JP6758616B2 - Cell culture method and culture tissue - Google Patents
Cell culture method and culture tissue Download PDFInfo
- Publication number
- JP6758616B2 JP6758616B2 JP2016031777A JP2016031777A JP6758616B2 JP 6758616 B2 JP6758616 B2 JP 6758616B2 JP 2016031777 A JP2016031777 A JP 2016031777A JP 2016031777 A JP2016031777 A JP 2016031777A JP 6758616 B2 JP6758616 B2 JP 6758616B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- cell culture
- shape
- irradiation
- fibrotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 102
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 232
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 232
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 232
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims description 110
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 67
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 65
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 55
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 claims description 46
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 23
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 claims description 22
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 claims description 21
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 106
- 239000000047 product Substances 0.000 description 87
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 48
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 description 41
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 38
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 12
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 12
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 11
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 10
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 7
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 7
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 7
- -1 polyethylenes Polymers 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 5
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229920002803 thermoplastic polyurethane Polymers 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 159000000011 group IA salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229920002050 silicone resin Polymers 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4-dimethylphenyl)propan-1-one Chemical compound CCC(=O)C1=CC=C(C)C=C1C UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N Cobalt-60 Chemical compound [60Co] GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002777 columnar cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 229920005992 thermoplastic resin Polymers 0.000 description 1
- 229920001187 thermosetting polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、細胞培養基材を用いた細胞培養方法及び培養組織に関する。 The present invention relates to a cell culture method and a culture tissue using a cell culture substrate.
近年、再生医療への関心の高まりから、細胞培養技術を用いて、生体組織と類似した構造及び機能を備えた培養組織を人工的に得る試みがなされている。生体を構成する細胞の多くは接着依存性細胞である。接着依存性細胞を効率的に培養して、生体組織と類似した培養組織を得るためには、足場となる細胞培養基材が不可欠である。 In recent years, due to growing interest in regenerative medicine, attempts have been made to artificially obtain a cultured tissue having a structure and function similar to that of a living tissue by using a cell culture technique. Most of the cells that make up a living body are adhesion-dependent cells. In order to efficiently culture adhesion-dependent cells and obtain a cultured tissue similar to a living tissue, a cell culture substrate as a scaffold is indispensable.
一方、コラーゲンは、生体内のタンパク質の30％を占め、骨格支持及び細胞接着等の機能を有する重要なタンパク質であり、例えば、骨・軟骨、靭帯・腱、角膜実質、皮膚、肝臓、筋肉等の組織は、コラーゲン線維からできている。コラーゲン線維は、３重螺旋構造のコラーゲン分子が略規則的に配向した会合体である。 On the other hand, collagen accounts for 30% of proteins in the living body and is an important protein having functions such as skeletal support and cell adhesion. For example, bone / cartilage, ligaments / tendons, stroma, skin, liver, muscle, etc. Tissue is made up of collagen fibers. Collagen fibers are aggregates in which collagen molecules having a triple helix structure are oriented substantially regularly.
コラーゲンを、細胞培養基材の材料として適用するために、種々の検討がなされている。例えば、特許文献１には、コラーゲン線維で構成され、三次元の細胞培養が可能な多孔質構造を有し、且つ、架橋処理されたコラーゲン線維架橋多孔体に関する技術が開示されている。 Various studies have been conducted to apply collagen as a material for a cell culture substrate. For example, Patent Document 1 discloses a technique relating to a collagen fiber crosslinked porous body which is composed of collagen fibers, has a porous structure capable of three-dimensional cell culture, and has been crosslinked.
特許文献２には、底面に複数の氷粒子を配置した鋳型にブタＩ型アテロコラーゲン酸性水溶液を注入し、凍結乾燥により氷粒子を除去した後、グルタルアルデヒドで架橋処理することにより、複数の凹部が表面に設けられた多孔質コラーゲン成形体の製造に関する技術が開示されている。
In
特許文献１及び２に記載の多孔質コラーゲン成形体では、その表面に存在する凹部形状は別として、成形体そのものが多孔質に形成されている。特許文献２に記載された製造方法は、凍結乾燥によりコラーゲン水溶液中の氷結晶を除去する方法であるため、細胞にとっては相当に大きな孔径の孔を有した多孔質の成形体が形成されると考えられる。したがって、このような多孔質コラーゲン成形体を細胞培養基材として用いた場合、細胞が成形体の孔内部に落ち込むため、成形体の表面にとどまるのが困難となる傾向がある。よって、このような成形体は、特に、細胞培養基材の表面で組織形成する細胞種にとって、好適な材料とは言い難かった。一説には、孔径が数十μｍ程度あれば、細胞が孔内部に落ち込むと言われている。
In the porous collagen molded product described in
以上のように、細胞の種類、細胞培養によって得られる培養組織の種類等によっては、新たな特性を有する細胞培養基材及びこれを用いた細胞培養方法の技術開発が要望されていた。 As described above, there has been a demand for technological development of a cell culture substrate having new characteristics and a cell culture method using the cell culture substrate, depending on the type of cells, the type of culture tissue obtained by cell culture, and the like.
本発明者らは、上記特性の１つとして、より生体組織に類似した細胞培養基材を用いた細胞培養方法について鋭意検討するなかで、驚くべきことに、非多孔質性であって、その表面に凹形状及び／又は凸形状を有する表面加工コラーゲン成形体を細胞培養基材として用いることにより、このような表面加工されていないコラーゲン成形体を細胞培養基材に用いた場合と比較して、優れた培養結果が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As one of the above-mentioned characteristics, the present inventors have diligently studied a cell culture method using a cell culture substrate more similar to a living tissue, and surprisingly, the cell culture method is non-porous. By using a surface-processed collagen molded product having a concave shape and / or a convex shape on the surface as the cell culture base material, as compared with the case where such a non-surface-processed collagen molded product is used as the cell culture base material. We have found that excellent culture results can be obtained, and have completed the present invention.
本発明は、以下のとおりである。
〔１〕細胞培養基材に細胞を播種する播種工程と、この細胞を培養する培養工程とを含む細胞培養方法であって、前記細胞培養基材が表面加工コラーゲン成形体であり、前記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部が凹形状及び／又は凸形状を有しており、かつこの成形体の主要構成要素が、損なわれていない（intact）線維化コラーゲン又はコラーゲン分子である細胞培養方法。
〔２〕細胞培養基材に細胞を播種する播種工程と、この細胞を培養する培養工程とを含む細胞培養方法であって、前記細胞培養基材が表面加工コラーゲン成形体であり、前記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、少なくとも一部が転写部材と接触した状態で、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に前記転写部材の形状が転写又は反映された被転写部を有しており、この被転写部に凹形状及び／又は凸形状を有している細胞培養方法。
〔３〕細胞培養基材に細胞を播種する播種工程と、この細胞を培養する培養工程とを含む細胞培養方法であって、前記細胞培養基材が表面加工コラーゲン成形体であり、前記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に、凹形状及び／又は凸形状に変形した表面形状を有している細胞培養方法。
〔４〕細胞培養基材と、この細胞培養基材の表面及び／又は内部に形成されている細胞組織とを含んでなる培養組織であって、上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部が凹形状及び／又は凸形状を有しており、かつこの成形体の主要構成要素が、損なわれていない（intact）線維化コラーゲン又はコラーゲン分子である培養組織。
〔５〕細胞培養基材と、この細胞培養基材の表面及び／又は内部に形成されている細胞組織とを含んでなる培養組織であって、上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、少なくとも一部が転写部材と接触した状態で、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に上記転写部材の形状が転写又は反映された被転写部を有しており、この被転写部に凹形状及び／又は凸形状を有している培養組織。
〔６〕細胞培養基材と、この細胞培養基材の表面及び／又は内部に形成されている細胞組織とを含んでなる培養組織であって、上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に、凹形状及び／又は凸形状に変形した表面形状を有している培養組織。
The present invention is as follows.
[1] A cell culture method including a seeding step of seeding cells on a cell culture substrate and a culture step of culturing the cells, wherein the cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product, and the surface-processed. A molded product in which an uncrosslinked fibrous collagen gel, a fibrous collagen membrane or a non-fibrotic collagen membrane is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. And at least a part of the surface of the molded body has a concave and / or convex shape, and the main components of the molded body are intact fibrotic collagen or collagen molecules. Is a cell culture method.
[2] A cell culture method including a seeding step of seeding cells on a cell culture base material and a culture step of culturing the cells, wherein the cell culture base material is a surface-processed collagen molded product, and the surface processing is performed. Collagen molded product, uncrosslinked fibrous collagen gel, fibrous collagen membrane or non-fibrotic collagen membrane in the presence of an aqueous solvent, with at least part in contact with the transfer member, γ-ray irradiation, electron beam irradiation , UV irradiation or plasma irradiation cross-linked molded body, and has a transferred portion in which the shape of the transfer member is transferred or reflected on at least a part of the surface of the molded body, and the transferred portion is transferred. A cell culture method having a concave shape and / or a convex shape.
[3] A cell culture method including a seeding step of seeding cells on a cell culture substrate and a culture step of culturing the cells, wherein the cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product, and the surface-processed. A molded product in which an uncrosslinked fibrous collagen gel, a fibrous collagen membrane or a non-fibrotic collagen membrane is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. A cell culture method in which at least a part of the surface of the molded product has a surface shape deformed into a concave shape and / or a convex shape.
[4] A culture tissue comprising a cell culture base material and a cell tissue formed on the surface and / or inside of the cell culture base material, wherein the cell culture base material is a surface-processed collagen molded product. The surface-processed collagen molded product is an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film or a non-fibrotic collagen film in the presence of an aqueous solvent, and is irradiated with γ-ray, electron-beam, UV or plasma. At least a part of the surface of the molded body has a concave shape and / or a convex shape, and the main components of the molded body are intact. Cultured tissue that is fibrotic collagen or collagen molecules.
[5] A culture medium comprising a cell culture substrate and a cell tissue formed on the surface and / or inside of the cell culture substrate, wherein the cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product. The surface-processed collagen molded product is a state in which an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film, or a non-fibrotic collagen film is in contact with a transfer member in the presence of an aqueous solvent. A molded body crosslinked by line irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation, or plasma irradiation, and having a transferred portion in which the shape of the transfer member is transferred or reflected on at least a part of the surface of the molded body. A cultured tissue having a concave shape and / or a convex shape in the transferred portion.
[6] A culture tissue comprising a cell culture base material and a cell tissue formed on the surface and / or inside of the cell culture base material, wherein the cell culture base material is a surface-processed collagen molded product. The surface-processed collagen molded product is an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film or a non-fibrotic collagen film in the presence of an aqueous solvent, γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation. A cultured structure having a surface shape deformed into a concave shape and / or a convex shape on at least a part of the surface of the molded body.
本発明に係る細胞培養方法は、その表面の少なくとも一部に凹形状及び／又は凸形状を有する表面加工コラーゲン成形体を、細胞培養基材として用いる方法である。この成形体の表面は、切削等の加工手段により生じうる損傷を受けていないため、上記凹形状及び／又は凸形状の部分においても、それ以外の部分の表面と同様の平滑性が保たれている。この成形体を細胞培養基材として用いることにより、平滑性の低下に起因する細胞接着性等への影響が抑制されうる。さらに、この表面加工コラーゲン成形体の主要構成要素は、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された架橋コラーゲンであるため、生体への悪影響が懸念される架橋剤等の化学物質を含まない。よって、この成形体は、生体親和性及び生体安全性により優れたものと言える。また、架橋コラーゲンを主要構成要素とするこの成形体は、細胞培養環境、生体内環境等においても分解し難いという利点を有する。この成形体を細胞培養基材とする細胞培養方法によれば、細胞培養基材への細胞接着性及び細胞増殖性の向上が期待できるため、効率的に細胞を培養することができる。また、この成形体は、細胞が成形体表面の凹形状及び／又は凸形状を居住や増殖の場として活用することも可能なものである。 The cell culture method according to the present invention is a method in which a surface-processed collagen molded product having a concave shape and / or a convex shape on at least a part of the surface thereof is used as a cell culture base material. Since the surface of this molded product has not been damaged due to processing means such as cutting, even in the concave and / or convex portions, the same smoothness as the surface of other portions is maintained. There is. By using this molded product as a cell culture substrate, the influence on cell adhesion and the like caused by the decrease in smoothness can be suppressed. Further, since the main component of this surface-processed collagen molded product is crosslinked collagen crosslinked by γ-ray irradiation, electron-beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent, there is a concern that it may have an adverse effect on the living body. Does not contain chemical substances such as collagen. Therefore, it can be said that this molded product is superior in biocompatibility and biosafety. In addition, this molded product containing crosslinked collagen as a main component has an advantage that it is difficult to decompose even in a cell culture environment, an in vivo environment, and the like. According to the cell culture method using this molded product as a cell culture base material, improvement of cell adhesion and cell proliferation to the cell culture base material can be expected, so that cells can be efficiently cultured. In addition, this molded product can also allow cells to utilize the concave shape and / or convex shape on the surface of the molded product as a place for residence and proliferation.
