JP6412414B2 - Suizenjinori polysaccharide-collagen complex - Google Patents
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Description
本発明は、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体に関する。さらに詳しくは、本発明は、例えば、細胞培養シートをはじめ、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体に関する。 The present invention relates to a suizendinori polysaccharide-collagen complex. More specifically, the present invention includes, for example, a cell culture sheet, an organ adhesion-preventing film for preventing adhesion of organs during surgery, a bandage for wound treatment, a wound covering film, a cooling sheet, The present invention relates to a suizendinori polysaccharide-collagen complex which is expected to be used for applications such as a cushion sheet for organ preservation and a body fluid absorbing sheet.
水性ゲルは、水膨潤性を有し、柔軟であることから、生体関連材料として注目されている。水性ゲルのなかでも体液を吸収しながら膨潤する性質を有する水性ゲルは、手術痕癒着防止膜、創傷を被覆するための膜として使用することが検討されている。 Aqueous gel has attracted attention as a bio-related material because it has water swellability and is flexible. Among aqueous gels, aqueous gels that have the property of swelling while absorbing body fluids have been studied for use as surgical scar adhesion prevention films and films for covering wounds.
接着性および生体適合性に優れ、多量の水溶液を吸収する親水性ゲルのシートとして、線状水溶性ポリエチレンオキシドからなる液体フィルムに高エネルギー線を照射することによって得られる親水性ゲルのシートが提案されている(例えば、特許文献1参照)。 A hydrophilic gel sheet obtained by irradiating a liquid film made of linear water-soluble polyethylene oxide with high energy rays is proposed as a hydrophilic gel sheet that has excellent adhesion and biocompatibility and absorbs a large amount of aqueous solution. (For example, refer to Patent Document 1).
しかし、前記親水性ゲルのシートは、引張強度が低いため、例えば、創傷被覆膜などの用途に適しているとはいえない。 However, since the hydrophilic gel sheet has a low tensile strength, it cannot be said that it is suitable for applications such as a wound dressing film.
前記親水性ゲルのシートの欠点を解消し、引張強度に優れたゲルシートとして、ポリエチレンオキシドおよびポリビニルアルコールを含有する水溶液に電離性放射線を照射することによって得られる医用材料用ゲルシートが提案されている(例えば、特許文献2参照)。 A gel sheet for medical materials obtained by irradiating ionizing radiation to an aqueous solution containing polyethylene oxide and polyvinyl alcohol has been proposed as a gel sheet that eliminates the disadvantages of the hydrophilic gel sheet and has excellent tensile strength ( For example, see Patent Document 2).
しかし、近年、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすい水膨潤性材料の開発が望まれている。 However, in recent years, there has been a demand for the development of a water-swellable material that is excellent in adhesion to cells when used as a medium for culturing cells and that facilitates cell expansion.
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすく、細胞培養シートをはじめ、例えば、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体およびその製造方法ならびに当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シートを提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above prior art, and has excellent adhesion to cells when used as a medium for culturing cells, and the cells are easy to extend, including cell culture sheets, for example, surgery. It can be used for applications such as organ adhesion-preventing membranes, wound-care bandages, wound-covering membranes, cooling sheets, organ-preserving cushion sheets, and body fluid-absorbing sheets. It is an object of the present invention to provide an expected suizendinori polysaccharide-collagen complex, a method for producing the same, and a cell culture sheet comprising the suizendinori polysaccharide-collagen complex.
本発明は、
(1) 原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられてなる複合体であって、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合されていることを特徴とするスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、
(2) 前記(1)に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シート、
(3) スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を0〜40℃の温度で乾燥させることを特徴とする前記(1)に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造方法、および
(4) 前記混合溶液が無機塩を含有する前記(3)に記載のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造方法
に関する。
The present invention
(1) A suizendinori polysaccharide-collagen composite comprising a suizendinori polysaccharide and collagen as raw materials, wherein the suizendinori polysaccharide and collagen are bonded by a chemical bond,
(2) A cell culture sheet comprising the suizendinori polysaccharide-collagen complex according to (1),
(3) The suizendinori polysaccharide-collagen complex according to (1) above, wherein the suizendinori polysaccharide aqueous solution and the collagen aqueous solution are mixed, and the obtained mixed solution is dried at a temperature of 0 to 40 ° C. Production method and (4) The present invention relates to the production method of the suizendinori polysaccharide-collagen complex according to (3), wherein the mixed solution contains an inorganic salt.
本発明によれば、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすく、細胞培養シートをはじめ、例えば、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体およびその製造方法ならびに当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体からなる細胞培養シートが提供される。 According to the present invention, when used as a medium for culturing cells, it has excellent adhesion to the cells, and the cells are easy to expand, for example, cell culture sheets, for example, organs during surgery, etc. Suizendinori polysaccharide-collagen complex expected to be used for applications such as anti-adhesion film for wound prevention, adhesive bandage for wound treatment, wound-covering film, cooling sheet, cushion sheet for organ preservation, and body fluid absorption sheet And a method for producing the same, and a cell culture sheet comprising the suizendinori polysaccharide-collagen complex.
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられており、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合されていることを特徴とする。 The suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention uses a suizendinori polysaccharide and collagen as raw materials, and is characterized in that the suizendinori polysaccharide and collagen are bound by a chemical bond.
本発明者らは、前記技術的課題に鑑みて、細胞培養シートなどとして好適に使用することができる材料を開発するべく鋭意研究を重ねたところ、原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを用い、両者を水溶液の状態で混合し、得られた混合物を乾燥させたとき、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとの静電相互作用が効率よく起こり、両者が化学結合によって結合し、得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、細胞に対する接着性に優れ、しかも細胞が伸展しやすいという優れた効果を奏することが見出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。 In view of the above technical problems, the present inventors have conducted extensive research to develop a material that can be suitably used as a cell culture sheet, etc. When mixed in the state of an aqueous solution and the resulting mixture is dried, electrostatic interaction between the suizendinori polysaccharide and collagen occurs efficiently, and both are bonded by chemical bonds, and the obtained suizendinori polysaccharide-collagen complex is obtained. It has been found that the body has an excellent effect that it has excellent adhesion to cells and the cells are easy to extend. The present invention has been completed based on such findings.
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、前記したように、原料としてスイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンが用いられた複合体であり、スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を0〜40℃の温度で乾燥させることによって得ることができる。 As described above, the Suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention is a complex in which a Suizendinori polysaccharide and collagen are used as raw materials, and a mixed solution obtained by mixing a Suizendinori polysaccharide aqueous solution and a collagen aqueous solution. Can be obtained by drying at a temperature of 0 to 40 ° C.
