JP6364351B2 - 大規模な商業的レンチウィルスベクターの生産システム及びそれにより生産されるベクター - Google Patents

Description

本発明は、キャスリーン ハイ、ジョン フレイザー ライト、バーンド ホーク、ガン チによるものである。本出願は、２０１１年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／５６９，７６５号に基づく優先権を主張し、そのすべての内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、分子生物学と遺伝子治療の分野に関連する。より詳細には、本発明は、臨床用途に対し医学的に有益な産物をコードする導入遺伝子から成るレンチウィルスベクターを大きな商業的規模で生産に対して改善されたプロセスを提供することにある。この発明が関係する技術水準を記述する目的で、複数の刊行物および特許文献が本明細書を通じて引用される。これらの引用は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

ウィルスは、感染により自身の遺伝物質を効率的にターゲット細胞に導入し、自身の複製についてこのホスト細胞に従属する生物学的なエージェントである。ベクターは、自身が由来する野生型のウィルス遺伝子の代わりに、発現させたい遺伝子を有する。従って、複製しないベクターは細胞内で自己増殖に対する遺伝的な情報を欠いているが、ターゲットセルに対して発現させたい遺伝子を導入する能力を保持する。レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ， レンチウィルス属）に属するウィルス由来である。非分裂細胞とともに分裂細胞に対して自身の安定的な統合性や、長期にわたる導入遺伝子の発現性により、ＬＶは研究と遺伝治療の両方への応用に対して、最も実用的な遺伝子を運ぶビークルのひとつとなっている。ヒト免疫不全ウィルスタイプＩ型（ＨＩＶ−１）はおそらく最も研究されたレンチウィルスのひとつであり、最もよく知られたヒト病原性にもかかわらず、ＨＩＶ由来のベクターが分化細胞や非分裂細胞に対するユニークな遺伝子治療のソリューションを提供することが急速に明らかになった。（Ｐａｕｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９−４５９−４７４）

組換えレンチウィルス（ｒＬＶ）ベクターは癌治療での近年の成功とともに遺伝子治療ベクターとして用いられるようになってきており、大人数の人々、すなわち癌患者、がｒＬＶ遺伝子治療により恩恵を受けている。現時点でのｒＬＶの製造における決定的な、そして未解決な課題は、これらのベクターを用いて遺伝子治療で潜在的に恩恵を受けられうる数多くの人々を効果的に治療することが可能となる程度の大きな分量が必要であるという点と同様に、高い濃縮、典型的には＞３ｘ１０^８／ｍｌ、が必要であることにある。こういったことが可能な量のｒＬＶを得るための鍵となる課題は、細胞培養（「上流」）工程中に十分な量のｒＬＶを生産すること、及び、不安定であり素早く簡単に不活性化されてしまうベクターの損失と不活性化を発生させずに細胞培養において生産されたｒＬＶを高収率で精製し濃縮することにある。典型的には、多層の細胞工場内で培養され、細胞培養の培地に分泌された細胞からｒＬＶは生産される。ｒＬＶを生産するために実施される細胞培養が行われた後の培地内における標準的なｒＬＶの「粗製」力価は１ｘ１０^５〜１ｘ１０^６トランスデューシンユニット（ＴＵ）／ｍＬの範囲となる。最適化された方法を用いての粗製力価においては、１ｘ１０^６から１ｘ１０^７ＴＵ／ｍＬがターゲットとなる。ｒＬＶはエンベロープウィルスであり、それ故きわめて壊れやすく簡単に不活性化されるため、影響が小さく確かで素早い精製方法が望まれていた。

本発明によると、治療用たんぱく質又はその断片をコードする導入遺伝子を含むｒＬＶベクター粒子の収率を増加させる方法が開示される。ひとつの方法では、ｐＨ７．１で塩化カルシウムのトランスフェクションミックスであり、そこでは前記塩化カルシウムとプラスミドが一定の速さで細胞に付加された複合体を形成するものを使用することで、細胞がｒＬＶの生産に必要な構成をコードしたプラスミドでトランスフェクトされる。前記細胞は、適切な時間の間培養され、ウィルス粒子の培地は培養中に少なくとも二回集められ、冷蔵保管ユニットに保管されてウィルスの不活性化を減少させる。その後、ウィルス粒子はタンジェンシャルフロー濾過を通じて濃縮され、続いて核酸のコンタミネーションを効率的に減少させるエンザイムへの暴露がされる。このように処理された前記粒子は、遠心分離によってペレットされ、再懸濁工程での収率性と効率性を改善する目的で界面活性剤を含む溶液を使用して再懸濁される。結果物の溶液は適切な勾配でレイヤー化され、そして遠心分離されて、それにより、この工程を除去した方法と比べ、さらに増加した収率性でｒＬＶを濃縮する。好ましい実施形態では、組換えＬＶ粒子は、概ね３ｘ１０^８／ｍｌで生産される。製薬的に許容されるキャリアとして、上述した方法を使用して精製されたｒＬＶ粒子を含むｒＬＶベクター製剤は、本発明に包含される。