以下、好ましい実施形態に基づいて本発明が詳細に説明されるが、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on the preferred embodiments, but the present invention is not limited to the following embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims.
本発明に係る細胞培養方法（以下、「本培養方法」と称する）は、以下に説明する表面加工コラーゲン成形体を細胞培養基材（以下、「本基材」と称する）として用いることを特徴とするものである。 The cell culture method according to the present invention (hereinafter, referred to as "main culture method") is characterized in that the surface-processed collagen molded product described below is used as a cell culture base material (hereinafter, "main base material"). Is to be.
〔本基材〕
本基材である表面加工コラーゲン成形体は、例えば、次の３つの態様で表すことができるものである。なお、いずれの態様においても、本基材は、切削等の加工手段によることなく、その表面の少なくとも一部に、凹形状及び／又は凸形状を有している。そのため、本基材の当該形状を有する部分は、それ以外の部分と同様の平滑性が保たれている。
[This base material]
The surface-processed collagen molded product as the base material can be represented by, for example, the following three aspects. In any of the embodiments, the base material has a concave shape and / or a convex shape on at least a part of the surface thereof without using a processing means such as cutting. Therefore, the portion of the base material having the shape has the same smoothness as the other portions.
第１態様は、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、上記成形体の表面の少なくとも一部が凹形状及び／又は凸形状を有し、かつ上記成形体の主要構成要素が、損なわれていない（intact）線維化コラーゲン又はコラーゲン分子である表面加工コラーゲン成形体である。 In the first aspect, an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen membrane or a non-fibrotic collagen membrane is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. And at least a part of the surface of the molded body has a concave shape and / or a convex shape, and the main component of the molded body is intact fibrotic collagen or collagen molecule. It is a surface-processed collagen molded body.
第２態様は、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、少なくとも一部が転写部材と接触した状態で、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、上記成形体の表面の少なくとも一部に上記転写部材の形状が転写又は反映された被転写部を有しており、上記被転写部に凹形状及び／又は凸形状を有している表面加工コラーゲン成形体である。 In the second aspect, uncrosslinked fibrotic collagen gel, fibrotic collagen membrane or non-fibrotic collagen membrane is irradiated with γ-ray or electron beam in the presence of an aqueous solvent in a state where at least a part of the gel is in contact with a transfer member. A molded body bridged by UV irradiation or plasma irradiation, and having a transferred portion in which the shape of the transfer member is transferred or reflected on at least a part of the surface of the molded body, and the transferred portion. It is a surface-processed collagen molded product having a concave shape and / or a convex shape.
第３態様は、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された成形体であって、上記成形体の表面の少なくとも一部が凹形状及び／又は凸形状に変形した表面形状を有する表面加工コラーゲン成形体である。 In the third aspect, an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen membrane or a non-fibrotic collagen membrane is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. It is a surface-processed collagen molded product having a surface shape in which at least a part of the surface of the molded product is deformed into a concave shape and / or a convex shape.
第１〜３態様に係る本基材の好適な製造方法として、後掲の第１製法と第２製法を挙げることができる。このうち、第３態様については、特に好適な製法として、第１製法を挙げることができる。以下、本願明細書において、本基材の表面の凹形状及び／又は凸形状を「パターン形状」と称する場合がある。また、本基材の表面とは、外表面を意味する。 As a suitable manufacturing method of the present base material according to the first to third aspects, the first manufacturing method and the second manufacturing method described later can be mentioned. Of these, with respect to the third aspect, the first production method can be mentioned as a particularly suitable production method. Hereinafter, in the specification of the present application, the concave shape and / or the convex shape of the surface of the base material may be referred to as “pattern shape”. Further, the surface of the base material means an outer surface.
以下、第１〜３態様に共通な事項である表面形状と架橋処理について説明した後、個々の態様について説明する。 Hereinafter, the surface shape and the crosslinking treatment, which are common matters in the first to third aspects, will be described, and then each aspect will be described.
（表面形状）
本発明の目的が達成される限り、本基材の表面全体がパターン形状を有していてもよく、表面の一部がパターン形状を有していてもよい。例えば、本基材の外形が平膜状の場合、その上面、下面及び側面のうちから選択されるいずれか又は全ての表面がパターン形状を有していてもよい。また、その上面、下面及び側面から選択されたいずれかの面において、その面全体がパターン形状を有していてもよく、その面の一部の領域がパターン形状を有していてもよい。以下、パターン形状が形成された領域を「パターン領域」と称する場合がある。一つの面の異なる領域に、複数のパターン領域が形成されてもよい。
(Surface shape)
As long as the object of the present invention is achieved, the entire surface of the base material may have a pattern shape, or a part of the surface may have a pattern shape. For example, when the outer shape of the base material is a flat film, any or all of the surfaces selected from the upper surface, the lower surface and the side surface may have a pattern shape. Further, on any surface selected from the upper surface, the lower surface and the side surface, the entire surface may have a pattern shape, and a part of the surface may have a pattern shape. Hereinafter, the region in which the pattern shape is formed may be referred to as a “pattern region”. A plurality of pattern regions may be formed in different regions on one surface.
本基材の表面全体の面積に対して、全てのパターン領域が占める面積の比率は、本基材の外形や使用目的により適宜選択することが好ましい。 The ratio of the area occupied by all the pattern regions to the area of the entire surface of the base material is preferably selected as appropriate according to the outer shape of the base material and the purpose of use.
本基材におけるパターン形状の個数は、１個であっても複数個であってもよい。複数個のパターン形状を有する場合、それらが規則的なパターンで配列されたものでもよく、不規則なパターンで配列されたものでもよい。細胞培養における培養効率の観点から、複数個のパターン形状が規則的なパターンで配列されることがより好ましい。 The number of pattern shapes in this base material may be one or a plurality. When having a plurality of pattern shapes, they may be arranged in a regular pattern or may be arranged in an irregular pattern. From the viewpoint of culture efficiency in cell culture, it is more preferable that a plurality of pattern shapes are arranged in a regular pattern.
本基材において、パターン形状の種類や大きさは、用途に応じて適宜選択されうる。例えば、パターン形状が凹形状である場合、当該形状は窪みのある形状であれば特に限定されることはなく、平面視形状として、正方形、長方形といった多角形、円、楕円等が例示でき、鉛直方向での断面視形状として、半円、長方形、三角形、台形等が例示できる。また、本基材の一面を横断する凹形状であっても、また、無数の窪み形状であっても構わない。パターン形状が凸形状である場合、当該形状は突起のある形状であれば特に限定されることはなく、平面視形状については上記凹形状と同様の形状が例示でき、断面視形状については上記凹形状と上下向きを反転させた形状が例示できる。本基材において、一の面に凹形状と凸形状が併存してもよく、またそれぞれの形状が２種以上で併存してもよい。また、平面視したときの１個のパターン形状の大きさについても特に限定されることはなく、用途に応じて適宜設定することが好ましい。 In this base material, the type and size of the pattern shape can be appropriately selected depending on the intended use. For example, when the pattern shape is a concave shape, the shape is not particularly limited as long as it has a concave shape, and polygons such as squares and rectangles, circles, ellipses, etc. can be exemplified as the plan view shape, and the shape is vertical. Examples of the cross-sectional view shape in the direction include a semicircle, a rectangle, a triangle, and a trapezoid. Further, it may have a concave shape that traverses one surface of the present base material, or may have an innumerable concave shape. When the pattern shape is a convex shape, the shape is not particularly limited as long as it has a protrusion, and a shape similar to the concave shape can be exemplified for the plan view shape and the concave shape for the cross-sectional view shape. An example is an example of a shape in which the shape and the vertical direction are inverted. In this base material, a concave shape and a convex shape may coexist on one surface, and two or more types of each shape may coexist. Further, the size of one pattern shape when viewed in a plan view is not particularly limited, and it is preferable to appropriately set the size according to the application.
凹形状の深さ及び凸形状の高さは、目的とする用途に応じて適宜設定されうる。例えば、培養細胞に応じて適正な深さ及び高さが選択されるが、敢えて数値範囲で示すと、非パターン領域の面を基準面として、この基準面と凹形状の最深部との差を、10〜1000μmの範囲に設定することが好ましく、この基準面と凸形状の最高部との差を、10〜1000μmの範囲に設定することが好ましい。尚、凹形状の深さ及び凸形状の高さは、例えば、本基材断面の走査型電子顕微鏡像により求められる。 The depth of the concave shape and the height of the convex shape can be appropriately set according to the intended use. For example, an appropriate depth and height are selected according to the cultured cells, but if it is intentionally shown in the numerical range, the difference between this reference surface and the deepest part of the concave shape is defined by using the surface of the non-patterned region as the reference surface. , It is preferable to set it in the range of 10 to 1000 μm, and it is preferable to set the difference between the reference surface and the highest portion of the convex shape in the range of 10 to 1000 μm. The depth of the concave shape and the height of the convex shape can be obtained from, for example, a scanning electron microscope image of the cross section of the present substrate.
前述した通り、本発明における凹形状及び凸形状は、あくまでも、非多孔質である本成形体の表面形状である。従って、凹形状の深さ及び凸形状の高さは、非多孔質である本成形体の非パターン領域を基準面として計測されるものであり、例えば、特許文献１及び２に記載された多孔質体の平均孔径とは、本質的に異なる技術事項である。
As described above, the concave shape and the convex shape in the present invention are merely surface shapes of the present molded product which are non-porous. Therefore, the depth of the concave shape and the height of the convex shape are measured with the non-patterned region of the present molded product, which is non-porous, as a reference plane. For example, the porous shape described in
（架橋）
本基材は、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下で、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋されたものである。以下、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜及び非線維化コラーゲン膜を、「コラーゲン基材」とも称する。また、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射による架橋を、「照射架橋」とも称する。
(Crosslink)
This substrate is an uncrosslinked fibrotic collagen gel, fibrotic collagen membrane or non-fibrotic collagen membrane crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. Is. Hereinafter, the uncrosslinked fibrotic collagen gel, fibrotic collagen membrane and non-fibrotic collagen membrane are also referred to as "collagen base material". Further, cross-linking by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation is also referred to as “irradiation cross-linking”.
ここで、本基材を特定するにあたって、架橋処理の規定を設けた理由を説明する。コラーゲンの架橋法として、物理的架橋法と化学的架橋法が知られている。物理的架橋法の代表例として、照射架橋と熱脱水架橋があり、化学的架橋法の代表例として、水溶性化学架橋剤又は気化能を有する化学架橋剤による架橋がある。以下、架橋法を問わず、架橋されたコラーゲンを「架橋体」と称する。 Here, in specifying the present base material, the reason why the provision for the cross-linking treatment is provided will be described. Physical cross-linking method and chemical cross-linking method are known as collagen cross-linking methods. Typical examples of the physical cross-linking method include irradiation cross-linking and thermal dehydration cross-linking, and typical examples of the chemical cross-linking method include cross-linking with a water-soluble chemical cross-linking agent or a chemical cross-linking agent having a vaporizing ability. Hereinafter, the crosslinked collagen is referred to as a "crosslinked product" regardless of the crosslinking method.
まず、物理的架橋法について、照射架橋によって得られた架橋体と、熱脱水架橋によって得られた架橋体とは、架橋体同士を見比べても外観的な違いを見出すことは極めて困難であり、また、分析によってもいずれの架橋法によって架橋されたものかを区別することは極めて困難である。 First, regarding the physical cross-linking method, it is extremely difficult to find a difference in appearance between the cross-linked product obtained by irradiation cross-linking and the cross-linked product obtained by thermal dehydration cross-linking. In addition, it is extremely difficult to distinguish which cross-linking method was used for cross-linking by analysis.
次に、照射架橋によって得られた架橋体と、化学的架橋法によって得られた架橋体とは、架橋体同士を見比べても外観的な違いを見出すことは極めて困難である。化学的架橋法のうち、化学的架橋剤として、例えば、グルタルアルデヒドやポリエポキシ化合物（エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル等）を用いた場合は、化学的架橋剤がコラーゲンと結合して架橋反応が起きるために、化学的架橋剤を検出できれば、両者の判別は可能である。しかし、化学的架橋剤として1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩等のコラーゲンと結合しないタイプのものを用いたときには、架橋体を分析しても化学的架橋剤の痕跡を見出すことはほぼ不可能である。 Next, it is extremely difficult to find a difference in appearance between the cross-linked product obtained by irradiation cross-linking and the cross-linked product obtained by the chemical cross-linking method even when the cross-linked products are compared with each other. Among the chemical cross-linking methods, when, for example, glutarualdehyde or a polyepoxy compound (ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, etc.) is used as the chemical cross-linking agent, the chemical cross-linking agent binds to collagen. Since a cross-linking reaction occurs, if a chemical cross-linking agent can be detected, it is possible to distinguish between the two. However, when a type that does not bind to collagen, such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride, is used as the chemical cross-linking agent, even if the cross-linked product is analyzed, the chemical cross-linking agent It is almost impossible to find any traces.
