JP6367172B2 - クロマトグラフカラムに充填する方法 - Google Patents

Description

本開示は、クロマトグラフカラム及びクロマトグラフカラムに充填する方法に関する。より詳細には、本開示は、クロマトグラフカラムに均一に充填するための改善された方法に関する。

クロマトグラフィーは、一般に、混合物から化合物を分離するために使用され得る。例えば、液体クロマトグラフィーにおいては、クロマトグラフィーは、カラムの固定相の中の固体粒子とそのカラムの中を通過させる液相の間で異なる分布を有する化合物に依存する。クロマトグラフィーを理想的に使用するためには、カラムに充填する材料は、分離を行うためのむらのない経路長をもたらすために均一に充填される必要がある。特定の化合物の、カラムを通過する移動相に対する親和力と比較した、カラム充填材に対する親和力が、当該化合物がそのカラム内部に滞留する期間を決定する。該化合物は、カラムからでた後、個々に検出され得る(例えば、分析用液体クロマトグラフィー)、又は、個々に収集され得る(例えば、分取液体クロマトグラフィー)。クロマトグラフ分離を効率的に実施するためには、カラム充填材は分離された化合物の再混合の原因となるであろう間隙(gap)又は狭隙(crack)を有さずに当該カラム中に均一に分散されなければならない。

直径が2μmよりも小さな粒子を使用することにより、クロマトグラフ分離の性能が改善された(J. Chromatog. 1127: 60-69, 2006)。2μmより小さな粒子のクロマトグラフ性能に対する重要な制限は、均一な充填を達成することが困難なことである；充填されたカラムは、充填時に半径方向の不均一性を示し、これが性能を低下させる。この効果は、渦拡散と呼ばれる。例えば、シリカ粒子が充填された内径(i.d.)が100μmのカラムは、渦拡散に起因して、長さが規格化されたピーク分散(length-normalized peak variance)(一般的に、理論段相当高さ(height equivalent to a theoretical plate)と称される)に対して1.0μmの寄与を示す(Anal. Chem. 76: 5777-5786, 2004)。シリカ粒子を均一に充填することが可能であれば、即ち、半径方向に均一に充填することが可能であれば、粒子の寸法が低減されるにつれて、分離性能は改善され続けるということが期待されるであろう。そのような改善は、特に、タンパク質とペプチドの分離に関して、有益であろう。ここで、タンパク質とペプチドの分離においては、何千もの成分からなる混合物を分離すること、1種類のタンパク質の極めて類似したイソ型を分割すること、又は、治療効果を有するモノクローナル抗体の純度を測定することが求められる。充填におけるこの改善は、上記分離及び別の分離に関して、1μm未満の粒子を商業的に使用することを可能にするであろう。シリカ粒子は、狭い粒度分布を有する1μm未満の非多孔性シリカ粒子を用いることによって、毛細管の中に実質的な結晶秩序(crystalline order)で首尾良く充填されてきた(Langmuir 20: 2033-2035, 2004)。この方法を制限しているのは、一般に間隙が存在していてそこで当該物質が毛細管壁に接触し、それによって、性能における改善が失われてしまうこと、及び、充填手順に何日もかかるということである。

J. Chromatog. 1127: 60-69, 2006 Anal. Chem. 76: 5777-5786, 2004 Langmuir 20: 2033-2035, 2004

クロマトグラフカラムに充填する方法が提供され、ここで、該方法は、
(a) クロマトグラフカラムの中に充填材を導入する工程；
(b) そのクロマトグラフカラムを超音波処理に付す工程；及び、
(c) 該充填材に圧力を加える工程；
を含み、ここで、工程(a)〜工程(c)は同時に実施され、渦拡散項が1μm未満である充填されたクロマトグラフカラムが形成される。

