JP6404034B2 - 核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソーム及びその製造方法。 - Google Patents
核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソーム及びその製造方法。 Download PDFInfo
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Description
(A)中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質
(B)核酸
(C)カルシウム塩、及び
(D)炭素数1〜4の低級アルコール
を含む水又は緩衝液を撹拌する工程を含む、製造方法。
本発明に係る中性又はアニオン性リポソームは、核酸を内封する。内封とは、リポソーム内部に核酸分子の一部さえ存在していればよく、核酸分子全体がリポソーム内部に存在していなくともよい。すなわち、核酸分子がリポソームを構成する脂質二重膜に貫通した態様も、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームに包含される。ただし、静電相互作用等によってリポソーム表面において核酸が結合している態様は、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームには包含されない。
上述の本発明に係る中性又はカチオン性リポソームの製造方法は、
(A)中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質
(B)核酸
(C)カルシウム塩、及び
(D)炭素数1〜4の低級アルコール
を含む水又は緩衝液を撹拌する工程を含む。
本発明に係る複合体は、上述の本発明に係る中性又はアニオン性リポソームとバイオナノカプセルを含む。
本発明に係る医薬組成物は、上述の中性若しくはアニオン性リポソーム、又は上述の複合体を含む。医薬組成物中の中性又はアニオン性リポソームの含有量は、特に限定はされないが、通常は医薬組成物100重量部あたり、0.001〜100重量部程度とすればよい。すなわち、本発明に係る中性又はアニオン性リポソームそのものを本発明に係る医薬組成物としてもよい。
核酸を内封するリポソーム作製の従来法
〔リポソームの調製〕
ナスフラスコ内で以下に示す任意の脂質を所望のモル比で混合し、クロロホルム:メタノール=2:1の混合溶媒に溶解させた。次いでこれを真空減圧して溶媒を除去し、脂質フィルムを形成させた。ここに、超純水又は10mMのTris−HClバッファーを加えてバッファー中にてリポソームを形成させた。得られたリポソームは適宜エクストルーダーを用いて所定の粒子径となるように調製した。
内封する核酸として、配列番号1〜4の何れかに示す塩基配列からなるsiRNAを必要に応じて組み合わせて用いた。なお、配列番号1及び2に示す塩基配列からなるsiRNAはホタル由来のルシフェラーゼの遺伝子の発現を抑制することを目的に設計された塩基配列を有するものであり、配列番号3及び4に示す塩基配列からなるsiRNAは、細胞への導入実験時にコントロールとして多用されるスクランブル配列を有するものである。
下記表1に示す脂質組成(組成比;mol比)及びInput(重量比;siRNA/リポソーム)でsiRNA内封リポソームを製造した。各種測定結果も表1に示す。
得られた核酸内封リポソームをアガロースゲル電気泳動法に供し、リポソーム内に核酸が封じ込められているかどうかを確認する実験を行った。
比較製造例1にて得られた、核酸を内封させた2種の脂質組成からなるリポソームを上述の(比較試験例1)におけるTriton X−100処理に代えて、血清(FBS)処理に供し、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解に耐えるかどうかを確認する実験を行った。血清処理は、50%FBS中で30分、37℃での処理とした。斯かる処理後のサンプルを(比較試験例1)と同様にアガロースゲル電気移動法に供した。また、コントロールとして、核酸そのもの(封入に用いたsiRNAそのもの)を用いた。結果を図2に示す。
上述の比較製造例1と同様の方法で、各種脂質組成のリポソームに核酸を内包させる実験を行った。Inputは、全て重量比でsiRNA/リポソーム=10/100とした。下記表2に表1と同様に脂質組成(組成比はモル比)、対脂質核酸量、粒子径、及び電荷と共に、相転移温度(℃)を示す。なお、相転移温度が高いと、リポソームの性状が硬くなる傾向であることが知られている。なお、siRNAは比較製造例1と同じものを用いた。
本発明の核酸を内封するリポソームの製造方法
本発明では、上述の<比較例>にて示す2段階の製造例とは異なる方法で、核酸を内封するリポソームを製造した。
下記表3に示す脂質組成(組成比はmol比)及びInput(重量比;siRNA/リポソーム)でsiRNA内封リポソームを製造した。各種測定結果も表3に示す。
Claims (14)
- 核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームであって、該核酸の内封量が中性又はアニオン性リポソームの総脂質量100重量部に対して2重量部以上である、リポソームであって、前記中性又はアニオン性リポソームの相転移温度が、35℃以上である、リポソーム。
- 核酸の内封量が、中性又はアニオン性リポソームの総脂質量100重量部に対して15重量部以上である、請求項1に記載のリポソーム。
- 中性又はアニオン性リポソームの平均粒子径が、50〜1000nmである、請求項1又は2に記載のリポソーム。
- 中性又はアニオン性リポソームのZ電位が、−80〜0mVである、請求項1〜3の何れか1項に記載のリポソーム。
- 核酸の塩基長が、20nt以上である、請求項1〜4の何れか1項に記載のリポソーム。
- 核酸が、DNA、RNA、又は核酸アナログである、請求項1〜5の何れか1項に記載のリポソーム。
- 核酸アナログが、GNA、LNA、PNA、TNA、及びモルホリノからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項6に記載のリポソーム。
- 請求項1〜7の何れか1項に記載のリポソームが、ポリアルキレングリコールにより表面修飾されてなるリポソーム。
- 請求項1〜8の何れか1項に記載のリポソーム及びバイオナノカプセルを含む複合体。
- バイオナノカプセルが、脂質及び自己組織化能を有するタンパク質を含む、請求項9に記載の複合体。
- バイオナノカプセルが、組織特異的結合分子を有する、請求項9又は10に記載の複合体。
- 自己組織化能を有するタンパク質が、B型肝炎表面抗原タンパク質である、請求項9〜11の何れか1項に記載の複合体。
- 請求項1〜7の何れか1項に記載の中性又はアニオン性リポソーム、又は請求項9〜12の何れか1項に記載の複合体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜7の何れか1項に記載の核酸を内封してなる中性又はアニオン性リポソームの製造方法であって、
(A)中性又はアニオン性リポソームを構成する脂質
(B)核酸
(C)カルシウム塩、及び
(D)炭素数1〜4の低級アルコール
を含む水又は緩衝液
を同時に撹拌する工程を含む、製造方法。
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