また、架橋されていないコラーゲン（「未架橋体」と称する）と架橋体との区別も極めて困難である。例えば、分析によって未架橋体と架橋体の違いを見出すことは、特に照射架橋体においては架橋点の多寡の違いしかないため、極めて困難である。未架橋体は架橋体よりも一般に強度的に弱く、水中保存安定性も低い傾向があるが、それら物理的傾向の違いが架橋処理の有無に起因したものであることを立証することも極めて困難である。 It is also extremely difficult to distinguish between uncrosslinked collagen (referred to as "uncrosslinked") and crosslinked collagen. For example, it is extremely difficult to find the difference between the uncrosslinked body and the crosslinked body by analysis because there is only a difference in the number of crosslinked points, especially in the irradiated crosslinked body. Uncrosslinked products are generally weaker in strength than crosslinked products and tend to have lower storage stability in water, but it is extremely difficult to prove that the difference in these physical tendencies is due to the presence or absence of cross-linking treatment. Is.
以上の区別の困難性から、第１〜３態様において本基材が照射架橋によって架橋されたものであることを発明特定事項としたのである。 From the above difficulty of distinction, it is a matter of invention specification that the present base material is crosslinked by irradiation crosslinking in the first to third aspects.
ところで、水性溶媒の存在下で照射架橋された架橋体の一特性は、例えば、特許第５６３３８８０号公報に記載されているように、細胞培養環境や生体内環境において分解し難いというものである。例えば、この架橋体をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）中に37℃で5日間浸漬した場合の溶解率が10質量％以下であるとき、この架橋体が上記特性を有するといえる。尚、溶解率とは、D-PBS中への架橋体からの溶出成分の質量の、浸漬前の架橋体の質量に対する割合（％）である。溶解率は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPS)によって、D-PBS中の溶出成分の分子量分布を測定する方法、又はD-PBS中の溶出成分の質量を測定する方法によって評価できる。本基材の溶解率も、10質量％以下である。 By the way, one characteristic of the crosslinked product that has been irradiated and crosslinked in the presence of an aqueous solvent is that it is difficult to decompose in a cell culture environment or an in vivo environment, for example, as described in Japanese Patent No. 5633880. For example, when the solubility of this crosslinked product in dalbecolinic acid buffered saline (D-PBS) at 37 ° C. for 5 days is 10% by mass or less, it can be said that the crosslinked product has the above characteristics. .. The dissolution rate is the ratio (%) of the mass of the components eluted from the crosslinked product into D-PBS to the mass of the crosslinked product before immersion. The solubility can be evaluated by a method of measuring the molecular weight distribution of the eluted component in D-PBS by gel permeation chromatography (GPS) or a method of measuring the mass of the eluted component in D-PBS. The dissolution rate of this base material is also 10% by mass or less.
（その他構成要素）
本発明の目的が阻害されない限り、使用目的に応じて、本基材に、その他構成要素として各種添加剤が配合されてもよい。その他構成要素の例として、フィブリン、トロンビン、ゼラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸等が挙げられる。
(Other components)
As long as the object of the present invention is not impaired, various additives may be added to the base material as other components depending on the purpose of use. Examples of other components include fibrin, thrombin, gelatin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, alginic acid and the like.
（コラーゲン）
本基材において、用いられるコラーゲンの種類は特に限定されないが、生体内での存在量が多いＩ型コラーゲンが好ましく、抗原決定基であるテロペプタイドが除去されたアテロコラーゲンがより好ましい。また、通常、哺乳類、魚介類、鳥類、爬虫類等の生物原料由来のコラーゲンが使用されうるが、ヒトと共通のウイルスを有しない魚介類由来のコラーゲンが好適に用いられる。
(collagen)
The type of collagen used in this substrate is not particularly limited, but type I collagen having a large amount in the living body is preferable, and atelocollagen from which the telopeptide which is an antigenic determinant has been removed is more preferable. In addition, collagen derived from biological materials such as mammals, seafood, birds, and reptiles can be usually used, but collagen derived from fish and shellfish that does not have a virus common to humans is preferably used.
以下、第１〜３態様における各特徴的部分を説明する。なお、コラーゲン基材、水性溶媒等は、後掲の製造方法において説明する。 Hereinafter, each characteristic part in the first to third aspects will be described. The collagen base material, the aqueous solvent and the like will be described in the production method described later.
（第１態様）
第１態様の特徴的部分は、本基材の主要構成要素が、損なわれていない（intact）線維化コラーゲン又はコラーゲン分子であることにある。即ち、表面の少なくとも一部にパターン形状を有する本基材が、切削等の加工手段による損傷を受けていないコラーゲンを主要構成要素として構成されていることを意味する。
(First aspect)
A characteristic portion of the first aspect is that the major component of the substrate is intact fibrotic collagen or collagen molecules. That is, it means that the present base material having a pattern shape on at least a part of the surface is composed of collagen that has not been damaged by processing means such as cutting as a main component.
（第２態様）
第２態様の特徴的部分は、転写部材と接触した状態で架橋されることにより、転写部材の形状が転写又は反映されたパターン形状を有する被転写部が、本基材の表面の少なくとも一部に存在することである。当該パターン形状としては、特に限定されるものではなく、例えば、転写部材の形状が完全に反転された形状だけでなく、その相似形状であってもよい。また、コラーゲン基材の表面が転写部材によって変形された形状であってもよい。変形の一例として、コラーゲン基材として弾力性を有したものを用いたときに、直方体状の突起を有した転写部材によって形成された略ドーム型の窪み形状（凹形状）が挙げられる。
(Second aspect)
The characteristic portion of the second aspect is that the transferred portion having a pattern shape in which the shape of the transfer member is transferred or reflected by being crosslinked in contact with the transfer member is at least a part of the surface of the base material. To be present in. The pattern shape is not particularly limited, and for example, the shape of the transfer member may be not only a completely inverted shape but also a similar shape. Further, the surface of the collagen base material may have a shape deformed by the transfer member. An example of the deformation is a substantially dome-shaped recessed shape (concave shape) formed by a transfer member having rectangular parallelepiped protrusions when an elastic collagen base material is used.
（第３態様）
第３態様の特徴的部分は、本基材の表面の少なくとも一部が、所定のパターン形状に変形していることである。つまり、このパターン形状は、本基材の表面の「変形」によるものであり、切削等の加工手段によるものではない。本態様には、第２態様で挙げた「変形の一例」も含まれる。
(Third aspect)
The characteristic portion of the third aspect is that at least a part of the surface of the base material is deformed into a predetermined pattern shape. That is, this pattern shape is due to "deformation" of the surface of the base material, not due to processing means such as cutting. This aspect also includes the "example of modification" mentioned in the second aspect.
〔本基材の製造方法〕
本基材の製造方法として、次の第１製法と第２製法を例示することができる。なお、本発明の目的が達成される限り、第１製法及び第２製法において、更に他の工程を含んでもよい。
[Manufacturing method of this base material]
As the method for producing the present base material, the following first and second production methods can be exemplified. In addition, as long as the object of this invention is achieved, the first manufacturing method and the second manufacturing method may further include other steps.
第１製法は、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜及び非線維化コラーゲン膜から選択されるコラーゲン基材の表面の少なくとも一部を転写部材で押圧した状態で、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射によって架橋処理する工程を含む、表面が凹形状及び／又は凸形状に変形加工された表面加工コラーゲン成形体の製造方法である。 The first method is in the presence of an aqueous solvent in a state where at least a part of the surface of a collagen substrate selected from uncrosslinked fibrotic collagen gel, fibrotic collagen membrane and non-fibrotic collagen membrane is pressed by a transfer member. , Γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation, or plasma irradiation is a method for producing a surface-processed collagen molded product having a surface deformed into a concave shape and / or a convex shape.
第２製法は、転写部材と接触した状態で、可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化させて、コラーゲン基材である線維化コラーゲンゲルを調製する第一工程と、上記線維化コラーゲンゲルを水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射によって架橋処理する第二工程とを含む、表面が凹形状及び／又は凸形状を有する表面加工コラーゲン成形体の製造方法である。 The second production method is a first step of preparing a fibrotic collagen gel as a collagen base material by fibrosis of collagen in a solubilized collagen solution in contact with a transfer member, and an aqueous solution of the fibrotic collagen gel. A method for producing a surface-processed collagen molded product having a concave and / or convex surface, which includes a second step of cross-linking by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of a solvent. ..
以下、第１製法及び第２製法に共通な事項について説明した後、個々の製法について説明する。 Hereinafter, after explaining the matters common to the first manufacturing method and the second manufacturing method, each manufacturing method will be described.
（コラーゲン基材）
コラーゲン基材としては未架橋のものを用いる。本発明の目的が阻害されない限り、コラーゲン基材が、少量の架橋コラーゲンを含んでもよい。以下、「未架橋の」と特に限定しなくても、コラーゲン基材である線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜及び非線維化コラーゲン膜は、架橋されていないものを指すこととする。
(Collagen base material)
An uncrosslinked collagen base material is used. The collagen substrate may contain a small amount of crosslinked collagen as long as the object of the present invention is not impaired. Hereinafter, the fibrotic collagen gel, the fibrotic collagen membrane, and the non-fibrotic collagen membrane, which are collagen base materials, are not particularly limited to “non-crosslinked” and refer to those which are not crosslinked.
線維化コラーゲンゲルは、可溶化コラーゲン溶液に適当な緩衝液を添加し、可溶化コラーゲン溶液のイオン強度及びpHを適正な範囲に調整して、コラーゲンの線維化を引き起こすことにより得られるものであり、水性溶媒等を含んでいるため、所謂ハイドロゲルと呼ばれるものである。ゲル化の程度により、粘稠性を有した液状物から一定の形状を有するものまでさまざまな性状の線維化コラーゲンゲルが得られるが、製造方法に応じて適宜使い分けることが好ましい。例えば、第１製法の場合、一定の形状を有するゲルを用いることが好ましい。また、第２製法の場合、第一工程において、目的に応じた好適なゲル化度の線維化コラーゲンゲルを調製して用いればよい。線維化コラーゲンゲルの全体的な外観形状については、特に限定されることはなく、例えば、膜状、立方体状、円柱状等の形状が挙げられる。 The fibrillated collagen gel is obtained by adding an appropriate buffer solution to the solubilized collagen solution and adjusting the ionic strength and pH of the solubilized collagen solution to an appropriate range to induce collagen fibrosis. Since it contains an aqueous solvent and the like, it is a so-called hydrogel. Depending on the degree of gelation, fibrotic collagen gels having various properties can be obtained, from a viscous liquid substance to one having a certain shape, and it is preferable to use them appropriately according to the production method. For example, in the case of the first production method, it is preferable to use a gel having a certain shape. Further, in the case of the second production method, a fibrotic collagen gel having a gelation degree suitable for the purpose may be prepared and used in the first step. The overall appearance shape of the fibrotic collagen gel is not particularly limited, and examples thereof include a membrane shape, a cube shape, and a columnar shape.
線維化コラーゲン膜は、線維化コラーゲンゲルから作製された膜状のものである。好適な一形態として、例えば、特許第５６３３８８０号公報、再公表特許第２０１２−７０６７９号公報等に記載の架橋前の線維化コラーゲン膜が挙げられる。具体的には、可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化させて線維化コラーゲンゲルを調製し、これを脱塩した後乾燥させる。脱塩においては、エタノール／水の容量比を50／50〜100／0まで段階的に変化させた混合液に順次浸漬させることが好ましい。また、乾燥においては、膜の上下面をポリスチレン板で覆い、側面のみから脱媒させることが好ましい。 The fibrotic collagen membrane is a membranous one made from fibrotic collagen gel. As a preferable form, for example, the fibrotic collagen membrane before cross-linking described in Japanese Patent No. 5633880, Japanese Patent No. 2012-701679 and the like can be mentioned. Specifically, collagen in a solubilized collagen solution is fibrotic to prepare a fibrotic collagen gel, which is desalted and then dried. In desalting, it is preferable to sequentially immerse the mixture in a mixed solution in which the volume ratio of ethanol / water is changed stepwise from 50/50 to 100/0. Further, in drying, it is preferable to cover the upper and lower surfaces of the membrane with a polystyrene plate and remove the medium only from the side surface.