さらにまた、開示されている方法で調製された充填されたカラムも提供され、ここで、該カラムは、均一に充填されたクロマトグラフィー材料(ここで、該クロマトグラフィー材料は、狭隙を示さず、カラムの内面とクロマトグラフィー材料の間が連続的に接触しており、且つ、渦拡散項が1μm未満である)を含んでいる。

シリカ粒子が充填されたカラムを示す図である。 重力によって250nmシリカ粒子が充填された石英ガラス毛細管(内径100μm)の光学顕微鏡写真を示す図である。 充填されたキャピラリーカラムの断面を示している走査電子顕微鏡写真を示す図である。充填材と毛細管壁の間に間隙を認めることができる。 重力によって500nm粒子が充填されたクロマトグラフカラムの光学顕微鏡写真を示す図である。この図には、別の一般的な問題(カラムの軸に沿った狭隙)が示されている。 カラムに超音波処理を施しながらクロマトグラフカラムに充填するための構成を表しているダイアグラムを示す図である。 超音波処理と圧力を用いて150nmシリカ粒子が充填された石英ガラス毛細管(内径100μm)の光学顕微鏡写真(倍率2700倍)を示す図である。充填材の中に、又は、カラム壁と充填材の間に、間隙も狭隙も認められない。 表面がポリアクリルアミド層で修飾されている700nmシリカ粒子が充填された長さ3cmで内径75μmの毛細管の中の1cmの距離にわたる前立腺特異抗原の糖型の高速等電点電気泳動法分離(rapid isoelectric focusing separation)を示す図である。 隣接する複数のピーク内で1つのマンノース基のみによって互いに異なっているリボヌクレアーゼB糖型のUHPLC分離を示す図である。分離は、表面がポリアクリルアミド基によって修飾された700nm粒子が充填されている長さ2cmで内径2.1mmのステンレス鋼カラムを用いて実施した。 長さ2cmで内径75μmの充填された石英ガラス毛細管を用いたモノクローナル抗体(抗PSA)のUHPLC分離を示す図である。該カラムには、粒子の表面上にn-ブチル基の単層を形成するように反応させた500nm非多孔性シリカ粒子を、超音波処理と圧力を同時に使用して充填した。「A」本来の抗体；「B」酸化された抗体。本来の抗体は、600nmのみの理論段高さを示し、100nm未満の渦拡散による寄与が認められる。

クロマトグラフカラムの改善された充填方法が開発され、ここで、該カラムは、著しく改善されたカラム性能及びクロマトグラフ分離を提供する。これらの方法は、一般的なタイプのクロマトグラフカラム(これは、限定するものではないが、キャピラリーカラム、ガラスカラム及びステンレス鋼カラムを包含する)のいずれにも適用可能である。これらの方法を用いれば、重力充填法(gravity packing technique)を用いた場合よりも極めて速やかにカラムを調製することが可能であり、及び、カラムは、重力充填カラム(gravity packed column)及びスラリー充填カラム(slurry packed column)と比較して半径方向に均一な粒子充填を示す。

理想的に充填されたカラムが、図１に例示されている。この実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、100nm〜2μmの直径を有するシリカ粒子で作られており、それらは、カラム内に均一に且つきつく充填されている。そのような理想的なカラムは、科学文献に記載されているが、調製するのに数日必要である。伝統的な充填方法では、長い調製時間に加えて、欠陥率が高い - 殆どのカラムに欠陥がある。欠陥としては、慣習的な方法を用いて重力下で充填された図２、図３及び図４のカラムの中に見られるような、充填材とカラム壁の間の間隙及び充填材料中の狭隙などがある。

