation solution prepared from at least water and liquid sugar. That is, fermentation is performed by adding the brewer's yeast for fermentation obtained by the culture method of the present invention to the pre-fermentation solution (preparation solution) prepared from water and liquid sugar, and the resulting fermentation solution (drinking liquor) Is stored at a low temperature if desired, and then the yeast is removed by a filtration step, whereby a beer-taste fermented alcoholic beverage can be produced. Moreover, the beer taste fermented alcoholic beverage which uses malt as a raw material can be manufactured by fermenting the pre-fermentation liquid (wort) prepared from water and malt at least. That is, fermentation is performed by adding the brewer's yeast for fermentation obtained by the culture method of the present invention to the pre-fermentation solution (preparation solution) prepared from water and malt. If desired, the beer-taste fermented alcoholic beverage can be produced by storing the yeast at a low temperature and then removing the yeast by a filtration step. In any of the production methods, auxiliary materials such as wheat, rice, corn, and starch can be added as a carbon source and a nitrogen source in accordance with regulations of the liquor tax law and the like. Similarly, other additives such as hops, fragrances, coloring agents (caramel), water conditioners, fermentation aids, and the like can be added.
実施例１：半合成培地を用いた醸造酵母の流加培養
本実施例では、醸造酵母の流加培養を試みた。
Example 1: Fed-batch culture of brewing yeast using semi-synthetic medium In this example, fed-batch culture of brewing yeast was attempted.
培地としては、麦汁を用いない半合成培地を用いた。半合成培地としては、廃糖蜜を用いずにビール酵母エキスを用いた。また、比較のために対照として従来の廃糖蜜を含む培地を用いた。それぞれの培地の具体的な組成は以下の表の通りであった。 As the medium, a semi-synthetic medium without wort was used. As the semi-synthetic medium, beer yeast extract was used without using molasses. For comparison, a medium containing conventional molasses was used as a control. The specific composition of each medium was as shown in the table below.
なお、廃糖蜜としては、カーギルジャパン社製の廃糖蜜（サトウキビ）を用い、ぶどう糖果糖液糖としては、日本食品化工社製のぶどう糖果糖液糖を用い、コーンスティープリカーとしては、日本食品化工社製の社製のコーンスティープリカーを用い、ビール酵母エキスとしては、キリン協和フーズ社製のビール酵母エキスを用いた。また、いずれの初発培地もｐＨが４．２に調整され、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを培養中維持した。 As the molasses, the molasses (sugar cane) manufactured by Cargill Japan is used, as the fructose fructose liquid sugar, the fructose fructose liquid sugar produced by Nippon Food Chemical Co., Ltd. is used. A corn steep liquor manufactured by Seisakusho Co., Ltd. was used, and a brewery yeast extract manufactured by Kirin Kyowa Foods Co., Ltd. was used as the brewery yeast extract. Moreover, pH of all the initial culture media was adjusted to 4.2, and pH was maintained during culture | cultivation using NaOH aqueous solution.
また、まず、ジャー中の初発培地に醸造酵母として下面ビール酵母を接種し、その後、培養は、２５℃で、攪拌（３００ｒｐｍ）および通気（１ｖｖｍ）の条件下で行なった。 First, the lower surface beer yeast was inoculated as the brewing yeast in the initial medium in the jar, and then the culture was performed at 25 ° C. under stirring (300 rpm) and aeration (1 vvm).