スイゼンジノリ多糖体は、例えば、スイゼンジノリから抽出することによって得られる。スイゼンジノリからスイゼンジノリ多糖体を抽出する方法としては、例えば、国際公開第2008/062574号パンフレットに記載の方法などが挙げられる。より具体的には、スイゼンジノリ多糖体は、例えば、80℃程度の温度の0.1N水酸化ナトリウム水溶液にスイゼンジノリを添加し、数時間程度攪拌することにより、スイゼンジノリから抽出する方法、スイゼンジノリの水分散液を121℃程度の温度で3時間程度加熱することにより、スイゼンジノリから抽出する方法などにより、得ることができる。抽出されたスイゼンジノリ多糖体は、例えば、遠心分離、濾過、アルコール洗浄などによって精製してもよい。また、スイゼンジノリからスイゼンジノリ多糖体を抽出する前に、スイゼンジノリを凍結させた後に融解させ、さらに色素を除去することによって精製してもよい。 A suizenjinori polysaccharide is obtained, for example, by extracting from a suizenjinori. Examples of a method for extracting a suizenjinori polysaccharide from a suizendinori include the method described in International Publication No. 2008/062574 pamphlet. More specifically, for example, a suizendinori polysaccharide can be extracted from a suizenjinori by adding the suizenjinori to a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution at a temperature of about 80 ° C. and stirring for several hours. The liquid can be obtained by, for example, a method of extracting from a lily of the valley by heating the liquid at a temperature of about 121 ° C. for about 3 hours. The extracted Suizendinori polysaccharide may be purified by, for example, centrifugation, filtration, alcohol washing, and the like. In addition, before extracting the suizendinori polysaccharide from the suizendinori, the suizenjinori may be frozen and then thawed and further purified by removing the pigment.
スイゼンジノリ多糖体は、硫酸化ムラミン酸、ヘキソース、ウロン酸などの単糖を構成単位として含む多糖類である。スイゼンジノリ多糖体を構成する単糖の割合および平均分子量は、スイゼンジノリの採取時期、採取場所などによって異なるが、通常、スイゼンジノリ多糖体は、通常、硫酸化ムラミン酸1〜30モル%、ヘキソース30〜80モル%およびウロン酸を1〜50モル%を含有し、400万〜6000万の重量平均分子量を有する。 The suizendinori polysaccharide is a polysaccharide containing monosaccharides such as sulfated muramic acid, hexose, and uronic acid as constituent units. The ratio and average molecular weight of the monosaccharides constituting the suizendinori polysaccharide vary depending on the collection time, place of collection, etc. of the suizendinori, but the suizendinori polysaccharide is usually 1-30 mol% sulfated muramic acid, 30-80 hexose. It contains 1 to 50 mol% of mol% and uronic acid, and has a weight average molecular weight of 4 to 60 million.
本発明において、スイゼンジノリ多糖体は、コラーゲンとの均一分散性を向上させる観点から、通常、水溶液の状態で用いることが好ましい。 In the present invention, the suizendinori polysaccharide is usually preferably used in the form of an aqueous solution from the viewpoint of improving uniform dispersibility with collagen.
スイゼンジノリ多糖体水溶液におけるスイゼンジノリ多糖体の濃度は、コラーゲンと効率よく反応させる観点から、好ましくは0.001(質量/体積)%以上、より好ましくは0.05(質量/体積)%以上、さらに好ましくは0.1(質量/体積)%以上、さらに一層好ましくは0.3(質量/体積)%以上であり、スイゼンジノリ多糖体の分散性を向上させる観点から、好ましくは10(質量/体積)%以下、より好ましくは8(質量/体積)%以下、さらに好ましくは5(質量/体積)%以下である。 The concentration of the suizendinori polysaccharide in the suizendinori polysaccharide aqueous solution is preferably 0.001 (mass / volume)% or more, more preferably 0.05 (mass / volume)% or more, and further preferably from the viewpoint of efficiently reacting with collagen. Is 0.1 (mass / volume)% or more, more preferably 0.3 (mass / volume)% or more, and preferably 10 (mass / volume)% from the viewpoint of improving the dispersibility of the Suizendinori polysaccharide. Hereinafter, more preferably 8 (mass / volume)% or less, and still more preferably 5 (mass / volume)% or less.
スイゼンジノリ多糖体水溶液の溶媒は水であるが、本発明の目的が阻害されない範囲内で、水溶性有機溶媒が含まれていてもよい。 The solvent of the suizendinori polysaccharide aqueous solution is water, but a water-soluble organic solvent may be contained within the range in which the object of the present invention is not inhibited.
水溶性有機溶媒としては、例えば、エチルアルコール、n−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n−ブチルアルコールなどの脂肪族1価アルコール;エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリンなどの脂肪族多価アルコール;メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジグライム、ジエチルエーテルなどのエーテル;アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン;ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドンなどのアミド;テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル;ジメチルスルホキシド、炭酸プロピレンなどのカーボネート、酢酸などのカルボン酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの水溶性有機溶媒は、それぞれ単独で用いてもよく、2種類以上を併用してもよい。 Examples of the water-soluble organic solvent include aliphatic monohydric alcohols such as ethyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, and n-butyl alcohol; aliphatic polyhydric alcohols such as ethylene glycol, diethylene glycol, and glycerin; methyl cellosolve, ethyl Ethers such as cellosolve, tetrahydrofuran, dioxane, diglyme and diethyl ether; ketones such as acetone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone; amides such as formamide, dimethylacetamide, dimethylformamide and N-methylpyrrolidone; ethers such as tetrahydrofuran and dioxane; dimethyl sulfoxide , Carbonates such as propylene carbonate, carboxylic acids such as acetic acid, etc., but the present invention is limited to such examples only. Is not to be done. These water-soluble organic solvents may be used alone or in combination of two or more.
コラーゲンは、例えば、ウシ、ブタ、サメなどの組織から抽出することによって得ることができるものであり、例えば、(株)高研製、製品番号:MIC−00(ウシ真皮由来アテロコラーゲン)などとして商業的に容易に入手することができる。コラーゲンとしては、例えば、I型コラーゲン、ネイティブコラーゲン、アテロコラーゲンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのコラーゲンは、それぞれ単独で用いてもよく、2種類以上を併用してもよい。 Collagen can be obtained, for example, by extraction from tissues such as bovine, pig, and shark, and is commercially available, for example, as manufactured by Koken Co., Ltd., product number: MIC-00 (bovine dermis-derived atelocollagen). Can be easily obtained. Examples of the collagen include type I collagen, native collagen, and atelocollagen, but the present invention is not limited to such examples. These collagens may be used alone or in combination of two or more.
本発明において、コラーゲンは、スイゼンジノリ多糖体との均一分散性を向上させる観点から、通常、水溶液の状態で用いることが好ましい。 In the present invention, collagen is usually preferably used in the form of an aqueous solution from the viewpoint of improving the uniform dispersibility with the suizendinori polysaccharide.