非線維化コラーゲン膜は、可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化させることなく膜状に作製されたものである。好適な一形態として、例えば、特許第５６３３８８０号公報、再公表特許第２０１２−７０６８０号公報等に記載の架橋前の非線維化コラーゲン膜が挙げられる。具体的には、成形器に入れたコラーゲン酸性溶液を乾燥させることによって得られる。 The non-fibrotic collagen membrane is prepared in the form of a membrane without fibrosis of collagen in the solubilized collagen solution. As a preferable form, for example, the non-fibrotic collagen membrane before cross-linking described in Japanese Patent No. 5633880, Japanese Patent No. 2012-70680 and the like can be mentioned. Specifically, it is obtained by drying an acidic collagen solution placed in a molding machine.
特に、コラーゲン基材として、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜を用いた場合は、細胞培養環境や生体内環境において収縮又は膨張し難い架橋体を得ることも可能である。一方、線維化コラーゲンゲルをコラーゲン基材として得られる架橋体には、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜を用いて得られる架橋体よりも、収縮しやすい特性を有するものがある。しかし、細胞培養の目的や細胞の種類によっては、収縮しやすい架橋体を本基材とすることが有利な場合がある。例えば、線維化コラーゲンゲルから得られる架橋体を本基材として、角化細胞を培養した場合に、本基材が収縮して、皮膚の表皮基底膜と類似した構造に変化する現象が観察されている。これにより、角化細胞の成長、増殖等に好適な環境が得られると考えられる。 In particular, when a fibrotic collagen membrane or a non-fibrotic collagen membrane is used as the collagen base material, it is possible to obtain a crosslinked product that does not easily contract or expand in a cell culture environment or an in vivo environment. On the other hand, some crosslinked products obtained by using a fibrotic collagen gel as a collagen base material have a property of being more easily contracted than a crosslinked product obtained by using a fibrotic collagen membrane or a non-fibrotic collagen membrane. However, depending on the purpose of cell culture and the type of cells, it may be advantageous to use a crosslinked product that easily contracts as the main base material. For example, when keratinocytes are cultured using a crosslinked product obtained from fibrotic collagen gel as the main substrate, a phenomenon is observed in which the main substrate contracts and changes to a structure similar to the epidermal basement membrane of the skin. ing. As a result, it is considered that a suitable environment for the growth and proliferation of keratinocytes can be obtained.
（転写部材）
転写部材は、本基材にパターン形状を形成することができる部材である。当該機能を有している限り、転写部材の種類、形状等は特に限定されることはなく、使用目的に応じて適切な転写部材を選択することが望ましい。ここで、転写部材のうち、本基材のパターン形状の形成に寄与する部分を転写部と称する。
(Transfer member)
The transfer member is a member capable of forming a pattern shape on the present base material. As long as it has this function, the type and shape of the transfer member are not particularly limited, and it is desirable to select an appropriate transfer member according to the purpose of use. Here, the portion of the transfer member that contributes to the formation of the pattern shape of the base material is referred to as a transfer portion.
転写部材は、例えば、転写部材全体が非通水性のものであってもよいし、転写部材全体が通水性を有するものであってもよい。後者の一例は、多孔質部材である。多孔質の孔構成は規則的であっても不規則であってもよい。また、転写部以外は非通水性であり、転写部のみが通水性を有する転写部材であってもよい。 As the transfer member, for example, the entire transfer member may be non-water permeable, or the entire transfer member may be water permeable. An example of the latter is a porous member. The porous pore structure may be regular or irregular. Further, the transfer member may be a transfer member which is impermeable to water other than the transfer portion and has water permeability only in the transfer portion.
転写部材の形状は、網、織布、不織布等の凹凸を有した平面形状部材であってもよく、パンチングメタルのような多孔板であってもよい。さらに、容器型であって、その内側の側面又は底面にパターン形状を有するものであってもよい。また、印判のように特定の部分に転写部を有したものであってもよい。転写部材の製造方法は特に限定されず、射出成形、押出成形、加圧成形等の既知の成形方法や、既存の成形品の表面加工等の製造方法を例示できる。 The shape of the transfer member may be a flat member having irregularities such as a net, a woven cloth, or a non-woven fabric, or a perforated plate such as punching metal. Further, it may be a container type and may have a pattern shape on the inner side surface or bottom surface thereof. Further, it may have a transfer portion in a specific portion such as a stamp. The manufacturing method of the transfer member is not particularly limited, and examples thereof include known molding methods such as injection molding, extrusion molding, and pressure molding, and manufacturing methods such as surface processing of existing molded products.
転写部材の材質は、コラーゲンとの相性や架橋方法を勘案して選択すればよい。例えば、コラーゲンが付着し難い材質や照射架橋に対する耐久性の高い材質を選択することも好ましい態様である。材質の具体例として、熱可塑性樹脂、例えば、アクリル樹脂、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、スチロール樹脂等が挙げられ、また、熱硬化性樹脂、例えば、シリコーン樹脂、ウレタン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等が挙げられる。また、無機材料、例えば、金属、ガラス等を材質として選択することも可能である。これらのうち、ウレタン樹脂、シリコーン樹脂等がより好ましく、特に好ましくはウレタン樹脂である。 The material of the transfer member may be selected in consideration of compatibility with collagen and the cross-linking method. For example, it is also a preferable embodiment to select a material to which collagen does not easily adhere or a material having high durability against irradiation cross-linking. Specific examples of the material include thermoplastic resins such as acrylic resins, polyurethanes, polyethylenes, polypropylenes, ABS resins, polycarbonates, polyethylene terephthalates, polyamides and styrol resins, and thermosetting resins such as silicone resins. Examples thereof include urethane resin, phenol resin, and epoxy resin. It is also possible to select an inorganic material, for example, metal, glass, or the like as the material. Of these, urethane resin, silicone resin and the like are more preferable, and urethane resin is particularly preferable.
（水性溶媒）
水性溶媒は、例えば、水、緩衝液、酸性溶液等が挙げられ、これらに有機溶媒を添加した混合溶媒でもよい。コラーゲン基材の種類と照射架橋の方法に応じて適宜使い分けることが好ましい。このような使い分けの具体例について、以下に説明する。
(Aqueous solvent)
Examples of the aqueous solvent include water, a buffer solution, an acidic solution and the like, and a mixed solvent obtained by adding an organic solvent to these may be used. It is preferable to use them properly according to the type of collagen base material and the method of irradiation cross-linking. Specific examples of such proper use will be described below.
線維化コラーゲンゲル又は線維化コラーゲン膜のように線維化コラーゲンを主要構成要素とする場合は、可溶化コラーゲン溶液から線維化コラーゲンを得るために用いた緩衝液と同様の緩衝液を水性溶媒として選択することが好適な一形態である。好ましくは、pH3.0〜10.0の範囲の緩衝液であり、より好ましくは、pH6.0〜8.0の範囲の中性塩水溶液又はpH8.0〜10.0の範囲のアルカリ性塩水溶液である。更に好ましくは、線維化コラーゲンを溶解しにくいpHに調整された中性塩水溶液又はアルカリ性塩水溶液である。しかし、線維化コラーゲンを比較的溶解し易い水性溶媒であっても、この水性溶媒への浸漬及び架橋処理を短時間でおこなう場合には使用可能である。線維化コラーゲンゲル又は線維化コラーゲン膜への適用に好適な水性溶媒として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、HEPES緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）、トリス緩衝生理食塩水、HEPES緩衝生理食塩水等を例示できる。 When fibrotic collagen is the main component, such as fibrotic collagen gel or fibrotic collagen membrane, select a buffer similar to the buffer used to obtain fibrotic collagen from the solubilized collagen solution as the aqueous solvent. Is a preferred form. A buffer solution in the pH range of 3.0 to 10.0 is preferable, and a neutral salt aqueous solution in the pH range of 6.0 to 8.0 or an alkaline salt aqueous solution in the pH range of 8.0 to 10.0 is more preferable. More preferably, it is a neutral salt aqueous solution or an alkaline salt aqueous solution adjusted to a pH at which fibrotic collagen is difficult to dissolve. However, even an aqueous solvent that relatively easily dissolves fibrotic collagen can be used when the immersion and cross-linking treatment in the aqueous solvent is performed in a short time. Phosphate buffer, Tris buffer, HEPES buffer, acetate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, phosphate buffered saline as an aqueous solvent suitable for application to fibrotic collagen gel or fibrous collagen membrane. Examples thereof include water (PBS), dalbecolinic acid buffered saline (D-PBS), Tris buffered saline, and HEPES buffered saline.
次に、非線維化コラーゲン膜の場合は、コラーゲンの線維化を引き起こさない水性溶媒を用いることが望ましい。例えば、酵素で可溶化したコラーゲン溶液又は希酸で抽出したコラーゲン溶液から得られた非線維化コラーゲン膜の場合、水性溶媒としてpH2.0〜6.0の酸性溶液を用いることが好ましく、より好ましくはpH3.0〜5.0のものである。酸性溶液としては、例えば、二酸化炭素が溶解した水溶液が挙げられ、具体的には、酸性水、酸性緩衝液、有機溶媒添加酸性水性溶媒等を例示できる。前記酸性水、酸性緩衝液及び有機溶媒添加酸性水性溶媒は、水、緩衝液若しくは有機溶媒添加水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、水、緩衝液若しくは有機溶媒添加水性溶媒にドライアイスを投入する方法等によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、pHを上記範囲とする溶解量に設定することが好ましい。また、二酸化炭素を含まない酸性緩衝液として、例えば、酢酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、塩酸等を使用することも可能である。 Next, in the case of a non-fibrotic collagen membrane, it is desirable to use an aqueous solvent that does not cause collagen fibrosis. For example, in the case of a non-fibrotic collagen membrane obtained from an enzyme-solubilized collagen solution or a collagen solution extracted with dilute acid, it is preferable to use an acidic solution having a pH of 2.0 to 6.0 as an aqueous solvent, and more preferably pH3. It is from .0 to 5.0. Examples of the acidic solution include an aqueous solution in which carbon dioxide is dissolved, and specific examples thereof include acidic water, an acidic buffer solution, and an acidic aqueous solvent added with an organic solvent. The acidic water, the acidic buffer solution and the acidic aqueous solvent added with an organic solvent are the method of bubbling carbon dioxide into water, a buffer solution or an aqueous solvent added with an organic solvent, and dry ice is added to the aqueous solvent added with water, a buffer solution or an organic solvent. It can be produced by a method or the like. The amount of carbon dioxide dissolved is not particularly limited, but it is preferable to set the amount of carbon dioxide dissolved in the above range. Further, as an acidic buffer solution containing no carbon dioxide, for example, an acetate buffer solution, a citric acid buffer solution, hydrochloric acid or the like can be used.
（架橋処理方法）
架橋処理方法は、照射架橋法である。γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射及びプラズマ照射のうち２種以上を組み合わせてもよい。好適な照射架橋法は、透過力が高く、均一に架橋させることができるγ線照射による架橋法である。特に、γ線照射による架橋処理では、照射線量を適宜設定することによって、高強度の表面加工コラーゲン成形体を得ることもできる。γ線照射では、線量率が固定の線源を用い、照射時間等の条件を適宜設定することにより、所定の照射線量を簡便に得ることができる。例えば、コバルト60線源を用いる場合、照射線量5〜75kGyで架橋処理を行うことができる。照射線量として、好ましくは5〜50kGyであり、より好ましくは10〜50kGyであり、さらに好ましくは15〜30kGyである。照射時間は、コラーゲン基材の量や大きさに応じて架橋反応が十分に進行するように設定することが好ましい。さらに、照射条件を適宜設定すれば架橋処理と同時に滅菌処理を行うことができる。そのため、架橋処理中及び架橋処理後の密封状態を保つようにすることで、滅菌済み製品として、そのまま市場に流通させることも可能である。
(Crosslinking method)
The cross-linking treatment method is an irradiation cross-linking method. Two or more of γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation and plasma irradiation may be combined. A suitable irradiation cross-linking method is a cross-linking method by γ-ray irradiation, which has high penetrating power and can be cross-linked uniformly. In particular, in the cross-linking treatment by γ-ray irradiation, a high-intensity surface-processed collagen molded product can be obtained by appropriately setting the irradiation dose. In γ-ray irradiation, a predetermined irradiation dose can be easily obtained by using a radiation source having a fixed dose rate and appropriately setting conditions such as irradiation time. For example, when a cobalt-60 source is used, the cross-linking treatment can be performed at an irradiation dose of 5 to 75 kGy. The irradiation dose is preferably 5 to 50 kGy, more preferably 10 to 50 kGy, and even more preferably 15 to 30 kGy. The irradiation time is preferably set so that the cross-linking reaction proceeds sufficiently according to the amount and size of the collagen base material. Further, if the irradiation conditions are appropriately set, the sterilization treatment can be performed at the same time as the cross-linking treatment. Therefore, it is possible to distribute the product as a sterilized product to the market as it is by keeping the sealed state during and after the crosslinking treatment.