間隙は、粒子間の力が極めて強い場合に生じて、カラム性能に悪影響を与え、サンプル中の化合物の許容される分離を妨げる。間隙は、図２及び図３に例示されている。カラムクロマトグラフィー及び電気泳動においては、充填物とカラム壁の間の間隙は、カラムの外側に抵抗性の低い経路を作り出し、この抵抗性の低い経路が分離を台無しにし得る。それは、カラム壁に沿って移動する検体がカラムの中心を通って移動する同じタイプの検体と異なった時間に検出器に達するからである。間隙は、さらにまた、サンプル物質をカラムから抜け出させ得るが、これは、カラムの突発故障を引き起こす。図４に示されているように、充填材料の中に狭隙も生じ得る。狭隙は、クロマトグラフピークの一部分をカラムを通して近道させ、それによって、壊滅的に区間が拡大する。

狭隙及び間隙は、重力によって極めてゆっくりと数日間掛けて充填することによって、低減させることができるか、場合によっては、なくすことができる。しかしながら、上記方法は、分離媒体の均一な充填をもたらし、間隙及び狭隙を防止し、並びに、数日の代わりに1時間未満で使用に適した充填カラムを製造することができる。

クロマトグラフカラムの改善された充填のための構成が図５に図示されている。一般に、当該カラムは、超音波処理浴の中に配置し、シリカ粒子のスラリーを貯蔵容器から加圧下でカラムの中にポンプで注入しながら超音波処理下で充填する。貯蔵容器は、ポンプの前又は後であり得るが、好ましくは、後に置く。ポンプを制御する機器は、流量を計って圧力を知らせることができるか、又は、圧力を計って流量を知らせることができる。超音波処理と圧力のこの組合せによって、クロマトグラフ媒体の均一な充填が可能となり、及び、充填されたカラム内の半径方向の均一性がもたらされる。本発明者らは、330nm〜900nmの範囲のさまざまな直径を有する非多孔性シリカ粒子に関して、充填を実証した。しかしながら、該方法は、超音波処理に対して反応を示す任意の粒径(即ち、100nm〜2μm)に適用することができる。

本発明の方法の一実施形態では、貯蔵容器は、カラムを満たすのに必要な重量の粒子で満たされており、カラム充填中に、流量を制御し且つ圧力をモニターしながら、超音波処理と圧力を同時に加える。流れスプリッターを使用し且つ充填されるカラムの数に比例して貯蔵容器中の充填材の量を増やすことによって、この方法で複数のカラムを同時に充填することができる。充填が進むにつれて圧力の示度は着実に上昇する。圧力が安定して一定の値に達したら、ポンプを停止する。内容物を上方へ押し上げる逆方向の圧力を防止するために、圧力が消失するまでカラムはポンプに連結されたままにしておく。典型的な担体溶媒は、疎水性単層で被覆されている粒子の場合には、70体積%のn-ヘキサンと30体積%のイソプロパノールを含むものであり、親水性単層で被覆されている粒子の場合には、水を含むものである。

カラム充填中に圧力と超音波処理を加えることによって、図６に示されているように、間隙及び狭隙が回避され、使用に適したカラムを製造するのに必要とされる期間が劇的に低減される。例えば、カラム長が2cmの場合、充填は15分以内で達成可能であり、5cmよりも長いカラムの場合、充填は1時間以内で達成可能である。別の状況、例えば、より粘性が高い担体液体及びさらに長いカラムを使用する状況においては、充填は6時間以内で達成可能である。圧力と超音波処理を加えて充填されたカラムは、渦拡散値が1μm未満であって、半径方向の均一性を示し、それによって、充填されたカラムの性能は増強されている。

カラム充填中に充分な圧力を与えるために、ポンプは、粒子を高密度に充填するのに充分な圧力を出さなくてはならない。UHPLCカラムの充填において広く使用されている同じ型のポンプが適している。例えば、Thermo Acela UHPLC クロマトグラフポンプ(これは、1分間当たり0.5mLの流量に設定した場合、900nmのシリカ粒子を充填するときに650バールの圧力で安定化する)を使用することができる。該圧力は、最大指定圧力(例えば、1000バール)まで上昇するようにプログラムすることができる。妥当な期間内で充填するためには、200バールの圧力が最低限であり、超音波処理との併用でのカラム充填に適した圧力には、明らかな上限は存在しない。好ましい実施形態では、600バール又は650バールの圧力が、到達最高圧力である。Lab Alliance 1500 ポンプでは、変動するように又は固定されるように圧力を設定することができる。900nmよりも小さな粒子の場合、充填中に圧力が徐々に上昇して、圧力がいったん650バールに達したらその圧力が一定に維持され、そして、流量が徐々に低減されるように、最高圧力(例えば、650バール)を設定するのが好ましい。流量がひとたび一定値に達したら、そのカラムは、充填されたものと考えられる。不必要に高い圧力(従って、最高圧力の設定値)は、漏出の可能性を上昇させる。

超音波処理(ultrasonication)(これは、高周波処理とも称される)は、充填材粒子をばらばらにすることによって、加えられた圧力の充填効果に対抗する。結果として、粒子は、高密度に充填されるのみではなく、一定の間隔を空けて均一に配置される。カラムに充填するためには、任意の適切な超音波処理器を使用することができる。市販されている適切な超音波処理器は、一連の大きさのものが提供されており、一般に、20kHz又は10kHzで、10〜300ワットで作動する。例えば、適切な超音波処理器は、「VWR B2500A MT」であり、これは、通常、実験室内で、ガラス器具及び実験器具を清浄にするために使用される。現在市販されている適切な別の超音波処理器としては、以下のものなどがある：Bandelin Ultrasonicator、Mettler Sonicator Ultrasound 730、及び、Fisher FS5, L&R bath sonicator。

充填対象のカラムは、任意の適切なクロマトグラフカラムであることができ、ここで、そのようなクロマトグラフカラムとしては、限定するものではないが、石英ガラスクロマトグラフィーカラム、ガラスクロマトグラフィーカラム、セラミッククロマトグラフィーカラム、ステンレス鋼クロマトグラフィーカラム、アルミニウムクロマトグラフィーカラム、PEEKクロマトグラフィーカラム、アクリルクロマトグラフィーカラム、又は、ポリスチレンクロマトグラフィーカラムなどを挙げることができる。カラムの内径はさまざまであることができ、カラムの所望される用途に応じて一連の直径が適している。例えば、該カラムは、10μm〜1メートル(好ましくは、25μm〜5cm)の範囲の内径を有し得る。石英ガラスキャピラリーカラムは、10μm〜500μmの範囲の内径を有する。充填材は、任意の適切なクロマトグラフ分離材料であることができ、ここで、そのようなクロマトグラフ分離材料としては、限定するものではないが、シリカ粒子、シランで処理されたシリカ粒子、ポリスチレン粒子、非多孔性シリカ粒子、多孔性シリカ粒子、及び、コアシェルシリカ粒子などを挙げることができる。該粒子は、球形であり得るか、又は、不規則な形状であり得る。

クロマトグラフの用途としては、小分子、ペプチド、糖及び多糖、グリカン、モノクローナル抗体、タンパク質及び別の高分子化合物並びにそれらの組合せを分離するための、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、潅流クロマトグラフィー、及び、逆相液体クロマトグラフィーなどがある。該カラムは、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー(UHPLC)、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)及び限外瀘過に適しており、そして、電気泳動法、等電点電気泳動法及びキャピラリー電気クロマトグラフィーによって化合物を分離するために使用することもできる。分離材料の選択は、カラムの使用目的及びサンプルのサイズに依存する。分離材料の粒子は、100nm〜10μm、好ましくは、300nm〜2μm、最も好ましくは、300nm〜900nmの範囲の寸法を有し得る。

慣習的なカラム充填方法についての概説は、「J. Sep. Sci. 27： 1475-1482, 2004」の中に見られる。カラムの慣習的な充填は、担体溶媒中に粒子をスラリーとして懸濁させるために超音波処理を使用し得るが、充填中は圧力のみが使用される(Anal. Chem. 60： 1662-1665, 1988)。本明細書中に記載されているような充填中のカラム全体の超音波処理については、1μm未満の粒子又は液体担体に関してはこれまで報告されていない。

実施例
下記実施例において使用されている充填材は、「Fiberoptic Center, Inc.」(AngstromSphere Silica Spheres, #SIOP025-01、#SIOP050-01、及び、#SIOP0100-01)及び「Nanogiant, LLC」から入手した。広範囲のクロマトグラフ充填材が市販されており、また、当技術分野において知られている。化学修飾としては、限定するものではないが、炭化水素単層、アニオン交換基及びカチオン交換基、極性基、及び、親水性相互作用相などがある。

実施例１： 超音波処理及び圧力を用いて調製されたシリカキャピラリーカラム
100μmの内径及び2cmの長さを有する石英ガラスキャピラリーカラムに150nmシリカ粒子を充填した。Thermo Scientific Accelaポンプ及びVWR超音波処理器を用いて、圧力及び超音波処理を同時に加えた。この方法で調製されたカラムの光学顕微鏡写真が、図６に示されている。小さな粒径によって当該毛細管は半透明になり、それによって、充填された毛細管の全体積の目視検査が可能である。毛細管壁とシリカ粒子の間に間隙は観察されず、また、充填された材料の中に狭隙は観察されない。

900nmの粒子を用いた以外は同じ方法で充填された3cm長の毛細管も、目に見える間隙又は狭隙は認められなかった。該キャピラリーカラムは、最初に、図７に示されているように、電荷を保存する染料で標識された前立腺特異抗原(PSA)の糖型の等電点電気泳動法に使用した。これらの結果は、改善された充填方法が新しい癌バイオマーカーの発見の助けとなり得ることを示している。

実施例２： 重力による圧力の下で充填されたキャピラリーカラム
100μmの内径及び2cmの長さを有する石英ガラスキャピラリーカラムに、3日間かけて、重力充填を用いて直径250nmのシリカ粒子を充填した。図２に示されているように、該カラムは、シリカと毛細管壁の間に間隙を示している。この方法で調製された毛細管の典型的な走査電子顕微鏡写真は、図３に示されているように、毛細管壁と充填材の間に間隙を示している。

実施例３： 超音波処理及び圧力を同時に用いて充填されたステンレス鋼カラム
長さ2cmで内径2.1mmのカラムを管を介して貯蔵容器に連結し、その空のカラムを超音波浴(VWR B2500A MT)の中に浸した。ポリアクリルアミドの層を有している750nmシリカ粒子の水の中のスラリーをカラムに充填する前に貯蔵容器の中に入れた。Lab Allianceポンプを用いて該スラリーをカラムの中に押し入れ、600バールの圧力下でクロマトグラフィー材料を充填した。カラムには35分間充填した。そのカラムを用いて、リボヌクレアーゼBの糖型(これは、1つのマンノース基のみによって互いに異なっている)を分離した。これらの結果は、図８に示されている。分離は、親水性相互作用クロマトグラフィーによって達成され、その性能は、分離度によって示されているように、市販されているカラムを用いて認められる性能を超えていた。

実施例４： 超音波処理及び圧力を用いて充填されたキャピラリーカラム
超音波処理と圧力を同時に用いて、長さ2cmで内径75μmの毛細管にブチル単層を有している500nm粒子を充填した。図９に示されているように、(A)PSAに対するモノクローナル抗体と(B)酸化された抗体の逆相無勾配UHPLCに関する極めてシャープなピークが得られた。理論段相当高さ(これは、単離されたピークに対して最もよく測定することが可能である)は、部分A内のピークに対して、600nmであると計算され、このカラムについての渦拡散項は100nm未満である。
以下は、本発明の実施形態の一つである。
（１）クロマトグラフカラムに充填する方法であって、
(a) クロマトグラフカラムの中に充填材を導入する工程；
(b) 該クロマトグラフカラムを超音波処理に付す工程；及び、
(c) 該充填材に圧力を加える工程；
を含み、ここで、工程(a)〜工程(c)は同時に実施され、渦拡散項が1μm未満である充填されたクロマトグラフカラムが形成される、前記方法。
（２）前記充填材がシリカ粒子を含んでいる、（１)に記載の方法。
（３）前記シリカ粒子の全て又は少なくとも一部分が約100nm〜2μmの直径範囲を有している、（２）に記載の方法。
（４）前記シリカ粒子が約150nm〜1μmの直径範囲を有している、（３）に記載の方法。
（５）前記充填材が、非多孔性シリカ粒子、多孔性シリカ粒子、コアシェルシリカ粒子、非多孔性ポリスチレン粒子又はそれらの組合せを含んでいる、（１）に記載の方法。
（６）前記クロマトグラフカラムが、石英ガラス、ガラス、セラミック、ステンレス鋼、アルミニウム、PEEK、アクリル又はポリスチレンを含んでいる、（１）に記載の方法。
（７）前記クロマトグラフカラムが石英ガラスを含んでいる、（６）に記載の方法。
（８）前記クロマトグラフカラムがガラスを含んでいる、（６）に記載の方法。
（９）前記クロマトグラフカラムがステンレス鋼を含んでいる、（６）に記載の方法。
（１０）前記クロマトグラフカラムが10μm〜1メートルの範囲内の内径を有している、（１）に記載の方法。
（１１）前記クロマトグラフカラムが10μm〜1cmの範囲内の内径を有している、（１０）に記載の方法。
（１２）複数のカラムに同時に充填する、（１）に記載の方法。
（１３）前記カラムが6時間以内で充填される、（１）に記載の方法。
（１４）前記カラムが1時間以内で充填される、（１３）に記載の方法。
（１５）前記充填材が100nm〜1μmの直径を有する非多孔性シリカ粒子を含んでいる、（５）に記載の方法。
（１６）前記圧力が約200バール〜約1,000バールの範囲内で加えられる、（１）に記載の方法。
（１７）均一に充填されたクロマトグラフィー材料を含み、該クロマトグラフィー材料は、狭隙を示さず、カラムの内面とクロマトグラフィー材料の間が連続的に接触しており、且つ、渦拡散項が1μm未満である、（１）の方法で調製された充填されたカラム。
（１８）内径約25μm及び長さ約10cmを有するガラスキャピラリーカラム並びに直径が100nm〜2μmの範囲内にあるシリカクロマトグラフィー粒子を含み、タンパク質を分離するのに適している、（１７）に記載の充填されたカラム。
（１９）内径約2.1mm及び長さ約5cmを有するステンレス鋼カラム並びに直径750nmのシリカクロマトグラフィー粒子を含み、UHPLCによってタンパク質を分離するのに適している、（１７）に記載の充填されたカラム。
（２０）内径約75μm及び長さ約5cmを有する石英ガラスキャピラリーカラム並びに直径750nmのシリカクロマトグラフィー粒子を含み、タンパク質の等電点電気泳動法に適している、（１７）に記載の充填されたカラム。
（２１）内径約75μm及び長さ約5cmを有する石英ガラスキャピラリーカラム並びに直径750nmのシリカクロマトグラフィー粒子を含み、タンパク質とペプチドの親水性相互作用クロマトグラフィーに適している、（１７）に記載の充填されたカラム。
（２２）内径約75μm及び長さ約5cmを有する石英ガラスキャピラリーカラム並びに直径750nmのシリカクロマトグラフィー粒子を含み、タンパク質とペプチドの逆相クロマトグラフィーに適している、（１７）に記載の充填されたカラム。

Claims (13)

1. シリカ粒子を含むクロマトグラフカラムを充填する方法であって、
   (a) クロマトグラフカラムの中にシリカ粒子を導入する工程であって、クロマトグラフカラムが長さ2〜10cm及び内径25μm〜5cmを有し、シリカ粒子が100nm〜900nmの直径を有している工程；
   (b) 該クロマトグラフカラムを超音波処理に付す工程；及び、
   (c) シリカ粒子に圧力を加える工程；
   を含み、ここで、工程(a)〜工程(c)は同時に実施され、渦拡散項が1μm未満である充填されたクロマトグラフカラムが形成され、
   シリカ粒子が均一に充填され、狭隙を示さず、又は、カラムの内面とシリカ粒子の間が連続的に接触しており、
   充填されたカラムが、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー(UHPLC)又は高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)に適する、前記方法。
2. 前記カラムが、ステンレス鋼クロマトグラフカラム、石英ガラスクロマトグラフカラム又はPEEKクロマトグラフカラムである、請求項１に記載の方法。
3. 前記カラムが、3〜5cmの長さを有している、請求項１に記載の方法。
4. 前記カラムが、75μm〜5cmの内径を有している、請求項１に記載の方法。
5. 前記カラムが、2.1 mmの内径を有している、請求項１に記載の方法。
6. 前記シリカ粒子が150nm〜900nmの直径を有している、請求項１に記載の方法。
7. 前記シリカ粒子が300nm〜900nmの直径を有している、請求項１に記載の方法。
8. 充填されたカラムが、内径25μm及び長さ10cmを有するガラスキャピラリーカラムであり、シリカ粒子が100nm〜900nmの直径を有し、充填されたカラムが、タンパク質を分離するのに適している、請求項１に記載の方法。
9. 充填されたカラムが、内径75μm及び長さ5cmを有する石英ガラスキャピラリーカラムであり、シリカ粒子が750nmの直径を有し、充填されたカラムが、タンパク質の等電点電気泳動法に適している、請求項１に記載の方法。
10. 充填されたカラムが、内径75μm及び長さ5cmを有する石英ガラスキャピラリーカラムであり、シリカ粒子が750nmの直径を有し、充填されたカラムが、タンパク質とペプチドの親水性相互作用クロマトグラフィーに適している、請求項１に記載の方法。
11. 充填されたカラムが、内径75μm及び長さ5cmを有する石英ガラスキャピラリーカラムであり、シリカ粒子が750nmの直径を有し、充填されたカラムが、タンパク質とペプチドの逆相クロマトグラフィーに適している、請求項１に記載の方法。
12. 100nm〜150nmの直径を有しているシリカ粒子を含むクロマトグラフカラムを充填する方法であって、
    (a) カラムの中にシリカ粒子を導入する工程；
    (b) 該カラムを超音波処理に付す工程；及び、
    (c) シリカ粒子に圧力を加える工程；
    を含み、ここで、工程(a)〜工程(c)は同時に実施され、渦拡散項が1μm未満である充填されたクロマトグラフカラムが形成され、
    シリカ粒子が均一に充填され、狭隙を示さず、又は、カラムの内面とシリカ粒子の間が連続的に接触しており、
    充填されたカラムが、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー(UHPLC)又は高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)に適する、前記方法。
13. 100nm〜900nmの直径を有しているシリカ粒子を含むクロマトグラフカラムを充填する方法であって、
    (a) カラムの中にシリカ粒子を導入する工程；
    (b) 該カラムを超音波処理に付す工程；及び、
    (c) シリカ粒子に圧力を加える工程；
    を含み、ここで、工程(a)〜工程(c)は同時に実施され、渦拡散項が100 nm未満である充填されたクロマトグラフカラムが形成され、
    シリカ粒子が均一に充填され、狭隙を示さず、又は、カラムの内面とシリカ粒子の間が連続的に接触しており、
    充填されたカラムが、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー(UHPLC)又は高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)に適する、前記方法。

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