コラーゲン水溶液におけるコラーゲンの濃度は、スイゼンジノリ多糖体と効率よく反応させる観点から、好ましくは0.001(質量/体積)%以上、より好ましくは0.05(質量/体積)%以上、さらに好ましくは0.1(質量/体積)%以上、さらに一層好ましくは0.3(質量/体積)%以上であり、コラーゲンの分散性を向上させる観点から、好ましくは30(質量/体積)%以下、より好ましくは25(質量/体積)%以下、さらに好ましくは20(質量/体積)%以下である。 The concentration of collagen in the aqueous collagen solution is preferably 0.001 (mass / volume)% or more, more preferably 0.05 (mass / volume)% or more, and still more preferably 0, from the viewpoint of efficiently reacting with the suizendinori polysaccharide. 0.1 (mass / volume)% or more, still more preferably 0.3 (mass / volume)% or more, and preferably 30 (mass / volume)% or less from the viewpoint of improving the dispersibility of collagen. Is 25 (mass / volume)% or less, more preferably 20 (mass / volume)% or less.
コラーゲン水溶液の溶媒は水であるが、本発明の目的が阻害されない範囲内で、水溶性有機溶媒が含まれていてもよい。水溶性有機溶媒は、前記スイゼンジノリ多糖体水溶液に用いることができる水溶性有機溶媒と同様のものを例示することができる。 The solvent of the collagen aqueous solution is water, but a water-soluble organic solvent may be contained within the range in which the object of the present invention is not impaired. Examples of the water-soluble organic solvent include the same water-soluble organic solvents that can be used for the aqueous solution of suizendinori polysaccharide.
スイゼンジノリ多糖体100質量部あたりのコラーゲンの量は、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを効率よく複合させる観点から、好ましくは5〜500質量部、より好ましくは10〜400質量部、さらに好ましくは30〜300質量部、さらに一層好ましくは50〜200質量部である。 The amount of collagen per 100 parts by mass of the Suizenzinori polysaccharide is preferably 5 to 500 parts by mass, more preferably 10 to 400 parts by mass, and even more preferably 30 to 300 parts from the viewpoint of efficiently combining the Suizenzinori polysaccharide and collagen. It is 50 mass parts, More preferably, it is 50-200 mass parts.
スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとの混合は、あらかじめ両者を均一な組成となるように混合した後、得られた混合物と水とを混合することによって行なってもよいが、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを均一に分散させる観点から、スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合することによって行なうことが好ましい。 The mixing of the suizendinori polysaccharide and collagen may be carried out by mixing both in advance so as to obtain a uniform composition, and then mixing the resulting mixture with water. From the viewpoint of dispersing in water, it is preferable to carry out by mixing an aqueous solution of suizendinori polysaccharide and an aqueous collagen solution.
スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合する際、スイゼンジノリ多糖体水溶液の液温およびコラーゲン水溶液の液温は、いずれも、水溶液の凍結を防止し、コラーゲンの変性を抑制する観点から、好ましくは0〜40℃、より好ましくは5〜35℃である。 When mixing the aqueous solution of suizendinori polysaccharide and the aqueous solution of collagen, the liquid temperature of the suizendinori polysaccharide aqueous solution and the temperature of the aqueous collagen solution are both preferably 0 from the viewpoint of preventing the aqueous solution from freezing and suppressing collagen denaturation. It is -40 degreeC, More preferably, it is 5-35 degreeC.
なお、スイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合することによって得られた混合溶液には、無機塩が溶解していてもよい。無機塩を前記混合溶液に溶解させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の膨潤度および機械的強度を適宜調整することができる。 In addition, an inorganic salt may be dissolved in a mixed solution obtained by mixing an aqueous solution of suizendinori polysaccharide and an aqueous collagen solution. By dissolving the inorganic salt in the mixed solution, the degree of swelling and mechanical strength of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex can be appropriately adjusted.
無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどのアルカリ金属ハロゲン化物;塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化カルシウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化カルシウムなどのアルカリ土類金属ハロゲン化物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの無機塩は、それぞれ単独で用いてもよく、2種類以上を併用してもよい。これらの無機塩のなかでは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムが好ましく、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが好ましく、塩化ナトリウムがさらに好ましい。 Examples of the inorganic salt include alkali metal halides such as sodium chloride, potassium chloride, sodium bromide, potassium bromide, sodium iodide, potassium iodide; magnesium chloride, calcium chloride, magnesium bromide, calcium bromide, iodine Examples include alkaline earth metal halides such as magnesium iodide and calcium iodide, but the present invention is not limited to such examples. These inorganic salts may be used alone or in combination of two or more. Among these inorganic salts, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride and calcium chloride are preferable, sodium chloride and potassium chloride are preferable, and sodium chloride is more preferable.
前記混合溶液における無機塩の濃度は、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の機械的強度を向上させる観点から、好ましくは0.01M以上、より好ましくは0.05M以上、さらに好ましくは0.1M以上であり、前記と同様にスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の機械的強度を向上させる観点から、好ましくは0.4M以下、より好ましくは0.3M以下、さらに好ましくは0.2M以下である。 The concentration of the inorganic salt in the mixed solution is preferably 0.01 M or more, more preferably 0.05 M or more, and still more preferably 0.1 M or more, from the viewpoint of improving the mechanical strength of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex. From the viewpoint of improving the mechanical strength of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex as described above, it is preferably 0.4M or less, more preferably 0.3M or less, and still more preferably 0.2M or less.
次に、前記で得られた混合溶液を0〜40℃の温度で乾燥させる。前記混合溶液の乾燥は、例えば、前記混合溶液を基材に塗布することにより、被膜を形成させ、形成された被膜から水分を除去することによって行なうことができる。 Next, the mixed solution obtained above is dried at a temperature of 0 to 40 ° C. The mixed solution can be dried by, for example, applying the mixed solution to a substrate to form a film and removing moisture from the formed film.
前記混合溶液を基材に塗布する際に用いられる基材としては、例えば、ステンレス鋼板などの金属板、ガラス板、ポリプロピレン、ポリエチレンなどのポリオレフィン;ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル;ナイロン66などに代表されるポリアミド;ポリメチル(メタ)アクリレートなどに代表されるアクリル樹脂などの樹脂からなる樹脂板、繊維強化樹脂(FRP)板、炭素板などの無機板などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the substrate used when the mixed solution is applied to the substrate include metal plates such as stainless steel plates, glass plates, polyolefins such as polypropylene and polyethylene; polyesters such as polyethylene terephthalate; nylon 66 and the like. Polyamide; Resin plates made of resins such as acrylic resin typified by polymethyl (meth) acrylate, inorganic plates such as fiber reinforced resin (FRP) plates, carbon plates, etc. are mentioned. It is not limited.
前記混合溶液を基材に塗布する方法としては、例えば、スプレーコート法、ロールコート法、はけ塗り法、グラビアコート法、リバースコート法、ロールブラッシュ法、エアーナイフコート法、浸漬(ディッピング)法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of methods for applying the mixed solution to the substrate include spray coating, roll coating, brush coating, gravure coating, reverse coating, roll brushing, air knife coating, and dipping. However, the present invention is not limited to such examples.
前記混合溶液を基材に塗布することによって形成される被膜の厚さは、特に限定されないが、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の機械的強度を向上させるとともに塗工性を向上させる観点から、好ましくは30〜300μm、より好ましくは50〜200μmである。なお、形成された被膜を乾燥させた後、形成された被膜上にさらに前記混合溶液を重ね塗りすることにより、被膜の厚さを大きくすることができる。 The thickness of the coating film formed by applying the mixed solution to the substrate is not particularly limited, but it is possible to improve the mechanical strength and improve the coating property of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention. Therefore, it is preferably 30 to 300 μm, more preferably 50 to 200 μm. In addition, after drying the formed film, the thickness of the film can be increased by applying the mixed solution again on the formed film.
次に、以上のようにして前記混合溶液から形成された被膜を0〜40℃の温度で乾燥させる。一般に、形成された被膜を乾燥させる方法として、加熱乾燥法、赤外線などの電子線照射による乾燥法などが知られている。これに対して、本発明では、これらの乾燥法と相違し、積極的に高温に加熱するのではなく、前記温度で乾燥させるという操作が採られているので、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合しているスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体を得ることができる。 Next, the film formed from the mixed solution as described above is dried at a temperature of 0 to 40 ° C. In general, as a method for drying a formed film, a heat drying method, a drying method by irradiation with an electron beam such as infrared rays, and the like are known. On the other hand, in the present invention, unlike these drying methods, the operation of drying at the above-mentioned temperature is employed instead of actively heating to a high temperature, so that the suizendinori polysaccharide and collagen are chemically treated. A Suizendinori polysaccharide-collagen complex bound by binding can be obtained.
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体では、このようにスイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合している理由は、確かではないが、おそらく前記混合溶液を乾燥させているときに、被膜の厚さが徐々に減少するにしたがい、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが徐々に錯体を形成することに基づくものと考えられる。したがって、本発明において、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合していることは、実質的にスイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが錯体を形成していることを意味する。 In the Suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention, the reason why the Suizendinori polysaccharide and collagen are thus bonded by chemical bonds is not certain, but it is probably when the mixed solution is dried. It is considered that the Suizendinori polysaccharide and collagen gradually form a complex as the thickness of the membrane gradually decreases. Therefore, in the present invention, the fact that the Suizenzinori polysaccharide and collagen are bonded by chemical bonding means that the Suizenzinori polysaccharide and collagen substantially form a complex.
前記混合溶液を乾燥させる際の当該混合溶液の液温は、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを化学結合によって結合させるとともに、当該混合溶液の凍結を防止し、コラーゲンの変性を抑制する観点から、0〜40℃、好ましくは3〜40℃、より好ましくは5〜40℃、さらに好ましくは5〜35℃に調整する。前記混合溶液を乾燥させる際の雰囲気は、特に限定されないが、通常、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造効率の向上の観点から、大気であることが好ましい。また、前記雰囲気は、常圧であってもよく、必要により、減圧または加圧されていてもよい。また、混合溶液を乾燥させるときの雰囲気の相対湿度についても特に限定がなく、通常の相対湿度、例えば、30〜80%程度であればよい。 The liquid temperature of the mixed solution when the mixed solution is dried is from 0 to 0, from the viewpoint of binding the suizendinori polysaccharide and collagen by chemical bonding, preventing freezing of the mixed solution, and suppressing collagen denaturation. It adjusts to 40 degreeC, Preferably it is 3-40 degreeC, More preferably, it is 5-40 degreeC, More preferably, it adjusts to 5-35 degreeC. Although the atmosphere at the time of drying the mixed solution is not particularly limited, it is usually preferably the atmosphere from the viewpoint of improving the production efficiency of the suizendinori polysaccharide-collagen complex. The atmosphere may be atmospheric pressure, and may be reduced or pressurized as necessary. Moreover, there is no limitation in particular also about the relative humidity of the atmosphere when drying a mixed solution, What is necessary is just about normal relative humidity, for example, about 30 to 80%.
前記混合溶液を乾燥させるのに要する時間は、当該混合溶液の液量、乾燥温度などによって異なるので一概には決定することができないことから、前記混合溶液の乾燥は、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが十分に化学結合によって結合するまで行なうことが好ましい。前記混合溶液を乾燥させるのに要する時間は、通常、コラーゲンの析出を防止し、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとを十分に化学結合によって結合させる観点から、好ましくは15時間以上、より好ましくは20時間以上、さらに好ましくは25時間以上、さらに一層好ましくは30時間以上であり、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の製造効率を向上させる観点から、好ましくは100時間以下、より好ましくは80時間以下、さらに好ましくは60時間以下である。 Since the time required for drying the mixed solution varies depending on the amount of the mixed solution, the drying temperature, etc., and therefore cannot be determined unconditionally, the drying of the mixed solution requires that the suizendinori polysaccharide and collagen are dried. It is preferable to carry out until it is sufficiently bonded by chemical bonding. The time required for drying the mixed solution is usually preferably 15 hours or more, more preferably 20 hours or more, from the viewpoint of preventing the precipitation of collagen and sufficiently binding the suizendinori polysaccharide and collagen by chemical bonding. More preferably, it is 25 hours or more, and even more preferably 30 hours or more. From the viewpoint of improving the production efficiency of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex, it is preferably 100 hours or less, more preferably 80 hours or less, still more preferably 60 hours or less.
前記混合溶液を基材に塗布し、乾燥させることによって本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体を製造した場合には、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、基材から剥離することにより、使用に供することができる。 When the mixed liquor polysaccharide-collagen complex of the present invention is produced by applying the mixed solution to a base material and drying, the suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention is peeled off from the base material. Can be used for use.
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の乾燥後の厚さは、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の用途などによって異なるので一概には決定することができないが、通常、10〜100μm程度である。 Although the thickness after drying of the Suizenzinori polysaccharide-collagen complex of the present invention varies depending on the use of the Suizenzinori polysaccharide-collagen complex, etc., it cannot generally be determined, but is usually about 10 to 100 μm. .
また、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の大きさは、任意であり、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の用途に応じて適宜調整することが好ましい。 Moreover, the size of the Suizenzinori polysaccharide-collagen complex of the present invention is arbitrary, and it is preferable to adjust appropriately according to the use of the Suizenzinori polysaccharide-collagen complex of the present invention.
以上のようにしてスイゼンジノリ多糖体水溶液とコラーゲン水溶液とを混合し、得られた混合溶液を0〜40℃の温度で乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合したスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体を得ることができる。スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体において、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが化学結合によって結合していることは、例えば、赤外吸光分析(IR)において、コラーゲンが有するアミド基に由来するピークが波数の大きいほうにシフトしていることによって確認することができる。 The suizendinori polysaccharide and the collagen aqueous solution are combined by chemical bonding by mixing the suizendinori polysaccharide aqueous solution and the collagen aqueous solution as described above, and drying the obtained mixed solution at a temperature of 0 to 40 ° C. -A collagen complex can be obtained. In the Suizen Ginori polysaccharide-collagen complex, the Suizen Ginori polysaccharide and collagen are bonded by a chemical bond. For example, in infrared absorption analysis (IR), the peak derived from the amide group of collagen has a large wave number. It can be confirmed by shifting to the direction.
本発明では、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の原料として、自然界に存在しており、食用として利用されているスイゼンジノリから抽出することによって得られるスイゼンジノリ多糖体および食用として利用されているコラーゲンが用いられているので、本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、ヒトをはじめとする動物に対する安全性が高いことから、例えば、細胞培養シート、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの用途に使用することが期待されるものである。 In the present invention, as a raw material of the suizendinori polysaccharide-collagen complex, a suizendinori polysaccharide that is present in nature and obtained by extraction from edible dinosaurs and edible collagen are used. Therefore, the Suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention is highly safe for animals such as humans, so that, for example, cell culture sheets, organs during surgery, and the like are prevented from adhering. It is expected to be used for applications such as organ adhesion-preventing membranes, wound bandages, wound-covering membranes, cooling sheets, organ preservation cushion sheets, and body fluid absorbing sheets.
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail based on examples. However, the present invention is not limited to such examples.
調製例
スイゼンジノリ(Aphanothece sacrum)の原試料を凍結させた後、解凍することにより、スイゼンジノリ細胞体を破壊し、当該スイゼンジノリ細胞体に含まれている蛍光性色素であるフィコビリプロテインなどを溶出させ、水洗することによって除去した。
Preparation Example It was removed by washing with water.
次に、前記で水洗したスイゼンジノリ原試料をイソプロパノールで洗浄することにより、当該スイゼンジノリ原試料に含まれている脂溶性色素、クロロフィル、カロテノイド系色素などを除去した。前記でイソプロパノールを用いて洗浄したスイゼンジノリ試料を0.1Nの水酸化ナトリウム水溶液中に浸漬し、当該溶液の液温を80℃に保ちながら5時間撹拌することにより、スイゼンジノリ細胞体を完全に破壊し、かつスイゼンジノリ試料に含まれているタンパク質やDNAなどの生体高分子を分解させ、これらの破壊残渣、解残渣およびスイゼンジノリ多糖体を含む溶液を得た。 Next, the water-washed lichenzinori original sample washed with water was washed with isopropanol to remove fat-soluble dyes, chlorophyll, carotenoid-based dyes, and the like contained in the suisuzinori original sample. The suizendinori cell body washed with isopropanol as described above is immersed in an aqueous 0.1N sodium hydroxide solution and stirred for 5 hours while maintaining the solution temperature at 80 ° C., thereby completely destroying the suizendinori cell body. In addition, biopolymers such as proteins and DNA contained in the suizendinori sample were decomposed to obtain a solution containing these destruction residue, degrading residue and suizendinori polysaccharide.
前記で得られた溶液をガーゼで濾過し、不純物を除去した後、当該溶液のpHがおよそ7〜8程度となるまで塩酸で中和した。その後、この溶液にイソプロパノールと水の混合溶媒(イソプロパノールと水の容量比:70:30)を添加し、撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体を精製し、回収した。 The solution obtained above was filtered with gauze to remove impurities, and then neutralized with hydrochloric acid until the pH of the solution reached about 7-8. Thereafter, a mixed solvent of isopropanol and water (volume ratio of isopropanol and water: 70:30) was added to this solution and stirred to purify and recover the suizendinori polysaccharide.
前記で回収されたスイゼンジノリ多糖体を再度、水中溶解させ、得られたスイゼンジノリ多糖体水溶液をイソプロピルアルコールに添加することによってスイゼンジノリ多糖体を脱水させ、繊維化させた。繊維化されたスイゼンジノリ多糖体の収率は、スイゼンジノリ原試料乾燥重量に対し約50〜80質量%であった。 The suizendinori polysaccharide recovered in the above was dissolved again in water, and the resulting suizendinori polysaccharide aqueous solution was added to isopropyl alcohol to dehydrate and fibrillate it. The yield of the fiberized Suizendinori polysaccharide was about 50 to 80% by mass based on the dry weight of the Suizendinori original sample.
以上のようにして精製されたスイゼンジノリ多糖体の重量平均分子量を多角度静的光散乱法(MALLS)にて以下の測定条件で測定した。その結果、当該スイゼンジノリ多糖体の重量平均分子量は、2000万であることが確認された。前記で精製されたスイゼンジノリ多糖体を以下の実施例で用いた。 The weight average molecular weight of the Suizendinori polysaccharide purified as described above was measured by the multi-angle static light scattering method (MALLS) under the following measurement conditions. As a result, it was confirmed that the weight average molecular weight of the Suizendinori polysaccharide was 20 million. The purified Suizendinori polysaccharide was used in the following examples.
〔測定条件〕
・装置:Wyatt Technology社製、商品名:Dawn Heleos II
・注入時の濃度:0.01質量%
・注入量:100μL
・流速:1mL/min
・溶媒:0.1M硝酸ナトリウム水溶液
・カラム:昭和電工(株)製、商品名:Shodex OHpak SB-807 HQおよび商品名:Shodex OHpak SB-804 HQ
・カラムの温度:40℃
・測定温度:25℃
・レーザーの波長:665.2nm
・測定角:13.0°、20.7°、29.6°、37.5°、44.8°、53.1°、61.1°
・セルのタイプ:溶融シリカ
・RI検出器:Wyatt Technology社製、商品名:Optilab T-rEX、レーザーの波長:658.0nm
〔Measurement condition〕
・ Equipment: Wyatt Technology, product name: Dawn Heleos II
・ Concentration at injection: 0.01% by mass
・ Injection volume: 100 μL
・ Flow rate: 1 mL / min
-Solvent: 0.1M sodium nitrate aqueous solution-Column: Showa Denko K.K., trade name: Shodex OHpak SB-807 HQ and trade name: Shodex OHpak SB-804 HQ
Column temperature: 40 ° C
・ Measurement temperature: 25 ℃
・ Laser wavelength: 665.2 nm
Measurement angle: 13.0 °, 20.7 °, 29.6 °, 37.5 °, 44.8 °, 53.1 °, 61.1 °
Cell type: fused silica RI detector: manufactured by Wyatt Technology, trade name: Optilab T-rEX, laser wavelength: 658.0 nm
実施例1
スイゼンジノリ多糖体0.5(質量/体積)%水溶液17mLおよびネイティブコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%水溶液33mLを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約40μmであった。
Example 1
By sufficiently stirring 17 mL of 0.5 (mass / volume)% aqueous solution of suizendinori polysaccharide and 33 mL of 0.5 (mass / volume) aqueous solution of native collagen (manufactured by Koken Co., Ltd.), A mixed solution containing was prepared. The mixed solution obtained above was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere at 35 ° C. for 2 days to obtain a suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet. When the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was peeled off from the plate and measured for its thickness, the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet was about 40 μm.
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを縦5mm、横5mmの正方形状に裁断し、得られた試験片を約15℃の純水中に24時間浸漬した後、浸漬前の質量および浸漬後の質量から式:
〔膨潤度(−)〕=〔(浸漬後の質量−浸漬前の質量)÷(浸漬前の質量)〕
に基づいて膨潤度を求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの膨潤度は、6.0であった。
Next, the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was cut into a 5 mm length and 5 mm width square shape, and the obtained test piece was immersed in pure water at about 15 ° C. for 24 hours, and then immersed. From the previous mass and the mass after immersion:
[Swelling degree (−)] = [(mass after immersion−mass before immersion) ÷ (mass before immersion)]
The degree of swelling was determined based on As a result, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was 6.0.
また、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを15℃の純水中に1時間した後、水中から取り出し、偏光顕微鏡で観察したところ、スイゼンジノリ多糖体分子およびコラーゲン分子が微細な配向ドメインがランダムに存在していることが確認された。 Moreover, when the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was left in pure water at 15 ° C. for 1 hour and then removed from the water and observed with a polarizing microscope, the Suizendinori polysaccharide molecule and the collagen molecule were finely oriented. It was confirmed that the domain existed at random.
実施例2
スイゼンジノリ多糖体0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液25mLおよびネイティブコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液25mLを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約40μmであった。
Example 2
25 mL of an aqueous solution containing 0.5 (mass / volume)% of suizendinori polysaccharide and 0.3 M sodium chloride and 0.5 (mass / volume)% of native collagen (manufactured by Koken Co., Ltd.) and 0.3 M sodium chloride By thoroughly stirring 25 mL of the aqueous solution containing the mixture, a mixed solution containing a suizendinori polysaccharide and collagen was prepared. The mixed solution obtained above was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere at 35 ° C. for 2 days to obtain a suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet. When the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was peeled off from the plate and measured for its thickness, the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet was about 40 μm.
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に1日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。 Thereafter, the suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above is immersed in a large excess of water for 1 day, so that the unreacted suizendinori polysaccharide, unreacted collagen, sodium ion contained in the dried product And the chlorine ion was removed, and it was made to dry in 35 degreeC atmosphere for 2 days, and the suizendinori polysaccharide-collagen composite film was obtained.
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例1と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は、10であった。 Next, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was determined in the same manner as in Example 1. As a result, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was 10.
また、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを15℃の純水中に1時間した後、水中から取り出し、得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の水膨潤物を偏光顕微鏡で観察したところ、色調の変化からスイゼンジノリ多糖体分子およびコラーゲン分子が配向していることが確認された。 In addition, the suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was left in pure water at 15 ° C. for 1 hour and then taken out from the water. When observed, it was confirmed from the change in color tone that the Suizendinori polysaccharide molecules and collagen molecules were oriented.
実施例3
スイゼンジノリ多糖体0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液25mLおよびアテロコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液25mLを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約40μmであった。
Example 3
Contains 25 mL of an aqueous solution containing 0.5 (mass / volume)% Suizendinori polysaccharide and 0.3 M sodium chloride and 0.5 (mass / volume)% of atelocollagen (manufactured by Koken) and 0.3 M sodium chloride By thoroughly stirring 25 mL of the aqueous solution to be prepared, a mixed solution containing a suizendinori polysaccharide and collagen was prepared. The mixed solution obtained above was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere at 35 ° C. for 2 days to obtain a suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet. When the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was peeled off from the plate and measured for its thickness, the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet was about 40 μm.
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に1日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。 Thereafter, the suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above is immersed in a large excess of water for 1 day, so that the unreacted suizendinori polysaccharide, unreacted collagen, sodium ion contained in the dried product And the chlorine ion was removed, and it was made to dry in 35 degreeC atmosphere for 2 days, and the suizendinori polysaccharide-collagen composite film was obtained.
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例1と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は61であった。 Next, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was determined in the same manner as in Example 1. As a result, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was 61.
実施例4
スイゼンジノリ多糖体0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液33mLおよびネイティブコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液17mLを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約40μmであった。
Example 4
33 mL of an aqueous solution containing 0.5 (mass / volume)% of suizendinori polysaccharide and 0.3 M sodium chloride and 0.5 (mass / volume)% of native collagen (manufactured by Koken Co., Ltd.) and 0.3 M sodium chloride By thoroughly stirring 17 mL of the aqueous solution containing the mixture, a mixed solution containing the suizendinori polysaccharide and collagen was prepared. The mixed solution obtained above was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere at 35 ° C. for 2 days to obtain a suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet. When the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was peeled off from the plate and measured for its thickness, the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet was about 40 μm.
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に1日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。 Thereafter, the suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above is immersed in a large excess of water for 1 day, so that the unreacted suizendinori polysaccharide, unreacted collagen, sodium ion contained in the dried product And the chlorine ion was removed, and it was made to dry in 35 degreeC atmosphere for 2 days, and the suizendinori polysaccharide-collagen composite film was obtained.
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例1と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は、3.1×102であった。 Next, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was determined in the same manner as in Example 1. As a result, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was 3.1 × 10 2 .
また、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを15℃の純水中に1時間した後、水中から取り出し、偏光顕微鏡で観察したところ、色調の変化からスイゼンジノリ多糖体分子およびコラーゲン分子が配向していることが確認された。 In addition, the suizendinori polysaccharide-collagen complex film obtained above was taken out of pure water at 15 ° C. for 1 hour, then taken out from water and observed with a polarizing microscope. Were confirmed to be oriented.
実施例5
スイゼンジノリ多糖体0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液33mLおよびアテロコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%および0.3M塩化ナトリウムを含有する水溶液17mLを十分に撹拌することにより、スイゼンジノリ多糖体およびコラーゲンを含む混合溶液を調製した。前記で得られた混合溶液を表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを得た。前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートをプレートから剥がし、その厚さを測定したところ、当該スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートの厚さは、約40μmであった。
Example 5
Contains 33 mL of an aqueous solution containing 0.5 (mass / volume)% Suizendinori polysaccharide and 0.3 M sodium chloride and 0.5 (mass / volume)% of atelocollagen (manufactured by Koken) and 0.3 M sodium chloride By thoroughly stirring 17 mL of the aqueous solution to be prepared, a mixed solution containing a suizendinori polysaccharide and collagen was prepared. The mixed solution obtained above was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere at 35 ° C. for 2 days to obtain a suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet. When the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above was peeled off from the plate and measured for its thickness, the thickness of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet was about 40 μm.
その後、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体シートを大過剰の水中に1日間浸漬することにより、当該乾燥体に含まれている未反応のスイゼンジノリ多糖体、未反応のコラーゲン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンを除去し、35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを得た。 Thereafter, the suizendinori polysaccharide-collagen composite sheet obtained above is immersed in a large excess of water for 1 day, so that the unreacted suizendinori polysaccharide, unreacted collagen, sodium ion contained in the dried product And the chlorine ion was removed, and it was made to dry in 35 degreeC atmosphere for 2 days, and the suizendinori polysaccharide-collagen composite film was obtained.
次に、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度を実施例1と同様にして求めた。その結果、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの膨潤度は、3.0×102であった。 Next, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was determined in the same manner as in Example 1. As a result, the swelling degree of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained above was 3.0 × 10 2 .
比較例1
スイゼンジノリ多糖体0.5(質量/体積)%を含有する水溶液50mLを表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、スイゼンジノリ多糖体フィルムを得た。
Comparative Example 1
50 mL of an aqueous solution containing 0.5% (mass / volume) of suizendinori polysaccharide was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere of 35 ° C. for 2 days to obtain a suizendinori polysaccharide film.
比較例2
アテロコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%を含有する水溶液50mLを表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、アテロコラーゲンフィルムを得た。
Comparative Example 2
50 mL of an aqueous solution containing 0.5 (mass / volume)% of atelocollagen [manufactured by Koken Co., Ltd.] was spray coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere of 35 ° C. for 2 days to obtain an atelocollagen film.
比較例3
ネイティブコラーゲン〔(株)高研製〕の0.5(質量/体積)%を含有する水溶液50mLを表面が平坦なポリプロピレン製のプレート上にスプレーコートした。前記プレートを35℃の雰囲気中で2日間乾燥させることにより、ネイティブコラーゲンフィルムを得た。
Comparative Example 3
50 mL of an aqueous solution containing 0.5 (mass / volume)% of native collagen (manufactured by Koken Co., Ltd.) was spray-coated on a polypropylene plate having a flat surface. The plate was dried in an atmosphere at 35 ° C. for 2 days to obtain a native collagen film.
実験例1
実施例2で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例3で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、比較例1で用いられたスイゼンジノリ多糖体、比較例2で用いられたアテロコラーゲン、および比較例3で用いられたネイティブコラーゲンの赤外吸収(IR)スペクトルを赤外吸収スペクトル装置(パーキンエルマー社製、商品名:Spectrum One)を用いて調べた。その結果を図1に示す。
Experimental example 1
Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 2, Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 3, Suizendinori polysaccharide used in Comparative Example 1, atelocollagen used in Comparative Example 2, And the infrared absorption (IR) spectrum of the native collagen used in Comparative Example 3 was examined using an infrared absorption spectrum apparatus (manufactured by PerkinElmer, trade name: Spectrum One). The result is shown in FIG.
図1に示された結果から、実施例2および3で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、比較例1で用いられたスイゼンジノリ多糖体、比較例2で用いられたアテロコラーゲンおよび比較例3で用いられたネイティブコラーゲンと対比して、アミドIIIに由来する1237cm-1のピークが減少および消失していないことから、コラーゲンが変性していないことが確認された。 From the results shown in FIG. 1, the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Examples 2 and 3 is the Suizendinori polysaccharide used in Comparative Example 1, the atelocollagen used in Comparative Example 2 and Comparative Example 3. Compared with the native collagen used in Example 1 , the 1237 cm −1 peak derived from amide III was not decreased and disappeared, confirming that the collagen was not denatured.
実験例2
実施例3で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例5で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および比較例2で用いられたアテロコラーゲンの赤外吸収(IR)スペクトルを赤外吸収スペクトル装置(パーキンエルマー社製、商品名:Spectrum One)を用いて調べた。その結果を図2に示す。
Experimental example 2
Infrared absorption (IR) spectra of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 3, the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 5 and the atelocollagen used in Comparative Example 2 It investigated using the spectrum apparatus (The Perkin-Elmer company make, brand name: Spectrum One). The result is shown in FIG.
図2に示された結果から、比較例1で用いられたスイゼンジノリ多糖体のアミノ基に由来する波数1537cm-1のピークが、実施例3で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および実施例5で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体では、いずれも波数1546cm-1にシフトしていることから、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが錯体(化学的結合)を形成していることが推察される。 From the results shown in FIG. 2, the peak at a wave number of 1537 cm −1 derived from the amino group of the suizendinori polysaccharide used in comparative example 1 is the suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in example 3 and the example. In the suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in 5, all were shifted to a wave number of 1546 cm −1 , so it was inferred that the suizendinori polysaccharide and collagen formed a complex (chemical bond). The
実験例3
実施例2で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体、実施例4で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および比較例3で用いられたネイティブコラーゲンの赤外吸収(IR)スペクトルを赤外吸収スペクトル装置(パーキンエルマー社製、商品名:Spectrum One)を用いて調べた。その結果を図3に示す。
Experimental example 3
Infrared absorption (IR) spectra of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 2, the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 4 and the native collagen used in Comparative Example 3 were infrared. It investigated using the absorption-spectrum apparatus (The product name: Spectrum One by the Perkin Elmer company). The result is shown in FIG.
図3に示された結果から、実施例2で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体および実施例4で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体では、いずれも、比較例3で用いられたスイゼンジノリ多糖体のアミノ基に由来する波数1537cm-1のピークが波数1545cm-1にシフトしていることから、スイゼンジノリ多糖体とコラーゲンとが錯体(化学的結合)を形成していることが推察される。 From the results shown in FIG. 3, all of the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 2 and the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained in Example 4 were used in Comparative Example 3. Since the peak of wave number 1537 cm −1 derived from the amino group of the suizendinori polysaccharide is shifted to the wavenumber of 1545 cm −1 , it is assumed that the suizendinori polysaccharide and collagen form a complex (chemical bond). The
実験例4
実施例2で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムおよび実施例5で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの物性として、異方性、圧縮弾性率および架橋点間分子量を以下の方法に基づいて調べた。その結果、実施例2で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの異方性は9.3であり、圧縮弾性率は108kPaであり、架橋点間分子量は7.5g/molであり、実施例4で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムの異方性は46であり、圧縮弾性率は5kPaであり、架橋点間分子量は29.0g/molであった。
Experimental Example 4
As physical properties of the Suizen Ginori polysaccharide-collagen composite film obtained in Example 2 and the Suizen Ginori polysaccharide-collagen composite film obtained in Example 5, the anisotropy, compression modulus and molecular weight between cross-linking points were as follows: Investigated based on the method. As a result, the anisotropy of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained in Example 2 was 9.3, the compression modulus was 108 kPa, and the molecular weight between cross-linking points was 7.5 g / mol. The anisotropy of the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained in Example 4 was 46, the compression modulus was 5 kPa, and the molecular weight between crosslinks was 29.0 g / mol.
〔異方性の測定方法〕
正立型生物顕微鏡〔オリンパス(株)製〕の光路に2枚の偏光子を互いに偏光方向が直交するようにして挿入し、その間にサンプル(スイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体の水膨潤物)をエッジ部分が光路に平行になるように設置した後、さらに波長530nmの偏光カラーフィルターを鋭敏色板としてサンプルの上方に挿入した。
[Method of measuring anisotropy]
Two polarizers are inserted into the optical path of an upright biological microscope (Olympus Co., Ltd.) so that the polarization directions are orthogonal to each other, and a sample (water swollen suizendinori polysaccharide-collagen complex) is inserted therebetween. After setting the edge portion so as to be parallel to the optical path, a polarizing color filter having a wavelength of 530 nm was further inserted as a sensitive color plate above the sample.
次に、鋭敏色板の偏光方向を前記偏光子に対して45°の方向になるように調整した後、白色光を下方から照射することにより、上方からサンプルの色を観察した。 Next, after adjusting the polarization direction of the sensitive color plate to be 45 ° with respect to the polarizer, the color of the sample was observed from above by irradiating white light from below.
〔圧縮弾性率の測定方法〕
各フィルムを縦約5mm、横約5mmの正方形状に裁断することにより、試験片を作製した。得られた試験片を約15℃の純水中に24時間浸漬した後、試験片の圧縮強度を圧縮試験機(INSTRON社製、型番:3365)で測定し、変位を縦軸に圧縮応力を横軸にとることによって描かれたグラフの傾きを求めることにより圧縮弾性率を算出した。
[Method of measuring compression modulus]
Each film was cut into a square shape having a length of about 5 mm and a width of about 5 mm to prepare a test piece. After the obtained test piece was immersed in pure water at about 15 ° C. for 24 hours, the compressive strength of the test piece was measured with a compression tester (manufactured by INSTRON, model number: 3365), and the displacement was plotted on the vertical axis with the compression stress. The compression modulus was calculated by determining the slope of the graph drawn by taking the horizontal axis.
〔架橋点間分子量の計算方法〕
架橋点間分子量は、式:
[架橋点間分子量(g/mol)]
=3×[水の密度(103kg/m3)/膨潤度)]
×[気体定数(8.31m2kg・s-2・K-1・mol-1)]
×[水温(300K)/圧縮弾性率(kPa)]
に基づいて求めた。
[Calculation method of molecular weight between cross-linking points]
The molecular weight between crosslink points is given by the formula:
[Molecular weight between cross-linking points (g / mol)]
= 3 × [density of water (10 3 kg / m 3 ) / degree of swelling)]
× [Gas constant (8.31 m 2 kg · s -2 · K -1 · mol -1 )]
× [Water temperature (300K) / Compressive elastic modulus (kPa)]
Based on.
実験例5
実施例2で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体フィルムを70%エタノール水溶液に24時間浸漬することにより、滅菌処理を行なった。その後、当該フィルムを滅菌リン酸緩衝液(PBS)で洗浄し、10%ウシ胎児県政含有ダルベッコ改変イーグル基礎培地(DMEM)に24時間浸漬し、膨潤ゲルとした。
Experimental Example 5
Sterilization was carried out by immersing the Suizendinori polysaccharide-collagen composite film obtained in Example 2 in a 70% ethanol aqueous solution for 24 hours. Thereafter, the film was washed with a sterile phosphate buffer (PBS) and immersed in Dulbecco's modified Eagle basal medium (DMEM) containing 10% fetal bovine prefectural government for 24 hours to obtain a swollen gel.
前記で得られた膨潤ゲルを15mmポンチで打ち抜き、24wellカルチャープレート〔旭硝子(株)製、IWAKIブランドマイクロプレート、品種コード:3820−024〕に静置し、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)500μLを添加した。 The swollen gel obtained above was punched out with a 15 mm punch, left still on a 24-well culture plate [Asahi Glass Co., Ltd., IWAKI brand microplate, product code: 3820-024], and Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 500 μL was added. did.
細胞接着試験に使用した細胞は、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(MSC)(独立行政法人理化学研究所、理化学研究所バイオリソースセンターから入手)を用いた。なお、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(MSC)は、継代数3のものを用いた。 Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (MSC) (obtained from RIKEN and RIKEN BioResource Center) were used as cells used for the cell adhesion test. Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (MSC) were used at passage 3.
次に、50000/mLの密度に調製した骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(MSC)懸濁液1mLを各wellに整地されたゲル上に播種し、24時間経過後、細胞の接着および伸展を観察した。なお、陽性対象として、24wellプレートの未処理wellに同数の骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(MSC)を播種し、観察した。 Next, 1 mL of bone marrow-derived human mesenchymal stem cell (MSC) suspension prepared to a density of 50000 / mL is seeded on a gel prepared in each well, and after 24 hours, cell adhesion and extension are observed. did. As a positive target, the same number of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (MSC) were seeded on an untreated well of a 24 well plate and observed.
細胞の接着および伸展は、位相差顕微鏡および染色用色素〔(株)同仁化学研究所製、商品名:Calcei−AM〕で染色された生細胞の蛍光像を蛍光顕微鏡で観察することによって評価した。その結果を図4に示す。 Cell adhesion and extension were evaluated by observing a fluorescence image of living cells stained with a phase-contrast microscope and a dye for staining (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc., trade name: Calcei-AM) with a fluorescence microscope. . The result is shown in FIG.
前記で培養された細胞は、いずれも生きており、しかも良好に培地の膨潤ゲルに接着していた。また、dish 1およびdish 2で培養された細胞の写真を図4に示すが、図4の白色で示されているように、細胞が培地の膨潤ゲルで伸展していることがわかる。さらに、細胞は、膨潤ゲルの表面に沿って均一に接着していることが確認された。 The cells cultured as described above were all alive and adhered well to the swelling gel of the medium. Moreover, although the photograph of the cell cultured by dish1 and dish2 is shown in FIG. 4, it turns out that the cell is extended with the swelling gel of a culture medium as it is shown with the white of FIG. Furthermore, it was confirmed that the cells adhered uniformly along the surface of the swollen gel.
以上の結果から、前記で得られたスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、細胞に対する親和性に優れているのみならず、細胞に対する接着性にも優れ、さらに細胞が伸展しやすいという優れた性質を有するものであることがわかる。 From the above results, the Suizendinori polysaccharide-collagen complex obtained above has not only excellent affinity for cells, but also excellent properties such as excellent adhesion to cells and easy cell extension. It turns out that it has.
本発明のスイゼンジノリ多糖体−コラーゲン複合体は、細胞を培養させる際の培地として使用したときに細胞に対する接着性に優れ、細胞が伸展しやすいことから、細胞培養シートをはじめ、例えば、手術の際の臓器などが癒着することを防止するための臓器癒着防止膜、創傷治療用絆創膏、創傷被覆膜、冷却用シート、臓器保存用クッションシート、体液吸い取りシートなどの種々の用途に使用することが期待されるものである。 The suizendinori polysaccharide-collagen complex of the present invention has excellent adhesion to cells when used as a medium for culturing cells, and the cells are easy to expand. It can be used for various applications such as organ adhesion-preventing membranes for preventing the adhesion of various organs, wound bandages, wound-covering membranes, cooling sheets, organ preservation cushion sheets, body fluid absorbing sheets, etc. Expected.
Claims (4)
The method for producing a suizendinori polysaccharide-collagen complex according to claim 3, wherein the mixed solution contains an inorganic salt.
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