（架橋処理と水性溶媒）
第１製法及び第２製法において、作用機序については定かではないが、水性溶媒の存在下で照射架橋をおこなうことによって、照射（γ線等）により発生した水のラジカルがコラーゲンの未架橋部分に作用し、これによって架橋反応を開始又は進行させると推測される。これにより、細胞培養環境や生体内環境で使用された場合にも、分解し難いという特性を付与することができると考えられる。特に好適な一形態は、照射架橋処理中に、転写部材と接触している部分のコラーゲン基材には水性溶媒が流通又は浸潤しており、転写部材と接触していない部分のコラーゲン基材には水性溶媒が流通している状態とすることである。即ち、転写部材と接触していない部分は当然のことながら、たとえ転写部材と接触している部分のコラーゲン基材であっても、水性溶媒の流動性が少なからず確保されている状態とする。これによって、水性溶媒の流動とともに、新たに発生した水のラジカルが順次コラーゲンの未架橋部分に作用して架橋反応を進行させてより強い架橋とすることも可能になると考えられる。尚、上記水性溶媒の流通又は浸潤においては、たとえ撹拌等による外力が作用しなくても、水分子のレベルでコラーゲン基材の内部から外部へ、またその逆方向への動きが確保されている状態であればよいと考えられる。
(Crosslinking and aqueous solvent)
In the first and second production methods, the mechanism of action is not clear, but by performing irradiation cross-linking in the presence of an aqueous solvent, water radicals generated by irradiation (γ-rays, etc.) are uncross-linked portions of collagen. It is presumed that the cross-linking reaction is initiated or promoted thereby. It is considered that this makes it possible to impart the property of being difficult to decompose even when used in a cell culture environment or an in vivo environment. A particularly preferable form is that during the irradiation cross-linking treatment, an aqueous solvent is circulated or infiltrated into the collagen base material in the portion in contact with the transfer member, and the collagen base material in the portion not in contact with the transfer member is formed. Is a state in which an aqueous solvent is in circulation. That is, as a matter of course, the portion that is not in contact with the transfer member is in a state in which the fluidity of the aqueous solvent is not a little secured even if the collagen base material is the portion that is in contact with the transfer member. It is considered that this makes it possible for the newly generated water radicals to sequentially act on the uncrosslinked portion of collagen to promote the crosslinking reaction and to make stronger crosslinks as the aqueous solvent flows. In the flow or infiltration of the aqueous solvent, movement from the inside to the outside of the collagen base material and vice versa is ensured at the level of water molecules even if an external force such as stirring does not act. It is considered that it should be in a state.
第１製法及び第２製法において、使用する水性溶媒の量は、特に限定されず、コラーゲン基材の外形や大きさに応じて調整される。例えば、少なくともコラーゲン基材の表面全体が水性溶媒で覆われる状態であり、好適には、コラーゲン基材が水性溶媒に浸漬した状態である。また、コラーゲン基材が水性溶媒に完全に浸漬していない状態、例えば、コラーゲン基材の一部が水性溶媒に浸漬していない場合であっても、当該部分における浸潤性が確保できていれば、コラーゲン基材が水性溶媒に浸漬した状態と言える。本願明細書では、以上例示したようなコラーゲン基材に対する水性溶媒の状態を含めて、「水性溶媒の存在下」と称するものである。水性溶媒の量として、例えば、コラーゲン基材の容量に対して、2〜100倍の範囲が好ましく、5〜100倍の範囲がより好ましく、10〜50倍の範囲が更に好ましい。 In the first production method and the second production method, the amount of the aqueous solvent used is not particularly limited, and is adjusted according to the outer shape and size of the collagen base material. For example, at least the entire surface of the collagen base material is covered with the aqueous solvent, and preferably the collagen base material is immersed in the aqueous solvent. Further, even when the collagen base material is not completely immersed in the aqueous solvent, for example, even when a part of the collagen base material is not immersed in the aqueous solvent, the infiltration property in the portion can be ensured. , It can be said that the collagen base material is immersed in an aqueous solvent. In the present specification, the state of the aqueous solvent with respect to the collagen substrate as exemplified above is included and referred to as "in the presence of the aqueous solvent". The amount of the aqueous solvent is preferably in the range of 2 to 100 times, more preferably 5 to 100 times, still more preferably 10 to 50 times the volume of the collagen base material, for example.
（第１製法）
第１製法では、水性溶媒の存在下、コラーゲン基材の表面の少なくとも一部を転写部材で押圧した状態で照射架橋する。転写部材による押圧の程度は特に限定されないが、コラーゲン基材の表面を所定の形状に加工できる程度の押圧力とすることが好ましい。好適な一形態は、押圧部分だけが変形し、それ以外の部分は大きく変形しない程度の圧力とすることである。
(1st manufacturing method)
In the first production method, at least a part of the surface of the collagen substrate is irradiated and crosslinked in the presence of an aqueous solvent while being pressed by a transfer member. The degree of pressing by the transfer member is not particularly limited, but it is preferable that the pressing pressure is such that the surface of the collagen base material can be processed into a predetermined shape. A preferable form is that the pressure is such that only the pressed portion is deformed and the other portions are not significantly deformed.
第１製法の別の好適な一形態は、押圧側と反対側にコラーゲン基材を支える支持部材を用いることである。このとき、例えば、非通水性の転写部材を用いる場合には、通水性を有する支持部材を用いて、コラーゲン基材と転写部材との接触部分に、水性溶媒が僅かでも浸潤できるような全体設計とすることが好ましい。さらに別の好適な一形態は、膜状のコラーゲン基材を用いて、この膜の両面を転写部材で押圧するものである。このときは、少なくとも一方に、通水性を有する転写部材を用いることが好ましく、コラーゲン基材の両面を押圧する転写部材を、適当な治具を用いて、押圧状態が保持されるように固定することが好ましい。 Another preferred embodiment of the first method is to use a support member that supports the collagen substrate on the side opposite to the pressing side. At this time, for example, when a non-water-permeable transfer member is used, the overall design is such that the contact portion between the collagen base material and the transfer member can be infiltrated with an aqueous solvent by using a support member having water permeability. Is preferable. Yet another preferred form is to use a membranous collagen substrate and press both sides of the membrane with a transfer member. At this time, it is preferable to use a transfer member having water permeability on at least one of them, and the transfer member that presses both sides of the collagen base material is fixed by using an appropriate jig so that the pressed state is maintained. Is preferable.
また、さらに別の好適な一形態は、所定の弾力性を有するコラーゲン基材を用いるものである。この場合、非通水性の転写部材を用いたとしても、転写部材と、転写部材に押圧されたコラーゲン基材との間にたわみが生じ易いために、水性溶媒が流通できる隙間の確保が容易となることがある。 Yet another preferred form is to use a collagen substrate having a predetermined elasticity. In this case, even if a non-water-permeable transfer member is used, deflection is likely to occur between the transfer member and the collagen base material pressed against the transfer member, so that it is easy to secure a gap through which the aqueous solvent can flow. May become.
（第２製法）
第２製法は、転写部材と接触した状態で、可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化させて、コラーゲン基材である線維化コラーゲンゲルを調製する第一工程と、転写部材と接触した状態の線維化コラーゲンゲルを水性溶媒の存在下で照射架橋する第二工程とを含むものである。
(2nd manufacturing method)
The second production method is a first step of preparing a fibrotic collagen gel which is a collagen base material by fibrosis of collagen in a solubilized collagen solution in a state of being in contact with a transfer member, and a state of being in contact with a transfer member. It includes a second step of irradiating and cross-linking the fibrotic collagen gel in the presence of an aqueous solvent.
第一工程では、容器に入れた可溶化コラーゲン溶液又は線維化が進行中の可溶化コラーゲン溶液の上面に転写部材を載置することにより、転写部材と可溶化コラーゲン溶液とを接触させてもよいし、転写部材を予め底面に敷設した容器に可溶化コラーゲン溶液を投入することにより、接触させてもよい。転写部材を載置する場合は、可溶化コラーゲン溶液中に転写部材が沈み込まないようにすることが好ましい。可溶化コラーゲン溶液中への転写部材の沈降を避ける方法として、例えば、軽量な転写部材を用いる方法、あるいは、可溶化コラーゲン溶液を容器上端まで充填し転写部材を容器に橋渡しに架ける方法等が挙げられる。また、容器の底面又は側面に転写部を有するものを転写部材として用い、この容器中で可溶化コラーゲン溶液を線維化させてもよい。 In the first step, the transfer member may be brought into contact with the solubilized collagen solution by placing the transfer member on the upper surface of the solubilized collagen solution in the container or the solubilized collagen solution in which fibrosis is in progress. Then, the transfer member may be brought into contact with the solubilized collagen solution by pouring it into a container laid on the bottom surface in advance. When the transfer member is placed, it is preferable to prevent the transfer member from sinking into the solubilized collagen solution. Examples of a method of avoiding sedimentation of the transfer member in the solubilized collagen solution include a method of using a lightweight transfer member, a method of filling the solubilized collagen solution to the upper end of the container, and a method of bridging the transfer member between the containers. Be done. Further, a container having a transfer portion on the bottom surface or the side surface thereof may be used as a transfer member, and the solubilized collagen solution may be fibrotic in the container.
第二工程では、転写部材と接触した部分の線維化コラーゲンゲルに水性溶媒が流通又は浸潤するような全体設計とすることが好ましい。架橋処理は、線維化コラーゲンゲルを容器から取り出して実施してもよいし、容器に入れたままで実施してもよい。後者においては、架橋処理中に、線維化コラーゲンゲルが容器内で位置を変えないように、通水性を有する部材を用いて線維化コラーゲンゲルを固定してもよい。 In the second step, it is preferable that the overall design is such that the aqueous solvent flows or infiltrates the fibrotic collagen gel in the portion in contact with the transfer member. The cross-linking treatment may be carried out by removing the fibrotic collagen gel from the container or by leaving the fibrotic collagen gel in the container. In the latter, the fibrotic collagen gel may be fixed using a water-permeable member so that the fibrotic collagen gel does not change its position in the container during the cross-linking treatment.
（乾燥工程）
第１製法及び第２製法の各最終工程に引き続き、架橋処理物を脱溶媒することにより乾燥させる乾燥工程を更に含んでもよい。乾燥の程度は、用途に応じて適宜設定すればよい。乾燥方法は、公知の方法を用いればよく、特に限定されることはない。本基材の主要構成要素が非線維化コラーゲンである場合、コラーゲンの線維化が生じない乾燥方法及び乾燥条件とすることが好ましい。
(Drying process)
Following each final step of the first manufacturing method and the second manufacturing method, a drying step of drying the crosslinked product by removing the solvent may be further included. The degree of drying may be appropriately set according to the intended use. The drying method may be a known method and is not particularly limited. When the main component of the present base material is non-fibrotic collagen, it is preferable to use a drying method and drying conditions that do not cause collagen fibrosis.
（その他構成要素の配合）
前述したその他構成要素を本基材に配合する場合は、その他構成要素の種類、目的とする用途等に応じて、その他構成要素の配合タイミングを適切に選択することが好ましい。配合のタイミングとして、例えば、架橋処理前、架橋処理後等が挙げられる。
(Combining other components)
When the above-mentioned other components are blended in the present base material, it is preferable to appropriately select the blending timing of the other components according to the type of the other components, the intended use, and the like. Examples of the timing of blending include before the crosslinking treatment and after the crosslinking treatment.
〔細胞培養方法〕
本発明は、以上説明した本基材を、細胞培養基材として用いることを特徴とする細胞培養方法である。具体的には、細胞を播種する播種工程と、この細胞を培養する培養工程とを含む。本発明の目的が阻害されない限り、本培養方法が、更に他の工程を含んでもよい。
[Cell culture method]
The present invention is a cell culture method characterized in that the present base material described above is used as a cell culture base material. Specifically, it includes a seeding step of seeding the cells and a culture step of culturing the cells. The culture method may further include other steps as long as the object of the present invention is not impaired.