一の実施形態において、この方法は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡから構成されるグループから選択される核酸、リボザイム及びｓｈＲＮＡをコードする転移遺伝子を含むｒＬＶを生産するために使用される。他の実施形態において、この方法は、プロテイン、ホルモン、成長因子、レセプター、抗体、若しくはその断片を含むがこれらに限られるものではない治療用遺伝子産物を生産するために用いられる。好ましい実施形態では、前記遺伝子産物は第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子である。

３７℃でのｒＬＶベクターの安定性を示すグラフ。このデータは、細胞培養で、ｒＬＶの生産に使用される前記温度において組替えレンチウィルスベクターが急速に非活性化されることを示しており、それ故に活性ベクターの高収率での回収について、採取するタイミングを注意深く最適化する必要があることを示している。

最初の４８時間で生産されるトランスダクションユニットの量を示すグラフ。

高精製され及び高濃縮された感染ｒＬＶを得るために用いられる工程を表すフローチャート。

ｒＬＶの生産に用いられるプラスミドのマップ。但し、多くの異なる代替が技術者により利用される。これらのプラスミドはＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的なトランスフェクションを使用してｒＬＶロットの製造に用いられる。

本発明は現在の「産業標準」である大規模なｒＬＶベクターの精製プロセスから差別化された複数の特徴を含むｒＬＶベクターの製造方法を提供することにある。これらは、以下を含む。すなわち、より改善されたトランスフェクションのための技術と試薬，細胞培養の間に、生産されるｒＬＶを回収するための、より最適化された採取スケジュールであって、これにより、生産されたｒＬＶの不安定性が最小化される，及び工程中にｒＬＶの不活性化を最小化する、より効率的なｒＬＶトランスダクションユニットの精製，である。

ｒＬＶベクターの生産と精製方法の最適化は、ベクター産物がターゲット細胞にその遺伝的なペイロードを効率的に運ぶことを確保するとともに、有害な免疫反応が活性化する可能性を最小限のものとする。ヒトの病気を扱う製品として組換えｒＬＶを精製するための生産プロセス開発は以下の目的を達成しなければならない。１）首尾一貫したベクターの純粋性、効能、及び安全性，２）生産工程のスケーラビリティ，３）受け入れられる製造コスト、である。現在における「産業標準」の大規模なｒＬＶベクターの生産と精製プロセスは、最適なウィルスベクター力価を十分に獲得していない。

以下の定義は、本発明の実施が可能となるよう提供されるものである。

レンチウィルスはｂｏｖｉｎｅレンチウィルスグループ、ｅｑｕｉｎｅレンチウィルスグループ、ｆｅｌｉｎｅレンチウィルスグループ ｏｖｉｎｅｃａｐｒｉｎｅレンチウィルスグループ及び原始レンチウィルスグループのメンバーを含む。遺伝子治療用のレンチウィルスベクター開発はＫｌｉｍａｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４：４８１−４９６で検討されている。遺伝子治療に適したレンチウイルスベクターのデザインと使用は、例えば、２００１年３月２７日に発行された米国特許登録第６２０７４５５号、２０００年１２月２６日に発行された米国特許登録第６１６５７８２号に記述されている。付加的なシステムはＭｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１１）に開示されている。限定されるものではないが、レンチウィルスの例として、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型ウィルス、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、山羊関節炎・脳脊髄炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、馬伝染性貧血ウィルス及びウシ免疫不全ウィルスが含まれる。

「ｇａｇポリプロテイン」、「ｐｏｌポリプロテイン」及び「ｅｎｖポリプロテイン」という用語は、典型的には単一の前駆体ポリプロテインとして発現されるレトロウィルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子によってコードされている複数のプロテインを指す。例えば、ＨＩＶｇａｇは他のプロテインの中から、ｐ１７、ｐ２４、ｐ９及びｐ６をコードしている。ＨＩＶｐｏｌは、他のプロテインの中から、プロテアーゼ（ＰＲ）、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）及びインテグラーゼ（ＩＮ）をコードしている。ＨＩＶｅｎｖは、他のプロテインの中から、Ｖｐｕ、ｇｐ１２０及びｇｐ４１をコードしている。本明細書で使用されている「ポリプロテイン」という用語はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖポリプロテインの全て、又はその任意の一部を含む。

「Ｖｐｘ」及び「Ｖｐｒ」という用語は、それぞれレンチウィルスのＶｐｘ及びＶｐｒプロテインを指し、例えばＷＯ９６／０７７４１に記載されており、この記載は参照により全体として本明細書に組み込まれる。これらの用語は、ｐ６と関連する能力を保持するＶｐｒ並びにＶｐｘの変異体、相同体、ミュータント、及び断片も指す。
「融合プロテイン」という用語は、互いにリンクしあった二以上のプロテインから構成される分子を指す。典型的には、融合プロテインは二以上のプロテイン配列を含むアミノ酸配列である。

「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、クロロソーム、ウィルス、ビリオン等といった任意の遺伝的な要素を意味し、適切な制御要素と関連した際に複製する能力を有し、細胞間で遺伝子配列を転移させることができる。従って、この用語はウィルスベクターと同様にクローニングや発現ビークルも含まれる。

「組換えウィルス」は、例えば、異種の核酸構造の粒子への付加、挿入によって遺伝的に変化したウィルスを意味する。

「ｒＬＶビリオン」は野生型（ｗｔ）ｒＬＶウィルス粒子（ｒＬＶエンベロープと関連する線形二重鎖ＬＶ核酸ゲノムを含む）といった完全なウィルス粒子を意味する。

本明細書では、「組換えｒＬＶビリオン」、「ｒＬＶベクター粒子」及び「完全な粒子」は、感染性のある複製欠損ウィルスであって、発現させたい異種ヌクレオチド配列を構成する導入遺伝子及びｒＬＶ膜エンベロープを含むものと定義される。ｒＬＶ分子の特徴についての検討はＤｒｏｐｕｌｉｃ（２０１１）で与えられる。

「ホスト細胞」という用語は、例えばｒＬＶヘルパー構造体、ｒＬＶベクタープラスミド及びアクセサリ機能ベクター若しくは他のトランスファーＤＮＡの受容体として使われうる、又は使われてきた微生物群、イースト細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞を指す。前記用語は、トランスフェクトされたオリジナル細胞の子孫を含む。従って、本明細書で使用されるホスト細胞は、一般的に外来性ＤＮＡ配列がトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発、又は故意の変異により、全体のＤＮＡ相補性として若しくは遺伝的に又は形態学的に、オリジナルの親と必ずしも一致しないと理解されている。

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞膜内に異種ＤＮＡが導入された際に細胞が「トランスフェクトされ」たことになる。多くのトランスフェクションの技術が一般的に該当分野で知られている。例えば、以下を参照。Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ； ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｇｅｎｅ １３：１９７。このような技術は、適当なホスト細胞に１以上の異種ＤＮＡの部分を導入するのに用いられうる。

本明細書で使用されるとおり、「細胞株」という用語は、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏで継続した又は長期の成長と分裂を可能とする細胞固体群を指す。しばしば、「細胞株」は単一の前駆細胞から由来するクローン個体群である。本技術分野では、このようなクローン個体群の貯蔵や移転の間、自発的に又は誘発されることで核型に変化が生じることがよく知られている。それ故、言及されている細胞株由来の細胞は、祖先の細胞又は培養地と正確に同一でない場合もあり、そして言及されている細胞株はそのような変異体を含む。

「核酸」配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。この用語は、限定はされないが、以下の知られたＤＮＡ及びＲＮＡの塩基類似物質を含む；４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルラデノシン、アジリニジルシトシン、擬イソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテンニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチル擬ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メソオキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メチルオキシカルボニルメチルウラシル、５−メソキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキサミン、擬ウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ブラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、擬ウラシル、クエオシン、２−チオシトシンと２，６−ジアミノプリン。

「コード配列」又は選択されたポリペプチドをコードする配列とは、適切な制御配列のコントロール下におかれて、Ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに（ＤＮＡの場合）転写され、及び（ｍＲＮＡの場合）翻訳される核酸分子を指す。コード配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより定められる。転写終始配列は３’コード配列に位置しうる。

ＤＮＡ「コントロール配列」は、プロモータ配列、ポリアデニレーションシグナル、転写終始配列、上流制御ドメイン、複製起点、Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ（ＩＲＥＳ）、エンハンサーといったものを総称する。これらは、受容細胞内でコード配列の複製、転写及び翻訳のために総体として備えられる。選択されたコード配列が適切なホスト細胞内で複製、転写及び翻訳される能力を有していれば、全てのコントロール配列が常に存在する必要はない。

本明細書で使用される「プロモータ」という用語は、通常の意味でＤＮＡ制御配列を構成するヌクレオチド領域を指し、前記制御配列はＲＮＡポリメラーゼをバインドし、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させる能力を有する遺伝子由来である。転写プロモータは「誘引プロモータ」（そこでは、プロモータに作動可能にリンクされているポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、補因子、制御プロテイン等により誘引される）、「抑制プロモータ」（そこでは、プロモータと作動可能にリンクされているポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、補因子、制御プロテイン等で誘引される）、及び「構成的プロモータ」が含まれうる。

「作動可能にリンクされる」とは、複数の要素の調整であって、そのように記述された複数の要素は、自身の通常の機能を発揮するよう設定される。従って、コード配列に作動可能にリンクされているコントロール配列は、コード配列の発現に影響を与えることが可能である。前記コード配列の発現を指示するよう機能する限りにおいて、前記コントロール配列は、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、翻訳されていないが、すでに転写された配列がプロモータ配列とコード配列の中に入り込んで存在して、前記プロモータ配列が前記コード配列に作動可能にリンクされていると考えうる。

例えば、ある特定のヌクレオチド配列が、他の配列と比較して「上流」、「下流」、「３’」または「５’」に位置すると記載される場合といった、ある特定の核酸分子においてヌクレオチド配列の相対位置を本願において記述する目的で、それが従来技術においてそのように言及されるＤＮＡ分子のらせん構造の「意味」または「コード」においてのその配列の位置であることは理解されるものである。

コード配列及びコントロール配列といった核酸配列に関連したものとしての「異種」という用語は、通常では結合はしない及び／又は通常ではある特定の細胞と関連しない配列を指す。従って、ベクター又は核酸体の「異種」領域とは、核酸の断片であって、他の核酸分子の中に存在する、又は、前記他の核酸分子に付加されており、前記他の核酸分子は、自然界のそれ以外の分子と関連して発見されていないものである。例えば、核酸体の異種領域は、コード配列であって、自然界で前記コード配列と関連して発見されていない配列により隣接されるものを含みうる。他の例として、異種コード配列は、コード配列自体が自然界で発見されないものである（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しないコンストラクトが導入された細胞は、本発明の目的において異種であると考えられうる。対立遺伝子変異型又は自然に起こる変異イベントはこの明細書において異種ＤＮＡを存在させることとしない又は生じさせない。

異種核酸から成る導入遺伝子は数多くの有用な産物を生じさせる。これらは、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡを含みうる。導入遺伝子は、ホルモン及び増殖若しくは分化因子をコードし、限定はされないが以下を含む；グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、アルファ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）、血小板由来細胞増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ型及びＩＩ型（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＦＧ−ＩＩ）、ベータ型トランスフォーミング増殖因子上科（ベータ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦβ）、アクチビン、インヒビン、若しくは骨形成たんぱく質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５）の任意の一つ、成長因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの任意の一つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリの任意の一つ、ネトリン−１並びにネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフェリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼ。

他の有用な導入遺伝子産物は、いかに限定されないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β並びにγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドといったサイトカインおよびリンホカインを含む免疫システムを調節するたんぱく質を含む。免疫システムにより生産された遺伝子の産物は本発明でもまた有用である。これらは、以下に限定されないが、改変された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子と同様に、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体一本鎖Ｔ細胞受容体（例えば、Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ ２０１１参照）、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子を含む。有用な遺伝子産物は、又、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９といった調節タンパク質を含む。

他の有用な遺伝子の産物は、先天性代謝異常を正すものを含む。このような導入遺伝子は、例えば、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチン・トランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１ アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノゲン・デアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンβ−シンターゼ、 分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、膵嚢胞線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィンｃＤＮＡ配列をコードすることができる。

医療用に有用なレンチウィルスベクターはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ ２００６）及び他のヒトに対して指令されたアンチセンス遺伝子も発現することができる。これらの、及び他のｒＬＶ並びに関連するベクターの有用な適用は最近検討されており、Ｎａｌｄｉｎｉ（２０１１）に引用されている。

ヌクレオチド配列に言及する際、「単離」という言葉によって指摘された分子は、同一タイプの他の生物的な高分子の潜在的な不存在のもと、存在していることを意味する。従って、ある特定のポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド分子とは、潜在的に他の核酸分子であって、目的のポリペプチドをコードしないものから潜在的に自由である核酸分子を指す，しかし、その分子はその合成物の基礎的な特性を害することがない、ある付加的な塩基や部分を含みうる。

本発明は、大規模生産の際ｒＬＶの力価を増加させること、及び、ｒＬＶ関連の不純物（例えば、ｒＬＶ関連核酸不純物）でｒＬＶビリオンの精製されたストックの中に含まれるものを、その中に存在するｒＬＶベクター粒子の最小限の減少を実現しつつ、減少させ又は取り除くことを含む。

ｒＬＶビリオンを生産する技術でよく知られているいくつかの方法がある。たとえば、ベクターとｒＬＶヘルパー配列を使用したトランスフェクションがある。例えば、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１１参照

ｒＬＶビリオンの精製

組換えＬＶの複製（すなわち、細胞培養系でのベクターの生産）に続いて、クロマトグラフィや、ショ糖勾配精製といった様々な従来の精製方法を用いて、ｒＬＶビリオンがホスト細胞から精製されうる。例えば、ＤＥＡＥクロマトグラフィレジンによる精製といった、カラム精製工程が使用しうる（Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１１）。

組換えＬＶベクターは、感染力価を決定するのに使用されうる任意の数のレポーター遺伝子を含んでいる。例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼが使用され得る。他のアッセイとしては、治療用の導入遺伝子核酸、又はアッセイのターゲットとしての導入遺伝子産物を使用する。一部の細胞は他の細胞よりも、より感受性が高いため、重要なファクターは、試験に用いられる細胞株である。得られる力価は系に依存しており、異なったアッセイが使用される場合大きく異なってくる。

より多いベクターの投与量が求められる臨床応用のために、＞５０％のＬＶベクターを含む精製されたＬＶ粒子は、不安定なエンベロープ粒子の不活性化を最小限にする方法での遠心分離及びタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程により、１ｍＬ当たり１０^８粒子にまで濃縮され得る。さらにより多いベクターの投与量が求められる他の臨床応用のために、＞５０％のＬＶベクターを含む精製されたＬＶ粒子は、不安定なエンベロープ粒子の不活性化を最小限にする方法での遠心分離及びタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程により、１０^９ＴＵ／ｍＬにまで濃縮され得る。

さらにより高いベクターの投与量が求められる他の臨床応用のために、＞５０％のＬＶベクターを含む精製されたＬＶ粒子は、不安定なエンベロープ粒子の不活性化を最小限にする方法での遠心分離及びタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程により、１０^１０ＴＵ／ｍＬ以上にまで濃縮され得る。粗製力価は、タンジェンシャルフロー濾過と遠心分離工程により濃縮がリーズナブルで実用的なものとなる程度に十分高いものでなければならない。それ故、コストとして効果的な方法で、多くのヒトへの投与が可能となるよう十分なｒＬＶを精製し濃縮することができるのに十分なｒＬＶを細胞培養プロセスにおいて生産可能とするために、可能な限り最も高い粗製力価を得ることは必要である。例えば、１０^６ＴＵ／ｍＬの粗製力価、より好ましくは１０^７ＴＵ／ｍＬ、最も好ましくは１０^８ＴＵ／ｍＬ以上が必要とされる。

感染力価をテストするには、方法として、１ウェルあたり約２０，０００のホスト細胞（好ましくはヒト由来、最も好ましくはＳｕｐＴ１細胞）を組織培養処理したプレート（例えば９６ウェルのプレート）にシードすることを含む。ウィルスは段階的に希釈され、細胞に付加されて３日間培養される。３日目に、細胞は採取され、導入遺伝子産物に対する抗体とともに染色される。細胞はＦＡＣＳを通じて分析され、トランスダクション力価（ＴＵ／ｍＬ）は、希釈化に基づいて計算される。

本明細書で述べられる細胞培養と精製方法は、大規模な方法でベクター関連の不純物の効率的な除去を通じて改善された安全なプロファイルをベクターに対して提供する。すなわち、コスト的に効率的な方法で多量のＬＶベクターの準備が可能となる。この細胞培養と精製方法に用いられるプロセス工程は、図３に示されたフローチャートでまとめられており、付加的な詳細は以下で述べられる。

１） 工程１：ＭＣＢからのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の拡張

一つのアプローチでは、他の細胞株もこの目的で使用されるうるが、マスターセルバンク（ＭＣＢ）又はワーキングセルバンク（ＷＣＢ）からの２９３Ｔ細胞であって、生産（ベクターの生産）に対して使用される医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）において用いられるよう準備され認定されたものを、５％のＦＢＳの下、ＤＭＥＭ中で拡大させる。一般的に、前記セルバンクからの一つのバイアルが単一のＴ７５フラスコ中で増殖される。一旦コンフルエンスとなったら、前記細胞はトリプシン処理され、まず２ｘＴ１７５フラスコにリプレートされ、その後５ｘ Ｔ１７５フラスコにリプレートされ、その後２ｘ４層セルファクトリー（ＣＦ４）にリプレートされる。究極的にはフルスケールのベクターラン（４から８の４層セルファクトリー）にまでリプレートされる。非トランスフェクト細胞は、細胞工場のシーディングの付加的なラウンドに対する出発物質として振舞うよう分離されたインキュベータにおいて、Ｔ１７５と管理されたフラスコ中で継代される。

２） 工程２：ｒＬＶベクター生産のためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクト

２９３Ｔ細胞はその細胞が＞７０％のコンフルエンスに達したら、トランスフェクトされる。トランスフェクションは燐酸カルシウム法を用いて行われる。トランスフェクション緩衝の一つのコンポーネントである、２ｘ ＨＥＰＥＳ緩衝液が、単一のセルファクトリーユニットに対し、十分な緩衝液が用意される程度に、複数の分かれた保存ボトルに分割される。塩化カルシウムと、ＷＦＩ品質の水と、すべてのＣＦユニットがトランスフェクトされるのに十分な量用意された該４つのプラスミドＤＮＡ溶液とが含まれて２番目のボトルが準備される。カルシウム−ＤＮＡ溶液の等しい量が２ｘ ＨＥＰＥＳ溶液ボトルにピペットを用いて混ぜ合わせられる。この混合液は、１０分の間放置されるのが許容され、その後、暖められた細胞培養地を含むボトルに注がれる。その後、各々のＣＦが空にされ、〜０．４Ｌの最終細胞導入培地に置き換えられる。概ね６時間後、このトランスフェクションメディアがレギュラーメディアと交換される。

３） 工程３：ｒＬＶの上澄みの採取及び濾過とＥＯＰ細胞の採取

トランスフェクションメディアが交換された後、ベクターは４８時間から７２時間で採取される。４８時間で集められた上澄みは４℃で一夜保管される。上澄みは７２時間で集められる。４８時間での採取された上澄みは７２時間での採取物と、バイオバーデンテスト、力価決定及びｐ２４分析の対象となるサンプルとともに組み合わされ、集められる。組み合わされた採取物プールは、０．４５ｕｍを超え０８．８ｕｍのカートリッジフィルタ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ）を通して、４００ｍＬ／秒の流量レートで新しい無菌のバイオプロセス用バッグに濾過される。バイオバーデンテスト、力価及びｐ２４分析のサンプルが取られ、マテリアルはすぐにさらに進行される。
細胞工場内のＥｎｄ Ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ＥＯＰ）細胞がトリプシン化され、集められ、数えられる。もしバイアビリティが＞６５％であれば、１ｘ１０^７の細胞がある４つバイアルを引き続くＱＣテストのため、液体窒素の中で凍結させる。残りの細胞は＜−６０℃で分割され保管される。ＥＯＰ細胞が、バイアビリティとして＜６５％を示している場合、細胞はＴ１７５フラスコ中で培養され、概ね３日後に凍結保存される。

４） 工程４：ｒＬＶ上澄みのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）とベンゾナーゼトリートメント

澄ませた上澄み採取プールは、初期設定後及び使用毎すぐにＩＮ ＮＡＯＨでサニタイズされた１０００００ＭＷＣＯ（ＧＥヘルスケア）中空糸カートリッジフィルターを通じて濃縮される。前記カートリッジは、無菌のＰＢＳで平衡され、中性のｐＨが検証される。結合は１００ＢＳＣクラスで形成される。澄まされた採取物プールはシステムに付加されて量は〜６フォールドに減ぜられる。濃縮された採取物は無菌バイオプロセスバッグへと回収させられ、その後ベンゾナーゼ（ＥＭＤ ３００Ｕｍｌ）とともに、室温で１時間の間処理される。バイオバーデンテスト、力価及びｐ２４分析のサンプルが取られ、マテリアルはすぐにさらに進行される。

５） 工程５：遠心分離によるｒＬＶ粒子のペレッティング

濃縮されたベンゾナーゼ処理したマテリアルは、６−８の２５０ｍｌ円錐遠心分離機ボトルに移され、４℃、＞１８時間、３８０００ｘｇで遠心分離される（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２６ＸＰＩ、ベックマン）。遠心分離機ボトルごとに１０ｍＬの再懸濁緩衝が用いられる。ｒＬＶを含んだペレットは回収され、前記ｒＬＶは上下にピペッティングの懸濁によって抽出される。大きなデブリは３０００ｒｐｍによる遠心分離によって沈殿し、ｒＬＶを含む上澄みは無菌の５０ｍＬ円錐チューブに移される。力価及びｐ２４分析のためのサンプルは取得され、マテリアルは即座にさらに進められる。

６） 工程６：ショ糖勾配遠心分離とｒＬＶの保管

ＭＰＲ ＬＸＰ１０２で生産されたベクター懸濁は、無菌のＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｔｙｐｅ Ｔｕｂｅの中で、Ｐｈ７．１５で１ｘＨＢＳＳの２０％のショ糖溶液の上に積層される。マテリアルは１０℃、＞２時間、７５０００ｘｇで遠心分離される（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２６ＸＰＩ、Ｂｅｃｋｍａｎ）。ベクターを含むペレットは遠心分離チューブから回収され、ｒＬＶはＶｅｃｔｏｒ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒを使用して抽出される。バイオバーデンテスト、力価及びｐ２４分析のサンプルが採取される。結果のベクター溶液は円錐チューブに＜−６００Ｃで保管される。

７） 工程７：濃縮されたｒＬＶのパッケージングと保管

最終製造サイクルが終了するに従い、全ての週間生産バッチがプールされ、１００ＢＳＣクラス １ｍｌが無菌状態で１．５ｍＬのクリオバイアルに入れられる（Ｎａｌｇｅｎｅ ５０００−１０２０）。ｒＬＶベクタープロダクトが含まれるバイアルは＜−６０℃で保管される。

続く例は、本発明のある実施例を説明するために提供される。なお、どのような方法であれ本発明を限定する意図で提供されるものではない。

ｒＬＶの生産（又は増殖）のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はｒＬＶの増殖のために必要な情報全てをコードするプラスミドに移され（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ、２０１１， Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ、２０１１）、その後細胞培地の上澄みに分泌される。

トランスフェクション後、細胞培地はｒＬＶの回収のため集められる。プラスミドトランスフェクションに用いられるｒＬＶを生産する方法は当該技術分野で知られている。本発明は、大規模なヒト遺伝子治療の治験の要求条件を満たすｒＬＶの生産及び回収方法に貢献することである。産業界で確立された採取スケジュールは、典型的にはトランスフェクション後４８時間から７２時間である。ｒＬＶは、高い温度でとても安定しているとはいえないエンベロープウィルスである（図１）。早い段階（例えば５６時間以内）での培地を含むｒＬＶを冷温の保管ユニットへ移転することは、活性ベクター粒子の量（ＴＵ単位での測定）の増加につながる。標準的な採取スケジュールとして、細胞は、培地が採取されるまで、３７℃で４８時間の間培地の元でインキュベートされる。培地が早い段階（３２時間）で採取され、低温保管庫に移転された場合、３７℃でのインキュベーション時間とすなわちＬＶのインキュベーションは減少する。図２はインキュベーション時間が分割された際に、より活性化されたＴＵが回収されることを示しており、すなわち、単一の採取（４８時間、３７℃でインキュベートしたもの）と比べた二つの採取（Ｈ１：３２時間、Ｈ２：４８時間）を意味する。３２及び４８時間がここに示されており、培養時間は例えば５２、５６、及び６０時間と拡張されうる。

ｒＬＶの生産がトランスフェクションの有効性と相関性があるため、トランスフェクションの混合の準備がｒＬＶ生産において重要な工程となる。このプロセスにおいて、ＤＮＡを含む溶液（図４）と１．２５Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）が、２８２ｍＭ塩化ナトリウム／１．４８ｍＭ燐酸水素ナトリウム／５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む２ｘ ＨＥＢＳ緩衝に追加され、接触によりＤＮＡ−ＣａＣｌ_２複合体がトランスフェクションに対し活性化された試薬を形成し、沈殿する。付加する速さ及び溶液の混合の制御が重要なパラメータとなる。産業界での標準的なセッティングにおいて、ＤＮＡ−ＣａＣｌ_２溶液はピペットの手段で手動により付加され、溶液は手動により混ぜ合わせられる。これは、速さの客観的な制御とならないうえ、作業者の間で大変異なることとなる。加えて、この手順は多量の準備が許容されず、トランスフェクションミックスを、それぞれの細胞培養ユニットに対し個々に準備する必要があり、変異性のもう一つのファクターとなる。同一の２ｘ ＨＥＢＳ緩衝をより高いｐＨ７．１でＣａＣｌ_２の濃縮を０．７５Ｍにまで下げ、ＤＮＡ−ＣａＣｌ_２溶液を一定の速さ（２００ｍＬ／ｍｉｎ）で付加し、トランスフェクションミックスを４細胞培養ユニットに対し十分な程度により多量に準備を行うことで、トランスフェクションミックスの準備を変更した。このことは、トランスフェクションバッチと異なる作業者によるコンシステンシーを与える。表１は上述の制御されていない手動によるドリップ方法と比べた、上述の改良された方法でのｒＬＶの生産増加を示している。細胞培養表面ごとの生産量を計測している。前記改良された方法は、ｒＬＶベクターの生産において１０ｘの増加を導き出している。

前記ダウンストリーム精製プロセスは、核酸のコンタミネーションを排除するためのベンゾナーゼダイジェスチョン（２００Ｕ／ｍＬ）、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を用いた濃縮工程、ｒＬＶ（１８時間で３８４００ｇ）をさらに濃縮する遠心分離工程、及び２０％ショ糖勾配遠心分離（２時間で７５６００ｇ）を含む。前述のｒＬＶの精製がｒＬＶ粒子の不活性化を最小限にすることが重要である。不活性化は、室温を超えた温度に対し集中的に露出されること及びベクターの脂質膜エンベロープを破壊する機械的なせん断力を通じて生じる。過去の使用されていたプロセスにおいて数時間であったものに比べ、大規模ＴＦＦシステム（１００ｋＤＡ カットオフカートリッジ ＵＦＰ−１００−Ｃ−９Ａを用い、７ＰＳＩの膜間差圧を適用したＧＥ、Ｆｌｅｘ Ｓｔａｎｄ）を用いることで、濃縮のプロセス時間を３０分程度にまで、大幅に減少させている。ペレットからのｒＬＶの再懸濁は、伝統的には、ハンドヘルド式のセロロジカルピペットを使用して行われていた。このプロセスにおいては、制御ができない空気泡が発生し得、再懸濁の効能が制限されていた。前述の改善された方法においては、定量ピペット（Ｆｉｎｎ ｐｉｐｅｔｔｅ Ｆ２、０．２−５ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）がｒＬＶを不活性にさせる空気泡を除去するために用いられる。

加えて、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８^(R)、ＢＡＳＦ）が０．０００１％の低い濃度で再懸濁緩衝に加えられ、ペレットから得られたｒＬＶ粒子の放出（ｒｅｌｅａｓｅ）を促進する。

アップストリーム細胞培養プロセス中に１０ｘ増加した生産性は、前述した改善されたプロセス中において生産性の１０ｘの増加をもたらされている最終精製ベクターへとつながっている。

このアップストリーム細胞培養及びダウンストリーム精製手順における変化は、ｒＬＶの生産性の増加（３〜１０倍）を導いており、医療用途に必要な増加した力価を有するベクターの準備につながっている。

引用文献

Ｋａｌｏｓ Ｍ， Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ， Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ， Ｋａｔｚ Ｓ， Ｇｒｕｐｐ ＳＡ， Ｂａｇｇ Ａ， ａｎｄ Ｊｕｎｅ ＣＨ （２０１１）． Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：１．
Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ， Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ， Ｋａｌｏｓ Ｍ， Ｂａｇｇ Ａ， Ｊｕｎｅ ＣＨ （２０１１）． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｏｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５．
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本発明は詳細に述べられ、その特定の例に言及しているが、当該技術の当業者により本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく様々な変更及び修正がなされ得ることは明らかである。

Claims (17)

1. 治療上有益な導入遺伝子を含んでなる高収率な組換えレンチウィルス（ｒＬＶ）を生産する方法であって、前記方法は、
   ａ） リン酸カルシウムとｒＬＶの生産に必要な成分をコードするプラスミドとを制御された速度で混合することによって複合体を形成し、次いで、培地中で前記複合体をホスト細胞に加えることによって前記ホスト細胞をトランスフェクトするステップと、
   ｂ） 前記ステップ（ａ）でトランスフェクトしたホスト細胞を培地中で一定時間インキュベートしてｒＬＶ粒子培地を生産し、次いで、前記トランスフェクションから３２時間後にｒＬＶウィルス粒子培地を回収して新しい培地に交換し、次いで、前記トランスフェクションから４８時間後にｒＬＶウィルス粒子培地を回収することによって、最大６０時間以内の時間にｒＬＶ粒子を含む培地を少なくとも２回にわたって回収し、回収したｒＬＶ粒子培地を冷蔵保管ユニットに置くことによってウィルスの不活性化を減少させるステップと、
   ｃ） タンジェンシャルフロー濾過により、前記ステップ（ｂ）から回収した培地中の前記ウイルス粒子を濃縮するステップと、
   ｄ） 核酸のコンタミネーションを減少させるエンザイムにより前記ステップ（ｃ）で得た濃縮されたｒＬＶ粒子を処理するステップと、
   ｅ） 前記ｒＬＶをさらに濃縮する目的で、ｄ）の該処理された粒子を遠心分離し、界面活性剤を含む溶液中で遠心分離したｒＬＶを再懸濁するステップと、
   ｆ） 前記ｅ）の界面活性剤溶液中でさらに濃縮されたｒＬＶをショ糖勾配上にレイヤリングし、次いで、そのｒＬＶをさらに遠心分離し、それにより、治療上有益な導入遺伝子を含んでなる高収率のｒＬＶを生産する方法。
2. 前記ステップ（ｆ）において生産されるｒＬＶの収率が少なくとも３×１０⁸ＴＵ／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 前記ステップ（ｆ）のｒＬＶを製剤中に製薬的に許容されるキャリアと共に混合するステップをさらに備える、請求項１記載の方法。
4. 前記導入遺伝子がｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、並びにｍｉＲＮＡから成るグループより選択された核酸、リボザイム、及びｓｈＲＮＡで構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 前記導入遺伝子が、
   グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、アルファ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）、血小板由来細胞増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ型及びＩＩ型（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＦＧ−ＩＩ）、ベータ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦβ）、アクチビン、インヒビン、骨形成たんぱく質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１並びにネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフェリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼから成るグループより選択される遺伝子産物をコードすることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. 前記導入遺伝子が、
   トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α並びにβ、インターフェロンα、β並びにγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ並びにＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、及びクラスＩ並びにクラスＩＩＭＨＣ分子
   から成るグループより選択される遺伝子産物をコードすることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 前記導入遺伝子は先天性代謝異常を正すのに有用なプロテインをコードする核酸から構成され、
   カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチン・トランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１ アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノゲン・デアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンβ−シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、膵嚢胞線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィンｃＤＮＡ配列から成るグループより選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
8. 前記導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子をコードする核酸で構成されることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 前記リン酸カルシウムミックスがｐＨ７．１であることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 前記ステップ（ｆ）の遠心分離の後に前記ｒＬＶを回収するステップと、界面活性剤を含む溶液中に前記回収したｒＬＶを任意に再懸濁するステップを含む請求項１記載の方法。
11. 前記トランスフェクションから３２時間後にｒＬＶウィルス粒子培地を回収して新しい培地に交換し、次いで、前記トランスフェクションから５２時間後、５６時間後又は６０時間後にｒＬＶウィルス粒子培地を回収する、請求項１記載の方法。
12. 前記ステップ（ｆ）において生産されるｒＬＶの収率が１×１０⁸ＴＵ／ｍｌ以上である、請求項１記載の方法。
13. 前記ステップ（ｆ）において生産されるｒＬＶの収率が１×１０⁹ＴＵ／ｍｌ以上である、請求項１記載の方法。
14. 前記ステップ（ｆ）において生産されるｒＬＶの収率が１×１０¹⁰ＴＵ／ｍｌ以上である、請求項１記載の方法。
15. 前記ホスト細胞が、イースト細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞で構成される、請求項１記載の方法。
16. 前記ホスト細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞で構成される、請求項１記載の方法。
17. 前記トランスフェクションから３２時間後及び４８時間後の２回にわたって回収した後の前記ステップ（ｆ）において生産されるｒＬＶの収率は、前記トランスフェクションから４８時間後に１回でｒＬＶウィルス粒子培地を回収する場合と比較して３〜１０倍である、請求項１記載の方法。