JP6364351B2 - 大規模な商業的レンチウィルスベクターの生産システム及びそれにより生産されるベクター - Google Patents
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Description
「融合プロテイン」という用語は、互いにリンクしあった二以上のプロテインから構成される分子を指す。典型的には、融合プロテインは二以上のプロテイン配列を含むアミノ酸配列である。
細胞工場内のEnd Of Production(EOP)細胞がトリプシン化され、集められ、数えられる。もしバイアビリティが>65%であれば、1x107の細胞がある4つバイアルを引き続くQCテストのため、液体窒素の中で凍結させる。残りの細胞は<−60℃で分割され保管される。EOP細胞が、バイアビリティとして<65%を示している場合、細胞はT175フラスコ中で培養され、概ね3日後に凍結保存される。
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Claims (17)
- 治療上有益な導入遺伝子を含んでなる高収率な組換えレンチウィルス(rLV)を生産する方法であって、前記方法は、
a) リン酸カルシウムとrLVの生産に必要な成分をコードするプラスミドとを制御された速度で混合することによって複合体を形成し、次いで、培地中で前記複合体をホスト細胞に加えることによって前記ホスト細胞をトランスフェクトするステップと、
b) 前記ステップ(a)でトランスフェクトしたホスト細胞を培地中で一定時間インキュベートしてrLV粒子培地を生産し、次いで、前記トランスフェクションから32時間後にrLVウィルス粒子培地を回収して新しい培地に交換し、次いで、前記トランスフェクションから48時間後にrLVウィルス粒子培地を回収することによって、最大60時間以内の時間にrLV粒子を含む培地を少なくとも2回にわたって回収し、回収したrLV粒子培地を冷蔵保管ユニットに置くことによってウィルスの不活性化を減少させるステップと、
c) タンジェンシャルフロー濾過により、前記ステップ(b)から回収した培地中の前記ウイルス粒子を濃縮するステップと、
d) 核酸のコンタミネーションを減少させるエンザイムにより前記ステップ(c)で得た濃縮されたrLV粒子を処理するステップと、
e) 前記rLVをさらに濃縮する目的で、d)の該処理された粒子を遠心分離し、界面活性剤を含む溶液中で遠心分離したrLVを再懸濁するステップと、
f) 前記e)の界面活性剤溶液中でさらに濃縮されたrLVをショ糖勾配上にレイヤリングし、次いで、そのrLVをさらに遠心分離し、それにより、治療上有益な導入遺伝子を含んでなる高収率のrLVを生産する方法。 - 前記ステップ(f)において生産されるrLVの収率が少なくとも3×108TU/ml以上であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(f)のrLVを製剤中に製薬的に許容されるキャリアと共に混合するステップをさらに備える、請求項1記載の方法。
- 前記導入遺伝子がsiRNA、アンチセンス分子、並びにmiRNAから成るグループより選択された核酸、リボザイム、及びshRNAで構成されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、
グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、黄体化ホルモン(LH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、アルファ型トランスフォーミング増殖因子(TGFα)、血小板由来細胞増殖因子(PDGF)、インスリン増殖因子I型及びII型(IGF−I及びIFG−II)、ベータ型トランスフォーミング増殖因子(TGFβ)、アクチビン、インヒビン、骨形成たんぱく質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT−3及びNT−4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−1並びにネトリン−2、肝細胞増殖因子(HGF)、エフェリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼから成るグループより選択される遺伝子産物をコードすることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 前記導入遺伝子が、
トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL−1〜IL17)、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α並びにβ、インターフェロンα、β並びにγ、幹細胞因子、flk−2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD並びにIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、一本鎖T細胞受容体、及びクラスI並びにクラスIIMHC分子
から成るグループより選択される遺伝子産物をコードすることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 前記導入遺伝子は先天性代謝異常を正すのに有用なプロテインをコードする核酸から構成され、
カルバモイル合成酵素I、オルニチン・トランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−1 アンチトリプシン、グルコース−6−ホスファターゼ、ポルホビリノゲン・デアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオニンβ−シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−CoAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H−タンパク質、T−タンパク質、膵嚢胞線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)配列及びジストロフィンcDNA配列から成るグループより選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 前記導入遺伝子が第VIII因子又は第IX因子をコードする核酸で構成されることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 前記リン酸カルシウムミックスがpH7.1であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(f)の遠心分離の後に前記rLVを回収するステップと、界面活性剤を含む溶液中に前記回収したrLVを任意に再懸濁するステップを含む請求項1記載の方法。
- 前記トランスフェクションから32時間後にrLVウィルス粒子培地を回収して新しい培地に交換し、次いで、前記トランスフェクションから52時間後、56時間後又は60時間後にrLVウィルス粒子培地を回収する、請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(f)において生産されるrLVの収率が1×108TU/ml以上である、請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(f)において生産されるrLVの収率が1×109TU/ml以上である、請求項1記載の方法。
- 前記ステップ(f)において生産されるrLVの収率が1×1010TU/ml以上である、請求項1記載の方法。
- 前記ホスト細胞が、イースト細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞で構成される、請求項1記載の方法。
- 前記ホスト細胞がHEK293T細胞で構成される、請求項1記載の方法。
- 前記トランスフェクションから32時間後及び48時間後の2回にわたって回収した後の前記ステップ(f)において生産されるrLVの収率は、前記トランスフェクションから48時間後に1回でrLVウィルス粒子培地を回収する場合と比較して3〜10倍である、請求項1記載の方法。
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