（播種工程）
播種工程では、本基材に対して、培養する細胞が播種される。一般には、培養容器に本基材を収容した状態で播種する。細胞を播種する方法は特に限定されず、既知の手法が用いられうる。例えば、目的とする細胞を緩衝液又は液状の培地に懸濁して、所定濃度の細胞懸濁液を作製し、この細胞懸濁液を滴下することにより、播種工程が実施されてもよい。本基材として、例えば、膜状のものを用いるときは、好適にはパターン形状を有する面に細胞を播種する。培養容器に収納する本基材の数は特に限定されず、目的に応じて複数の本基材を用いることも可能であり、その場合には、外形、大きさ、パターン形状等が異なる複数の本基材を一つの培養容器に収容してもよい。培養容器の種類及び大きさは特に限定されず、通常、細胞培養用として使用されるシャーレ、ディッシュ、マルチカルチャープレート、フラスコ等既知の培養容器が適宜選択されて用いられる。また、培養容器の材質は、ガラスであってもよく、ポリスチレン等の樹脂であってもよい。
(Sowing process)
In the seeding step, the cells to be cultured are seeded on the substrate. Generally, the seedling is sown with the base material contained in a culture vessel. The method of seeding the cells is not particularly limited, and a known method can be used. For example, the seeding step may be carried out by suspending the cells of interest in a buffer solution or a liquid medium to prepare a cell suspension having a predetermined concentration, and dropping the cell suspension. When, for example, a film-like base material is used, cells are preferably seeded on a surface having a pattern shape. The number of the main base materials to be stored in the culture container is not particularly limited, and a plurality of the main base materials can be used depending on the purpose. In that case, a plurality of main base materials having different outer shapes, sizes, pattern shapes, etc. The substrate may be contained in one culture vessel. The type and size of the culture vessel are not particularly limited, and usually known culture vessels such as petri dishes, dishes, multiculture plates, and flasks used for cell culture are appropriately selected and used. Further, the material of the culture container may be glass or a resin such as polystyrene.
（培養工程）
培養工程では、本基材に播種した細胞を所定の培養条件下で培養する。培養工程の一例では、先ず、細胞が播種された本基材を収容する培養容器に、培地が添加される。培地の種類は特に限定されないが、播種工程において、細胞懸濁液の作製に使用した培地と同じ種類の培地が好ましい。必要に応じて、各種成長因子、血清、抗生物質等を含む培地が用いられてもよい。次に、培地が添加された培養容器が、細胞の種類や培養の目的等に応じて選択された所定の培養条件下に置かれることにより、本基材に播種された細胞が培養される。一般には、温度37℃、湿度90％以上、CO2濃度5容積％に調整されたインキュベーターが利用される。
(Culture process)
In the culturing step, the cells seeded on this substrate are cultivated under predetermined culturing conditions. In one example of the culture step, first, the medium is added to the culture vessel containing the present substrate in which the cells are seeded. The type of medium is not particularly limited, but in the seeding step, the same type of medium as the medium used for preparing the cell suspension is preferable. If necessary, a medium containing various growth factors, serum, antibiotics and the like may be used. Next, the cells seeded on the present substrate are cultured by placing the culture vessel to which the medium has been added under predetermined culture conditions selected according to the type of cells, the purpose of culture, and the like. Generally, an incubator adjusted to a temperature of 37 ° C., a humidity of 90% or more, and a CO 2 concentration of 5% by volume is used.
また、別の細胞培養方法の一例は、本基材の乾燥体を細胞培養基材として用いるものであり、初めに、本基材を細胞懸濁液中に浸漬した後、細胞懸濁液を含有した状態で本基材を培養容器に収容して、これを所定の培養条件下に置くことにより培養をおこなう方法である。当該細胞培養方法も、細胞を播種する播種工程と、この細胞を培養する培養工程とを含む本発明の範囲に含まれる。当該細胞培養方法では、本基材の外表面及び内部に効率よく細胞を付着させることも可能である。 Further, another example of the cell culture method is to use a dried product of this base material as a cell culture base material. First, the base material is immersed in the cell suspension, and then the cell suspension is used. This is a method in which the substrate is contained in a culture vessel and placed under predetermined culture conditions for culturing. The cell culture method is also included in the scope of the present invention including a seeding step of seeding cells and a culture step of culturing the cells. In the cell culture method, it is also possible to efficiently attach cells to the outer surface and the inside of the base material.
本培養方法の対象となる細胞の種類として、例えば、角化細胞（keratinocyte）、上皮細胞（epithelial cell）、内皮細胞（endothelial cell）、線維芽細胞（fibroblast）、神経細胞（nerve cell）、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）、骨細胞（osteocyte）、軟骨細胞（chondrocyte）等が挙げられ、これらの細胞の由来として、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等が例示されるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本基材のパターン形状を好んで接着及び増殖する細胞が選択される。この観点から、より好ましい細胞として、例えば、角化細胞、上皮細胞、神経細胞等が挙げられる。本培養方法の播種工程において、２種以上の細胞を本基材に播種することも可能である。 The types of cells to be targeted in this culture method include, for example, keratinocytes, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, nerve cells, and interstitial cells. Examples thereof include foliar stem cells (mesenchymal stem cells), bone cells (osteocytes), chondrocytes (chondrocytes), and examples of the origin of these cells include humans, monkeys, pigs, dogs, rats, and mice. It is not limited to these. Preferably, cells that adhere and proliferate in favor of the pattern shape of the substrate are selected. From this point of view, more preferable cells include, for example, keratinocytes, epithelial cells, nerve cells and the like. In the seeding step of the main culture method, it is also possible to seed two or more kinds of cells on the present substrate.
本培養方法において、本基材の表面及び／又は内部で、培養細胞が増殖及び分化することにより、細胞組織が形成されうる。本基材が備えるパターン形状は、とりわけ細胞の接着及び増殖に有効に作用するものであり、本基材を用いることによって、生体組織と類似した構造及び機能を有する細胞組織を構築することも可能である。 In the main culture method, cell tissue can be formed by the proliferation and differentiation of cultured cells on the surface and / or inside of the base material. The pattern shape provided by this base material particularly effectively acts on cell adhesion and proliferation, and by using this base material, it is possible to construct a cell tissue having a structure and function similar to that of a living tissue. Is.
（培養組織）
本発明は、本基材と、本基材の表面及び／又は内部に形成されている細胞組織とを含んでなる培養組織をも対象とするものである。本発明に係る培養組織（以下、「本培養組織」と称する）は、少なくとも、本基材を製造する製造工程、本基材に細胞を播種する播種工程及びこの細胞を培養する培養工程を含む製造方法により作製される。各工程の詳細については前述した通りである。
(Cultured tissue)
The present invention is also intended for a cultured tissue including the present substrate and the cell tissue formed on the surface and / or inside of the present substrate. The cultured tissue according to the present invention (hereinafter referred to as "main culture tissue") includes at least a production step of producing the present base material, a seeding step of seeding cells on the main base material, and a culture step of culturing the cells. It is produced by a manufacturing method. The details of each step are as described above.
本培養組織において、細胞組織を構成する細胞の種類は特に限定されず、目的とする用途等に応じて適宜選択される。細胞組織が、種類の異なる複数の細胞を含んで構成されたものでもよい。また、本培養組織が、それぞれ異なる種類の細胞からなる複数の細胞組織を含んでもよい。さらには、種類の異なる複数の培養組織を組み合わせたものも、本発明の範囲に含まれる。 In the main culture tissue, the type of cells constituting the cell tissue is not particularly limited, and is appropriately selected according to the intended use and the like. The cell tissue may be composed of a plurality of cells of different types. In addition, the main culture tissue may contain a plurality of cell tissues each consisting of different types of cells. Furthermore, a combination of a plurality of different types of cultured tissues is also included in the scope of the present invention.
尚、本発明は、前述した細胞培養方法によって得られた培養組織を対象とするものであるが、この培養組織は、細胞の種類、培養期間等の条件は勿論のこと、本基材の種類によっても得られる培養組織の形状、性状等が異なるものとなるため、その特徴を物の構造又は特性により直接特定することは、分析・解析手段を駆使しても不可能であることは明白である。したがって、「不可能・非実際的事情」が存在することは容易に理解できるところである。 The present invention is intended for a cultured tissue obtained by the above-mentioned cell culture method, and this cultured tissue is not only a condition such as a cell type and a culture period, but also a type of the present base material. Since the shape, properties, etc. of the cultured tissue obtained will differ, it is clear that it is impossible to directly identify the characteristics by the structure or characteristics of the object, even by making full use of analytical means. is there. Therefore, it is easy to understand that there are "impossible / impractical circumstances".
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。尚、実施例において％は、特に断らない限り全て質量％を示す。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. In the examples,% indicates mass% unless otherwise specified.
〔製造例１〕
（可溶化コラーゲン溶液の調製）
ティラピアの鱗から製造された多木化学（株）製「セルキャンパス FD-08G」（凍結乾燥品）をpH3のHCl溶液に溶解した後、コラーゲン濃度1.1％、pH3に調整して、無色透明の可溶化コラーゲン溶液を得た。
[Manufacturing Example 1]
(Preparation of solubilized collagen solution)
"Cell Campus FD-08G" (freeze-dried product) manufactured by Taki Kagaku Co., Ltd. manufactured from Thirapia scales is dissolved in an HCl solution at
（線維化コラーゲン成形体の作製）
可溶化コラーゲン溶液の9容量部と、10倍濃度のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）の1容量部とを混合し、この混合液0.79mlをシリコーン製成形器（直径20mm、高さ2.5mm）に注入した。水分の蒸発を防ぐために、成形器の上面をスライドグラスで覆い、25℃で12時間保持して線維化コラーゲンゲルを得た。当該線維化コラーゲンゲルを、エタノール／水混合液（容量比50／50）に浸漬した。続いて、容量比70／30、90／10、100／0のエタノール／水混合液に順次浸漬して、この線維化コラーゲンゲルを脱塩した。その後、成形器から取り出した線維化コラーゲンゲルの上下面をポリスチレン板で覆い、側面のみから脱溶媒することにより乾燥させて膜状の線維化コラーゲン成形体（以下、「線維化コラーゲン膜」と称する）を得た。
(Preparation of fibrotic collagen molded product)
9 parts by volume of the solubilized collagen solution and 1 part by volume of 10-fold concentrated saline buffered saline (D-PBS) are mixed, and 0.79 ml of this mixture is used in a silicone molder (
（表面加工コラーゲン成形体の製造）
製造例１では、前述の線維化コラーゲン膜をコラーゲン基材とし、ナイロンメッシュ（目開き：300μm、繊維径：100〜150μm）を転写部材として使用し、ポリエチレンシートを支持部材として使用した。１枚の線維化コラーゲン膜の上面及び下面を、上記各1枚のナイロンメッシュ及びポリエチレンシートで挟んで押圧し、クリップで固定して押圧状態を保持した。その後、D-PBS中に投入して、25kGyのγ線を照射することにより、製造例１の表面加工コラーゲン成形体を得た。得られた表面加工コラーゲン成形体の主要構成要素は、架橋された線維化コラーゲンである。
(Manufacturing of surface-processed collagen molded product)
In Production Example 1, the above-mentioned fibrotic collagen film was used as a collagen base material, a nylon mesh (opening: 300 μm, fiber diameter: 100 to 150 μm) was used as a transfer member, and a polyethylene sheet was used as a support member. The upper surface and the lower surface of one fibrotic collagen membrane were sandwiched between each one nylon mesh and polyethylene sheet and pressed, and fixed with a clip to maintain the pressed state. Then, it was put into D-PBS and irradiated with γ-rays of 25 kGy to obtain a surface-processed collagen molded product of Production Example 1. The main component of the resulting surface-processed collagen molding is cross-linked fibrotic collagen.
（表面観察）
製造例１の表面加工コラーゲン成形体のナイロンメッシュと接していた表面を、走査型電子顕微鏡（日本電子(株)製「JSM-6010LA」）で観察した。その結果、この表面にナイロンメッシュの表面形状が転写又は反映された、一定のパターン形状が形成されていることを確認した（図１Ｂ、倍率50倍）。また、この成形体そのものが多孔質構造を有するものでないことを確認した。尚、図１Ａは、転写部材として用いたナイロンメッシュをカーボンペースト上に載置して撮影した走査型電子顕微鏡像（倍率50倍）である。
(Surface observation)
The surface of the surface-processed collagen molded product of Production Example 1 in contact with the nylon mesh was observed with a scanning electron microscope (“JSM-6010LA” manufactured by JEOL Ltd.). As a result, it was confirmed that a constant pattern shape was formed on this surface in which the surface shape of the nylon mesh was transferred or reflected (Fig. 1B, magnification 50 times). It was also confirmed that the molded product itself did not have a porous structure. FIG. 1A is a scanning electron microscope image (magnification: 50 times) taken by placing a nylon mesh used as a transfer member on a carbon paste.
（溶解率）
製造例１の表面加工コラーゲン成形体を、6wellプレートに配し、D-PBS 5ml中に37℃で5日間浸漬した。5日後、上澄みのみをサンプリングし、80℃で1日間乾燥した後、溶解重量を測定し、溶解率を求めた。その結果、溶解率は3％であった。
(Dissolution rate)
The surface-processed collagen molded product of Production Example 1 was placed on a 6-well plate and immersed in 5 ml of D-PBS at 37 ° C. for 5 days. After 5 days, only the supernatant was sampled, dried at 80 ° C. for 1 day, and then the dissolution weight was measured to determine the dissolution rate. As a result, the dissolution rate was 3%.