流加培養は、連続流加培養とし、流加基質液としてフィード液をエタノールが生成しない範囲で培養期間を通じて添加量が最大量となるように培地に添加しながら行なった。培養中、培地中のエタノール濃度をモニターして添加量を調節し、エタノール濃度を所定値以下に維持することができた。本実施例では、培養工程中、培養液中のエタノールが産生されない範囲でできるだけ多くの流加基質が添加された。具体的には、本実施例の酵母エキス試験区の場合では、培養工程中、培養液中のエタノール濃度が０．５容量％以下となるように、酵母増殖に合わせてフィード液を指数的に増加させながら添加し、培養終了時までに糖積算量として８．２ｇ／１００ｍＬまで添加を行なった。 The fed-batch culture was performed as a continuous fed-batch culture while adding a feed solution as a fed-bath substrate solution to the medium so that the addition amount became the maximum amount throughout the culture period within a range where ethanol was not generated. During the culture, the ethanol concentration in the medium was monitored to adjust the addition amount, and the ethanol concentration could be kept below a predetermined value. In this example, as many fed-batch substrates as possible were added during the culturing process as long as ethanol in the culture solution was not produced. Specifically, in the case of the yeast extract test section of the present example, during the culturing process, the feed solution is exponentially adjusted to the yeast growth so that the ethanol concentration in the culture solution is 0.5% by volume or less. It was added while increasing, and the total amount of sugar was added to 8.2 g / 100 mL by the end of the culture.
培養の結果は、図１に示される通りであった。図１には、各培地におけるビール酵母の細胞数と時間経過（時間）との関係が示されている。 The culture results were as shown in FIG. FIG. 1 shows the relationship between the number of brewer's yeast cells and the passage of time (time) in each medium.
図１に示されるように、廃糖蜜培地で培養した場合も、廃糖蜜の代わりに酵母エキスを用いて培養した場合も、細胞数は良好に増加することが明らかとなった。従って、本発明の流加培養では、廃糖蜜を用いても用いなくてもよいことが明らかとなった。 As shown in FIG. 1, it was revealed that the number of cells increased well both when cultured in a molasses medium and when cultured using yeast extract instead of molasses. Therefore, it became clear that the molasses may or may not be used in the fed-batch culture of the present invention.
また、図１に示されるように、流加培養では、細胞濃度が１０９細胞／ｍＬの濃度に達した。通常の回分培養では、細胞濃度は１０８細胞／ｍＬ程度であることを考慮すると、流加培養によるビール酵母の培養は、従来の方法に比べて飛躍的に大量の細胞が得られることが明らかとなった。また、炭素原としてビール酵母エキスを用いた場合には、廃糖蜜を用いた場合よりも、良好な細胞の増殖が見られた。なお、通常ｐＨ調整剤として用いられるアンモニア水をＮａＯＨ水溶液やＫＯＨ水溶液に代えても良好な流加培養が可能であった（データ非掲載）。 Moreover, as shown in FIG. 1, the cell concentration reached 10 9 cells / mL in fed-batch culture. Considering that the cell concentration is about 10 8 cells / mL in normal batch culture, it is clear that culture of brewer's yeast by fed-batch culture can dramatically increase the number of cells compared to conventional methods. It became. Further, when brewer's yeast extract was used as the carbon source, better cell growth was observed than when molasses was used. In addition, good fed-batch culture was possible even if the aqueous ammonia usually used as a pH adjusting agent was replaced with an aqueous NaOH solution or an aqueous KOH solution (data not shown).
また、図２には、各培地における比増殖速度μと時間経過（時間）との関係が示されている。比増殖速度μは、以下の式により算出した。
図２に示されるように、比増殖速度において、廃糖蜜の代わりに酵母エキスを用いて培養した場合には、廃糖蜜培地で培養した場合と同等かそれ以上の比増殖速度を示した。 As shown in FIG. 2, in the specific growth rate, when the yeast extract was used instead of molasses, the specific growth rate was equal to or higher than that in the case of culturing in the molasses medium.
これらのことから、醸造酵母が、廃糖蜜の代替として酵母エキスを含有する培地を用いて良好に流加培養が可能であったことが分かった。 From these facts, it was found that brewing yeast was able to perform fed-batch culture well using a medium containing yeast extract as an alternative to molasses.
実施例２：醸造酵母の流加培養条件の検討
本実施例では、醸造酵母の増殖に対するアンモニウムイオン濃度の影響を調べた。
Example 2: Examination of fed-batch conditions for brewing yeast In this example, the effect of ammonium ion concentration on the growth of brewing yeast was examined.
アンモニウムイオン濃度の異なる２種類の培地（試験区１、２および３）をそれぞれ下記表３に従って調製した。培養中培地のアンモニウムイオン濃度を、試験区１では０．９ｇ／Ｌ以下に保ち、試験区２では１．７ｇ／Ｌ以下に保ち、試験区３は６．６ｇ／Ｌ以下に保って培養した。また、これらの培地は、廃糖蜜、麦汁およびアンモニア水のいずれも含まない培地であった。 Two types of media (test groups 1, 2 and 3) having different ammonium ion concentrations were prepared according to Table 3 below. During the culture, the ammonium ion concentration of the culture medium was kept at 0.9 g / L or less in the test group 1, 1.7 g / L or less in the test group 2, and the test group 3 was kept at 6.6 g / L or less. . Moreover, these culture media were culture media which did not contain any of molasses, wort and aqueous ammonia.
なお、ぶどう糖果糖液糖は、日本食品化工社製のぶどう糖果糖液糖を用い、パン酵母エキスとしては、キリン協和フーズ社製の酵母エキスを用いた。各培地は、ｐＨが４．２に調整され、２５％ＫＯＨ溶液を用いてｐＨを培養中維持した。上記初発培地では、アンモニウムイオンが試験区１では０．８２ｇ／Ｌ、試験区２では１．６４ｇ／Ｌ、および、試験区３では、６．５ｇ／Ｌ含まれていた。 In addition, the grape fructose liquid sugar used the grape sugar fructose liquid sugar made from Nippon Shokuhin Kako, and the yeast extract made from Kirin Kyowa Foods company was used as a baker's yeast extract. Each medium was adjusted to a pH of 4.2 and maintained at a pH during culture using a 25% KOH solution. In the above-mentioned initial culture medium, ammonium ion was contained in test group 1 at 0.82 g / L, test group 2 at 1.64 g / L, and test group 3 at 6.5 g / L.
まず、ジャー中の初発培地に醸造酵母として下面ビール酵母を接種し、培養は、２５℃、攪拌（３００ｒｐｍ）および通気（１．７ｖｖｍ）の条件下で行なった。また、流加培養は、連続流加培養とし、流加基質液としてフィード液をエタノールが生成しない範囲で培養期間を通じて添加量が最大量となるように培地に添加しながら行なった。すなわち、培養工程中、培養液中のエタノール濃度は、１．０容量％以下に維持された。 First, the lower surface beer yeast was inoculated as a brewing yeast in the initial medium in the jar, and the culture was performed under conditions of 25 ° C., stirring (300 rpm) and aeration (1.7 vvm). In addition, the fed-batch culture was a continuous fed-batch culture, and was performed while adding a feed solution as a fed-batch substrate solution to the medium so that the addition amount became the maximum amount throughout the culture period as long as ethanol was not generated. That is, during the culture process, the ethanol concentration in the culture solution was maintained at 1.0% by volume or less.
結果は、図３および４に示される通りであった。図３に示されるように、試験区１および２のいずれでも、培養開始４０時間後の細胞濃度は１０９細胞／ｍＬに達した。一方で、試験区３では、細胞濃度は１０９細胞／ｍＬに達したものの、増殖速度が試験区１および２よりも遅かった（図３）。このように、廃糖蜜を用いずに酵母エキスを用いる流加培養では、培地のアンモニウムイオン濃度によらず、極めて良好な培養が達成されたことが理解できる。一方で、細胞数の比増殖速度は、培地のアンモニウムイオン濃度に依存し、アンモニウムイオン濃度が２ｇ／Ｌである試験区１および２は、試験区３を上回った。
The results were as shown in FIGS. As shown in FIG. 3, any of the test group 1 and 2, the cell concentration after the start of
図４に示されるように、比増殖速度は、試験区１および２において試験区３と同等か試験区３を上回ることが明らかとなった。このことから、培地中のアンモニウムイオン濃度は、細胞増殖速度に影響することが明らかとなった。また、酵母エキスとして、パン酵母エキスを用いてもよいことが明らかとなった。 As shown in FIG. 4, it was revealed that the specific growth rate was the same as or higher than the test group 3 in the test groups 1 and 2. From this, it became clear that the ammonium ion concentration in the medium affects the cell growth rate. Moreover, it became clear that baker's yeast extract may be used as the yeast extract.
実施例３：様々な醸造酵母の培養法への適用
上記実施例と同様の培養を他の下面ビール酵母、上面ビール酵母、ワイン酵母および焼酎酵母で実施した。
Example 3: Application of various brewing yeasts to the culture method The same culture as in the above example was carried out with other lower surface brewer's yeast, upper surface brewer's yeast, wine yeast and shochu yeast.
培地は、麦汁および廃糖蜜を用いない半合成培地とした。具体的な培地組成は、表４に示す通りであった。 The medium was a semi-synthetic medium without wort and molasses. The specific medium composition was as shown in Table 4.
なお、ぶどう糖果糖液糖は、日本食品化工社製のぶどう糖果糖液糖を用い、パン酵母エキスとしては、キリン協和フーズ社製の酵母エキスを用いた。各培地は、ｐＨが４．２に調整され、培養中ｐＨは維持された。 In addition, the grape fructose liquid sugar used the grape sugar fructose liquid sugar made from Nippon Shokuhin Kako, and the yeast extract made from Kirin Kyowa Foods company was used as a baker's yeast extract. Each medium was adjusted to a pH of 4.2, and the pH was maintained during the culture.
ジャー中の初発培地に醸造酵母として、それぞれ下面ビール酵母Ｗ３４株（試験区４）、上面ビール酵母株（試験区５）、ワイン酵母株（試験区６）および焼酎酵母株（試験区７）を接種した。培養は、表４に記載の条件下で行なった。 As the brewing yeast in the initial medium in the jar, the lower surface beer yeast strain W34 (Test Zone 4), the upper surface beer yeast strain (Test Zone 5), the wine yeast strain (Test Zone 6) and the shochu yeast strain (Test Zone 7), respectively. Vaccinated. The culture was performed under the conditions described in Table 4.
流加培養は、連続流加培養とし、流加基質液としてフィード液をエタノールが生成しない範囲で培養期間を通じて添加量が最大量となるように培地に添加しながら行なった。培養中、培地中のエタノール濃度をモニターして添加量を調節し、エタノール濃度を所定値以下に維持することができた。本実施例では、培養工程中、培養液中のエタノールが産生されない範囲でできるだけ多くの流加基質が添加された。具体的には、本実施例の酵母エキス試験区の場合では、培養工程中、培養液中のエタノール濃度が０．５容量％以下となるように、酵母増殖に合わせてフィード液を指数的に増加させながら添加した。 The fed-batch culture was performed as a continuous fed-batch culture while adding a feed solution as a fed-bath substrate solution to the medium so that the addition amount became the maximum amount throughout the culture period within a range where ethanol was not generated. During the culture, the ethanol concentration in the medium was monitored to adjust the addition amount, and the ethanol concentration could be kept below a predetermined value. In this example, as many fed-batch substrates as possible were added during the culturing process as long as ethanol in the culture solution was not produced. Specifically, in the case of the yeast extract test section of the present example, during the culturing process, the feed solution is exponentially adjusted to the yeast growth so that the ethanol concentration in the culture solution is 0.5% by volume or less. Added in increments.
結果は図５に示される通りであった。いずれの試験区でも細胞は良好な増殖を示し、細胞数は１０９細胞／ｍＬに達した。上面ビール酵母（試験区５）とワイン酵母（試験区６）では特に良好な増殖が見られ、細胞数は、２×１０９細胞／ｍＬに達した。 The result was as shown in FIG. Any of cells showed good growth in the test group, the cell number reached 10 9 cells / mL. The top beer yeast (test group 5) and wine yeast (test group 6) showed particularly good growth, and the number of cells reached 2 × 10 9 cells / mL.
このように、廃糖蜜を用いない本培地組成での流加培養法によって、様々な酒造酵母を良好に培養可能なことが明らかになった。 Thus, it was revealed that various brewing yeasts can be cultivated satisfactorily by the fed-batch culture method using the present medium composition without using molasses.
Claims (5)
（ａ）アンモニウム塩と１０〜５０ｇ／Ｌの酵母エキスとを含む培地組成物、および液糖を含む流加基質を調製すること、
（ｂ）該培地組成物に醸造酵母を接種すること、
（ｃ）醸造酵母を培養すること、および
（ｄ）培養中において、培地組成物に流加基質を、培養液中のアンモニウムイオン濃度が６．６ｇ／Ｌ以下に維持され、エタノール濃度が１．０容量％以下に維持される範囲で添加すること、ならびに
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の工程によって調製された醸造酵母を用いて、発酵前液を発酵させること
を含んでなる、方法。 A method for producing a fermented alcoholic beverage, comprising:
(A) preparing a medium composition containing an ammonium salt and 10 to 50 g / L yeast extract , and a fed-batch substrate containing liquid sugar;
(B) inoculating the brewing yeast into the medium composition;
(C) culturing brewer's yeast; and (d) during cultivation, a fed-batch substrate is maintained in the medium composition , the ammonium ion concentration in the culture solution is maintained at 6.6 g / L or less, and the ethanol concentration is 1. Adding within a range that is maintained at 0% by volume or less , and (e) fermenting the pre-fermentation solution using the brewing yeast prepared by the steps (a) to (d). Method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014103742A JP6415850B2 (en) | 2014-05-19 | 2014-05-19 | Brewing yeast culture method and medium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014103742A JP6415850B2 (en) | 2014-05-19 | 2014-05-19 | Brewing yeast culture method and medium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015216888A JP2015216888A (en) | 2015-12-07 |
| JP6415850B2 true JP6415850B2 (en) | 2018-10-31 |
Family
ID=54776887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014103742A Active JP6415850B2 (en) | 2014-05-19 | 2014-05-19 | Brewing yeast culture method and medium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6415850B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7009196B2 (en) * | 2017-12-14 | 2022-01-25 | キリンホールディングス株式会社 | Method for improving the flavor characteristics of fed-batch brewed yeast |
| GB2610309B (en) * | 2019-05-27 | 2023-09-13 | Dandonnellytek Ltd | A process for fed-batch yeast propagation |
| GB2584286A (en) * | 2019-05-27 | 2020-12-02 | Dandonnellytek Ltd | A process for fed-batch yeast propagation |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63226274A (en) * | 1987-03-16 | 1988-09-20 | Hakutsuru Syuzo Kk | Production of sake |
| JP3260919B2 (en) * | 1993-08-05 | 2002-02-25 | 協和醗酵工業株式会社 | Food and beverage manufacturing method |
| US6004784A (en) * | 1998-09-14 | 1999-12-21 | General Electric Co. | Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids |
| IT1308641B1 (en) * | 1999-03-03 | 2002-01-09 | Res Inst Innovative Tech Earth | DOUBLE MUTANT OF RHODOBACTER SPHAEROIDES RV AND ITS USE IN THE PRODUCTION OF HYDROGEN. |
| JP3822415B2 (en) * | 2000-05-10 | 2006-09-20 | サッポロビール株式会社 | Yeast mutant for alcoholic beverage production and method for producing alcoholic beverages using the yeast mutant |
| JP3600803B2 (en) * | 2001-05-08 | 2004-12-15 | バイオエヌゲーネ シーオー．，エルティーディー． | Mannitol producing strain Candida magnolia and method for producing mannitol by fermentation using the same |
| DK174835B1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-12-15 | Pharma Nord Aps | Selenium yeast product, process for the preparation of a selenium yeast product and use of the product for the manufacture of a food, a dietary supplement, or a drug |
| JP3906992B2 (en) * | 2003-01-30 | 2007-04-18 | 日本甜菜製糖株式会社 | New bread production method |
| US8147884B2 (en) * | 2003-07-10 | 2012-04-03 | Sapporo Breweries Limited | Sparkling alcoholic beverage and process for producing the same |
| JP5035820B2 (en) * | 2006-03-24 | 2012-09-26 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Yeast culture medium supplement |
| JP5176022B2 (en) * | 2007-03-23 | 2013-04-03 | 佐賀県 | Method for producing high-concentration alcohol |
| JP5506159B2 (en) * | 2008-03-13 | 2014-05-28 | 麒麟麦酒株式会社 | A novel wine yeast obtained by crossing sake yeast and wine yeast and its production method |
| JP4237810B2 (en) * | 2008-03-31 | 2009-03-11 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Synthetic and semi-synthetic media for baker's yeast production |
| JP2010063451A (en) * | 2008-09-14 | 2010-03-25 | Mitsui Sugar Co Ltd | Beer yeast fermentation promotor |
| CN102216443A (en) * | 2008-11-18 | 2011-10-12 | 朝日啤酒株式会社 | Method for producing alanine-rich yeast |
| JP5695322B2 (en) * | 2009-02-12 | 2015-04-01 | サントリーホールディングス株式会社 | Method for improving flavor of beer-taste beverage using yeast extract and beer-taste beverage with improved flavor |
| JP2013172739A (en) * | 2013-05-10 | 2013-09-05 | Kirin Kyowa Foods Co Ltd | Bread yeast |
-
2014
- 2014-05-19 JP JP2014103742A patent/JP6415850B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015216888A (en) | 2015-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boulton et al. | Brewing yeast and fermentation | |
| CN109161450B (en) | Production of low-alcohol or alcohol-free beer using pichia kluyveri yeast strains | |
| RU2687338C2 (en) | Method of preparing fermented beverage and beverage thus produced | |
| JP6208939B2 (en) | Method for producing fermented beverage | |
| JP6812197B2 (en) | Beer taste beverage | |
| Lentz et al. | Genetic and physiological characterization of yeast isolated from ripe fruit and analysis of fermentation and brewing potential | |
| JP6415850B2 (en) | Brewing yeast culture method and medium | |
| CN101014696A (en) | Process for producing highly stable fermented drink | |
| CN112195076A (en) | Brewing process of strong aromatic Chinese spirits | |
| JP7009196B2 (en) | Method for improving the flavor characteristics of fed-batch brewed yeast | |
| EP1263925B1 (en) | Method of enhancing yeast fermentation rate | |
| JP4611895B2 (en) | Sake mother manufacturing method | |
| CN102161954B (en) | Method for producing strong aromatic flavoring wine | |
| Yalçin et al. | Determination of growth and glycerol production kinetics of a wine yeast strain Saccharomyces cerevisiae Kalecik 1 in different substrate media | |
| JPH0584060A (en) | Production of alcoholic drink | |
| JP5864098B2 (en) | Production method of beer-like beverage | |
| JP4024827B2 (en) | Production method of malt alcoholic beverage | |
| BE1027664B9 (en) | PROCEDURE FOR BREWING BEER BY MEANS OF COLD TOLERANT YEAST STRAINS | |
| JP6456696B2 (en) | Method for improving fermentation characteristics of brewer's yeast in fed-batch culture | |
| Coldea et al. | Fermentative bioprocesses | |
| RU2343189C1 (en) | Method of honey wine production | |
| Parachin et al. | Microbes in wine and beer industries | |
| KR20140096011A (en) | Method for Manufacturing Beer Using Desalinized Magma Seawater and the Beer Obtained Thereby | |
| WO2023166177A1 (en) | Process for the production of ethanol and/or fermentation by-products from a starch-containing biomass | |
| CN115521927A (en) | Complex enzyme preparation capable of reducing content of higher alcohol and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20161012 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161019 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170809 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170822 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171003 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180302 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180419 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180907 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181003 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6415850 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |