JP5633880B2 - Collagen molded body and method for producing the same - Google Patents

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本発明は、コラーゲン成形体及びその製造方法に関し、前記コラーゲン成形体は、細胞培養基材、再生医療用の足場材料、移植用材料、創傷被覆材、癒着防止材及び薬物輸送担体等に好適な材料である。   The present invention relates to a collagen molded body and a method for producing the same, and the collagen molded body is suitable for a cell culture substrate, a scaffold material for regenerative medicine, a transplant material, a wound dressing material, an adhesion prevention material, a drug transport carrier and the like. Material.

コラーゲンは、生体内のタンパク質の３０％を占め、骨格支持及び細胞接着などの機能を有する重要なタンパク質であり、例えば、骨・軟骨、靭帯・腱、角膜実質、皮膚、肝臓、筋肉などの組織は、コラーゲン線維からできている。このコラーゲンを用いた成形体（生体材料）は、細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨・骨・脊椎・髄核・靭帯・角膜実質・皮膚・血管・神経・肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、止血材料、癒着防止材など）又は薬物送達担体として有用であり、特に再生医療による大型組織再生、細胞の分散防止、及び細胞の分化誘導には必要不可欠である。   Collagen is an important protein that accounts for 30% of in vivo proteins and has functions such as skeletal support and cell adhesion. For example, bone, cartilage, ligament / tendon, corneal stroma, tissue such as skin, liver, muscle Is made of collagen fibers. Molded bodies (biomaterials) using this collagen are cell culture substrates, scaffold materials for regenerative medicine (for example, cartilage, bone, spine, nucleus pulposus, ligament, corneal stroma, skin, blood vessel, nerve, liver tissue) Regenerative materials), transplantation materials (wound dressing materials, bone filling materials, hemostatic materials, adhesion prevention materials, etc.) or drug delivery carriers, especially large tissue regeneration by regenerative medicine, cell dispersion prevention, and cell differentiation Indispensable for guidance.

しかし、コラーゲン成形体は、力学特性が十分でないため、操作が難しく、臨床現場における使用は限定されていた。一般的に、コラーゲン線維化成形体及びコラーゲン非線維化成形体は、水や細胞培養液中で膨潤し易く、また、これを細胞培養基材として用いた場合には、培養期間が数日以上に渡ると形態が変化したり、あるいはコラーゲンが徐々に分解して溶出したりすることがあった。そのため、移植すると、播種した細胞が分散してしまい、所望の組織部位に留まることが困難であったりした。   However, since the collagen molded body has insufficient mechanical properties, it is difficult to operate, and its use in clinical settings is limited. In general, a collagen fibrillated molded body and a collagen non-fibrotic molded body easily swell in water or a cell culture medium. When this is used as a cell culture substrate, the culture period is several days or more. The morphology may change, or the collagen may gradually decompose and elute. Therefore, when transplanted, the seeded cells are dispersed and it is difficult to stay at a desired tissue site.

特開２００５−２６１２９２号公報JP 2005-261292 A 特開２００６−２５７０１４号公報JP 2006-257014 A 特開２０１０−１９３８０８号公報JP 2010-193808 A 国際公開第２０１２／０７０６７９号パンフレットInternational Publication No. 2012/070679 Pamphlet

コラーゲン成形体の膨潤、又は溶出を防ぐ対策として、コラーゲン又はコラーゲン線維同士を架橋処理することが行われている（特許文献１）。架橋処理方法として、物理的架橋法及び化学的架橋法が知られている。化学的架橋法とは、グルタルアルデヒドに代表されるアルデヒド類、又はカルボジイミド類等の架橋剤を用いて架橋する方法であり、物理的架橋法とは、γ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、又は熱脱水等によって架橋する方法である。   As a measure for preventing swelling or elution of a collagen molded body, a cross-linking treatment of collagen or collagen fibers has been performed (Patent Document 1). As a crosslinking treatment method, a physical crosslinking method and a chemical crosslinking method are known. The chemical crosslinking method is a method of crosslinking using an aldehyde represented by glutaraldehyde or a crosslinking agent such as carbodiimide, and the physical crosslinking method is γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, electron beam irradiation, This is a method of crosslinking by plasma irradiation or thermal dehydration.

しかし、コラーゲン成形体を化学的架橋した場合は、架橋剤または架橋剤の分解物がコラーゲン成形体に残存する可能性があるため、用途によっては不都合なことがあった。例えば、前記細胞培養基材は、細胞と接触させるものであり、その中に化学的架橋に用いる架橋剤または架橋剤の分解物が含まれている場合、細胞の増殖に影響を与える可能性がある。また、再生医療用の足場材料、移植用材料、創傷被覆材、癒着防止材又は薬物輸送担体は、生体内において使用するものであり、架橋剤または架橋剤の分解物による生体内の組織や器官への影響、即ち、毒性・アレルギーなど、が懸念された。   However, when the collagen molded body is chemically cross-linked, there is a possibility that a cross-linking agent or a decomposition product of the cross-linking agent may remain in the collagen molded body. For example, if the cell culture substrate is in contact with cells and contains a cross-linking agent used for chemical cross-linking or a degradation product of the cross-linking agent, it may affect cell growth. is there. In addition, scaffold materials, transplant materials, wound dressings, adhesion prevention materials, or drug transport carriers for regenerative medicine are used in vivo, and tissues and organs in vivo due to a crosslinking agent or a degradation product of the crosslinking agent. There were concerns about the effects on the body, ie toxicity and allergies.

本発明者らは、架橋剤を使用しないコラーゲン成形体（例えば、コラーゲン膜及びコラーゲン多孔体）の物理的架橋法について、鋭意研究した結果、従来のように乾燥したコラーゲン成形体に、γ線照射などの物理的架橋を行った場合、架橋したコラーゲン膜及びコラーゲン多孔体は、液体中又は生体内において、時間の経過とともに溶解し形状を維持することができないことを見出した。特に、細胞の増殖の足場として最適なコラーゲン多孔体は、強度も大きくないため、溶解又は膨潤が大きかった。
従って、本発明の目的は、細胞培養液又は体液等により、溶解、収縮、又は膨張などの変化が起こりにくい、コラーゲン成形体（特には、コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、及びコラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体）、及びその製造方法を提供することである。 As a result of diligent research on physical crosslinking methods for collagen molded bodies (for example, collagen membranes and collagen porous bodies) that do not use a cross-linking agent, the inventors of the present invention applied γ-ray irradiation to a collagen molded body that had been dried as before. In the case where physical cross-linking such as the above is performed, it has been found that the cross-linked collagen membrane and the collagen porous body cannot be dissolved and maintained in shape in the liquid or in vivo. Particularly, a collagen porous body that is optimal as a scaffold for cell proliferation has a high dissolution or swelling due to its low strength.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a collagen molded body (in particular, a collagen molded body including a collagen membrane, and a collagen membrane and a collagen porous body), which hardly undergo changes such as dissolution, contraction, or expansion due to cell culture fluid or body fluid. Collagen molded body including a laminate with the body) and a method for producing the same.

本発明者は、液体中で溶解、収縮、又は膨張などの変化が起こりにくいコラーゲン成形体について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、コラーゲン膜を液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射などの物理的架橋を行い、重量法による密度が０．４ｇ／ｃｍ３以上、且つ湿潤下での引張強度を１ＭＰａ以上とすることにより、液体中で溶解せず、且つ高強度のコラーゲン膜を製造できることを見出した。更に、コラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射などの物理的架橋を行うことにより、強度の高いコラーゲン膜と、細胞の増殖の足場として優れたコラーゲン多孔体を含む、液体中での溶解が起きにくいコラーゲン成形体を製造できることを見出した。更に、前記物理的架橋をポリエチレングリコール誘導体の存在下で行うことにより、優れた強度のコラーゲン成形体を得ることができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体であって、前記コラーゲン膜が、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理することによって得られ、重量法による密度が０．４ｇ／ｃｍ３以上であり、そして湿潤下での引張強度が１ＭＰａ以上であることを特徴とする、コラーゲン成形体、
［２］前記コラーゲン成形体が、架橋処理コラーゲン膜と線維化又は非繊維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体であって、
前記架橋処理コラーゲン多孔体が、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理することによって得られる、［１］に記載のコラーゲン成形体、
［３］前記架橋処理が、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下での架橋処理である、［１］又は［２］に記載のコラーゲン成形体、
［４］前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が１，０００〜１５，０００である、［１］〜［３］のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
［５］前記液体のｐＨが３．０〜１０．０である、［１］〜［４］のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
［６］前記γ線照射の照射量が、５〜５０ｋＧｙである、［１］〜［５］のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
［７］ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に３７℃で５日間浸漬した場合の溶解率が１０質量％以下である、［１］〜［６］のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
［８］ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に３７℃で５日間浸漬した後の、浸漬前に対する面積変化率が５％以内である、［１］〜［７］のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
［９］（１）コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、（２）前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、（３）前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、及び（４）前記線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程、を含む線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法、
［１０］（１）コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、（２）前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、（３）前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、（３ａ）（Ａ）前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは、（Ｂ）前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、（３ｂ）前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、（４）前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程を含む、線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含む［９］に記載のコラーゲン成形体の製造方法、
［１１］前記乾燥工程（３）が、脱塩した線維化コラーゲンゲルを、上部及び下部を被覆して通気性を遮断した被覆上部と被覆下部との間に、非被覆の外周部を設け、当該外周部から脱媒して乾燥させる工程である、［９］又は［１０］に記載のコラーゲン成形体の製造方法、
［１２］前記液体、前記コラーゲン溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも１つが、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）で表されるポリエチレングリコール誘導体を含む、［９］〜［１１］のいずれかに記載のコラーゲン成形体の製造方法、
［１３］（１）酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、（２）前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、（３）前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、及び（４）前記非線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程、を含む非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法、
［１４］（１）酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、（２）前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、（３）前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、（３ａ）（Ａ）前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは（Ｂ）前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、（３ｂ）前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、（４）前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程、を含む、非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含む［１３］に記載のコラーゲン成形体の製造方法、
［１５］前記液体、前記コラーゲン膜作製用コラーゲン酸性溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも１つが、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）で表されるポリエチレングリコール誘導体を含む、［１３］又は［１４］に記載のコラーゲン成形体の製造方法、及び
［１６］［９］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法によって得ることのできるコラーゲン成形体、
に関する。 As a result of intensive studies on a collagen molded body in which changes such as dissolution, contraction, or expansion hardly occur in a liquid, the present inventor has surprisingly found that a collagen membrane is irradiated with γ-rays, electron beams in the presence of liquid. Does not dissolve in liquid by performing physical cross-linking such as irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation, density by gravimetric method is 0.4 g / cm 3 or more, and tensile strength under wet condition is 1 MPa or more. And it discovered that a high intensity | strength collagen membrane could be manufactured. Further, the collagen membrane and the porous collagen body are subjected to physical cross-linking such as γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid, whereby a high strength collagen film and The present inventors have found that a collagen molded body that includes a collagen porous body excellent as a scaffold for cell growth and hardly dissolves in a liquid can be produced. Furthermore, it has been found that a collagen molded body having excellent strength can be obtained by performing the physical crosslinking in the presence of a polyethylene glycol derivative.
The present invention is based on these findings.
Therefore, the present invention
[1] A collagen molded body comprising a fibrillated or non-fibrotic crosslinked collagen membrane, wherein the collagen membrane is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid. A collagen molded body, characterized in that the density by gravimetric method is 0.4 g / cm 3 or more and the tensile strength under wet condition is 1 MPa or more,
[2] The collagen molded body includes a laminate of a cross-linked collagen membrane and a fibrous or non-fibrotic cross-linked collagen porous body,
The collagen molded body according to [1], wherein the cross-linked collagen porous body is obtained by performing a cross-linking treatment by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid,
[3] The crosslinking treatment is performed by using the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms A collagen molded product according to [1] or [2], which is a crosslinking treatment in the presence of a polyethylene glycol derivative represented by formula (5): n is an alkylene group of 5 and n is an integer of 1 to 500:
[4] The collagen molded body according to any one of [1] to [3], wherein the polyethylene glycol derivative has a molecular weight of 1,000 to 15,000.
[5] The collagen molded body according to any one of [1] to [4], wherein the liquid has a pH of 3.0 to 10.0.
[6] The collagen molded body according to any one of [1] to [5], wherein an irradiation amount of the γ-ray irradiation is 5 to 50 kGy,
[7] Collagen according to any one of [1] to [6], wherein the dissolution rate when immersed in Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) at 37 ° C. for 5 days is 10% by mass or less. Molded body,
[8] Any of [1] to [7], wherein the area change rate after immersion in Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) at 37 ° C. for 5 days is within 5%. A collagen molded body according to claim 1,
[9] (1) A step of forming a fibrillated collagen gel by placing a collagen solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less in a molding machine to fibrillate the collagen, (2 ) A step of desalting the fibrotic collagen gel by sequentially immersing it in a mixed solution of water-miscible organic solvent and water whose concentration of water-miscible organic solvent is increased stepwise; (3) the desalted fibrosis A step of drying a collagen gel to obtain a fibrillated collagen membrane, and (4) a step of crosslinking the fibrillated collagen membrane by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid, A method for producing a collagen molded product comprising a fibrillated cross-linked collagen membrane comprising
[10] (1) A step of forming a fibrillated collagen gel by placing a collagen solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less in a molding machine to fibrillate the collagen, (2 ) A step of desalting the fibrotic collagen gel by sequentially immersing it in a mixed solution of water-miscible organic solvent and water whose concentration of water-miscible organic solvent is increased stepwise; (3) the desalted fibrosis A step of drying a collagen gel to obtain a fibrillated collagen membrane, (3a) (A) the fibrillated collagen membrane, and a fibrillated collagen gel for producing a porous body having a collagen concentration of 0.5% by mass to 3.0% by mass Or (B) contacting the fibrillated collagen membrane with a collagen acidic solution for preparing a porous body having a collagen concentration of 5.0% by mass or less, and (3b) freeze-drying the contact product. To obtain a laminate, and (4) a fibrosis-crosslinked collagen membrane comprising a step of crosslinking the laminate by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid. And a method for producing a collagen molded article according to [9], comprising a laminate of a crosslinked collagen porous body,
[11] In the drying step (3), an uncoated outer peripheral portion is provided between the coated upper portion and the coated lower portion in which the desalted fibrotic collagen gel is covered with the upper and lower portions to block air permeability, The method for producing a collagen molded body according to [9] or [10], which is a step of removing the solvent from the outer peripheral portion and drying it.
[12] At least one selected from the group consisting of the liquid, the collagen solution, the fibrillated collagen gel for producing the porous body, and the collagen acidic solution for producing the porous body is represented by the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms A method for producing a collagen molded product according to any one of [9] to [11], comprising a polyethylene glycol derivative represented by the formula (5): n is an alkylene group of 5 and n is an integer of 1 to 500:
[13] (1) A step of dissolving collagen in an acidic solution to obtain a collagen acidic solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, (2) placing the collagen acidic solution in a molding machine, A step of molding, (3) a step of drying the acidic collagen solution to obtain a non-fibrotic collagen membrane, and (4) the non-fibrotic collagen membrane in the presence of a liquid, γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma A method for producing a collagen molded body comprising a non-fibrotic cross-linked collagen membrane, comprising a step of cross-linking by irradiation or UV irradiation,
[14] (1) A step of dissolving collagen in an acidic solution to obtain a collagen acidic solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, (2) putting the collagen acidic solution in a molding machine, A step of molding, (3) a step of drying the acidic collagen solution to obtain a non-fibrotic collagen membrane, (3a) (A) the non-fibrotic collagen membrane, and a collagen concentration of 0.5 mass% or more and 3.0 mass Or (B) contacting the non-fibrotic collagen membrane with an acidic collagen solution for preparing a porous material having a collagen concentration of 5.0% by mass or less. (3b) a step of freeze-drying the contact product to obtain a laminate, and (4) crosslinking the laminate by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid. Method for producing a collagen molded article according step, in [13], including, including a laminate of a non-fibrotic crosslinking collagen film with crosslinking collagen porous body of,
[15] At least one selected from the group consisting of the liquid, the collagen acidic solution for preparing the collagen membrane, the fibrotic collagen gel for preparing the porous material, and the collagen acidic solution for preparing the porous material is represented by the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms And a method for producing a collagen molded article according to [13] or [14], comprising a polyethylene glycol derivative represented by formula (5), wherein n is an integer of 1 to 500: 9] to [15] Collagen molded body that can be obtained by a production method,
About.

本発明の架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体は、液体中で溶解しにくく、従って液体中でまたは細胞培養中に、収縮、又は膨潤などの体積変化が起こりにくい。また、本発明の架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体によれば、強度の高いコラーゲン膜と、細胞の増殖の足場として優れたコラーゲン多孔体を含み、溶液中での膨潤、及び溶解が起きにくいことから、再生医療用の足場材料、移植用材料、創傷被覆材、癒着防止材又は薬物輸送担体として、好適に用いることができる。また、本発明のコラーゲン成形体は、物理的架橋処理によって滅菌されており、細胞培養基材としての使用、又は生体内での使用に適している。
また、本発明の成形体は、ポリエチレングリコール誘導体の存在下で架橋処理されることによって、ポリエチレングリコール誘導体がコラーゲン分子または線維同士を架橋し、強度が向上する。更に、コラーゲン分子又は線維に結合したポリエチレングリコール誘導体の片側末端に成長因子またはペプチドなどを結合させるのに好適である。
更に、本発明の製造方法は本発明のコラーゲン成形体を製造することができる。従って、本発明の製造方法によって得られるコラーゲン成形体は、例えば細胞培養液中に数日間浸漬しても分解し難く且つ膨張や収縮が極めて少ない。従って、細胞培養基材、再生医療用の足場材料、移植用材料、創傷被覆材、癒着防止材、又は薬物輸送担体等に適した材料である。 The collagen molded body including the cross-linked collagen membrane of the present invention is hardly dissolved in a liquid, and therefore, volume change such as contraction or swelling is unlikely to occur in the liquid or cell culture. In addition, according to the collagen molded body including the laminate of the crosslinked collagen membrane of the present invention and the crosslinked collagen porous body, the collagen molded body having high strength and a collagen porous body excellent as a scaffold for cell proliferation are contained in a solution. Since it does not easily swell and dissolve, it can be suitably used as a scaffold material for regenerative medicine, a transplant material, a wound dressing material, an adhesion prevention material, or a drug transport carrier. Moreover, the collagen molded body of the present invention is sterilized by a physical cross-linking treatment and is suitable for use as a cell culture substrate or in vivo.
In addition, the molded article of the present invention is crosslinked in the presence of a polyethylene glycol derivative, whereby the polyethylene glycol derivative crosslinks collagen molecules or fibers to improve strength. Furthermore, it is suitable for binding a growth factor or a peptide to one end of a polyethylene glycol derivative bound to a collagen molecule or fiber.
Furthermore, the manufacturing method of this invention can manufacture the collagen molded object of this invention. Therefore, the collagen molded body obtained by the production method of the present invention is hardly decomposed even when immersed in a cell culture solution for several days, and has very little expansion and contraction. Therefore, it is a material suitable for a cell culture substrate, a scaffold material for regenerative medicine, a transplant material, a wound dressing material, an adhesion prevention material, a drug transport carrier, or the like.

実施例１（２５ｋＧｙ照射）及び比較例１（未照射）で得られたコラーゲン成形体の引張応力を測定した結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having measured the tensile stress of the collagen molding obtained in Example 1 (25 kGy irradiation) and Comparative Example 1 (non-irradiation). 実施例１（２５ｋＧｙ照射）、実施例２（１０ｋＧｙ照射）及び比較例１（未照射）で得られたコラーゲン成形体を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中において、３７℃で５日間インキュベートした後のＰＢＳ中の分子量分布をＧＰＣで分析した結果を示すグラフである。After incubating collagen molded bodies obtained in Example 1 (25 kGy irradiation), Example 2 (10 kGy irradiation) and Comparative Example 1 (unirradiated) in a phosphate buffer solution (PBS) at 37 ° C. for 5 days It is a graph which shows the result of having analyzed molecular weight distribution in PBS of GPC by GPC. 架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体の模式図及び写真を示した図である。It is the figure which showed the schematic diagram and photograph of a laminated body of a crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body. 実施例３で得られた、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体を、ＰＢＳ中で３７℃、２４時間インキュベーションした場合の、変形を検討した写真である。It is the photograph which examined the deformation | transformation when the collagen molded object containing the laminated body of the crosslinked collagen membrane obtained by Example 3 and a crosslinked collagen porous body was incubated at 37 degreeC for 24 hours in PBS. 実施例３で得られた、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の、コラーゲン膜（緻密面）及びコラーゲン多孔体（多孔面）の電子顕微鏡写真である。It is an electron micrograph of a collagen membrane (dense surface) and a collagen porous body (porous surface) of a collagen molded body including a laminate of a crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body obtained in Example 3. 実施例４、５、又は６の引張強度試験に用いる試料形状の模式図である。It is a schematic diagram of the sample shape used for the tensile strength test of Example 4, 5, or 6.

[１]コラーゲン成形体
本発明のコラーゲン成形体は、線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体である。そして、前記コラーゲン膜は、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理することによって得られ、重量法による密度が０．４ｇ／ｃｍ３以上であり、そして湿潤下での引張強度が１ＭＰａ以上である。
また本発明のコラーゲン成形体は、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含んでもよい。そして、前記架橋処理コラーゲン多孔体は、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理することによって得られるものである。
本発明のコラーゲン成形体は、限定されるものではないが、後述のコラーゲン成形体の製造方法によって製造することができる。
以下、上記いずれかに係る本発明のコラーゲン成形体を「本発明の成形体」と称する。 [1] Collagen molded body The collagen molded body of the present invention is a collagen molded body including a fibrillated or non-fibrotic crosslinked collagen membrane. The collagen membrane is obtained by performing a crosslinking treatment by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid, and has a density by a gravimetric method of 0.4 g / cm 3 or more. And the tensile strength under wet condition is 1 MPa or more.
Moreover, the collagen molded body of the present invention may include a laminate of a crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body. The crosslinked collagen porous body is obtained by performing a crosslinking treatment by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid.
Although the collagen molded object of this invention is not limited, it can be manufactured with the manufacturing method of the collagen molded object mentioned later.
Hereinafter, the collagen molded body of the present invention according to any one of the above will be referred to as “the molded body of the present invention”.

本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜としては、線維化架橋処理コラーゲン膜又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を挙げることができる。線維化架橋処理コラーゲン膜、及び非線維化架橋処理コラーゲン膜は、後述のコラーゲン成形体の製造方法に記載の手順に従って製造することができる。
また、本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン多孔体としては、線維化架橋処理コラーゲン多孔体又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体を挙げることができる。線維化架橋処理コラーゲン多孔体及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体は、後述のコラーゲン成形体の製造方法に記載の手順に従って製造することができる。 Examples of the crosslinked collagen membrane contained in the molded article of the present invention include a fibrillated crosslinked collagen membrane or a non-fibrotic crosslinked collagen membrane. The fibrillated cross-linked collagen membrane and the non-fibrotic cross-linked collagen membrane can be produced according to the procedure described in the method for producing a collagen molded body described later.
Examples of the crosslinked collagen porous body contained in the molded article of the present invention include a fibrillated crosslinked collagen porous body or a non-fibrotic crosslinked collagen porous body. The fibrillated cross-linked collagen porous body and the non-fibrotic cross-linked collagen porous body can be produced according to the procedure described in the method for producing a collagen molded body described later.

《架橋処理コラーゲン膜》
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜は、重量法による密度が０．４ｇ／ｃｍ３以上であり、好ましくは０．５ｇ／ｃｍ３以上であり、より好ましくは０．６ｇ／ｃｍ３以上であり、更に好ましくは０．６５ｇ／ｃｍ３以上であり、最も好ましくは０．７０ｇ／ｃｍ３以上である。密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満であると架橋の効果を十分に得ることができず、機械的強度が不足することがある。また、密度の上限は、特に限定されるものではないが、１．２ｇ／ｃｍ３以下が好ましく、１．１５ｇ／ｃｍ３以下がより好ましく、１．１ｇ／ｃｍ３以下が最も好ましい。重量法による密度は、架橋処理コラーゲン膜の重量を体積で割ることによって計算することができる。 <Crosslinked collagen membrane>
The cross-linked collagen membrane contained in the molded article of the present invention has a density by a gravimetric method of 0.4 g / cm 3 or more, preferably 0.5 g / cm 3 or more, more preferably 0.6 g / cm 3. Or more, more preferably 0.65 g / cm 3 or more, and most preferably 0.70 g / cm 3 or more. When the density is less than 0.4 g / cm 3 , the effect of crosslinking cannot be sufficiently obtained, and the mechanical strength may be insufficient. The upper limit of the density is not particularly limited, preferably 1.2 g / cm 3 or less, more preferably 1.15 g / cm 3 or less, 1.1 g / cm 3 or less is most preferred. The density by the gravimetric method can be calculated by dividing the weight of the cross-linked collagen membrane by the volume.

本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜は、湿潤下での引張強度が１ＭＰａ以上であり、より好ましくは２．０ＭＰａ以上であり、更に好ましくは２．５ＭＰａ以上であり、最も好ましくは３．０ＭＰａ以上である。湿潤下での引張強度が１ＭＰａ以上であることによって、溶液中又は生体内において、十分な強度を得ることができる。例えば、架橋処理コラーゲン膜の強度については、架橋処理コラーゲン膜を、Ｄ−ＰＢＳ中に２０℃で、１日間浸漬した後に湿潤状態のまま測定した該膜の引張強度を測定することによって評価することができる。平均膜厚が１μｍ〜２ｍｍの範囲内において引張強度が１ＭＰａ以上であれば、強度が高いと判断する目安となる。ここで、平均膜厚とは、最低５箇所の膜厚を計測して求めた平均値である。   The cross-linked collagen membrane contained in the molded article of the present invention has a tensile strength under wetness of 1 MPa or more, more preferably 2.0 MPa or more, still more preferably 2.5 MPa or more, and most preferably 3 0.0 MPa or more. When the tensile strength under humidity is 1 MPa or more, sufficient strength can be obtained in a solution or in vivo. For example, the strength of the cross-linked collagen membrane is evaluated by measuring the tensile strength of the cross-linked collagen membrane measured in a wet state after being immersed in D-PBS at 20 ° C. for 1 day. Can do. When the average film thickness is in the range of 1 μm to 2 mm and the tensile strength is 1 MPa or more, it is a standard for determining that the strength is high. Here, the average film thickness is an average value obtained by measuring the film thickness of at least five locations.

具体的には、引張強度試験は、常法に従って行うことができる。すなわち、幅１〜１０ｍｍ、長さ１０〜３０ｍｍの試験片を、ロードセル間の距離が５〜１０ｍｍとなるように両端を固定し、速度０．５ｍｍ／分で引っ張り、破断時の伸び（％）及び応力（ｇ）を、引張試験機（Ｏｒｉｅｎｔｅｃ；ＳＴＡ−１１５０）を用いて測定する。測定は、５個の試験片について行い、その平均値を求める。なお、試験片の厚みは、マイクロメータにより計測し、引張強度を計算する。
試験片の形態は、例えば幅１０ｍｍ×長さ２０ｍｍの長方形でもよく、図６に示したように、幅１０ｍｍ×長さ２０ｍｍで、中央部分において幅を１０ｍｍから５ｍｍに狭くした形状でもよい。引張強度は、試験片の厚み、及び幅から計算することができる。 Specifically, the tensile strength test can be performed according to a conventional method. Specifically, a test piece having a width of 1 to 10 mm and a length of 10 to 30 mm was fixed at both ends so that the distance between the load cells was 5 to 10 mm, pulled at a speed of 0.5 mm / min, and elongation at break (%) The stress (g) is measured using a tensile tester (Orientec; STA-1150). The measurement is performed on five test pieces, and the average value is obtained. In addition, the thickness of a test piece is measured with a micrometer, and tensile strength is calculated.
The shape of the test piece may be, for example, a rectangle having a width of 10 mm × a length of 20 mm, or may be a shape having a width of 10 mm × a length of 20 mm and a width narrowed from 10 mm to 5 mm at the center as shown in FIG. The tensile strength can be calculated from the thickness and width of the test piece.

架橋処理コラーゲン膜の乾燥状態における引張強度は、３０ＭＰａ以上が好ましく、３５ＭＰａ以上がより好ましく、４５ＭＰａ以上が更に好ましい。３０ＭＰａ未満では、生体材料として使用した場合に、十分な強度及び操作性を得ることができないからである。また、引張強度の上限は、特に限定されるものではないが、２００ＭＰａ以下が好ましく、１５０ＭＰａ以下がより好ましく、１２０ＭＰａ以下が最も好ましい。２００ＭＰａを超えると、例えば移植した際に周辺組織と結合しないことや周辺組織を損傷してしまうことがある。   The tensile strength in the dry state of the crosslinked collagen membrane is preferably 30 MPa or more, more preferably 35 MPa or more, and further preferably 45 MPa or more. This is because if it is less than 30 MPa, sufficient strength and operability cannot be obtained when used as a biomaterial. The upper limit of the tensile strength is not particularly limited, but is preferably 200 MPa or less, more preferably 150 MPa or less, and most preferably 120 MPa or less. If it exceeds 200 MPa, for example, when transplanted, the tissue may not be combined with the surrounding tissue or the surrounding tissue may be damaged.

架橋処理コラーゲン膜の平均膜厚は、例えば１μｍ〜２ｍｍであり、好ましくは５μｍ〜１ｍｍであり、より好ましくは１０〜５００μｍ、更に好ましくは２０〜３００μｍであり、最も好ましくは５０〜２００μｍである。１μｍ未満であると、強度が著しく低下したり、均一な膜が得られないことがあり、２ｍｍを超えると乾燥工程に時間がかかったり、均一な膜成形が困難であったりすることがある。
平均膜厚は、以下の方法によって測定することができる。マイクロメータを用いて最低５点の膜厚を計測して、その平均値を出すことで平均膜厚を測定できる。 The average film thickness of the crosslinked collagen membrane is, for example, 1 μm to 2 mm, preferably 5 μm to 1 mm, more preferably 10 to 500 μm, still more preferably 20 to 300 μm, and most preferably 50 to 200 μm. If the thickness is less than 1 μm, the strength may be significantly reduced or a uniform film may not be obtained. If the thickness exceeds 2 mm, the drying process may take a long time, and uniform film formation may be difficult.
The average film thickness can be measured by the following method. The average film thickness can be measured by measuring the film thickness of at least 5 points using a micrometer and calculating the average value.

架橋処理コラーゲン膜の膜厚のバラツキは、平均膜厚の±３０％以内であることが好ましい。膜厚のバラツキが３０％を超えると、膜に強度の強い部分と強度の弱い部分とが混在し、引張強度などの機械的強度が低下する原因となることがある。
膜厚のバラツキは、以下の方法によって測定することができる。マイクロメータを用いて、最低５点の膜厚を計測して、その標準偏差を算出することでバラツキを数値化できる。 The film thickness variation of the cross-linked collagen film is preferably within ± 30% of the average film thickness. When the variation in film thickness exceeds 30%, a strong portion and a weak portion are mixed in the film, which may cause a decrease in mechanical strength such as tensile strength.
The variation in film thickness can be measured by the following method. The variation can be quantified by measuring the film thickness of at least 5 points using a micrometer and calculating the standard deviation.

（非線維化架橋処理コラーゲン膜の物性）
以下に、線維化架橋処理コラーゲン膜と異なる非線維化架橋処理コラーゲン膜の物性について説明する。
非線維化架橋処理コラーゲン膜の表面粗さは、極めて低いものであるが、好ましくは３０ｎｍ以下であり、より好ましくは２０ｎｍ以下であり、最も好ましくは１０ｎｍ以下である。３０ｎｍを超えると、コラーゲン分子だけではなく線維が混合していることがある。非線維化架橋処理コラーゲン膜の表面粗さが小さく表面が滑らかであるのは、コラーゲン細線維を含まず、表面にコラーゲン線維による凹凸の構造が現れないからである。表面が滑らかであることによって、非線維化架橋処理コラーゲン膜は、光を散乱せずに透過性の優れた膜である。
表面粗さは、以下の方法によって測定することができる。市販のカンチレバー及び原子間力顕微鏡を用いて表面粗さを測定できる。測定範囲を４μｍとして、一定速度（０．７Ｈｚから１．２Ｈｚ）で走査させ、高さ像（立体像）を計測する。更に原子間力顕微鏡に付随しているソフトウェアで面粗さ（表面粗さ）を計算することで得られる。 (Physical properties of non-fibrotic cross-linked collagen membrane)
The physical properties of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane different from the fibrotic cross-linked collagen membrane will be described below.
The surface roughness of the non-fibrotic cross-linked collagen membrane is extremely low, but is preferably 30 nm or less, more preferably 20 nm or less, and most preferably 10 nm or less. When it exceeds 30 nm, not only collagen molecules but also fibers may be mixed. The reason why the surface roughness of the non-fibrotic cross-linked collagen membrane is small and the surface is smooth is that it does not contain collagen fine fibers, and the uneven structure due to collagen fibers does not appear on the surface. Due to the smooth surface, the non-fibrotic crosslinked collagen membrane is a membrane with excellent permeability without scattering light.
The surface roughness can be measured by the following method. The surface roughness can be measured using a commercially available cantilever and an atomic force microscope. A measurement range is set to 4 μm, scanning is performed at a constant speed (0.7 Hz to 1.2 Hz), and a height image (stereoscopic image) is measured. Furthermore, it is obtained by calculating the surface roughness (surface roughness) with software attached to the atomic force microscope.

非線維化架橋処理コラーゲン膜の透過率（透明度）は、極めて高いものであり、例えば、細胞培養用のポリスチレンのプレートの透過率に近いものである。非線維化架橋処理コラーゲン膜の透過率は、４８０〜７００ｎｍのいずれかの波長における透過率が９０％以上でもよいが、５００〜７００ｎｍの範囲において９０％以上であることが好ましく、４８０〜７００ｎｍの範囲において、９０％以上であることが更に好ましい。
透過率を測定する膜厚は、特に限定されるものではないが、例えば１μｍ〜１ｍｍの膜厚の範囲において９０％以上の透過率を示す。
透過率は、以下の方法によって測定することができる。非線維化架橋処理コラーゲン膜を細胞培養皿（ポリスチレンディッシュ）に貼り付け、例えばパワースキャンＨＴ（ＤＳファーマバイオメディカル）により波長３００〜７００ｎｍの範囲でスキャンを行うことによって測定することができる。透過率は、吸光度（Ｏ．Ｄ．）から次の式、透過率＝１／１０＾Ｏ．Ｄ．×１００で算出することができる。 The permeability (transparency) of the non-fibrotic crosslinked collagen membrane is extremely high, for example, close to that of a polystyrene plate for cell culture. The transmittance of the non-fibrotic cross-linked collagen membrane may be 90% or more at any wavelength of 480 to 700 nm, but preferably 90% or more in the range of 500 to 700 nm, and 480 to 700 nm. In the range, 90% or more is more preferable.
The film thickness for measuring the transmittance is not particularly limited. For example, the transmittance is 90% or more in the film thickness range of 1 μm to 1 mm.
The transmittance can be measured by the following method. The measurement can be performed by attaching a non-fibrotic cross-linked collagen membrane to a cell culture dish (polystyrene dish) and scanning with a power scan HT (DS Pharma Biomedical) in a wavelength range of 300 to 700 nm. The transmittance is calculated from the absorbance (O.D.) according to the following formula: transmittance = 1/10 ^ O.D. D. It can be calculated by x100.

《架橋》
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜は、コラーゲン膜（以下「コラーゲン膜」とは、線維化コラーゲンゲルを乾燥して得られる線維化コラーゲン膜、又はコラーゲン酸性溶液を乾燥して得られる非線維化コラーゲン膜を指す）を液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理することにより、得ることができる。ここで、液体の存在下とは、架橋処理中にコラーゲン膜の表面全体が液体によって覆われている状態を指し、例えば湿潤状態であってもよいが、好ましくはコラーゲン膜全体が水溶液中に浸漬した状態である。従って、コラーゲン膜の表面全体が液体によって覆われている状態である限り、液体の容量も限定されるものではないが、液体の容量がコラーゲン膜の容量に対して２〜１００が好ましく、１０〜５０がより好ましい。 <Crosslinking>
The cross-linked collagen membrane contained in the molded article of the present invention is obtained by drying a collagen membrane (hereinafter referred to as “collagen membrane” is a fibrillated collagen membrane obtained by drying a fibrillated collagen gel or an acidic collagen solution. It can be obtained by cross-linking a non-fibrotic collagen membrane) in the presence of a liquid by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation. Here, the presence of liquid refers to a state in which the entire surface of the collagen membrane is covered with the liquid during the crosslinking treatment, and may be in a wet state, for example, but preferably the entire collagen membrane is immersed in an aqueous solution. It is in the state. Therefore, as long as the entire surface of the collagen membrane is covered with the liquid, the volume of the liquid is not limited, but the volume of the liquid is preferably 2 to 100 with respect to the collagen membrane volume, 50 is more preferable.

架橋処理は、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって行うが、これら架橋処理を２種以上組み合わせてもよい。これらのうち、透過力が高く、均一に架橋させることができるγ線照射が好ましい。架橋処理においては、高強度の膜が得られるように、照射線量を適宜設定すればよい。なお、線量率が固定の線源を用い、照射時間等の条件を適宜設定すれば、所定の照射線量を簡便に得ることができる。例えば、コバルト６０線源を用いた場合、照射線量５〜７５ｋＧｙで架橋処理を行うことができるが、照射強度は５〜５０ｋＧｙが好ましく、１０〜５０ｋＧｙがより好ましく、１５〜３０ｋＧｙが更に好ましい。
照射条件を適宜設定すれば架橋処理と同時に滅菌も行うことができるため、架橋中及び架橋後の密封状態を保つように包装体を適宜選択すれば、滅菌済み製品として市場に流通させることもできる。 The crosslinking treatment is performed by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation, but two or more kinds of these crosslinking treatments may be combined. Of these, γ-ray irradiation is preferable because it has high permeability and can be uniformly crosslinked. In the crosslinking treatment, the irradiation dose may be set as appropriate so that a high-strength film can be obtained. A predetermined irradiation dose can be easily obtained by using a radiation source with a fixed dose rate and appropriately setting conditions such as irradiation time. For example, when a cobalt 60 radiation source is used, the crosslinking treatment can be performed with an irradiation dose of 5 to 75 kGy, but the irradiation intensity is preferably 5 to 50 kGy, more preferably 10 to 50 kGy, and still more preferably 15 to 30 kGy.
If irradiation conditions are set appropriately, sterilization can be performed at the same time as the crosslinking treatment. Therefore, if a package is appropriately selected so as to maintain a sealed state during and after crosslinking, it can be distributed to the market as a sterilized product. .

（液体）
本発明の架橋処理に用いるコラーゲン膜を浸漬する液体は、水を含んでいる限りにおいて限定されるものではなく、例えば水又は緩衝液などの水性溶媒を挙げることができる。更に、水又は緩衝液に、有機溶媒を添加した水性溶媒を用いることもできる。
コラーゲンは、酸性条件では可溶性であり、適度なイオン強度及び適度なｐＨ（中性からアルカリ性）において線維化する。従って、線維化コラーゲン膜を浸漬する液体（水性溶媒）のｐＨは好ましくはｐＨ３．０〜１０．０であり、具体的には塩を含む中性塩水溶液、又はアルカリ性塩水溶液が好ましい。中性塩水溶液またはアルカリ性塩水溶液は、線維化コラーゲン膜が溶解し難いものであることが好ましいが、比較的溶解し易い水溶液を用いたとしても、水溶液との接触後速やかに架橋処理すればよい。前記中性塩水溶液のｐＨは、例えば６．０〜８．０であり、アルカリ性塩水溶液のｐＨは、例えば８．０〜１０．０の範囲である。
より具体的には、緩衝液として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液等を用いることができる。また、それらの生理食塩水であるＰＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水、又はＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を用いてもよい。 (liquid)
The liquid in which the collagen membrane used for the crosslinking treatment of the present invention is immersed is not limited as long as it contains water, and examples thereof include an aqueous solvent such as water or a buffer solution. Furthermore, an aqueous solvent obtained by adding an organic solvent to water or a buffer solution can also be used.
Collagen is soluble in acidic conditions and fibrillates at moderate ionic strength and moderate pH (neutral to alkaline). Therefore, the pH of the liquid (aqueous solvent) in which the fibrotic collagen membrane is immersed is preferably pH 3.0 to 10.0, and specifically, a neutral salt aqueous solution containing salt or an alkaline salt aqueous solution is preferable. The neutral salt aqueous solution or alkaline salt aqueous solution is preferably one in which the fibrotic collagen membrane is difficult to dissolve, but even if an aqueous solution that is relatively easy to dissolve is used, it may be crosslinked immediately after contact with the aqueous solution. . The pH of the neutral salt aqueous solution is, for example, 6.0 to 8.0, and the pH of the alkaline salt aqueous solution is, for example, in the range of 8.0 to 10.0.
More specifically, a phosphate buffer, Tris buffer, HEPES buffer, acetate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, or the like can be used as the buffer. Alternatively, PBS, D-PBS, Tris buffered saline, or HEPES buffered saline, which are those physiological saline, may be used.

一方、非線維化コラーゲン膜を浸漬する液体は、線維化を防ぐために、酸性の水性溶媒が好ましい。前記液体（水性溶媒）のｐＨは、好ましくはｐＨ２．０〜６．０であり、より好ましくはｐＨ３．０〜５．０である。
例えば、酸性の水性溶媒としては、二酸化炭素が溶解した、酸性水、酸性緩衝液、又は有機溶媒添加酸性水性溶媒などを挙げることができる。前記酸性水、酸性緩衝液、又は有機溶媒添加酸性水性溶媒は、水、緩衝液若しくは有機溶媒添加水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、又は水、緩衝液若しくは有機溶媒添加水性溶媒にドライアイスを投入する方法によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、ｐＨを３．０〜５．０とする溶解量が好ましい。
また、酸性の緩衝液の場合、二酸化炭素を含まないものを用いることもでき、酸性緩衝液としては、例えば酢酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、又は塩酸を挙げることができる。 On the other hand, the liquid in which the non-fibrotic collagen membrane is immersed is preferably an acidic aqueous solvent in order to prevent fibrosis. The pH of the liquid (aqueous solvent) is preferably pH 2.0 to 6.0, more preferably pH 3.0 to 5.0.
For example, as the acidic aqueous solvent, there can be mentioned acidic water, acidic buffer solution, or organic solvent-added acidic aqueous solvent in which carbon dioxide is dissolved. The acidic water, acidic buffer solution, or organic solvent-added acidic aqueous solvent is a method of bubbling carbon dioxide in water, buffer solution or organic solvent-added aqueous solvent, or dry ice in water, buffer solution or organic solvent-added aqueous solvent. It can be produced by a method of charging. The dissolution amount of carbon dioxide is not particularly limited, but a dissolution amount with a pH of 3.0 to 5.0 is preferable.
Further, in the case of an acidic buffer solution, one that does not contain carbon dioxide can be used, and examples of the acidic buffer solution include an acetate buffer solution, a citrate buffer solution, and hydrochloric acid.

《架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体》
本発明の成形体は、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含んでもよい。架橋処理コラーゲン膜は、前記の線維化架橋処理コラーゲン膜、又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を用いることができる。また、架橋処理コラーゲン多孔体としては、線維化架橋処理コラーゲン多孔体、又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体を用いることができる。
従って、積層体の組み合わせとしては、線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体、線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体、非線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体、又は非線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の４つの組み合わせを挙げることができる。 << Laminated body of cross-linked collagen membrane and cross-linked collagen porous body >>
The molded body of the present invention may include a laminate of a crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body. As the cross-linked collagen membrane, the above-mentioned fibrotic cross-linked collagen membrane or non-fibrotic cross-linked collagen membrane can be used. In addition, as the cross-linked collagen porous body, a fibrillated cross-linked collagen porous body or a non-fibrotic cross-linked collagen porous body can be used.
Therefore, as a combination of laminates, there are fibrotic cross-linked collagen membrane and fibrotic cross-linked collagen porous body, fibrotic cross-linked collagen membrane and non-fibrotic cross-linked collagen porous body, non-fibrotic cross-linked collagen membrane and fibrosis. There can be mentioned four combinations of a cross-linked collagen porous body, or a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a non-fibrotic cross-linked collagen porous body.

架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体は、特に限定されるものではないが、例えばコラーゲン膜と、線維化コラーゲンゲル若しくはコラーゲン酸性溶液とを接触させた接触物を、液体の存在下で架橋処理することによって得ることができる。架橋処理方法については、前記「《架橋》」における「コラーゲン膜」を「接触物」に読み替えればよい。また、用いる液体も前記「（液体）」に記載のものと同様のものを用いればよく、具体的には、積層体の多孔体が線維化架橋処理コラーゲン多孔体の場合は前記線維化コラーゲン膜に好適な液体と同様のものを、非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の場合は前記非線維化コラーゲン膜に好適な液体と同様のものを用いればよい。   The laminate of the cross-linked collagen membrane and the cross-linked collagen porous body is not particularly limited. For example, a contact product obtained by contacting a collagen membrane with a fibrotic collagen gel or a collagen acidic solution is present in the presence of liquid. It can be obtained by cross-linking treatment below. As for the crosslinking treatment method, “collagen membrane” in “<< crosslinking” may be read as “contact”. Further, the liquid used may be the same as that described in “(Liquid)”. Specifically, when the porous body of the laminate is a fibrillated cross-linked collagen porous body, the fibrillated collagen membrane is used. For the non-fibrotic crosslinked collagen porous body, the same liquid as that suitable for the non-fibrotic collagen membrane may be used.

《架橋処理コラーゲン多孔体の物性》
前記積層体に含まれる架橋処理コラーゲン多孔体（線維化架橋処理コラーゲン多孔体、又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体）の物性は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、以下の物性を有するものが好ましい。
（気孔率）
架橋処理コラーゲン多孔体は、例えば気孔率８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、最も好ましくは９０％以上である。気孔率が８０％以上であると、多孔体内部への細胞や組織の侵入性に優れているからである。 <Physical properties of cross-linked collagen porous material>
The physical properties of the cross-linked collagen porous body (fibrotic cross-linked collagen porous body or non-fibrotic cross-linked collagen porous body) contained in the laminate are not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained. However, those having the following physical properties are preferred.
(Porosity)
For example, the cross-linked collagen porous body has a porosity of 80% or more, more preferably 85% or more, and most preferably 90% or more. This is because when the porosity is 80% or more, the penetration of cells and tissues into the porous body is excellent.

（水浸透性）
架橋処理コラーゲン多孔体は、適当な水浸透性を有することが好ましい。この水浸透性は、細胞培養を行う際に、多孔体の中にまで細胞が侵入できるかどうかの目安として重要であるからである。 (Water permeability)
The cross-linked collagen porous body preferably has an appropriate water permeability. This is because this water permeability is important as a measure of whether cells can penetrate into the porous body during cell culture.

（粘弾性特性）
架橋処理コラーゲン多孔体の弾性値は、特に限定されるものではないが、２．０ｋＰａ〜１０ＭＰａが好ましく、２０ｋＰａ〜２ＭＰａがより好ましい。２．０ｋＰａ〜１０ＭＰａであることによって、細胞を播種した際に多孔体内部への侵入性及び操作性に優れているからである。
架橋処理コラーゲン多孔体の粘性値は、特に限定されるものではないが、１．０〜５００ｋＰａが好ましく、１．５〜１００ｋＰａがより好ましい。１．０〜５００ｋＰａであることによって、細胞を播種した際に内部への侵入性及び操作性に優れているからである。 (Viscoelastic properties)
The elastic value of the crosslinked collagen porous body is not particularly limited, but is preferably 2.0 kPa to 10 MPa, more preferably 20 kPa to 2 MPa. It is because it is excellent in the penetration | invasion property and the operativity into a porous body when it seed | inoculates a cell by being 2.0kPa-10MPa.
The viscosity value of the crosslinked collagen porous body is not particularly limited, but is preferably 1.0 to 500 kPa, more preferably 1.5 to 100 kPa. It is because it is excellent in the invasion property and operability when seed | inoculating a cell by being 1.0-500 kPa.

（平均孔径）
架橋処理コラーゲン多孔体の平均孔径は、特に限定されるものではないが、５０〜５００μｍが好ましく、８０〜３００μｍがより好ましい。５０〜５００μｍであることによって、細胞や組織が材料内部に侵入しやすく、細胞培養基材や移植材料として最適であるからである。
架橋処理コラーゲン多孔体の平均孔径は、水銀圧入法又は走査型電子顕微鏡観察によって、測定することができる。以下に走査型電子顕微鏡観察による平均孔径の測定法を記載する。作製した多孔体を任意の高さで断面を作製し、帯電防止のため、白金などによるコーティング（２０ｎｍ以下）を行う。観察の際には、加速電圧１０ｋＶ以下で行う。倍率は、１０００倍以下が好ましく、１００個以上の孔径を計測する。これにより、孔径の分布を計算し、その平均値を求めることで平均孔径を測定することが可能である。 (Average pore diameter)
The average pore diameter of the crosslinked collagen porous body is not particularly limited, but is preferably 50 to 500 μm, and more preferably 80 to 300 μm. This is because, when the thickness is 50 to 500 μm, cells and tissues easily enter the material, which is optimal as a cell culture substrate and a transplant material.
The average pore diameter of the crosslinked collagen porous body can be measured by mercury porosimetry or scanning electron microscope observation. The method for measuring the average pore diameter by observation with a scanning electron microscope is described below. A cross section of the prepared porous body is prepared at an arbitrary height, and coating (20 nm or less) with platinum or the like is performed to prevent charging. In the observation, the acceleration voltage is 10 kV or less. The magnification is preferably 1000 times or less, and 100 or more hole diameters are measured. Thereby, it is possible to measure the average pore size by calculating the pore size distribution and obtaining the average value.

（ポリエチレングリコール誘導体）
前記コラーゲン膜の架橋処理は、ポリエチレングリコール誘導体の存在下で行うことも好ましい。ポリエチレングリコール誘導体は、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）で表されるポリエチレングリコール誘導体である。
Ｒ１又はＲ２は、前記の基である限りにおいて限定されるものではないが、好ましくは−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、又は−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２である。
Ｙは限定されるものではないが、好ましくは、単結合、酸素原子（Ｏ）、鎖中に酸素原子を含む炭素数１〜５のアルキレン基である。鎖中に酸素原子を含む炭素数１〜５のアルキレン基に含まれる酸素原子の数は限定されるものではないが、好ましくは２以下であり、より好ましくは１である。酸素原子はアルキレン基の主鎖の任意の位置に含まれてもよいが、重合部分に直接結合することが好ましい。従って、鎖中に酸素原子を含む炭素数１〜５のアルキレン基としては、例えば（Ｒ１）−ＣＨ２−Ｏ−、（Ｒ１）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、（Ｒ１）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を挙げることができる。
Ｚは限定されるものではないが、好ましくは単結合、又は炭素数１〜５のアルキレン基である。炭素数１〜５のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、又はブチレン基を挙げることができる。
本明細書において、「場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基」とは、アルキレン基の水素原子が、置換されたアルキレン基を意味する。置換基は限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜２のアルキル基である。
具体的なポリエチレングリコール誘導体としては、ポリエチレングリコールビスアミン、ポリエチレングリコールビスカルボキシオキソプロピルアミノ、ポリエチレンジチオール、ポリエチレングリコールジアクリレート、又はポリエチレングリコールジメタクリレートを挙げることができる。
前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は、特に限定されるものではないが、１，０００〜１５，０００が好ましく、２，０００〜１３，０００がより好ましく、４，０００〜１０，０００が更に好ましい。分子量が１，０００〜１５，０００であることにより架橋距離が長くなり、強度を向上させることが可能だからである。 (Polyethylene glycol derivative)
The cross-linking treatment of the collagen membrane is also preferably performed in the presence of a polyethylene glycol derivative. The polyethylene glycol derivative has the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms 5 is an alkylene group, and n is an integer of 1 to 500).
R 1 or R 2 is not limited as long as it is the group described above, but preferably —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2, or -CO-C (CH 3) a = CH 2.
Y is not limited, but is preferably a single bond, an oxygen atom (O), or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms containing an oxygen atom in the chain. The number of oxygen atoms contained in the alkylene group having 1 to 5 carbon atoms containing an oxygen atom in the chain is not limited, but is preferably 2 or less, more preferably 1. The oxygen atom may be contained in any position of the main chain of the alkylene group, but is preferably directly bonded to the polymerization moiety. Accordingly, examples of the alkylene group having 1 to 5 carbon atoms containing an oxygen atom in the chain include (R 1 ) —CH 2 —O—, (R 1 ) —CH 2 —CH 2 —O—, and (R 1 ). it can be mentioned -CH 2 -CH 2 -CH 2 -O-.
Z is not limited, but is preferably a single bond or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms. Examples of the alkylene group having 1 to 5 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, and a butylene group.
In the present specification, the “optionally substituted alkylene group having 1 to 5 carbon atoms” means an alkylene group in which a hydrogen atom of the alkylene group is substituted. Although a substituent is not limited, Preferably it is a C1-C4 alkyl group, More preferably, it is a C1-C2 alkyl group.
Specific examples of the polyethylene glycol derivative include polyethylene glycol bisamine, polyethylene glycol biscarboxyoxopropylamino, polyethylene dithiol, polyethylene glycol diacrylate, and polyethylene glycol dimethacrylate.
The molecular weight of the polyethylene glycol derivative is not particularly limited, but is preferably 1,000 to 15,000, more preferably 2,000 to 13,000, and still more preferably 4,000 to 10,000. This is because when the molecular weight is 1,000 to 15,000, the cross-linking distance becomes long and the strength can be improved.

本発明の成形体の物性は特に限定されるものではないが、例えば、以下の物性を有するものが好ましい。   Although the physical property of the molded object of this invention is not specifically limited, For example, what has the following physical properties is preferable.

（溶解率）
本発明の成形体は、細胞培養液や体液等により分解し難く且つ収縮又は膨張し難いという優れた特性を有するものである。細胞培養液や体液等により分解し難いという特性は、例えば、コラーゲン成形体を３７℃のＰＢＳに浸漬した条件下において、ＧＰＣによってＰＢＳ中の分子量分布を測定することによって、または、本発明の成形体の溶解率を測定することによって評価することができる。例えば、本発明の成形体をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に３７℃で５日間浸漬した場合の溶解率を測定する方法が挙げられ、溶解率は特に限定されるものではないが１０質量％以下であることが好ましく、より好ましくは７質量％であり、更に好ましくは５質量％である。 (Dissolution rate)
The molded article of the present invention has excellent characteristics that it is difficult to be decomposed by cell culture fluid, body fluid, etc., and is difficult to contract or expand. The property that it is difficult to be decomposed by cell culture fluid, body fluid, etc. is, for example, by measuring the molecular weight distribution in PBS by GPC under the condition that the collagen molded body is immersed in PBS at 37 ° C. It can be evaluated by measuring the dissolution rate of the body. For example, there is a method for measuring the dissolution rate when the molded article of the present invention is immersed in Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) at 37 ° C. for 5 days, and the dissolution rate is not particularly limited. However, it is preferably 10% by mass or less, more preferably 7% by mass, and further preferably 5% by mass.

（面積変化率）
また、本発明の成形体の収縮又は膨張し難いという特性は、例えば、本発明の成形体をＤ−ＰＢＳ中に３７℃で、５日間浸漬した後の浸漬前に対する面積変化率を求めることによって評価することができる。面積変化率は特に限定されるものではないが、５％以内であれば、細胞培養液や体液等により収縮又は膨張し難いと判断する目安となる。面積変化率は４％以内であることがより好ましく、３％以内であることが更に好ましい。 (Area change rate)
In addition, the characteristic that the molded article of the present invention is difficult to shrink or expand is obtained by, for example, determining the area change rate with respect to before immersion after immersing the molded article of the present invention in D-PBS at 37 ° C. for 5 days. Can be evaluated. The area change rate is not particularly limited, but if it is within 5%, it is a standard for determining that it is difficult to contract or expand due to cell culture fluid or body fluid. The area change rate is more preferably within 4%, still more preferably within 3%.

《変性温度》
コラーゲンは一般的に、温度が上昇するとコラーゲンの３重らせん構造が破壊されて、ゼラチンとなるが、この３重螺旋構造が破壊される温度を変性温度と言う。
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜または架橋処理コラーゲン多孔体の変性温度は、その構造により架橋する前のコラーゲンの変性温度と比較すると有意に上昇しているものである。すなわち、本発明の成形体は、温度に対しても耐性を有しているともいえる。
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜または架橋処理コラーゲン多孔体の変性温度は、特に限定されるものではないが、架橋する前のコラーゲンの変性温度より、好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上、更に好ましくは８℃以上高いものである。好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上、更に好ましくは２０℃以上、最も好ましくは２５℃以上高いものである。変性温度が、高いことにより熱への耐性が高まり、本発明の用途が広がるからである。上限は特に限定されないが、２００℃以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。 << denaturation temperature >>
Collagen generally breaks down the triple helical structure of collagen when the temperature rises to become gelatin. The temperature at which this triple helical structure is destroyed is called the denaturing temperature.
The denaturation temperature of the cross-linked collagen membrane or the cross-linked collagen porous body contained in the molded article of the present invention is significantly higher than that of the collagen before cross-linking due to its structure. That is, it can be said that the molded article of the present invention has resistance to temperature.
The denaturation temperature of the cross-linked collagen membrane or the cross-linked collagen porous body contained in the molded article of the present invention is not particularly limited, but is preferably 3 ° C. or more, more preferably higher than the denaturation temperature of collagen before cross-linking. Is higher than 5 ° C, more preferably higher than 8 ° C. It is preferably 10 ° C or higher, more preferably 15 ° C or higher, still more preferably 20 ° C or higher, most preferably 25 ° C or higher. This is because, since the denaturation temperature is high, heat resistance is enhanced and the application of the present invention is expanded. Although an upper limit is not specifically limited, 200 degrees C or less is preferable and 90 degrees C or less is more preferable.

本発明の成形体には、本発明の成形体の機能が維持される限りにおいて、架橋処理コラーゲン膜及び架橋処理コラーゲン多孔体に加えて、その他原料を含有することができる。その他原料としては、コラーゲン、多糖類（例えばセルロース、澱粉（スターチ）、マンナン、アガロース、デキストラン、デキストリン、アミロペクチン、アミロース、プルラン、キサンガム、グアールガム、アルギン酸、キチン若しくはキトサン、セルロース、カードラン又はそれらの誘導体）、ヒアルロン酸、デルタマン硫酸、ヘパリン、ヘパランリ硫酸、ケラタン硫酸、又はコンドロイチン硫酸などを挙げることができる。
その他原料の含有量は特に限定されるものではないが、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体の合計量に対して、３０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、５．０質量％以下が最も好ましい。３０質量％を超えると、力学的特性の低下が生じるためである。
架橋処理コラーゲン膜または架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体にその他原料を含有させて本発明の成形体とする方法については、本発明の成形体の機能が維持される限りにおいて特に制限は無く、例えば、架橋処理コラーゲン膜又は架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体をその他原料の溶解液に含浸、塗布又は噴霧した後、乾燥する方法が挙げられる。 As long as the function of the molded body of the present invention is maintained, the molded body of the present invention can contain other raw materials in addition to the crosslinked collagen membrane and the crosslinked collagen porous body. Other raw materials include collagen, polysaccharides (eg cellulose, starch (starch), mannan, agarose, dextran, dextrin, amylopectin, amylose, pullulan, xanthan gum, guar gum, alginic acid, chitin or chitosan, cellulose, curdlan or derivatives thereof. ), Hyaluronic acid, deltaman sulfate, heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, or chondroitin sulfate.
The content of other raw materials is not particularly limited, but is preferably 30% by mass or less, more preferably 10% by mass or less, with respect to the total amount of the cross-linked collagen membrane and the cross-linked collagen porous body, The mass% or less is most preferable. This is because when it exceeds 30% by mass, the mechanical properties are deteriorated.
Regarding the method of forming the molded product of the present invention by adding other raw materials to the cross-linked collagen membrane or a laminate of the cross-linked collagen membrane and the cross-linked collagen porous body, as long as the function of the molded product of the present invention is maintained, There is no particular limitation, and examples thereof include a method in which a cross-linked collagen membrane or a laminate of a cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body is impregnated with a solution of other raw materials, applied or sprayed and then dried.

《コラーゲン》
ここで、架橋処理コラーゲン膜及び架橋処理コラーゲン多孔体の作製に用いる出発原料としてのコラーゲン、並びに、その他原料として含有させることができるコラーゲンについて説明する。
前記コラーゲンは、特に限定されるものではないが、例えばＩ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸII型コラーゲン、ＸIII型コラーゲン、ＸIV型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸVI型コラーゲン、ＸVII型コラーゲン、ＸVIII型コラーゲン、ＸIX型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸII型コラーゲン、ＸＸIII型コラーゲン、ＸＸIV型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸVI型コラーゲン、ＸＸVII型コラーゲン、ＸＸVIII型コラーゲン又はこれらの２つ以上の組み合わせを挙げることができる。
前記のコラーゲンのうち、例えばＩ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、及びＶ型コラーゲンは線維型コラーゲンであるが、いずれも原料として使用することができる。更に、これらのコラーゲンのうち、実際に汎用されているのは、Ｉ型コラーゲン又はII型コラーゲンである。これらのコラーゲンは、精製・分離するための原料を大量に入手することが可能であり、産業上の利用に適している。 "collagen"
Here, collagen as a starting material used for production of a cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body, and collagen that can be contained as other raw materials will be described.
The collagen is not particularly limited. For example, type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen, type VI collagen, type VII collagen, type VIII collagen, type IX collagen, X type collagen, XI type collagen, XII type collagen, XIII type collagen, XIV type collagen, XV type collagen, XVI type collagen, XVII type collagen, XVIII type collagen, XIX type collagen, XX type collagen, XXI type collagen, XXII type Mention may be made of collagen, XXIII type collagen, XXIV type collagen, XXV type collagen, XXVI type collagen, XXVII type collagen, XXVIII type collagen, or a combination of two or more thereof.
Among the above collagens, for example, type I collagen, type II collagen, type III collagen, and type V collagen are fibrous collagens, and any of them can be used as a raw material. Furthermore, among these collagens, type I collagen or type II collagen is actually widely used. These collagens can be obtained in large quantities from raw materials for purification and separation, and are suitable for industrial use.

コラーゲンを取得する動物種も、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳類由来コラーゲン（例えば、ウシ由来コラーゲン、ブタ由来コラーゲン、ヒツジ由来コラーゲン、ヤギ由来コラーゲン、又はサル由来コラーゲン）、鳥類由来コラーゲン（例えば、ニワトリ由来コラーゲン、ガチョウ由来コラーゲン、アヒル由来コラーゲン、又はダチョウ由来コラーゲン）、爬虫類由来コラーゲン（例えば、ワニ由来コラーゲン）、両生類由来コラーゲン（例えば、カエル由来コラーゲン）、魚類由来コラーゲン（例えば、テラピア由来コラーゲン、タイ由来コラーゲン、ヒラメ由来コラーゲン、チョウザメ由来コラーゲン、サメ由来コラーゲン、又はサケ由来コラーゲン）、又は無脊椎動物由来コラーゲン（例えば、クラゲ由来コラーゲン）、を挙げることができる。またコラーゲンを得る部位も限定されるものではなく、例えば、皮膚、骨、皮、筋肉、軟骨、鱗、又は浮袋を挙げることができる。更に様々な細胞から抽出・精製されたコラーゲン、遺伝子組み換え操作により製造される人工コラーゲン、又はコラーゲンの側鎖に他の官能基が結合した修飾コラーゲンなども挙げることができる。前記修飾コラーゲンとしては、例えばメチル化コラーゲン、エチル化コラーゲン、プロピル化コラーゲン、スクシニル化コラーゲン、エステル化コラーゲン、メチルエステル化コラーゲン、エチルエステル化コラーゲン、又はアシル化コラーゲンを挙げることができる。   The animal species from which the collagen is obtained is also not particularly limited. For example, mammal-derived collagen (for example, bovine-derived collagen, pig-derived collagen, sheep-derived collagen, goat-derived collagen, or monkey-derived collagen), avian-derived collagen ( For example, chicken-derived collagen, goose-derived collagen, duck-derived collagen, or ostrich-derived collagen), reptile-derived collagen (eg, crocodile-derived collagen), amphibian-derived collagen (eg, frog-derived collagen), fish-derived collagen (eg, tilapia-derived) Collagen, Thai-derived collagen, flounder-derived collagen, sturgeon-derived collagen, shark-derived collagen, or salmon-derived collagen), or invertebrate-derived collagen (eg, jellyfish-derived collagen), It can be mentioned. Moreover, the site | part which obtains collagen is not limited, either, For example, skin, bone, skin, muscle, cartilage, scale, or a float can be mentioned. Furthermore, collagen extracted and purified from various cells, artificial collagen produced by genetic recombination, or modified collagen in which other functional groups are bonded to the side chain of collagen can be mentioned. Examples of the modified collagen include methylated collagen, ethylated collagen, propylated collagen, succinylated collagen, esterified collagen, methyl esterified collagen, ethyl esterified collagen, and acylated collagen.

本発明に用いるコラーゲンの１例として、魚類由来コラーゲンについて以下に説明する。魚類由来コラーゲンとしては、特に限定されるものではないが、Ｉ型又はＩＩ型のコラーゲンを挙げることができる。Ｉ型コラーゲンとしては、魚鱗由来コラーゲンが好ましい。魚類の鱗由来のコラーゲンは、他のコラーゲンと比較して線維化しやすく、線維形成速度が著しく速いからである。更に、魚鱗由来コラーゲンから得られた線維化コラーゲン膜は線維間の相互作用が強いため、特に高い機械強度が得られると考えられる。魚類由来コラーゲンを取得する魚類の種類としては、例えば、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケなどを挙げることができるが、変性温度の観点から、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましい。このような魚類として、具体的には、オレオクロミス属の魚類を挙げる事ができ、特にはテラピアが好ましい。オレオクロミス属の魚類からは、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得でき、例えば日本や中国で食用として養殖されているナイルテラピア（Oreochromis niloticus）は入手が容易であり、大量のコラーゲンを取得することができる。
魚類由来コラーゲンを取得する魚の部位も、限定されるものではない。例えば、鱗、皮、骨、軟骨、ひれ、筋肉及び臓器（例えば、浮き袋）等を挙げることができるが、鱗が好ましい。鱗は、魚臭の原因となる脂質が少ないからである。また、魚類の鱗由来のコラーゲンは、細胞との接着性に優れているからである。特に、魚鱗由来のコラーゲンは、分子間の相互作用が強いと考えられ、強度の高い成形体を得ることができる。 As an example of collagen used in the present invention, fish-derived collagen will be described below. Although it does not specifically limit as collagen derived from fish, I type or II type collagen can be mentioned. As type I collagen, fish scale-derived collagen is preferred. This is because collagen derived from fish scales is more easily fibrillated than other collagens, and the fiber formation rate is significantly faster. Furthermore, since a fibrotic collagen film obtained from fish scale-derived collagen has a strong interaction between fibers, it is considered that a particularly high mechanical strength can be obtained. Examples of the type of fish from which fish-derived collagen is obtained include tilapia, gonzui, rabeo rojita, katra, carp, thunderfish, piraluk, thailand, flounder, shark, and salmon. Therefore, fish that inhabit rivers, lakes, or seas with high water temperatures are preferred. Specific examples of such fish include fish of the genus Oreochromis, with tilapia being particularly preferred. Collagen with a relatively high denaturation temperature can be obtained from fish of the genus Oreochromis. For example, Nile tilapia (Oreochromis niloticus), which is cultivated for food in Japan and China, is easily available, and a large amount of collagen can be obtained. it can.
The part of the fish from which fish-derived collagen is obtained is not limited. For example, scales, skin, bones, cartilage, fins, muscles and organs (for example, buoyancy bags) can be mentioned, and scales are preferred. This is because the scale has few lipids that cause fishy odor. Moreover, it is because the collagen derived from a fish scale is excellent in adhesiveness with a cell. In particular, collagen derived from fish scales is considered to have a strong interaction between molecules, and a molded article having high strength can be obtained.

また、ＩＩ型の魚類由来コラーゲンとして、チョウザメ由来コラーゲンを挙げることができる。チョウザメは、チョウザメ亜目（Acipenseroidei）に属し、２科６属２７種に分類されている。２つの科はチョウザメ科（２亜科、４属、２５種）とヘラチョウザメ科（２属、２種）とに分類される。
チョウザメ科のAcipenserinae亜科のチョウザメ属（Acipenser属）には、Acipenser baeri、Acipenser brevirostrum、Acipenser dabryanus（ダブリーチョウザメ）、Acipenser fulvescens（レイクチョウザメ）、Acipenser gueldenstaedti（ロシアチョウザメ）、Acipenser medirostris（ミドリチョウザメ）、Acipenser mikadoi（ミカドチョウザメ）、Acipenser naccarii（アドリアチョウザメ）、Acipenser nudiventris、Acipenser oxyrinchus、Acipenser persicus（ペルシャチョウザメ）、Acipenser ruthenus（コチョウザメ）、Acipenser schrencki（アムールチョウザメ）、Acipenser sinensis（カラチョウザメ）、Acipenser stellatus、Acipenser sturio（バルトチョウザメ）、及びAcipenser transmontanus（シロチョウザメ）の１７種が含まれる。チョウザメ科のAcipenserinae亜科のPseudoscaphirhynchus属には、Pseudoscaphirhynchus fedtschenkoi、Pseudoscaphirhynchus hermannii、及びPseudoscaphirhynchus kaufmanniの３種が含まれる。チョウザメ科のAcipenserinae亜科のScaphirhynchus属には、Scaphirhynchus albus、Scaphirhynchus platorynchus、及びScaphirhynchus suttkusiの３種が含まれる。また、チョウザメ科のHusinae亜科のダウリアチョウザメ属（Huso属）には、Huso huso（オオチョウザメ）、及びHuso douricus（ダウリアチョウザメ）の２種が含まれる。
ヘラチョウザメ科には、ヘラチョウザメ属（Polyodon）のPolyodon spathula（ヘラチョウザメ）及びハシナガチョウザメ属（Psephurus）のPsephurus gladius（シナヘラチョウザメ）の２種が含まれる。
また、養殖種としてオオチョウザメの雌とコチョウザメの雄を人工交配して作出されたベステル（Acipenser ruthenus×Huso huso）、その他、人工交配して作出されたチョウザメも含まれる。
本発明に用いる魚類由来コラーゲンを得るためのチョウザメは限定されるものではないが、ベステル又はアムールチョウザメが好ましい。また、ＩＩ型の魚類由来コラーゲンを抽出する組織も特に限定されるものではないが、吻部軟骨又は脊索が好ましい。 In addition, examples of type II fish-derived collagen include sturgeon-derived collagen. The sturgeon belongs to the subfamily Acipenseroidei and is classified into 27 species in 2 families, 6 genera. The two families are classified into sturgeon family (2 subfamily, 4 genera, 25 species) and spatula family (2 genera, 2 species).
Acipensrinae subfamily Sturgeon (Acipenser spp.) Includes Acipenser baeri, Acipenser brevirostrum, Acipenser dabryanus, Acipenser fulvescens, Acipenser gueldenstaedti (Russian sturgeon), Acipenser gueldenstaedti (Russian sturgeon) Acipenser mikadoi, Acipenser naccarii, Acipenser nudiventris, Acipenser oxyrinchus, Acipenser persicus, Acipenser ruthenus, Acipenser schrencen, Acipenser schrencen, Acipenser schrencen, Acipenser schrencen , Acipenser sturio (Bart sturgeon), and Acipenser transmontanus (Butterfly shark). The Pseudoscaphirhynchus genus of the subfamily Acipenserinae includes three species of Pseudoscaphirhynchus fedtschenkoi, Pseudoscaphirhynchus hermannii, and Pseudoscaphirhynchus kaufmanni. Three species of Scaphirhynchus albus, Scaphirhynchus platorynchus, and Scaphirhynchus suttkusi are included in the genus Scaphirhynchus of the subfamily Acipenserinae of the sturgeon family. Moreover, two species of Huso huso (Husa sturgeon) and Huso douricus (Dauria sturgeon) are contained in the genus Huuriae (Huso genus) of the subfamily Husinae of the sturgeon family.
There are two species in the family of sturgeon, Polyodon spathula of the genus Polyodon and Psephurus gladius of the genus Psephurus.
Also included are vestels (Acipenser ruthenus x Huso huso) produced by artificial mating of female sturgeon and male sturgeon as farming species, and sturgeon produced by artificial mating.
The sturgeon for obtaining the fish-derived collagen used in the present invention is not limited, but wester or amur sturgeon is preferred. The tissue from which type II fish-derived collagen is extracted is not particularly limited, but rostral cartilage or notochord is preferred.

《コラーゲンの取得》
コラーゲンの取得法は、特に限定されることはなく、常法に従えばよい。例えば、特許文献２（特開２００６−２５７０１４号公報）又は特許文献３（特開２０１０−１９３８０８号公報）等に記載の方法を挙げることができる。取得法の一態様を鱗の例で簡単に説明すると、酸によって脱灰した鱗をペプシン等のプロテアーゼを用いて処理することによりコラーゲンをアテロ化し、必要に応じて塩析等の精製処理を行うことで、酸性溶液で可溶化する可溶化コラーゲンを取得することができる。また、市販の可溶化コラーゲン製品を用いてもよく、例えば魚鱗由来のものとしては、多木化学株式会社製の「セルキャンパス ＡＱ−０３Ａ」（コラーゲン濃度が０．３０〜０．３６％、ｐＨ３．０〜５．０の無色透明のコラーゲン溶液）や「セルキャンパス ＦＤ−０８Ｇ」（コラーゲンの凍結乾燥体）が好適である。 <Acquisition of collagen>
The method for obtaining collagen is not particularly limited, and may be a conventional method. For example, the method described in Patent Document 2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-257014) or Patent Document 3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-193808) can be given. One aspect of the acquisition method will be briefly explained with an example of scales: collagen is atelolated by treating scales decalcified with acid with a protease such as pepsin, and purification treatment such as salting out is performed as necessary. Thus, solubilized collagen that is solubilized with an acidic solution can be obtained. Commercially available solubilized collagen products may also be used. For example, those derived from fish scales include “Cell Campus AQ-03A” manufactured by Taki Chemical Co., Ltd. (collagen concentration is 0.30 to 0.36%, pH 3 0 to 5.0 colorless and transparent collagen solution) and “Cell Campus FD-08G” (freeze-dried collagen).

［２］コラーゲン成形体の製造方法
本発明の成形体の製造方法によれば、＜１＞線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、＜２＞線維化架橋処理コラーゲン膜と線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体、＜３＞線維化架橋処理コラーゲン膜と非線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体、＜４＞非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、＜５＞非線維化架橋処理コラーゲン膜と線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体、及び＜６＞非線維化架橋処理コラーゲン膜と非線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体を製造することができる。
以下に、上記＜１＞〜＜６＞の製造方法を説明する。
なお、以下では、＜２＞と＜３＞を合わせて、「線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体」と称することがある。また、＜５＞と＜６＞を合わせて、「非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体」と称することがある。 [2] Method for Producing Collagen Molded Body According to the method for producing a molded body of the present invention, <1> a collagen molded body including a fibrillated cross-linked collagen membrane, <2> a fibrillated cross-linked collagen membrane and fibrillated cross-linked Collagen molded body comprising a laminate with a porous collagen body, <3> Collagen molded body comprising a laminate of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a non-fibrotic cross-linked collagen porous body, <4> Non-fibrotic cross-linked collagen Collagen molded body including a membrane, <5> collagen molded body including a laminate of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a fibrotic cross-linked collagen porous body, and <6> a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and non-fibrotic A collagen molded body including a laminate with a cross-linked collagen porous body can be produced.
Below, the manufacturing method of said <1>-<6> is demonstrated.
In the following, <2> and <3> may be collectively referred to as a “collagen molded body including a laminate of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body”. Further, <5> and <6> may be collectively referred to as “a collagen molded body including a laminate of a non-fibrotic crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body”.

［２−１］線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法（前記＜１＞）
本発明の線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法は、（１）コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程（以下、成形工程（１）と称することがある）、（２）前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程（以下、脱塩工程（２）と称することがある）、（３）前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程（以下、乾燥工程（３）と称することがある）、及び（４）前記線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程（以下、架橋工程（４）と称することがある）、を含む。成形工程（１）、脱塩工程（２）、乾燥工程（３）、及び架橋工程（４）は、この順番で行うことが好ましいが、線維化架橋処理コラーゲン膜が得られる限りにおいて限定されるものではなく、架橋工程（４）を脱塩工程（２）の前に行うことも可能である。すなわち、成形工程（１）、架橋工程（４）、脱塩工程（２）、乾燥工程（３）の順番に行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜を得ることができる。実施例４に示すように、脱塩工程（２）及び／又は乾燥工程（３）の前に架橋工程（４）を行った線維化架橋処理コラーゲン膜は、高い引張強度を示す。従って、線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、脱塩工程（２）及び／又は乾燥工程（３）の前に架橋工程（４）を行うことが好ましい。これらの成形工程（１）、脱塩工程（２）、乾燥工程（３）、及び架橋工程（４）は、前記＜２＞と＜３＞を合わせて説明する、以下の［２−２］線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法における各工程と基本的に共通である。 [2-1] Method for Producing Collagen Molded Body Containing Fibrosis Crosslinked Collagen Membrane (<1> above)
The method for producing a collagen molded body including a fibrosis-crosslinked collagen membrane of the present invention is as follows: (1) A collagen solution having a collagen concentration of 0.5 mass% to 3.0 mass% is placed in a molding machine, The step of forming a fibrillated collagen gel (hereinafter sometimes referred to as the forming step (1)), (2) the water-miscible organic solvent concentration of the fibrillated collagen gel was increased stepwise. A step of desalting by sequentially immersing in a mixture of a water-miscible organic solvent and water (hereinafter sometimes referred to as a desalting step (2)), (3) drying the desalted fibrotic collagen gel. A step of obtaining a fibrotic collagen membrane (hereinafter sometimes referred to as a drying step (3)), and (4) the fibrotic collagen membrane in the presence of a liquid, γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, Or by UV irradiation The step of cross-linking treatment (hereinafter sometimes referred to as crosslinking step (4)), including. The forming step (1), the desalting step (2), the drying step (3), and the cross-linking step (4) are preferably performed in this order, but are limited as long as a fibrillated cross-linked collagen membrane is obtained. Instead, the crosslinking step (4) can be performed before the desalting step (2). That is, a fibrotic crosslinked collagen membrane can be obtained by performing the molding step (1), the crosslinking step (4), the desalting step (2), and the drying step (3) in this order. As shown in Example 4, the fibrotic cross-linked collagen membrane subjected to the cross-linking step (4) before the desalting step (2) and / or the drying step (3) exhibits high tensile strength. Therefore, from the viewpoint of improving the tensile strength of the fibrotic crosslinked collagen membrane, it is preferable to perform the crosslinking step (4) before the desalting step (2) and / or the drying step (3). These molding step (1), desalting step (2), drying step (3), and crosslinking step (4) will be described together with the above <2> and <3>, [2-2] This is basically the same as each step in the method for producing a collagen molded body including a laminate of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body.

［２−２］線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法（前記＜２＞及び＜３＞）
本発明の線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法は、（１）コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、（２）前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、（３）前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、（３ａ）（Ａ）前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは（Ｂ）前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程（以下、接触工程（３ａ）と称することがある）、（３ｂ）前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程（以下、凍結乾燥工程（３ｂ）と称することがある）、及び（４）前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程を含む。前記成形工程（１）、脱塩工程（２）、乾燥工程（３）、接触工程（３ａ）、凍結乾燥工程（３ｂ）、及び架橋工程（４）は、この順番で行うことが好ましいが、積層体が得られる限りにおいて、その順番及び回数は限定されるものではなく、例えば１回目の架橋工程（４）を脱塩工程（２）の前に行い、更に凍結乾燥工程（３ｂ）の後に２回目の架橋工程（４）を行うことも可能である。すなわち、成形工程（１）、架橋工程（４）、脱塩工程（２）、乾燥工程（３）、接触工程（３ａ）、凍結乾燥工程（３ｂ）、及び架橋工程（４）の順番に行うことにより、積層体を得ることができる。線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、脱塩工程（２）及び／又は乾燥工程（３）の前に、線維化架橋処理コラーゲン膜の架橋を行ことが好ましい。
本製造方法によって、線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体、又は線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体を製造することができる。 [2-2] Method for producing a collagen molded body including a laminate of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body (above <2> and <3>)
The method for producing a collagen molded body comprising a laminate of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body according to the present invention comprises: (1) a collagen solution having a collagen concentration of 0.5% by mass to 3.0% by mass (2) forming a fibrillated collagen gel by fibrillating collagen, and (2) forming the fibrillated collagen gel into a water-miscible organic solvent having a concentration of water-miscible organic solvent increased stepwise. A step of desalting by sequentially immersing in a mixed solution of a solvent and water, (3) a step of drying the desalted fibrillated collagen gel to obtain a fibrillated collagen membrane, (3a) (A) the fibrillated collagen membrane And a step of contacting a fibrillated collagen gel for producing a porous body having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, or (B) the fibrillated collagen membrane and collagen concentration A step of contacting with 5.0% by mass or less of an acidic collagen solution for preparation of a porous body (hereinafter sometimes referred to as a contacting step (3a)), (3b) a step of freeze-drying the contacted matter to obtain a laminate (Hereinafter, it may be called a freeze-drying process (3b).), And (4) The process of bridge | crosslinking the said laminated body by gamma ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in presence of a liquid. including. The molding step (1), desalting step (2), drying step (3), contacting step (3a), freeze-drying step (3b), and crosslinking step (4) are preferably performed in this order, As long as the laminate is obtained, the order and number of times are not limited. For example, the first crosslinking step (4) is performed before the desalting step (2), and further after the freeze-drying step (3b). It is also possible to perform the second crosslinking step (4). That is, the forming step (1), the crosslinking step (4), the desalting step (2), the drying step (3), the contact step (3a), the freeze-drying step (3b), and the crosslinking step (4) are performed in this order. As a result, a laminate can be obtained. From the viewpoint of improving the tensile strength of the fibrillated cross-linked collagen membrane, it is preferable to crosslink the fibrillated cross-linked collagen membrane before the desalting step (2) and / or the drying step (3).
By this production method, a collagen molded body including a laminate of a combination of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a fibrillated cross-linked collagen porous body, or a laminate of a combination of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a non-fibrotic cross-linked collagen porous body A collagen molded body containing the body can be produced.

以下に、「［２−１］線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法」及び「［２−２］線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法」の工程について説明する。   Hereinafter, “[2-1] Method for Producing Collagen Molded Body Containing Fibrosis Crosslinked Treatment Collagen Film” and “[2-2] Collagen Containing Laminated Body of Fibrosis Crosslinked Treatment Collagen Membrane and Crosslinked Treatment Collagen Porous Body” The process of “Method for producing molded body” will be described.

《成形工程（１）》
成形工程（１）は、コラーゲンの濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程である。コラーゲンの濃度は、０．５質量％以上であれば、限定されるものではないが、１．０質量％以上が好ましく、１．５質量％以上がより好ましい。
コラーゲンを線維化させる方法は、コラーゲンの濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下である限りにおいて特に限定されることはなく、常法に従えばよい。一般に広く知られている方法としては、コラーゲンを溶解させた酸性溶液を適度なイオン強度及びｐＨとすることでコラーゲンを線維化させる方法である。線維化には、適当な緩衝液を添加してｐＨを中性付近にする方法が簡便である。緩衝液としては前記作用を有するものであれば特に限定はされず、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が例示でき、それらの生理食塩水であってもよい。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等である。これらのうち、特に生体系用途に用いる場合は、Ｄ−ＰＢＳが好ましい。ｐＨ及びイオン強度は、適宜決定することが可能であるが、例えばコラーゲンを溶解させた酸性溶液にＤ−ＰＢＳの２．５〜１０倍程度の濃縮液を添加して、コラーゲンを線維化させる方法が挙げられる。 << Molding process (1) >>
The forming step (1) is a step of forming a fibrillated collagen gel by putting a collagen solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less into a molding machine and fibrillating the collagen. is there. The collagen concentration is not limited as long as it is 0.5% by mass or more, but is preferably 1.0% by mass or more, and more preferably 1.5% by mass or more.
The method for fibrosis of collagen is not particularly limited as long as the concentration of collagen is 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, and may be a conventional method. As a generally known method, collagen is fibrillated by setting an acidic solution in which collagen is dissolved to an appropriate ionic strength and pH. For fibrosis, a method of adding an appropriate buffer to make the pH near neutral is convenient. The buffer solution is not particularly limited as long as it has the above action, and examples thereof include phosphate buffer solution, Tris buffer solution, HEPES buffer solution and the like, and may be physiological saline thereof. For example, phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), Tris buffered saline, HEPES buffered saline, and the like. Of these, D-PBS is preferred particularly when used for biological applications. The pH and ionic strength can be appropriately determined. For example, a method of adding a concentrated solution of about 2.5 to 10 times that of D-PBS to an acidic solution in which collagen is dissolved to fibrose collagen. Is mentioned.

コラーゲンの線維化を膜形成に適した成形器内で行うことにより、線維化コラーゲンゲルを得る。例えば、細胞培養用ウェルプレートに適した膜を作製する場合は、円形に成形できるシリコン製成形器を用いることが好ましい。線維化コラーゲンゲルの調製法の具体例としては、コラーゲンの酸性溶液とＤ−ＰＢＳとを混合した後、成形器内に注入してもよいし、Ｄ−ＰＢＳを入れた成形器内にコラーゲンの酸性溶液を注入し、成形器内で両溶液を混合してもよい。その後、適度な温度で一定時間保持することによって線維化させる。コラーゲンの酸性溶液の注入量は、必要とする膜厚に応じて適宜調整すればよい。また、線維化における温度及び時間条件についても、目的とする線維化度に応じて適宜設定すればよいが、例えば保持温度は変性温度未満であることが好ましく、具体的には２５〜４０℃であるのが好ましい。また保持する時間は０．５〜２４時間が好ましく、０．５〜１２時間がより好ましく、１〜６時間が更に好ましい。
なお、線維化中は上面をシールで覆うなどして水分の蒸発を防ぐための措置を採ることが望ましい。 By performing collagen fibrillation in a molding machine suitable for film formation, a fibrillated collagen gel is obtained. For example, when a membrane suitable for a cell culture well plate is produced, it is preferable to use a silicon molding machine that can be molded into a circular shape. As a specific example of the preparation method of the fibrillated collagen gel, an acidic solution of collagen and D-PBS may be mixed and then injected into the molding machine, or collagen may be injected into the molding machine containing D-PBS. An acidic solution may be injected and both solutions may be mixed in a molder. Then, it is made fibrotic by holding at an appropriate temperature for a certain time. What is necessary is just to adjust suitably the injection amount of the acidic solution of collagen according to the required film thickness. Further, the temperature and time conditions in fibrosis may be appropriately set according to the target degree of fibrosis. For example, the retention temperature is preferably less than the denaturation temperature, specifically 25 to 40 ° C. Preferably there is. The holding time is preferably 0.5 to 24 hours, more preferably 0.5 to 12 hours, and still more preferably 1 to 6 hours.
During fibrosis, it is desirable to take measures to prevent evaporation of moisture by covering the upper surface with a seal.

《脱塩工程（２）》
脱塩工程（２）は、前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程である。
前記成形工程（１）で得られた線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬することにより脱塩する（以下、段階脱塩法と称する）。なお、この脱塩方法では水分も除去することができる。段階脱塩法は、組織切片作成に一般に用いられている手法であり、一例を挙げると、１段回目は水混和性有機溶媒／水が容量比で５０／５０の混合液（以下、５０／５０のように表記する）に線維化コラーゲンゲルを浸漬し、２段回目は７０／３０、３段階目は９０／１０、４段階目は１００／０に順次浸漬する方法である。なお、水混和性有機溶媒／水の混合液の種類と浸漬時間は適宜設定し、効率的に脱塩することが望ましい。本工程では、線維化コラーゲンゲル中の水分が水混和性有機溶媒と完全に置換されることが望ましい。
ここで、水混和性有機溶媒とは、水と任意の割合で相溶する有機溶媒を指し、例えば、炭素数１〜４の低級アルコール、アセトン、アセトニトリル等が例示でき、これらのうち２種以上を用いてもよい。上記低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を例示することができる。上記例示した水混和性有機溶媒のうち、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等の低級アルコールが好ましく、特に生体系用途への適用を考慮するとエタノールが好ましい。 << Desalting step (2) >>
The desalting step (2) is a step in which the fibrillated collagen gel is desalted by sequentially immersing it in a mixed solution of water-miscible organic solvent and water whose concentration of water-miscible organic solvent is increased stepwise.
The fibrillated collagen gel obtained in the molding step (1) is desalted by sequentially immersing it in a mixed solution of a water-miscible organic solvent and water in which the concentration of the water-miscible organic solvent is increased stepwise (hereinafter referred to as the following). , Referred to as step desalting). In this desalting method, water can also be removed. The step desalting method is a method generally used for preparing tissue slices. For example, in the first step, a water-miscible organic solvent / water mixed solution having a volume ratio of 50/50 (hereinafter referred to as 50/50) is used. The fibrosis collagen gel is immersed in the second stage, 70/30 in the second stage, 90/10 in the third stage, and 100/0 in the fourth stage. In addition, it is desirable to set the kind and soaking time of the water miscible organic solvent / water mixture appropriately, and to desalinate efficiently. In this step, it is desirable that the water in the fibrillated collagen gel is completely replaced with the water-miscible organic solvent.
Here, the water-miscible organic solvent refers to an organic solvent that is compatible with water at an arbitrary ratio, and examples thereof include C1-C4 lower alcohols, acetone, acetonitrile, and the like. May be used. Examples of the lower alcohol include methanol, ethanol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol and the like. Of the water-miscible organic solvents exemplified above, lower alcohols such as ethanol, methanol, and isopropyl alcohol are preferable, and ethanol is particularly preferable in consideration of application to biological system applications.

《乾燥工程（３）》
乾燥工程（３）は、脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し、線維化コラーゲン膜を得る工程である。乾燥方法は、特に限定されるものではなく、例えば、自然乾燥、通風乾燥、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。 << Drying process (3) >>
The drying step (3) is a step of drying the desalted fibrillated collagen gel to obtain a fibrillated collagen membrane. The drying method is not particularly limited, and examples thereof include natural drying, ventilation drying, vacuum drying, reduced pressure drying, and freeze drying.

脱塩した線維化コラーゲンゲルは、例えば以下のように乾燥させることができる。面方向の通気性を遮断した状態で乾燥させて線維化コラーゲン膜を得る。ここで、面方向とは膜の上面と下面のことであり、面方向の通気性を遮断した状態で側面からのみ脱媒させることにより、面方向の強度を高くすることができる。通気性を遮断するための被覆材としては膜との密着性が高く且つ膜から剥離しやすい平滑なものであることが望ましく、例えば、ポリスチレン、シリコン、ポリエステル、ポリプロピレン、ガラス等を例示することができるが、これらのうちポリスチレンが特に好ましい。乾燥方法としては、脱媒することができ且つ膜強度の低下が少ない方法であれば特に制限はない。例えば前記脱塩工程における最後の有機溶媒が揮発性のアルコールの場合、常温でアルコールが揮発するため、脱塩した線維化コラーゲンゲルは自然乾燥により容易に乾燥することができる。   The desalted fibrillated collagen gel can be dried, for example, as follows. The fiber is dried in a state where air permeability in the surface direction is blocked to obtain a fibrillated collagen membrane. Here, the surface direction is the upper surface and the lower surface of the membrane, and the strength in the surface direction can be increased by removing the solvent only from the side surface in a state where the air permeability in the surface direction is blocked. The covering material for blocking the air permeability is preferably a smooth material that has high adhesion to the film and is easily peeled off from the film, and examples thereof include polystyrene, silicon, polyester, polypropylene, and glass. Of these, polystyrene is particularly preferred. The drying method is not particularly limited as long as it can remove the solvent and causes little decrease in film strength. For example, when the last organic solvent in the desalting step is a volatile alcohol, the alcohol volatilizes at room temperature, and thus the desalted fibrillated collagen gel can be easily dried by natural drying.

《接触工程（３ａ）》
接触工程（３ａ）は、線維化コラーゲン膜と、線維化コラーゲンゲルまたはコラーゲン酸性溶液との接触物を作製するための工程である。なお、線維化コラーゲンゲルから線維化コラーゲン多孔体を作製することが可能であり、コラーゲン酸性溶液から非線維化コラーゲン多孔体を作製することができる。線維化コラーゲン膜及び多孔体用コラーゲン液（線維化コラーゲンゲル、又はコラーゲン酸性溶液）を接触させ積層化させる方法として、例えば、（ｉ）多孔体用コラーゲン液を成形器内に入れた後、当該溶液上に線維化コラーゲン膜を載置する方法、（ｉｉ）線維化コラーゲン膜を成形器内に入れた後、多孔体用コラーゲン液を注入する方法、（ｉｉｉ）上記（ｉ）の上から更に多孔体用コラーゲン液を注入する方法、（ｉｖ）上記（ｉｉ）の上に更に線維化コラーゲン膜を載置する方法、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、上記（ｉ）又は（ｉｖ）のように、多孔体用コラーゲン液の上に線維化コラーゲン膜を載置する場合、当該膜は多孔体用コラーゲン液中に沈み込むことはほとんど無く、多孔体用コラーゲン液の上面に保持されることが一般的である。ところで、線維化コラーゲン膜と多孔体用コラーゲン液との接触部分では、線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。
積層体作製工程（３ａ）は、多孔体用コラーゲン液が、線維化コラーゲンゲルであるか、又はコラーゲン酸性溶液であるかによって、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の２つの工程に分けることができる。
（Ａ）多孔体作製用線維化コラーゲンゲル
前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の線維化コラーゲンゲルとを接触させることによって線維化コラーゲン膜と線維化コラーゲンゲルとの接触物を得ることができる。ところで、線維化コラーゲン膜と線維化コラーゲンゲルとの接触部分では、線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。なお、前記接触物は、線維化コラーゲン膜と線維化コラーゲン多孔体との積層体の前駆体とも云えるものである。
コラーゲンを線維化させる方法は、コラーゲンの濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下である限りにおいて特に限定されることはなく、常法に従えばよい。一般に広く知られている方法としては、コラーゲンを溶解させた酸性溶液を適度なイオン強度及びｐＨとすることでコラーゲンを線維化させる方法である。コラーゲンの線維化を多孔体形成に適した成形器内で行うことにより、線維化コラーゲンゲルを得ることができる。線維化に伴う、緩衝液、ｐＨ、イオン強度、成形器の選択、温度、及び時間等は前記の「成形工程（１）」の線維化コラーゲン膜の製造方法に準じて行うことができる。
線維化コラーゲンゲルは、後述の凍結乾燥により線維化コラーゲン多孔体となる。
（Ｂ）多孔体作製用コラーゲン酸性溶液
前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液とを接触させ、そして積層体化することによって線維化コラーゲン膜とコラーゲン酸性溶液との接触物を得ることができる。なお、コラーゲン濃度の下限は０．５質量％であることが好ましい。ところで、線維化コラーゲン膜とコラーゲン酸性溶液との接触部分では、線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。なお、前記接触物は、線維化コラーゲン膜と、非線維化コラーゲン多孔体との積層体の前駆体とも云えるものである。
本工程においては、酸性液にコラーゲンを溶解することによってコラーゲン酸性溶液を得ることができる。酸性液は、水性溶媒に二酸化炭素を溶解させて調製する二酸化炭素酸性液でもよく、水性溶媒に無機酸又は有機酸を溶解して調製する酸性液でもよい。二酸化炭素酸性液は、例えば、水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、又は水性溶媒にドライアイスを投入する方法によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、コラーゲンを溶解させるためには、溶媒のｐＨを２〜４とすることが好ましい。従って、ｐＨ４以下になるように、二酸化炭素を溶解させることが望ましい。
また、酸性液を調製するための無機酸又は有機酸は、特に限定されるものでないが、ｐＨを４以下にできる酸が好ましく、特には積層体形成後に酸を除去することができる揮発性の酸が好ましい。具体的には塩酸、酢酸、又は炭酸が好ましい。
本明細書において、水性溶媒は水、又は水と有機溶媒とを混合した溶媒を意味する。水性溶媒に含まれる有機溶媒としては水と混和し、コラーゲンを溶解することができれば特に限定されるものではないが、好ましくは低級アルコールであり、例えば炭素数１〜４の低級アルコール（すなわち、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、又はｔｅｒｔ−ブチルアルコール）を用いることができる。このような低級アルコールは、製造にかかるコストが比較的低廉である。
また、コラーゲン酸性溶液は、コラーゲンと、二酸化炭素、無機酸、又は有機酸とを水性溶媒に同時に溶解することによって調製することも可能である。 << Contact process (3a) >>
The contact step (3a) is a step for preparing a contact product between the fibrillated collagen membrane and the fibrillated collagen gel or the collagen acidic solution. In addition, it is possible to produce a fibrillated collagen porous body from a fibrillated collagen gel, and it is possible to prepare a non-fibrotic collagen porous body from a collagen acidic solution. Examples of the method of bringing the fibrotic collagen membrane and the porous body collagen liquid (fibrotic collagen gel or collagen acidic solution) into contact and laminating include, for example, (i) after placing the porous body collagen liquid in the molding machine, A method of placing a fibrotic collagen membrane on the solution, (ii) a method of injecting a collagen fluid for porous material after the fibrotic collagen membrane is placed in a molding machine, (iii) further from above (i) above Examples thereof include, but are not limited to, a method of injecting a collagen solution for porous bodies, and (iv) a method of further placing a fibrotic collagen film on the above (ii). When the fibrotic collagen membrane is placed on the porous body collagen solution as in the above (i) or (iv), the membrane hardly sinks into the porous body collagen solution. Generally, it is held on the upper surface of the body collagen solution. By the way, a part of the fibrillated collagen membrane may be dissolved at the contact portion between the fibrillated collagen membrane and the porous body collagen solution, which is considered to contribute to the improvement of the binding property.
The laminate preparation step (3a) can be divided into the following two steps (A) or (B) depending on whether the collagen solution for porous bodies is a fibrillated collagen gel or an acidic collagen solution. it can.
(A) Fibrotic collagen gel for porous body preparation The fibrotic collagen membrane and the fiber are brought into contact with the fibrotic collagen membrane by contacting the fibrous collagen gel having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less. A contact product with the modified collagen gel can be obtained. By the way, in the contact part of a fibrillated collagen membrane and a fibrillated collagen gel, a part of fibrillated collagen membrane may melt | dissolve, and it is thought that this contributes to an improvement in binding property. In addition, the said contact thing can also be called the precursor of the laminated body of a fibrillated collagen membrane and a fibrillated collagen porous body.
The method for fibrosis of collagen is not particularly limited as long as the concentration of collagen is 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, and may be a conventional method. As a generally known method, collagen is fibrillated by setting an acidic solution in which collagen is dissolved to an appropriate ionic strength and pH. By performing collagen fibrillation in a molding machine suitable for porous body formation, a fibrillated collagen gel can be obtained. The buffer solution, pH, ionic strength, selection of the molding device, temperature, time, and the like accompanying the fibrosis can be performed in accordance with the method for producing a fibrotic collagen membrane in the “molding step (1)”.
The fibrillated collagen gel becomes a fibrillated collagen porous body by lyophilization described later.
(B) Collagen acidic solution for porous body preparation The fibrillated collagen membrane and collagen acidic solution are brought into contact with a collagen acidic solution having a collagen concentration of 5.0% by mass or less to form a laminate. Contact with can be obtained. The lower limit of the collagen concentration is preferably 0.5% by mass. By the way, at the contact portion between the fibrotic collagen membrane and the collagen acidic solution, a part of the fibrotic collagen membrane may be dissolved, which is considered to contribute to the improvement of the binding property. In addition, the said contact thing can also be called the precursor of the laminated body of a fibrillation collagen membrane and a non-fibrosis collagen porous body.
In this step, a collagen acidic solution can be obtained by dissolving collagen in an acidic solution. The acidic liquid may be a carbon dioxide acidic liquid prepared by dissolving carbon dioxide in an aqueous solvent, or an acidic liquid prepared by dissolving an inorganic acid or an organic acid in an aqueous solvent. The carbon dioxide acidic liquid can be prepared, for example, by a method of bubbling carbon dioxide in an aqueous solvent or a method of putting dry ice in an aqueous solvent. The amount of carbon dioxide dissolved is not particularly limited, but the pH of the solvent is preferably 2 to 4 in order to dissolve collagen. Therefore, it is desirable to dissolve carbon dioxide so that the pH is 4 or less.
Further, the inorganic acid or organic acid for preparing the acidic liquid is not particularly limited, but an acid capable of reducing the pH to 4 or less is preferable, and in particular, a volatile substance capable of removing the acid after forming the laminate. Acid is preferred. Specifically, hydrochloric acid, acetic acid, or carbonic acid is preferable.
In this specification, an aqueous solvent means water or a solvent obtained by mixing water and an organic solvent. The organic solvent contained in the aqueous solvent is not particularly limited as long as it is miscible with water and can dissolve collagen, but is preferably a lower alcohol, for example, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (that is, methanol). , Ethanol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol, sec-butyl alcohol, or tert-butyl alcohol). Such lower alcohols are relatively inexpensive to produce.
The acidic collagen solution can also be prepared by simultaneously dissolving collagen and carbon dioxide, inorganic acid, or organic acid in an aqueous solvent.

《凍結乾燥工程（３ｂ）》
凍結乾燥工程は、前記接触物を凍結乾燥することにより積層体を得る工程である。凍結乾燥は、水分を含んだものを凍結し、真空下（０．１〜３ｍｍＨｇ）で氷を昇華させることによって、乾燥する方法である。凍結乾燥を行うことにより、前記線維化コラーゲンゲル、又は前記コラーゲン酸性溶液は、多孔体化し、それぞれ線維化コラーゲン多孔体、又は非線維化コラーゲン多孔体（以下、「コラーゲン多孔体」と総称することがある）となることができる。凍結乾燥を行うことにより、コラーゲン線維、コラーゲン細線維などを破壊することなく、多孔体化することが可能である。 << Freeze drying process (3b) >>
A freeze-drying process is a process of obtaining a laminated body by freeze-drying the said contact thing. Freeze-drying is a method of drying by freezing water-containing material and sublimating ice under vacuum (0.1 to 3 mmHg). By performing lyophilization, the fibrillated collagen gel or the collagen acidic solution becomes porous and is generally referred to as a fibrillated collagen porous body or a non-fibrotic collagen porous body (hereinafter referred to as “collagen porous body”). Can be). By performing freeze-drying, it is possible to make a porous body without destroying collagen fibers, collagen fine fibers and the like.

《架橋工程（４）》
架橋工程（４）は、前記乾燥工程（３）で得られた線維化コラーゲン膜、又は凍結乾燥工程（３ｂ）で得られた線維化コラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体（以下、両者を「乾燥体」と総称することがある）を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程である。
本発明の成形体の製造方法における架橋工程は、前記「《架橋》」の項目に記載の方法に従って、行うことができる。
具体的には、以下のように架橋工程を行うことができる。前記液体の存在下とは、架橋処理中に乾燥体の表面全体が液体によって覆われている状態を指し、例えば湿潤状態であってもよいが、好ましくは乾燥体全体が水溶液中に浸漬した状態である。従って、乾燥体の表面全体が液体によって覆われている状態である限り、液体の容量も限定されるものではないが、液体の容量がコラーゲン成形体の容量に対して２〜１００が好ましく、１０〜５０がより好ましい。また、液体の種類も、上述に従い、線維化架橋処理コラーゲン多孔体又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体のいずれを作製するかにより適宜選択すればよい。
架橋工程（４）は、前記一般式（１）で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下で行ってもよい。ポリエチレングリコール誘導体を添加する液として、架橋工程において線維化コラーゲン膜、又は積層体を浸漬する液体、前記コラーゲン溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液、又はそれらの２つ以上の組み合わせを挙げることができるが、前記液体が好ましい。 << Crosslinking process (4) >>
The cross-linking step (4) includes a fibrotic collagen membrane obtained in the drying step (3) or a laminate of the fibrotic collagen membrane obtained in the freeze-drying step (3b) and a collagen porous body (hereinafter referred to as both (Sometimes collectively referred to as “dried body”) in the presence of a liquid by a crosslinking treatment by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation.
The crosslinking step in the method for producing a molded article of the present invention can be performed according to the method described in the item “<< Crosslinking”.
Specifically, the crosslinking step can be performed as follows. The presence of the liquid refers to a state in which the entire surface of the dry body is covered with the liquid during the crosslinking treatment, and may be in a wet state, for example, but is preferably a state in which the entire dry body is immersed in an aqueous solution. It is. Accordingly, the volume of the liquid is not limited as long as the entire surface of the dried body is covered with the liquid, but the volume of the liquid is preferably 2 to 100 with respect to the volume of the collagen molded body. ~ 50 is more preferred. In addition, the type of liquid may be appropriately selected depending on whether the fibrillated cross-linked collagen porous body or the non-fibrotic cross-linked collagen porous body is to be produced according to the above.
You may perform a bridge | crosslinking process (4) in presence of the polyethyleneglycol derivative represented by the said General formula (1). As a liquid for adding a polyethylene glycol derivative, a liquid for immersing a fibrotic collagen film or a laminate in a crosslinking step, the collagen solution, the fibrotic collagen gel for producing a porous body, the collagen acidic solution for producing a porous body, or those The above liquid is preferable.

以下に、非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、及び非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法について説明する。
［２−３］非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法（前記＜４＞）
本発明の非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法は、（１）酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程（以下、コラーゲン溶解工程（１）と称することがある）、（２）前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程（以下、成形工程（２）と称することがある）、（３）前記成形されたコラーゲン酸性溶液（以下、「非線維化コラーゲン膜の前駆体」と称することがある）を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程（以下、乾燥工程（３）と称することがある）、及び（４）前記非線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程（以下、架橋工程（４）と称することがある）、を含む。コラーゲン溶解工程（１）、成形工程（２）、乾燥工程（３）、及び架橋工程（４）は、この順番で行うことが好ましいが、非線維化架橋処理コラーゲン膜が得られる限りにおいて限定されるものではなく、架橋工程（４）を乾燥工程（３）の前に行うことも可能である。すなわち、コラーゲン溶解工程（１）、成形工程（２）、架橋工程（４）、及び乾燥工程（３）の順番に行うことにより、非線維化架橋処理コラーゲン膜を得ることができる。非線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、乾燥工程（３）の前に架橋工程（４）を行うことが好ましい。これらのコラーゲン溶解工程（１）、成形工程（２）、乾燥工程（３）、及び架橋工程（４）は、前記＜５＞と＜６＞を合わせて説明する、以下の［２−４］非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法における各工程と基本的に共通である。 Hereinafter, a method for producing a collagen molded body including a non-fibrotic crosslinked collagen membrane and a laminate of the non-fibrotic crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body will be described.
[2-3] Method for producing collagen molded body including non-fibrotic cross-linked collagen membrane (<4> above)
The method for producing a collagen molded body comprising a non-fibrotic cross-linked collagen membrane of the present invention includes: (1) Collagen acidic solution in which collagen is dissolved in an acidic liquid and the collagen concentration is 0.5 mass% or more and 3.0 mass% or less. (Hereinafter, sometimes referred to as a collagen dissolution step (1)), (2) a step of putting the collagen acidic solution into a molding machine and molding (hereinafter, sometimes referred to as a molding step (2)), (3) A step of drying the shaped collagen acidic solution (hereinafter sometimes referred to as “precursor of non-fibrotic collagen membrane”) to obtain a non-fibrotic collagen membrane (hereinafter referred to as drying step (3)). And (4) a step of crosslinking the non-fibrotic collagen membrane by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of a liquid (hereinafter referred to as a cross-linking step (4)). It referred it is), including. The collagen dissolution step (1), the molding step (2), the drying step (3), and the cross-linking step (4) are preferably performed in this order, but are limited as long as a non-fibrotic cross-linked collagen membrane is obtained. However, the crosslinking step (4) may be performed before the drying step (3). That is, a non-fibrotic crosslinked collagen membrane can be obtained by performing the collagen dissolution step (1), the molding step (2), the crosslinking step (4), and the drying step (3) in this order. From the viewpoint of improving the tensile strength of the non-fibrotic crosslinked collagen membrane, it is preferable to perform the crosslinking step (4) before the drying step (3). These collagen dissolution step (1), molding step (2), drying step (3), and cross-linking step (4) will be described together with the above <5> and <6>, [2-4] This is basically the same as each step in the method for producing a collagen molded body including a laminate of a non-fibrotic crosslinked collagen membrane and a crosslinked collagen porous body.

［２−４］非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法（前記＜５＞及び＜６＞）
本発明の非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法は、（１）酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、（２）前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、（３）非線維化コラーゲン膜の前駆体を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、
（３ａ）（Ａ）前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の多孔体作製用線維化コラーゲン溶液とを接触させる工程、若しくは（Ｂ）前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程（以下、接触工程（３ａ）と称することがある）、（３ｂ）前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程（以下、凍結乾燥工程（３ｂ）と称することがある）、及び（４）前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程、を含む。
前記コラーゲン溶解工程（１）、成形工程（２）、乾燥工程（３）、接触工程（３ａ）、凍結乾燥工程（３ｂ）、及び架橋工程（４）は、この順番で行うことが好ましいが、積層体が得られる限りにおいて、その順番及び回数は限定されるものではなく、例えば１回目の架橋工程（４）を乾燥工程（３）の前に行い、更に凍結乾燥工程（３ｂ）の後に２回目の架橋工程（４）を行うことも可能である。すなわち、コラーゲン溶解工程（１）、成形工程（２）、架橋工程（４）、乾燥工程（３）、接触工程（３ａ）、凍結乾燥工程（３ｂ）、及び架橋工程（４）の順番に行うことにより、積層体を得ることができる。非線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、乾燥工程（３）の前に線維化架橋処理コラーゲン膜の架橋を行ことが好ましい。
本製造方法によって、非線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体、又は非線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体を製造することができる。
以下に、非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、及び非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法の工程について説明する。 [2-4] Method for producing a collagen molded body including a laminate of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body (above <5> and <6>)
The method for producing a collagen molded body comprising a laminate of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body according to the present invention comprises: (1) Collagen is dissolved in an acidic solution, and the collagen concentration is 0.5% by mass or more. A step of obtaining a collagen acid solution of 3.0% by mass or less, (2) a step of placing the collagen acid solution in a molding machine and molding, (3) drying a precursor of the non-fibrotic collagen membrane to form a non-fibrotic collagen membrane Obtaining a step,
(3a) (A) contacting the non-fibrotic collagen membrane with a fibrotic collagen solution for producing a porous body having a collagen concentration of 0.5% by mass to 3.0% by mass, or (B) the non-fibrous A step of contacting a fibrillated collagen membrane with a collagen acidic solution for preparing a porous body having a collagen concentration of 5.0% by mass or less (hereinafter sometimes referred to as a contact step (3a)), (3b) A step of freeze-drying to obtain a laminate (hereinafter sometimes referred to as freeze-drying step (3b)), and (4) gamma ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation of the laminate in the presence of a liquid. Or a crosslinking treatment by UV irradiation.
The collagen dissolution step (1), molding step (2), drying step (3), contact step (3a), freeze-drying step (3b), and crosslinking step (4) are preferably performed in this order, As long as the laminate is obtained, the order and number of times are not limited. For example, the first crosslinking step (4) is performed before the drying step (3), and further after the freeze-drying step (3b), 2 It is also possible to perform the second crosslinking step (4). That is, the collagen dissolution step (1), the molding step (2), the crosslinking step (4), the drying step (3), the contact step (3a), the freeze-drying step (3b), and the crosslinking step (4) are performed in this order. As a result, a laminate can be obtained. From the viewpoint of improving the tensile strength of the non-fibrotic cross-linked collagen membrane, it is preferable to cross-link the fibrotic cross-linked collagen membrane before the drying step (3).
By this production method, a collagen molded body comprising a laminate of a combination of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a fibrotic cross-linked collagen porous body, or a combination of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a non-fibrotic cross-linked collagen porous material A collagen molded body containing a laminate of the above can be produced.
Below, the process of the manufacturing method of the collagen molded object containing the laminated body of the collagen molded object containing a non-fibrosis crosslinked treatment collagen membrane and a non-fibrosis crosslinked treatment collagen membrane and a crosslinked treatment collagen porous body is demonstrated.

《コラーゲン溶解工程（１）》
コラーゲン溶解工程（１）は、酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程である。コラーゲン酸性溶液のコラーゲン濃度は、０．５質量％以上であれば、限定されるものではないが、１．０質量％以上が好ましく、１．５質量％以上がより好ましい。
コラーゲン溶解工程においては、酸性液にコラーゲンを溶解させ、コラーゲン酸性溶液を得ることができる。酸性液は、水性溶媒に二酸化炭素を溶解させて調製する二酸化炭素酸性液でもよく、水性溶媒に無機酸又は有機酸を溶解して調製する酸性液でもよい。二酸化炭素酸性液は、例えば、水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、又は水性溶媒にドライアイスを投入する方法によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、コラーゲンを溶解させるためには、溶媒のｐＨを２〜４とすることが好ましい。従って、ｐＨ４以下になるように、二酸化炭素を溶解させることが望ましい。
また、酸性液を調製するための無機酸又は有機酸は、特に限定されるものでないが、ｐＨを４以下にできる酸が好ましい。また、積層体形成後に酸を除去することができる揮発性の酸が好ましい。具体的には塩酸、酢酸、又は炭酸が好ましい。
また、コラーゲン酸性液は、コラーゲンと、二酸化炭素、無機酸、又は有機酸とを水性溶媒に同時に溶解することによって調製することも可能である。 << Collagen dissolution process (1) >>
The collagen dissolving step (1) is a step of dissolving collagen in an acidic solution to obtain a collagen acidic solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less. The collagen concentration of the collagen acidic solution is not limited as long as it is 0.5% by mass or more, but is preferably 1.0% by mass or more, and more preferably 1.5% by mass or more.
In the collagen dissolving step, collagen can be dissolved in an acidic solution to obtain a collagen acidic solution. The acidic liquid may be a carbon dioxide acidic liquid prepared by dissolving carbon dioxide in an aqueous solvent, or an acidic liquid prepared by dissolving an inorganic acid or an organic acid in an aqueous solvent. The carbon dioxide acidic liquid can be prepared, for example, by a method of bubbling carbon dioxide in an aqueous solvent or a method of putting dry ice in an aqueous solvent. The amount of carbon dioxide dissolved is not particularly limited, but the pH of the solvent is preferably 2 to 4 in order to dissolve collagen. Therefore, it is desirable to dissolve carbon dioxide so that the pH is 4 or less.
In addition, the inorganic acid or organic acid for preparing the acidic liquid is not particularly limited, but an acid capable of reducing the pH to 4 or less is preferable. Moreover, the volatile acid which can remove an acid after laminated body formation is preferable. Specifically, hydrochloric acid, acetic acid, or carbonic acid is preferable.
The acidic collagen solution can also be prepared by simultaneously dissolving collagen and carbon dioxide, inorganic acid, or organic acid in an aqueous solvent.

《成形工程（２）》
成形工程（２）は、コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、非線維化コラーゲン膜の前駆体を成形する工程である。
例えば、細胞培養用ウェルプレートに適した膜を作製する場合は、円形に成形できるシリコン製成形器を用いることが好ましい。コラーゲン酸性溶液の注入量は、必要とする膜厚に応じて適宜調整すればよい。また、温度及び時間条件についても、適宜設定すればよいが、例えば保持温度は２５〜４０℃であるのが好ましく、保持する時間は０．５〜１２時間であるのが好ましく、１〜６時間であるのがより好ましい。なお、成形中は上面をシールで覆うなどして水分の蒸発を防ぐための措置を採ることが望ましい。 << Molding process (2) >>
The forming step (2) is a step in which an acidic collagen solution is placed in a forming device to form a non-fibrotic collagen membrane precursor.
For example, when producing a membrane suitable for a well plate for cell culture, it is preferable to use a silicon molder that can be molded into a circle. What is necessary is just to adjust suitably the injection amount of a collagen acidic solution according to the required film thickness. The temperature and time conditions may be set as appropriate. For example, the holding temperature is preferably 25 to 40 ° C., and the holding time is preferably 0.5 to 12 hours, and 1 to 6 hours. It is more preferable that During molding, it is desirable to take measures to prevent evaporation of moisture by covering the upper surface with a seal.

《乾燥工程（３）》
乾燥工程（３）は、非線維化コラーゲン膜の前駆体を乾燥させる工程である。乾燥方法は、特に限定されるものではなく、例えば、自然乾燥、通風乾燥、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等が挙げられ、前記「《乾燥工程（３）》」に記載の方法に従って行うことができる。
例えば、非線維化コラーゲン膜の前駆体の乾燥は、以下の通り行うことができる。乾燥は、前駆体の上面から水性溶媒を蒸発させることによって、行うことができる。また、ゲルの上面及び下面を、水性溶媒が通過しない平滑なプレートなど覆い、側面からのみ徐々に脱水させることにより行うことができる。また、平滑なプレートで覆うことによって、得られる非線維化コラーゲン膜の膜厚を均一にすることができ、機械的強度を上昇させることが可能である。プレートは、特に限定されるものではないが、ポリスチレン、シリコーン、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル又はガラスを挙げることができるが、これらのうち剥離性の良いポリスチレンが好ましい。 << Drying process (3) >>
The drying step (3) is a step of drying the non-fibrotic collagen membrane precursor. The drying method is not particularly limited and includes, for example, natural drying, ventilation drying, vacuum drying, reduced pressure drying, freeze drying, and the like. Can do.
For example, the precursor of the non-fibrotic collagen membrane can be dried as follows. Drying can be performed by evaporating the aqueous solvent from the top surface of the precursor. Moreover, it can carry out by covering the upper surface and the lower surface of the gel with a smooth plate or the like through which the aqueous solvent does not pass, and gradually dehydrating only from the side surface. Moreover, by covering with a smooth plate, the thickness of the obtained non-fibrotic collagen film can be made uniform, and the mechanical strength can be increased. The plate is not particularly limited, and examples thereof include polystyrene, silicone, polyester, polyamide, polypropylene, polyethylene, polymethyl methacrylate, and glass. Among these, polystyrene having good peelability is preferable.

《接触工程（３ａ）》
接触工程（３ａ）は、非線維化コラーゲン膜と、線維化コラーゲンゲルまたはコラーゲン酸性溶液との接触物を作製するための工程である。なお、線維化コラーゲンゲルから線維化コラーゲン多孔体を作製することが可能であり、コラーゲン酸性溶液から非線維化コラーゲン多孔体を作製することができる。非線維化コラーゲン膜及び多孔体用コラーゲン液（線維化コラーゲンゲル又はコラーゲン酸性溶液）を接触させ積層化させる方法として、例えば、（ｉ）多孔体用コラーゲン液を成形器内に入れた後、当該溶液上に非線維化コラーゲン膜を載置する方法、（ｉｉ）非線維化コラーゲン膜を成形器内に入れた後、多孔体用コラーゲン液を注入する方法、（ｉｉｉ）上記（ｉ）の上から更に多孔体用コラーゲン液を注入する方法、（ｉｖ）上記（ｉｉ）の上に更に非線維化コラーゲン膜を載置する方法、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、上記（ｉ）又は（ｉｖ）のように、多孔体用コラーゲン液の上に非線維化コラーゲン膜を載置する場合、当該膜はコラーゲン液中に沈み込むことはほとんど無く、多孔体用コラーゲン液の上面に保持されることが一般的である。ところで、線維化コラーゲン膜と多孔体用コラーゲン液との接触部分では、非線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。多孔体用コラーゲン液が、線維化コラーゲンゲルであるか、又はコラーゲン酸性溶液であるかによって、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の２つの工程に分けることができる。
（Ａ）多孔体作製用線維化コラーゲンゲル
本工程は、線維化コラーゲン膜に代えて、非線維化コラーゲン膜を用いることを除いては、前記「（Ａ）多孔体作製用線維化コラーゲンゲル」に記載の方法に従って行うことができる。
（Ｂ）多孔体作製用コラーゲン酸性溶液
本工程も、線維化コラーゲン膜に代えて、非線維化コラーゲン膜を用いることを除いては、前記「（Ｂ）多孔体作製用コラーゲン酸性溶液」に記載の方法に従って行うことができる。 << Contact process (3a) >>
A contact process (3a) is a process for producing the contact thing of a non-fibrosis collagen membrane, a fibrosis collagen gel, or a collagen acidic solution. In addition, it is possible to produce a fibrillated collagen porous body from a fibrillated collagen gel, and it is possible to prepare a non-fibrotic collagen porous body from a collagen acidic solution. Examples of the method for contacting and laminating the non-fibrotic collagen membrane and the porous collagen solution (fibrotic collagen gel or collagen acidic solution) include, for example, (i) after placing the porous collagen solution in the molding machine, A method of placing a non-fibrotic collagen film on the solution, (ii) a method of injecting a collagen solution for porous material after the non-fibrotic collagen membrane is placed in a molding machine, (iii) above (i) (Iv) a method of further injecting a collagen solution for a porous body, (iv) a method of further placing a non-fibrotic collagen film on the above (ii), and the like, but is not limited thereto. When the non-fibrotic collagen membrane is placed on the porous body collagen solution as in the above (i) or (iv), the membrane hardly sinks into the collagen fluid, and is used for the porous body. Generally, it is held on the upper surface of the collagen liquid. By the way, a part of the non-fibrotic collagen membrane may be dissolved in the contact portion between the fibrotic collagen membrane and the porous body collagen solution, which is considered to contribute to the improvement of the binding property. Depending on whether the collagen solution for porous bodies is a fibrillated collagen gel or an acidic collagen solution, it can be divided into the following two steps (A) or (B).
(A) Fibrotic collagen gel for porous body preparation In this step, “(A) Fibrotic collagen gel for porous body preparation” is used except that a non-fibrotic collagen film is used instead of the fibrotic collagen film. Can be carried out according to the method described in 1.
(B) Collagen acidic solution for porous body preparation This step is also described in "(B) Collagen acidic solution for porous body preparation" except that a non-fibrotic collagen film is used instead of the fibrotic collagen film. It can be performed according to the method.

《架橋工程（４）》
架橋工程（４）は、前記乾燥工程（３）で得られた非線維化コラーゲン膜、又は凍結乾燥工程（３ｂ）で得られた非線維化コラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程である。
本発明のコラーゲン成形体の製造方法における架橋工程は、前記［２−２］線維化架橋処理コラーゲン膜及び架橋処理コラーゲン多孔体を含むコラーゲン成形体の製造方法の「架橋工程（４）」に記載の方法に従って、行うことができる。
架橋工程（４）は、前記一般式（１）で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下で行ってもよい。ポリエチレングリコール誘導体を添加する液として、架橋工程において非線維化コラーゲン膜、又は積層体を浸漬する液体、コラーゲン膜作製用コラーゲン酸性溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液、又はそれらの２つ以上の組み合わせを挙げることができるが、前記液体が好ましい。 << Crosslinking process (4) >>
In the cross-linking step (4), the non-fibrotic collagen membrane obtained in the drying step (3) or the laminate of the non-fibrotic collagen membrane obtained in the freeze-drying step (3b) and the collagen porous body is liquid. In the presence of γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation.
The cross-linking step in the method for producing a collagen molded body of the present invention is described in “2-2 Cross-linking step (4)” of the method for producing a collagen molded body including the [2-2] fibrosis cross-linked collagen membrane and the cross-linked collagen porous body. This can be done according to the method of
You may perform a bridge | crosslinking process (4) in presence of the polyethyleneglycol derivative represented by the said General formula (1). As a liquid for adding a polyethylene glycol derivative, a non-fibrotic collagen film or a liquid for immersing a laminate in a crosslinking step, a collagen acidic solution for preparing a collagen film, a fibrotic collagen gel for preparing the porous body, and a material for preparing the porous body A collagen acidic solution or a combination of two or more thereof can be mentioned, but the liquid is preferred.

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
なお、実施例において％は、特に断らない限り全て質量％（重量％）を示す。また、特に断らない限り化合物はすべて試薬を用いた。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
In Examples, “%” means “% by mass” (% by weight) unless otherwise specified. Unless otherwise specified, all compounds used reagents.

《実施例１》
コラーゲンとして、テラピアの鱗から製造された多木化学（株）製「セルキャンパス ＦＤ−０８Ｇ」スポンジ品をｐＨ３のＨＣｌ溶液に溶解し、コラーゲン濃度が１．１％の無色透明溶液（以下、「コラーゲン溶液Ａ」という）を調製した。コラーゲン溶液Ａの９容量部と１０倍濃い濃度に作製したＤ−ＰＢＳの１容量部とを混合し、この混合液０．７９ｍＬをシリコン製の成形器（直径２０ｍｍ、高さ２．５ｍｍ）に注入し、水分の蒸発を防ぐためにスライドグラスで上面を覆い、２５℃・１２時間保持して線維化コラーゲンゲルを得た。当該線維化コラーゲンゲルを、エタノール／水の容量比が５０／５０の混合液（以下、５０／５０のように表記する）、７０／３０、９０／１０、１００／０に順次浸漬して、脱塩した後、膜の上下面をポリスチレン板で覆い、側面のみから脱媒させることにより乾燥させて線維化コラーゲン膜を得た。
得られた線維化コラーゲン膜は、引張強度は４７ＭＰａ、平均膜厚は４５μｍであった。また、線維化コラーゲン膜の重量を体積で除した密度は０．６６ｇ／ｃｍ３であった。
次に、当該線維化コラーゲン膜をＤ−ＰＢＳに浸漬した状態で、２５ｋＧｙのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を作製した。 Example 1
As a collagen, a “Cell Campus FD-08G” sponge manufactured by Taki Chemical Co., Ltd. manufactured from tilapia scales was dissolved in a pH 3 HCl solution, and a colorless transparent solution (hereinafter, “ Collagen solution A ”) was prepared. 9 parts by volume of collagen solution A and 1 part by volume of D-PBS prepared to a 10-fold higher concentration were mixed, and 0.79 mL of this mixed solution was placed in a silicon molder (diameter 20 mm, height 2.5 mm). Injected, the upper surface was covered with a slide glass to prevent evaporation of moisture, and kept at 25 ° C. for 12 hours to obtain a fibrillated collagen gel. The fibrotic collagen gel is sequentially immersed in a 50/50 ethanol / water volume ratio (hereinafter expressed as 50/50), 70/30, 90/10, 100/0, After desalting, the upper and lower surfaces of the membrane were covered with polystyrene plates and dried by removing the solvent only from the side surfaces to obtain a fibrillated collagen membrane.
The obtained fibrotic collagen film had a tensile strength of 47 MPa and an average film thickness of 45 μm. The density obtained by dividing the weight of the fibrotic collagen membrane by the volume was 0.66 g / cm 3 .
Next, in the state where the fibrotic collagen membrane was immersed in D-PBS, 25 kGy of γ-ray irradiation was performed to produce a collagen molded body composed of a fibrotic crosslinked collagen membrane.

得られたコラーゲン成形体の膜厚は１０３μｍ、面積変化率は３．８％（収縮）、引張強度は２．０９ＭＰａであった。また、溶出試験による溶出率は３％であった。   The obtained collagen molded body had a film thickness of 103 μm, an area change rate of 3.8% (shrinkage), and a tensile strength of 2.09 MPa. Further, the dissolution rate by the dissolution test was 3%.

《実施例２》
γ線照射を１０ｋＧｙとした以外は、実施例１の操作を繰り返し、線維化コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を作製した。得られたコラーゲン成形体の膜厚は１００μｍ、面積変化率は０．２％（膨潤）、引張強度は３．７ＭＰａであった。また、溶出試験による溶出率は４％であった。 Example 2
Except that the γ-ray irradiation was set to 10 kGy, the operation of Example 1 was repeated to prepare a collagen molded body composed of a fibrotic collagen film. The obtained collagen molded body had a film thickness of 100 μm, an area change rate of 0.2% (swelling), and a tensile strength of 3.7 MPa. Further, the dissolution rate by the dissolution test was 4%.

〔比較例１〕
乾燥させた線維化コラーゲン膜をそのままγ線照射した以外は、実施例１と同様にして架橋線維化コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を作製した。得られたコラーゲン成形体の膜厚は４５μｍであったが、面積変化率は３７℃のＤ−ＰＢＳに浸漬した時点で膜が溶解し始め、３時間後には完全に溶解したため測定できなかった。また、引張強度も１日間のＤ−ＰＢＳ浸漬によって膜が脆弱になったため、測定不能であった。また、溶出試験による溶出率は１２％であった。 [Comparative Example 1]
A collagen molded body composed of a crosslinked fibrotic collagen membrane was produced in the same manner as in Example 1 except that the dried fibrotic collagen membrane was directly irradiated with γ rays. The film thickness of the obtained collagen molded body was 45 μm, but the area change rate could not be measured because the film started to dissolve when immersed in D-PBS at 37 ° C. and completely dissolved after 3 hours. Also, the tensile strength was not measurable because the membrane became brittle after 1 day of D-PBS immersion. Further, the dissolution rate by the dissolution test was 12%.

《評価方法》
前記実施例１、実施例２、及び比較例１のコラーゲン成形体の物性は、以下の方法により測定した。 "Evaluation method"
The physical properties of the collagen molded bodies of Example 1, Example 2, and Comparative Example 1 were measured by the following methods.

［膜厚の測定法］
実施例１及び実施例２のコラーゲン成形体については、架橋処理後にＤ−ＰＢＳから取り出した湿潤状態のコラーゲン成形体の５箇所の膜厚をマイクロメーターにより計測し、その平均値を求めた。一方、実施例１の架橋処理前の線維化コラーゲン膜及び比較例１のコラーゲン成形体については、乾燥状態で同様に膜厚を測定し、その平均値を求めた。 [Measurement method of film thickness]
About the collagen molded object of Example 1 and Example 2, the film thickness of five places of the collagen molded body of the wet state taken out from D-PBS after bridge | crosslinking process was measured with the micrometer, and the average value was calculated | required. On the other hand, for the fibrotic collagen membrane before the crosslinking treatment of Example 1 and the collagen molded body of Comparative Example 1, the film thickness was similarly measured in a dry state, and the average value was obtained.

［面積変化率試験］
コラーゲン成形体をＤ−ＰＢＳ中に３７℃、５日間浸漬した後、角度を変えて３箇所計測した直径から算出した面積の平均値と、浸漬前に同様に算出した面積の平均値との差を求め、これを浸漬前の面積の平均値で除し、面積変化率として算出した。 [Area change rate test]
The difference between the average value of the area calculated from the diameter measured at three locations after changing the angle after immersing the collagen molded body in D-PBS at 37 ° C. for 5 days and the average value of the area similarly calculated before the immersion This was divided by the average area before immersion and calculated as the area change rate.

［引張強度試験］
コラーゲン成形体をＤ−ＰＢＳ中に２０℃、１日間浸漬し、Ｄ−ＰＢＳから取り出した後２０分以内に、乾燥させること無く湿潤状態のままで、引張強度測定機（Ｏｒｉｅｎｔｅｃ社製「ＳＴＡ−１１５０」）により引張強度を測定した。具体的には、ロードセル間の距離が１０ｍｍとなるように膜の両端を固定し、０．５ｍｍ／分の速度で引張り、破断時の応力を測定した。引張強度の計算は以下の式により求めた。
（式）ｆｔ＝Ｐ／Ｓ
但し、ｆｔ：引張強度（ＭＰａ）、Ｐ：最大荷重（Ｎ）、Ｓ：断面積（ｍｍ２）
膜５個の平均値を引張強度とした。 [Tensile strength test]
The collagen molded body was immersed in D-PBS at 20 ° C. for 1 day, taken out from D-PBS, and within 20 minutes, without being dried, a tensile strength measuring machine (“STA-” manufactured by Orientec) 1150 ") and the tensile strength was measured. Specifically, both ends of the membrane were fixed so that the distance between the load cells was 10 mm, the film was pulled at a rate of 0.5 mm / min, and the stress at break was measured. The calculation of the tensile strength was obtained by the following formula.
(Formula) f t = P / S
However, ft : Tensile strength (MPa), P: Maximum load (N), S: Cross-sectional area (mm 2 )
The average value of five films was taken as the tensile strength.

［溶出試験］
コラーゲン成形体を６ｗｅｌｌプレートに配し、ＰＢＳ溶液５ｍＬ中に３７℃で５日間浸漬した。５日後、上澄みのみをサンプリングし、８０℃で１日間乾燥した後、重量を測定し、溶出率を算出した。 [Dissolution test]
The collagen compact was placed on a 6-well plate and immersed in 5 mL of PBS solution at 37 ° C. for 5 days. After 5 days, only the supernatant was sampled and dried at 80 ° C. for 1 day, and then the weight was measured to calculate the elution rate.

［ＧＰＣによる分子量分布測定］
コラーゲン成形体を２０ｍＬのＰＢＳに浸漬し、３７℃で５日間インキュベートした。インキュベート後、上澄みを回収しサンプルとした。得られたサンプルの分子量分布を下記の条件で測定し、結果を図２に示した。
・装置：（株）島津製作所製 高速液体クロマトグラフ ＬＣ−２０Ａシステム
・検出器：ＲＩ検出器 ＲＩＤ−１０Ａ 温度２５℃
・カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ−８０３
・カラムオーブン：２５℃
・流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・溶離液：ＰＢＳ
・サンプル量：２０μＬ
図２より、２５ｋＧｙ照射の実施例１及び１０ｋＧｙ照射の実施例２ではクロマトグラフの変化が少なかったのに対し、未照射の比較例１はピークが２つ検出され、そのうちの１つはゼラチンに相当する分子量ピークであった。このことより、３７℃で５日間のＰＢＳ浸漬によって、実施例１及び実施例２のコラーゲン成形体はほとんど分解しなかった又は分解したとしてもわずかな量にとどまったのに対し、比較例１のコラーゲン成形体は分解しやすいものであることが分かった。 [Molecular weight distribution measurement by GPC]
The collagen compact was immersed in 20 mL of PBS and incubated at 37 ° C. for 5 days. After incubation, the supernatant was recovered and used as a sample. The molecular weight distribution of the obtained sample was measured under the following conditions, and the results are shown in FIG.
・ Device: Shimadzu Corporation high performance liquid chromatograph LC-20A system ・ Detector: RI detector RID-10A Temperature 25 ° C.
Column: Shodex PROTEIN KW-803
-Column oven: 25 ° C
・ Flow rate: 1.0 mL / min
・ Eluent: PBS
-Sample volume: 20 μL
As shown in FIG. 2, the chromatographic changes were small in Example 1 with 25 kGy irradiation and Example 2 with 10 kGy irradiation, whereas in Comparative Example 1 without irradiation, two peaks were detected, one of which was in gelatin. The corresponding molecular weight peak. From this, the collagen molded bodies of Example 1 and Example 2 were hardly decomposed by PBS immersion at 37 ° C. for 5 days, or only a small amount even if they were decomposed. It was found that the collagen molded body was easily decomposed.

《実施例３》
湿潤状態でγ線照射をしない以外は、実施例１の操作を繰り返し、線維化コラーゲン膜を作製した。一方、実施例１に記載のコラーゲン溶液Ａを成形器内に入れ、前記線維化コラーゲン膜をコラーゲン溶液Ａの上に載置し、しばらく静置して積層体化させた。なお、載置した前記線維化コラーゲン膜は、コラーゲン溶液Ａの上面に保持された状態で積層体化した。
次いで、前記積層体を−３５℃で約２時間凍結乾燥し、積層体を得た（図３）。乾燥後の積層体は、膜側が緻密構造を有し、反対面には多孔構造を有するものであった（図５）。
次に、当該積層体をＤ−ＰＢＳに浸漬した。このとき、多孔体部分の気泡を平先ピンセットで脱気した。これを２５ｋＧｙのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜と非線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体からなるコラーゲン成形体を作製した。
当該コラーゲン成形体を３７℃条件のＤ−ＰＢＳに２４時間浸漬しても殆ど変形は確認されなかった（図４）。 Example 3
The procedure of Example 1 was repeated except that γ-ray irradiation was not performed in a wet state to produce a fibrotic collagen membrane. On the other hand, the collagen solution A described in Example 1 was placed in a molding machine, and the fibrotic collagen membrane was placed on the collagen solution A and allowed to stand for a while to form a laminate. In addition, the placed fibrotic collagen membrane was laminated in a state of being held on the upper surface of the collagen solution A.
Next, the laminate was freeze-dried at −35 ° C. for about 2 hours to obtain a laminate (FIG. 3). The laminated body after drying had a dense structure on the membrane side and a porous structure on the opposite surface (FIG. 5).
Next, the laminate was immersed in D-PBS. At this time, the air bubbles in the porous body portion were deaerated with flat-tip tweezers. This was irradiated with 25 kGy of γ-rays to prepare a collagen molded body comprising a laminate of a fibrillated cross-linked collagen membrane and a non-fibrotic cross-linked collagen porous body.
Even when the collagen compact was immersed in D-PBS at 37 ° C. for 24 hours, almost no deformation was observed (FIG. 4).

《実施例４》
実施例１と同様の方法で作製した線維化コラーゲンゲルをＤ−ＰＢＳに浸漬させ、２５ｋＧｙのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲンゲルを作製した。これを実施例１と同様のエタノール／水の混合液にて、脱塩した後、側面のみから脱媒させることにより、乾燥させて線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を得た。引張強度測定は、Ｄ−ＰＢＳに浸漬した状態で行った。その結果、２１．１±４．６ＭＰａであった。 Example 4
The fibrotic collagen gel produced by the same method as in Example 1 was dipped in D-PBS, and irradiated with 25 kGy of γ-ray to produce a fibrotic cross-linked collagen gel. This was desalted with the same ethanol / water mixture as in Example 1 and then desolvated only from the side surface, thereby drying to obtain a collagen molded body comprising a fibrotic crosslinked collagen membrane. Tensile strength measurement was performed in a state immersed in D-PBS. As a result, it was 21.1 ± 4.6 MPa.

《実施例５》
実施例１と同様の方法で、図６に示すダンベル型形状（高さ２．５ｍｍ）に加工した成形器を用いて線維化コラーゲンゲルを作製した。当該線維化コラーゲンゲル（５個）を、全コラーゲン分子数の１０倍モル量のポリエチレングリコールジアクリレート（分子量２，０００）を混合した２０ｍＬのＤ−ＰＢＳに浸漬させた。２５ｋＧｙのγ線照射を行い、線維化架橋処理コラーゲンゲルを作製した。これを実施例１と同様のエタノール／水の混合液にて、脱塩した後、側面から脱水させることにより、乾燥させて線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を得た。引張強度測定は、Ｄ−ＰＢＳに浸漬した状態で行った。その結果、３５．４±１．６ＭＰａであった。 Example 5
In the same manner as in Example 1, a fibrillated collagen gel was prepared using a molding machine processed into a dumbbell shape (height 2.5 mm) shown in FIG. The fibrotic collagen gels (5) were immersed in 20 mL of D-PBS mixed with polyethylene glycol diacrylate (molecular weight: 2,000) having a molar amount of 10 times the total number of collagen molecules. Irradiation with 25 kGy of γ rays was performed to prepare a fibrosis-crosslinked collagen gel. This was desalted with the same ethanol / water mixed solution as in Example 1, and then dehydrated from the side surface, and dried to obtain a collagen molded body composed of a fibrotic crosslinked collagen membrane. Tensile strength measurement was performed in a state immersed in D-PBS. As a result, it was 35.4 ± 1.6 MPa.

《実施例６》
全コラーゲン分子数の５倍モル量のポリエチレングリコールジアクリレート（分子量２，０００）をＤ−ＰＢＳに混合した以外は、実施例１と同様の方法で、成形器を図６に示すダンベル型形状（高さ２．５ｍｍ）に加工した線維化コラーゲンゲルを作製した。当該線維化コラーゲンゲルを、エタノール／水の容量比が５０／５０の混合液（以下、５０／５０のように表記する）、７０／３０、９０／１０、１００／０に順次浸漬して、脱塩した後、膜の上下面をポリスチレン板で覆い、側面のみから脱媒させることにより乾燥させて線維化コラーゲン膜を得た。当該線維化コラーゲン膜をＤ−ＰＢＳに浸漬した状態で、２５ｋＧｙのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を得た。引張強度測定は、Ｄ−ＰＢＳに浸漬した状態で行った。その結果、２３．８±２．６ＭＰａであった。
これらの結果は、ポリエチレングリコールをコラーゲン成形体に混合することで、架橋密度が向上し、その引張強度を劇的に向上させることを示していた。 Example 6
Except that polyethylene glycol diacrylate (molecular weight: 2,000) having a molar amount of 5 times the total number of collagen molecules was mixed with D-PBS, the molding machine was dumbbell-shaped as shown in FIG. A fibrillated collagen gel processed to a height of 2.5 mm was prepared. The fibrotic collagen gel is sequentially immersed in a 50/50 ethanol / water volume ratio (hereinafter expressed as 50/50), 70/30, 90/10, 100/0, After desalting, the upper and lower surfaces of the membrane were covered with polystyrene plates and dried by removing the solvent only from the side surfaces to obtain a fibrillated collagen membrane. In the state where the fibrotic collagen membrane was immersed in D-PBS, 25 kGy of γ-ray irradiation was performed to obtain a collagen molded body composed of a fibrotic cross-linked collagen membrane. Tensile strength measurement was performed in a state immersed in D-PBS. As a result, it was 23.8 ± 2.6 MPa.
These results showed that the crosslink density was improved and the tensile strength was dramatically improved by mixing polyethylene glycol with the collagen molded body.

本発明のコラーゲン成形体、及び本発明の架橋方法及び本発明の製造方法によって得られたコラーゲン成形体は、液体中で溶解しにくく、液体中で収縮、又は膨潤などの変化が起こりにくい。従って、液体や生体中でも用いられる、細胞培養基材、再生医療用の足場材料、移植用材料、創傷被覆材、癒着防止材、又は薬物輸送担体等に効果的に用いることができる。   The collagen molded body of the present invention, and the collagen molded body obtained by the cross-linking method of the present invention and the manufacturing method of the present invention are hardly dissolved in a liquid, and changes such as shrinkage or swelling are unlikely to occur in the liquid. Therefore, it can be effectively used as a cell culture substrate, a scaffold material for regenerative medicine, a transplant material, a wound dressing material, an anti-adhesion material, a drug transport carrier, etc., used in liquids and in living bodies.

Claims (13)

線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜と、線維化又は非繊維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体であって、前記線維化架橋処理コラーゲン膜は線維化コラーゲンゲルを脱塩及び乾燥することにより得られるものであり、前記非線維化架橋処理コラーゲン膜はコラーゲン酸性溶液を乾燥することにより得られるものであり、前記積層体が、凍結乾燥後に、水性溶媒の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理することによって得られ、
前記架橋処理コラーゲン膜の重量法による密度が０．４ｇ／ｃｍ３以上であり、そして
湿潤下での引張強度が１ＭＰａ以上であることを特徴とする、
コラーゲン成形体。 A collagen molded body comprising a laminate of a fibrillated or non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a fibrillated or non-fibrotic cross-linked collagen porous body, wherein the fibrillated cross-linked collagen membrane removes a fibrillated collagen gel. The non-fibrotic cross-linked collagen membrane is obtained by drying a collagen acidic solution, and the laminate is freeze-dried in the presence of an aqueous solvent. It is obtained by crosslinking treatment by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation,
The density by the gravimetric method of the cross-linked collagen membrane is 0.4 g / cm 3 or more, and the tensile strength under wet condition is 1 MPa or more,
Collagen molded body. 前記架橋処理が、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）
で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下での架橋処理である、請求項１に記載のコラーゲン成形体。 The crosslinking treatment is performed by the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms 5 is an alkylene group, and n is an integer of 1 to 500)
The collagen molded body according to claim 1, which is a crosslinking treatment in the presence of a polyethylene glycol derivative represented by the formula: 前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が１，０００〜１５，０００である、請求項１又は２に記載のコラーゲン成形体。   The collagen molded product according to claim 1 or 2, wherein the polyethylene glycol derivative has a molecular weight of 1,000 to 15,000. 前記水性溶媒のｐＨが３．０〜１０．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。 The collagen molded body according to any one of claims 1 to 3, wherein the pH of the aqueous solvent is 3.0 to 10.0. 前記γ線照射の照射量が、５〜５０ｋＧｙである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。   The collagen molded body according to any one of claims 1 to 4, wherein an irradiation amount of the γ-ray irradiation is 5 to 50 kGy. ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に３７℃で５日間浸漬した場合の溶解率が１０質量％以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。   The collagen molded product according to any one of claims 1 to 5, wherein the dissolution rate when immersed in Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) at 37 ° C for 5 days is 10% by mass or less. ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に３７℃で５日間浸漬した後の、浸漬前に対する面積変化率が５％以内である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。   The area change rate with respect to before immersion after dipping in Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) at 37 ° C for 5 days is 5% or less, according to any one of claims 1 to 6. Collagen molded body. （１）コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、
（２）前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、
（３）前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、
（３ａ）（Ａ）前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは、
（Ｂ）前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、
（３ｂ）前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、
（４）前記積層体を、水性溶媒の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程
を含む、線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法。 (1) A step of forming a fibrillated collagen gel by placing a collagen solution having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less in a molding machine to fibrillate the collagen,
(2) A step of desalting the fibrotic collagen gel by sequentially immersing the mixture in a water-miscible organic solvent in which the water-miscible organic solvent concentration is increased stepwise.
(3) drying the desalted fibrillated collagen gel to obtain a fibrillated collagen membrane;
(3a) (A) contacting the fibrillated collagen membrane with a fibrillated collagen gel for producing a porous body having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, or
(B) a step of bringing the fibrillated collagen membrane into contact with a collagen acidic solution for preparing a porous body having a collagen concentration of 5.0% by mass or less;
(3b) a step of freeze-drying the contact material to obtain a laminate,
(4) A fibrotic cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body comprising a step of cross-linking the laminate by gamma ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of an aqueous solvent. The manufacturing method of the collagen molded object containing the laminated body of this. 前記乾燥工程（３）が、脱塩した線維化コラーゲンゲルを、上部及び下部を被覆して通気性を遮断した被覆上部と被覆下部との間に、非被覆の外周部を設け、当該外周部から脱媒して乾燥させる工程である、請求項８に記載のコラーゲン成形体の製造方法。   In the drying step (3), the desalted fibrillated collagen gel is provided with an uncoated outer peripheral portion between the coated upper portion and the coated lower portion, which covers the upper and lower portions to block the air permeability, and the outer peripheral portion. The method for producing a collagen molded product according to claim 8, wherein the method is a step of removing the solvent from the product and drying it. 前記水性溶媒、前記コラーゲン溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも１つが、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）
で表されるポリエチレングリコール誘導体を含む、請求項８又は９に記載のコラーゲン成形体の製造方法。 At least one selected from the group consisting of the aqueous solvent , the collagen solution, the fibrillated collagen gel for producing the porous body, and the collagen acidic solution for producing the porous body is represented by the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms 5 is an alkylene group, and n is an integer of 1 to 500)
The manufacturing method of the collagen molded object of Claim 8 or 9 containing the polyethyleneglycol derivative represented by these. （１）酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、
（２）前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、
（３）前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、
（３ａ）（Ａ）前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が０．５質量％以上３．０質量％以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは
（Ｂ）前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が５．０質量％以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、
（３ｂ）前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、
（４）前記積層体を、水性溶媒の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はＵＶ照射によって架橋処理する工程、
を含む、非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法。 (1) A step of dissolving collagen in an acidic solution to obtain a collagen acidic solution having a collagen concentration of 0.5% by mass to 3.0% by mass,
(2) A step of putting the collagen acidic solution into a molding machine and molding the collagen solution,
(3) drying the collagen acidic solution to obtain a non-fibrotic collagen membrane;
(3a) (A) a step of bringing the non-fibrotic collagen membrane into contact with a fibrous collagen gel for producing a porous body having a collagen concentration of 0.5% by mass or more and 3.0% by mass or less, or (B) the non-fibrosis A step of contacting the fibrillated collagen membrane with a collagen acidic solution for producing a porous body having a collagen concentration of 5.0% by mass or less,
(3b) a step of freeze-drying the contact material to obtain a laminate,
(4) A step of crosslinking the laminate by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, or UV irradiation in the presence of an aqueous solvent ;
A method for producing a collagen molded body comprising a laminate of a non-fibrotic cross-linked collagen membrane and a cross-linked collagen porous body. 前記水性溶媒、前記コラーゲン膜作製用コラーゲン酸性溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも１つが、一般式（１）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−Ｃ＝ＣＨ２、及び−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２からなる群から選択される基であり、Ｙは、単結合、酸素原子（Ｏ）、場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基、又は鎖中に酸素原子を含む場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｚは、単結合、又は場合により置換されていることのある炭素数１〜５のアルキレン基であり、そしてｎは１〜５００の整数である）
で表されるポリエチレングリコール誘導体を含む、請求項１１に記載のコラーゲン成形体の製造方法。 At least one selected from the group consisting of the aqueous solvent , the collagen acidic solution for preparing the collagen membrane, the fibrotic collagen gel for preparing the porous material, and the collagen acidic solution for preparing the porous material is represented by the general formula (1)
Wherein R 1 and R 2 are each independently —COOH, —OH, —SH, —NH 2 , —NH—CO—CH 2 —CH 2 —COOH, —CO—C═CH 2 , and A group selected from the group consisting of —CO—C (CH 3 ) ═CH 2 , wherein Y is a single bond, an oxygen atom (O), or an optionally substituted alkylene having 1 to 5 carbon atoms. Group or an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms which may be optionally substituted if it contains an oxygen atom in the chain, and Z is a single bond or optionally substituted 1 to 1 carbon atoms 5 is an alkylene group, and n is an integer of 1 to 500)
The manufacturing method of the collagen molded object of Claim 11 containing the polyethyleneglycol derivative represented by these. 請求項８〜１２のいずれか一項に記載の製造方法によって得ることのできるコラーゲン成形体。   The collagen molded object which can be obtained by the manufacturing method as described in any one of Claims 8-12.
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