〔製造例２〕
製造例１と同様の方法で調製した可溶化コラーゲン溶液の9容量部と、10倍濃度のD-PBSの1容量部とを混合し、この混合液0.79mlをシリコーン製成形器（直径20mm、高さ2.5mm）に注入した。
[Manufacturing Example 2]
9 parts by volume of the solubilized collagen solution prepared by the same method as in Production Example 1 and 1 part by volume of D-PBS having a 10-fold concentration were mixed, and 0.79 ml of this mixed solution was added to a silicone molding machine (
次に、ナイロンメッシュ（目開き：300μm、繊維径：100〜150μm）を転写部材として、可溶化コラーゲン溶液の上面に載置した。さらに、水分の蒸発を防ぐために、成形器の上面をスライドグラスで覆い、25℃で12時間保持して、ナイロンメッシュが載置された線維化コラーゲンゲルを得た。 Next, a nylon mesh (opening: 300 μm, fiber diameter: 100 to 150 μm) was placed on the upper surface of the solubilized collagen solution as a transfer member. Further, in order to prevent evaporation of water, the upper surface of the molding machine was covered with a slide glass and held at 25 ° C. for 12 hours to obtain a fibrotic collagen gel on which a nylon mesh was placed.
得られた線維化コラーゲンゲルをシリコーン製成形器に入れたまま、ナイロンメッシュを載置した状態で、D-PBS中に投入して25kGyのγ線を照射した。γ線の照射終了後に載置されたナイロンメッシュを除去して、成形器から取り出すことにより、製造例２の表面加工コラーゲン成形体を得た。この表面加工コラーゲン成形体は、架橋された線維化コラーゲンが水性溶媒で膨潤したハイドロゲルである。 The obtained fibrotic collagen gel was put into D-PBS with a nylon mesh placed in the silicone molding machine and irradiated with 25 kGy of γ-rays. The nylon mesh placed after the completion of γ-ray irradiation was removed and taken out from the molding machine to obtain a surface-processed collagen molded product of Production Example 2. This surface-processed collagen molded product is a hydrogel in which crosslinked fibrotic collagen is swollen with an aqueous solvent.
製造例２の表面加工コラーゲン成形体の、ナイロンメッシュを載置していた表面の走査型電子顕微鏡像（図２、倍率50倍）により、この表面にナイロンメッシュの表面形状が転写又は反映された、一定のパターン形状が形成されていることを確認した。また、この成形体そのものが多孔質構造を有するものでないことを確認した。製造例２の表面加工コラーゲン成形体の溶解率は8％であった。 The surface shape of the nylon mesh was transferred or reflected on the surface of the surface-processed collagen molded product of Production Example 2 by the scanning electron microscope image (Fig. 2, magnification 50 times) on the surface on which the nylon mesh was placed. , It was confirmed that a certain pattern shape was formed. It was also confirmed that the molded product itself did not have a porous structure. The dissolution rate of the surface-processed collagen molded product of Production Example 2 was 8%.
（実施例１）
製造例１の表面加工コラーゲン成形体を細胞培養基材として、以下の手順により、本発明に係る細胞培養方法を実施した。なお、角化細胞（Keratinocyte）として、新潟大学歯学部倫理委員会の承認を受けて実験に使用している、新潟大学医歯学総合病院の口腔外科を受診した患者の口腔粘膜上皮由来の初代培養細胞を用いた。
(Example 1)
The cell culture method according to the present invention was carried out by the following procedure using the surface-processed collagen molded product of Production Example 1 as a cell culture base material. In addition, as keratinocytes, primary cultured cells derived from the oral mucosal epithelium of patients who underwent oral surgery at Niigata University Medical and Dental Hospital, which are used in experiments with the approval of the Ethics Committee of the Faculty of Dentistry, Niigata University. Was used.
(Day 0)
12wellプレートに、細胞培養基材として、製造例１の表面加工コラーゲン成形体を収容した。尚、パターン形状を有する面を上面とした。これを1 wellあたり1μg/μlのIV型コラーゲン溶液25μLとD-PBS 500μlの混合液でコーティングした後、4℃で一晩静置した。
(Day 0)
The surface-processed collagen molded product of Production Example 1 was housed in a 12-well plate as a cell culture substrate. The surface having the pattern shape was used as the upper surface. This was coated with a mixture of 25 μL of 1 μg / μl type IV collagen solution and 500 μl of D-PBS per well, and then allowed to stand overnight at 4 ° C.
(Day 1)
角化細胞の細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液を、1×106 cells/wellとなるように、細胞培養基材の表面に播種した。培地は、EpiLife（登録商標、Thermo Fisher Scientific）high Ca++(1.2mM)培地5.5mLを用い、液相培養（Submerged Culture）にて培養4日目（Day 4）まで毎日培地交換した。
(Day 1)
A cell suspension of keratinocytes was prepared, and the cell suspension was seeded on the surface of the cell culture substrate at 1 × 10 6 cells / well. As the medium, 5.5 mL of EpiLife (registered trademark, Thermo Fisher Scientific) high Ca ++ (1.2 mM) medium was used, and the medium was changed daily by submerged culture until the 4th day (Day 4) of the culture.
（Day 4）
気相−液相培養(air-liquid interface culture)に移行し、EpiLife（登録商標、Thermo Fisher Scientific）high Ca++(1.2mM)培地10mLで1日おきに培地交換した。当該培養を培養11日目（Day 11）まで継続した。
(Day 4)
The transition was made to air-liquid interface culture, and the medium was changed every other day with 10 mL of EpiLife (registered trademark, Thermo Fisher Scientific) high Ca ++ (1.2 mM) medium. The culture was continued until the 11th day of culture (Day 11).
（Day 11）
得られた培養組織を、4％パラホルムアルデヒドに一晩浸漬（4℃）することにより固定した。次に、パラフィン包埋後、常法によるヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を施して、光学顕微鏡による形態観察に供した。実施例１で得られた培養組織の光学顕微鏡写真が、図４（４Ａ及び４Ｂ）に示されている。
(Day 11)
The obtained culture tissue was fixed by immersing it in 4% paraformaldehyde overnight (4 ° C.). Next, after embedding in paraffin, hematoxylin and eosin (HE) staining was performed by a conventional method, and the morphology was observed with an optical microscope. Optical micrographs of the cultured tissue obtained in Example 1 are shown in FIGS. 4A and 4B.
（実施例２）
製造例１の表面加工コラーゲン成形体に替えて、製造例２の表面加工コラーゲン成形体を細胞培養基材として用いた以外は、実施例１と同様にして、実施例２の細胞培養方法を実施した。尚、細胞培養基材は、パターン形状を有する面を上面として12wellプレートに収容し、この上面に対して細胞懸濁液を播種した。実施例２で得られた培養組織の光学顕微鏡写真が、図５（５Ａ−５Ｃ）に示されている。
(Example 2)
The cell culture method of Example 2 was carried out in the same manner as in Example 1 except that the surface-processed collagen molded product of Production Example 2 was used as the cell culture base material in place of the surface-processed collagen molded product of Production Example 1. did. The cell culture substrate was housed in a 12-well plate with the pattern-shaped surface as the upper surface, and the cell suspension was seeded on this upper surface. An optical micrograph of the cultured tissue obtained in Example 2 is shown in FIG. 5 (5A-5C).
（培養期間中の細胞培養基材の外観）
図３は、12wellプレートに収容した製造例１及び２の細胞培養基材の、Day 0からDay 11までの形状変化を示す写真である。図示される通り、製造例１の細胞培養基材は、外観形状にほとんど変化がみられなかったが、製造例２の細胞培養基材は、培養日数の経過とともに収縮した。
(Appearance of cell culture substrate during the culture period)
FIG. 3 is a photograph showing the shape change of the cell culture substrates of Production Examples 1 and 2 housed in the 12-well plate from
（実施例１で得られた培養組織の組織像）
図４は、実施例１で得られた培養組織の断面を示す組織像である（４Ａ：倍率10倍、４Ｂ：倍率20倍）。実施例１では、細胞培養基材の上部（表面）全体に、連続した上皮層の形成が見られた。細胞培養基材のパターン形状が形成された部位には、上皮脚様の細胞が増殖していた。細胞組織が厚い部分では、10層程度の上皮層及び5層程度の角化層の形成が確認された。
(Tissue image of cultured tissue obtained in Example 1)
FIG. 4 is a histological image showing a cross section of the cultured tissue obtained in Example 1 (4A: magnification 10 times, 4B:
（実施例２で得られた培養組織の組織像）
図５は、実施例２で得られた培養組織の断面を示す組織像である（５Ａ：倍率10倍、５Ｂ：倍率20倍、５Ｃ：倍率40倍）。実施例２では、細胞培養基材の上部（表面）全体に、連続した上皮層の形成が見られた。また、細胞と細胞培養基材との接着は良好であった。細胞培養基材のパターン形状が形成された部位には、上皮脚様の細胞が増殖していた。実施例２では、パターン形状の有無に関係なく、どの部位にもある程度の厚みがある上皮層が形成され、細胞の密度が高く、円柱状の細胞の配列が認められた。細胞組織が厚い部分では、10層程度の上皮層及び5層程度の角化層の形成が確認された。
(Tissue image of cultured tissue obtained in Example 2)
FIG. 5 is a histological image showing a cross section of the cultured tissue obtained in Example 2 (5A: magnification 10 times, 5B:
〔比較製造例１〕
特許文献１に記載の実施例１に従って、多孔質コラーゲン成形体を作製した。先ず、実施例１と同様の方法で調製した可溶化コラーゲン溶液の9容量部に、重炭酸ナトリウム水溶液1容量部を、重炭酸ナトリウム／可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲン（モル比）＝1.5×103となるように添加して、線維化コラーゲンゲルを得た。次に、当該線維化コラーゲンゲルを12wellプレートに2mlずつ分注した後、-35℃・3時間で凍結乾燥して、線維化コラーゲンで構成された多孔体を得た。次いで、この多孔体を0.05mol/Lの重炭酸ナトリウム水溶液中に浸漬した状態で25kGyのγ線照射を行うことによって、比較製造例１の多孔質コラーゲン成形体を得た。比較製造例１の多孔質コラーゲン成形体の表面には凹凸は殆ど確認出来なかった。また、特許文献１に記載の方法で平均孔径を求めたところ、多孔質コラーゲン成形体の平均孔径は95.5μm であった。この多孔質コラーゲン成形体の主要構成要素は、架橋された線維化コラーゲンである。
[Comparative Manufacturing Example 1]
A porous collagen molded product was prepared according to Example 1 described in Patent Document 1. First, 1 part by volume of an aqueous sodium bicarbonate solution was added to 9 parts by volume of the solubilized collagen solution prepared in the same manner as in Example 1, and collagen (molar ratio) in the sodium bicarbonate / solubilized collagen solution = 1.5 × 10. It was added so as to be 3, and a fibrotic collagen gel was obtained. Next, 2 ml of the fibrotic collagen gel was dispensed into a 12-well plate and then freeze-dried at −35 ° C. for 3 hours to obtain a porous body composed of fibrotic collagen. Next, the porous collagen molded product of Comparative Production Example 1 was obtained by irradiating the porous body with γ-rays of 25 kGy while being immersed in a 0.05 mol / L sodium bicarbonate aqueous solution. Almost no unevenness could be confirmed on the surface of the porous collagen molded product of Comparative Production Example 1. Further, when the average pore size was determined by the method described in Patent Document 1, the average pore size of the porous collagen molded product was 95.5 μm. The main component of this porous collagen molding is crosslinked fibrotic collagen.
（比較例１）
製造例１の表面加工コラーゲン成形体に替えて、比較製造例１の多孔質コラーゲン成形体を細胞培養基材として用いた以外は、実施例１と同様にして、比較例１の細胞培養方法を実施した。比較例１では、播種した角化細胞が成形体内部に落ち込み、所定の培養期間経過後も、ヒト口腔粘膜上皮に類似した層構造を有する上皮の形成は見られなかった。
(Comparative Example 1)
The cell culture method of Comparative Example 1 was used in the same manner as in Example 1 except that the porous collagen molded product of Comparative Production Example 1 was used as the cell culture base material in place of the surface-processed collagen molded product of Production Example 1. Carried out. In Comparative Example 1, the seeded keratinocytes fell into the molded body, and no epithelium having a layered structure similar to that of human oral mucosal epithelium was observed even after the lapse of a predetermined culture period.
以上説明された細胞培養方法及び培養組織は、再生医療用材料、移植用材料、創傷被覆用材料、癒着防止用材料等種々の用途への適用が可能である。 The cell culture method and culture tissue described above can be applied to various uses such as regenerative medicine materials, transplant materials, wound dressing materials, and adhesion prevention materials.
Claims (6)
上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、
上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された非多孔質である成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部が凹形状及び／又は凸形状を有しており、かつこの成形体の主要構成要素が、損なわれていない（intact）線維化コラーゲン又はコラーゲン分子であり、
上記凹形状の深さが10〜1000μmであり、上記凸形状の高さが10〜1000μmであり、この凹形状の深さ及び凸形状の高さが、凹形状及び凸形状が形成されていない領域の面を基準面として測定される、細胞培養方法。 A cell culture method including a seeding step of seeding cells on a cell culture substrate and a culture step of culturing the cells.
The cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product.
In the surface-processed collagen molded product, an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film or a non-fibrotic collagen film is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. It is a non-porous molded body, in which at least a part of the surface of the molded body has a concave shape and / or a convex shape, and the main components of the molded body are not impaired ( intact) is a fibrotic collagen or collagen molecule,
The depth of the concave shape is 10 to 1000 μm, the height of the convex shape is 10 to 1000 μm, and the depth of the concave shape and the height of the convex shape are such that the concave shape and the convex shape are not formed. A cell culture method in which a plane of a region is used as a reference plane.
上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、
上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、少なくとも一部が転写部材と接触した状態で、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された非多孔質である成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に上記転写部材の形状が転写又は反映された被転写部を有しており、この被転写部に凹形状及び／又は凸形状を有しており、
上記凹形状の深さが10〜1000μmであり、上記凸形状の高さが10〜1000μmであり、この凹形状の深さ及び凸形状の高さが、凹形状及び凸形状が形成されていない領域の面を基準面として測定される、細胞培養方法。 A cell culture method including a seeding step of seeding cells on a cell culture substrate and a culture step of culturing the cells.
The cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product.
The surface-processed collagen molded product was irradiated with γ-rays in a state where the uncrosslinked fibrotic collagen gel, fibrotic collagen film or non-fibrotic collagen film was in contact with the transfer member in the presence of an aqueous solvent. It is a non-porous molded body crosslinked by electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation, and has a transferred portion in which the shape of the transfer member is transferred or reflected on at least a part of the surface of the molded body. This part to be transferred has a concave shape and / or a convex shape .
The depth of the concave shape is 10 to 1000 μm, the height of the convex shape is 10 to 1000 μm, and the depth of the concave shape and the height of the convex shape are such that the concave shape and the convex shape are not formed. A cell culture method in which a plane of a region is used as a reference plane .
上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、
上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された非多孔質である成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に、凹形状及び／又は凸形状に変形した表面形状を有しており、
上記凹形状の深さが10〜1000μmであり、上記凸形状の高さが10〜1000μmであり、この凹形状の深さ及び凸形状の高さが、凹形状及び凸形状が形成されていない領域の面を基準面として測定される、細胞培養方法。 A cell culture method including a seeding step of seeding cells on a cell culture substrate and a culture step of culturing the cells.
The cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product.
In the surface-processed collagen molded product, an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film or a non-fibrotic collagen film is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. It is a non-porous molded body, and at least a part of the surface of the molded body has a surface shape deformed into a concave shape and / or a convex shape.
The depth of the concave shape is 10 to 1000 μm, the height of the convex shape is 10 to 1000 μm, and the depth of the concave shape and the height of the convex shape are such that the concave shape and the convex shape are not formed. A cell culture method in which a plane of a region is used as a reference plane.
上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、
上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された非多孔質である成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部が凹形状及び／又は凸形状を有しており、かつこの成形体の主要構成要素が、損なわれていない（intact）線維化コラーゲン又はコラーゲン分子であり、
上記凹形状の深さが10〜1000μmであり、上記凸形状の高さが10〜1000μmであり、この凹形状の深さ及び凸形状の高さが、凹形状及び凸形状が形成されていない領域の面を基準面として測定される、培養組織。 A culture medium comprising a cell culture substrate and a cell tissue formed on the surface and / or inside of the cell culture substrate.
The cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product.
In the surface-processed collagen molded body, an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film or a non-fibrotic collagen film is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. It is a non-porous molded product, in which at least a part of the surface of the molded product has a concave shape and / or a convex shape, and the main components of the molded product are not impaired ( intact) is a fibrotic collagen or collagen molecule,
The depth of the concave shape is 10 to 1000 μm, the height of the convex shape is 10 to 1000 μm, and the depth of the concave shape and the height of the convex shape are such that the concave shape and the convex shape are not formed. Cultured tissue measured with the plane of the region as the reference plane.
上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、
上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、少なくとも一部が転写部材と接触した状態で、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された非多孔質である成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に上記転写部材の形状が転写又は反映された被転写部を有しており、この被転写部に凹形状及び／又は凸形状を有しており、
上記凹形状の深さが10〜1000μmであり、上記凸形状の高さが10〜1000μmであり、この凹形状の深さ及び凸形状の高さが、凹形状及び凸形状が形成されていない領域の面を基準面として測定される、培養組織。 A culture medium comprising a cell culture substrate and a cell tissue formed on the surface and / or inside of the cell culture substrate.
The cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product.
The surface-processed collagen molded product was irradiated with γ-rays in a state where the uncrosslinked fibrotic collagen gel, fibrotic collagen film or non-fibrotic collagen film was in contact with the transfer member in the presence of an aqueous solvent. It is a non-porous molded body crosslinked by electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation, and has a transferred portion in which the shape of the transfer member is transferred or reflected on at least a part of the surface of the molded body. This part to be transferred has a concave shape and / or a convex shape .
The depth of the concave shape is 10 to 1000 μm, the height of the convex shape is 10 to 1000 μm, and the depth of the concave shape and the height of the convex shape are such that the concave shape and the convex shape are not formed. Cultured tissue measured with the plane of the region as the reference plane .
上記細胞培養基材が、表面加工コラーゲン成形体であり、
上記表面加工コラーゲン成形体が、未架橋の線維化コラーゲンゲル、線維化コラーゲン膜又は非線維化コラーゲン膜が、水性溶媒の存在下、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射又はプラズマ照射により架橋された非多孔質である成形体であって、この成形体の表面の少なくとも一部に、凹形状及び／又は凸形状に変形した表面形状を有しており、
上記凹形状の深さが10〜1000μmであり、上記凸形状の高さが10〜1000μmであり、この凹形状の深さ及び凸形状の高さが、凹形状及び凸形状が形成されていない領域の面を基準面として測定される、培養組織。 A culture medium comprising a cell culture substrate and a cell tissue formed on the surface and / or inside of the cell culture substrate.
The cell culture substrate is a surface-processed collagen molded product.
In the surface-processed collagen molded body, an uncrosslinked fibrotic collagen gel, a fibrotic collagen film or a non-fibrotic collagen film is crosslinked by γ-ray irradiation, electron beam irradiation, UV irradiation or plasma irradiation in the presence of an aqueous solvent. It is a non-porous molded body, and at least a part of the surface of the molded body has a surface shape deformed into a concave shape and / or a convex shape.
The depth of the concave shape is 10 to 1000 μm, the height of the convex shape is 10 to 1000 μm, and the depth of the concave shape and the height of the convex shape are such that the concave shape and the convex shape are not formed. Cultured tissue measured with the plane of the region as the reference plane.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016031777A JP6758616B2 (en) | 2016-02-23 | 2016-02-23 | Cell culture method and culture tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016031777A JP6758616B2 (en) | 2016-02-23 | 2016-02-23 | Cell culture method and culture tissue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017147951A JP2017147951A (en) | 2017-08-31 |
| JP6758616B2 true JP6758616B2 (en) | 2020-09-23 |
Family
ID=59739978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016031777A Active JP6758616B2 (en) | 2016-02-23 | 2016-02-23 | Cell culture method and culture tissue |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6758616B2 (en) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7414224B2 (en) * | 2018-06-29 | 2024-01-16 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 | Hydrogel for cell culture, gel kit, method for producing cell culture product, and method for producing hydrogel for cell culture |
| JP7197886B2 (en) * | 2018-08-01 | 2022-12-28 | 国立大学法人 新潟大学 | Template material for fibrosis collagen gel production |
| JP7203376B2 (en) * | 2018-12-26 | 2023-01-13 | 国立大学法人 新潟大学 | Cross-linked fibrous collagen gel for oral mucosal epithelial cell culture |
| KR102486925B1 (en) * | 2019-12-27 | 2023-01-10 | 주식회사 아모라이프사이언스 | Cell cultivation substrate and method for manufacturing thereof |
| US20230340402A1 (en) * | 2019-12-27 | 2023-10-26 | Amolifescience Co., Ltd. | Cell culture substrate and manufacturing method thereof |
| TWI753622B (en) * | 2020-10-23 | 2022-01-21 | 財團法人工業技術研究院 | Cell sheet forming apparatus and equipment |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1147258A (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-23 | Menicon Co Ltd | Medical base material containing gelatin and collagen |
| JP2004065087A (en) * | 2002-08-06 | 2004-03-04 | National Institute For Materials Science | Cell culture product for high-density culture and its culture module |
| JP4672376B2 (en) * | 2005-01-11 | 2011-04-20 | 株式会社クラレ | Cell culture method with controlled extension direction |
| JP5013584B2 (en) * | 2006-08-30 | 2012-08-29 | 株式会社日立製作所 | Chondrocyte culture method and chondrocyte |
| US20100167401A1 (en) * | 2007-03-19 | 2010-07-01 | Vasif Hasirci | Stacked, patterned biomaterials and/or tissue engineering scaffolds |
| SG184204A1 (en) * | 2010-03-23 | 2012-10-30 | Kuraray Co | Culture method for causing differentiation of pluripotent mammalian cells |
| JP2013226112A (en) * | 2011-07-12 | 2013-11-07 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | Hepatocyte culture method |
| JP5633880B2 (en) * | 2013-05-07 | 2014-12-03 | 国立大学法人東京工業大学 | Collagen molded body and method for producing the same |
| JP6240997B2 (en) * | 2013-08-13 | 2017-12-06 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Method for producing hydrogel film after vitrification, method for producing hydrogel material, hydrogel film after vitrification, dried hydrogel film after vitrification, and cell sheet |
| JP6432967B2 (en) * | 2014-05-12 | 2018-12-05 | 多木化学株式会社 | Soluble collagen fiber porous body |
-
2016
- 2016-02-23 JP JP2016031777A patent/JP6758616B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017147951A (en) | 2017-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6758616B2 (en) | Cell culture method and culture tissue | |
| López-Marcial et al. | Agarose-based hydrogels as suitable bioprinting materials for tissue engineering | |
| You et al. | 3D printing of porous cell-laden hydrogel constructs for potential applications in cartilage tissue engineering | |
| CN107007883B (en) | Cartilage repair support and preparation method thereof | |
| CN106397819B (en) | A kind of hydrogel and preparation method thereof for the growth of regulating cell three-dimensional micro-patterning | |
| CN102481389A (en) | Three-dimensional nanostructured hybrid scaffold and manufacture thereof | |
| Parke-Houben et al. | Interpenetrating polymer network hydrogel scaffolds for artificial cornea periphery | |
| US20140271454A1 (en) | Cell-synthesized particles | |
| US20180280576A1 (en) | Method for producing sheet-like cell structure and sheet-like cell structure | |
| JP6240997B2 (en) | Method for producing hydrogel film after vitrification, method for producing hydrogel material, hydrogel film after vitrification, dried hydrogel film after vitrification, and cell sheet | |
| Baptista et al. | Silk fibroin photo-lyogels containing microchannels as a biomaterial platform for in situ tissue engineering | |
| JPWO2019064807A1 (en) | Method for producing collagen vitrigel and purified product thereof, collagen vitrigel obtained by the method and purified product thereof | |
| CA2874527C (en) | Collagenous foam materials | |
| JP6730044B2 (en) | Surface processed collagen molding | |
| Forgacs et al. | Biofabrication: micro-and nano-fabrication, printing, patterning and assemblies | |
| Sun et al. | Scaffold with orientated microtubule structure containing polylysine-heparin sodium nanoparticles for the controlled release of TGF-β1 in cartilage tissue engineering | |
| KR101909328B1 (en) | Tissue regeneration construct, and method for producing tissue regeneration construct | |
| Midha et al. | Silk-based bioinks for 3D bioprinting | |
| JP7203376B2 (en) | Cross-linked fibrous collagen gel for oral mucosal epithelial cell culture | |
| RU2772734C2 (en) | Method for obtaining bioink that provides a high level of porosity in tissue engineeried structures | |
| RU2822238C1 (en) | Graft-tissue-engineered perichondrium for cartilage restoration of subject | |
| RU2819701C1 (en) | Hydrogel biocomposite based on bacterial polysaccharides for use in tissue engineering | |
| US20240335594A1 (en) | Method for consolidating an alginate/gelatin hydrogel | |
| Teixeira et al. | Evaluation of BMSCs response to PLA Scaffolds produced by FDM and Coating with Dopamine and Collagen | |
| Rosellini et al. | Engineering of multifunctional scaffolds for myocardial repair through nanofunctionalization and microfabrication of novel polymeric biomaterials |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190123 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20190123 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190123 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20191018 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191029 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191118 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200407 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200423 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200811 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200819 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6758616 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |