JP6334397B2 - 生体分子親和性高分岐ポリマー及び生体分子認識表面 - Google Patents
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Description
また、特許文献2では、シラン、ポリエチレンオキシド及びビオチンを有する化合物の溶液を基材上にスピンコーティングで塗布することにより、比較的短時間で分子認識表面を作成することが可能であるが、該化合物のシラン部分と反応可能なシラノール部分を有するシリコンウエハーやガラスなどの基材でなければアビジンを固定化することが出来ない。このため、ポリスチレンなどの安価で軽量なプラスチック基材に本文献で開示された上記化合物を固定化するためには、ポリスチレン表面に対してプラズマ処理などを行い、予めヒドロキシ基を作成する工程が必要となり、基材の選択自由性に乏しいことが課題であった。
第2観点として、前記モノマーが、ビニル基又は(メタ)アクリル基の何れか一方又は双方を有する化合物である、第1観点に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーに関する。
第3観点として、前記モノマーが、ジビニル化合物又はジ(メタ)アクリレート化合物である、第2観点に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーに関する。
第4観点として、前記モノマーが下記式[1]で表される化合物である、第3観点に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーに関する。
第5観点として、前記重合開始剤がアゾ系重合開始剤である、第1観点に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーに関する。
第6観点として、前記重合開始剤が4,4’−アゾビス(4−シアノバレリン酸)である、第5観点に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーに関する。
第7観点として、第1観点乃至第6観点のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーを含有するワニスに関する。
第8観点として、第1観点乃至第6観点のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーより作製される薄膜に関する。
第9観点として、(a)第1観点乃至第6観点のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマー、及び(b)親水性の低い熱可塑性樹脂を含む樹脂ブレンドに関する。
第10観点として、第9観点に記載の樹脂ブレンドより作製される薄膜に関する。
第11観点として、第1観点乃至第6観点のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーより作製される薄膜の製造方法であって、
該生体分子親和性高分岐ポリマーを溶媒中に含む液をスピンコート法により基材上に塗布し、塗膜を形成する工程、及び
該塗膜を乾燥し溶媒を除去する工程
を含む、薄膜の製造方法に関する。
第12観点として、第9観点に記載の樹脂ブレンドより作製される薄膜の製造方法であって、
該樹脂ブレンドを溶媒中に含む液をスピンコート法により基材上に塗布し、塗膜を形成する工程、
該塗膜を乾燥し溶媒を除去する工程、及び
親水性媒体の雰囲気下で、得られた塗膜のアニーリングを行う工程
を含む、薄膜の形成方法に関する。
第13観点として、第11観点又は第12観点に記載の薄膜を基材上に備え、これにより、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子を認識可能な、分子認識表面チップに関する。
第14観点として、分子内にアルキレンオキシド及び2個以上のラジカル重合性二重結合を有するモノマーを、該モノマーのモル数に対して5モル%以上200モル%以下の分子内にカルボキシ基を有する重合開始剤の存在下で重合させることにより得られるカルボキシ基含有高分岐ポリマーを、N−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることにより得られる、該カルボキシ基の一部又は全部がヒドロキシコハク酸イミドエステル化された、活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーに関する。
第15観点として、第14観点に記載の活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーと、
該活性化カルボキシ基と反応し得る官能基、並びにビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子部位を有する化合物とを反応させることを特徴とする、請求項1に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーの製造方法に関する。
第16観点として、前記活性化カルボキシ基と反応し得る官能基がアミノ基である、第15観点に記載の製造方法に関する。
また本発明の生体分子認識部位を有する高分岐ポリマーは、積極的に枝分かれ構造を導入しているため、線状高分子と比較して分子間の絡み合いが少なく微粒子的挙動を示す。そして、親水性の低い熱可塑性樹脂のマトリクス中においては、高分岐ポリマーの表面・界面への移動が容易となり、樹脂表面に活性を付与しやすい。従って、本発明の生体分子認識部位を有する高分岐ポリマーと上記熱可塑性樹脂等を含む樹脂ブレンドから膜などの成形体を作製する際、微粒子状の該高分岐ポリマーは界面(膜表面)に容易に移動することができ、その表面において該高分岐ポリマーの存在量が高められた成形体(膜)を形成可能である。すなわち、本発明の生体分子認識部位を有する高分岐ポリマーに親水性の低い熱可塑性樹脂等を配合した樹脂ブレンドから、その表面が分子認識可能な表面である成形体(膜)等を形成できる。
本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーは、分子内にアルキレンオキシド及び2個以上のラジカル重合性二重結合を有するモノマーを、該モノマーのモル数に対して、5モル%以上200モル%以下の量の重合開始剤の存在下で重合させることにより得られる高分岐ポリマーであって、その分子末端に、ビオチンとアビジン等の相補的な生体分子部位の対のうち、一方の生体分子部位を有する、生体分子親和性高分岐ポリマーである。
詳細には、本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーは、その分子末端に、結合基を介して生体分子部位を有するポリマーである。
上記生体分子親和性高分岐ポリマーはいわゆる開始剤断片組込み(IFIRP)型高分岐ポリマーであり、その末端に重合に使用した重合開始剤の断片を有している。
さらに、上記生体分子親和性高分岐ポリマーは、本発明の効果を損なわない限り、後述のモノマーに属さない多官能モノマー及び/又は単官能モノマーを、必要に応じて共重合させてもよい。
上記分子内にアルキレンオキシド及び2個以上のラジカル重合性二重結合を有するモノマーは、ビニル基又は(メタ)アクリル基の何れか一方又は双方を有することが好ましく、特にジビニル化合物又はジ(メタ)アクリレート化合物であることが好ましい。特に前記式[1]で表される化合物がより好ましい。なお、本発明では(メタ)アクリレート化合物とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方をいう。例えば(メタ)アクリル酸は、アクリル酸とメタクリル酸をいう。
上記重合開始剤としては、好ましくはアゾ系重合開始剤が用いられる。アゾ系重合開始剤としては、例えば以下の(1)〜(5)に示す化合物を挙げることができる。
(1)アゾニトリル化合物:
2,2’−アゾビスイソブチロニトリル、2,2’−アゾビス(2−メチルブチロニトリル)、2,2’−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)、1,1’−アゾビス(1−シクロヘキサンカルボニトリル)、2,2’−アゾビス(4−メトキシ−2,4−ジメチルバレロニトリル)、2−(カルバモイルアゾ)イソブチロニトリル等;
(2)アゾアミド化合物:
2,2’−アゾビス{2−メチル−N−[1,1−ビス(ヒドロキシメチル)−2−ヒドロキシエチル]プロピオンアミド}、2,2’−アゾビス{2−メチル−N−[2−(1−ヒドロキシブチル)]プロピオンアミド}、2,2’−アゾビス[2−メチル−N−(2−ヒドロキシエチル)プロピオンアミド]、2,2’−アゾビス[N−(2−プロペニル)−2−メチルプロピオンアミド]、2,2’−アゾビス(N−ブチル−2−メチルプロピオンアミド)、2,2’−アゾビス(N−シクロヘキシル−2−メチルプロピオンアミド)等;
(3)環状アゾアミジン化合物:
2,2’−アゾビス[2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン]ジヒドロクロリド、2,2’−アゾビス[2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン]ジスルフェートジヒドレート、2,2’−アゾビス[2−[1−(2−ヒドロキシエチル)−2−イミダゾリン−2−イル]プロパン]ジヒドロクロリド、2,2'−アゾビス[2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン]、2,2'−アゾビス(1−イミノ−1−ピロリジノ−2−メチルプロパン)ジヒドロクロリド等;
(4)アゾアミジン化合物:
2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)ジヒドロクロリド、2,2’−アゾビス[N−(2−カルボキシエチル)−2−メチルプロピオンアミジン]テトラヒドレート等;
(5)その他:
2,2’−アゾビスイソ酪酸ジメチル、4,4’−アゾビス(4−シアノバレリン酸)、2,2’−アゾビス(2,4,4−トリメチルペンタン)、1,1’−アゾビス(1−アセトキシ−1−フェニルエタン)、ジメチル1,1’−アゾビス(1−シクロヘキサンカルボキシレート)等。
前述のモノマーと、該モノマーに対して所定量の重合開始剤の存在下で重合させる重合方法としては公知の方法、例えば溶液重合、分散重合、沈殿重合、及び塊状重合等が挙げられ、中でも溶液重合又は沈殿重合が好ましい。特に分子量制御の点から、有機溶媒中での溶液重合によって反応を実施することが好ましい。
重合反応は常圧、加圧密閉下、又は減圧下で行われ、装置及び操作の簡便さから常圧下で行うのが好ましい。また、N2等の不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。
重合温度は、反応混合物の沸点以下であれば任意であるが、重合効率と分子量調節の点から、好ましくは50℃以上200℃以下であり、さらに好ましくは80℃以上150℃以下であり、80℃以上130℃以下がより好ましい。
反応時間は、反応温度や、モノマー及び重合開始剤の種類及び割合、重合溶媒種等によって変動するものであるため一概には規定できないが、好ましくは30分以上720分以下、より好ましくは40分以上540分以下である。
重合反応の終了後、得られた高分岐ポリマーを任意の方法で回収し、必要に応じて洗浄等の後処理を行う。反応溶液から高分子を回収する方法としては、再沈殿等の方法が挙げられる。
本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーの構造中に含まれる結合基としては、上記高分岐ポリマーの末端官能基と後述の生体分子部位を結合可能な二価の有機基であれば特に制限はないが、共有結合を形成しやすいエステル結合、アミド結合、エーテル結合等で該末端官能基及び該生体分子部位と結合する基が好ましい。例えば、該末端官能基及び該生体分子部位が有する官能基が共にカルボキシ基又はその誘導体の場合、このような結合基としては、ヘキサメチレンジアミノ基などのアルキレンジアミノ基等を挙げることができる。
本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーの分子末端に存在する生体分子部位とは、ビオチンとアビジン等の相補的な生体分子部位の対のうちの一方の生体分子部位である。このような対としては、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、そしてヘパリンとラミニンとの組合せの対を挙げることができる。
本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーにおいて、これらの対のうちいずれか一方をその分子末端に有していればよく、2種以上の複数の対の一方を有していてもよい。またこれらの対のうち、前記高分岐ポリマーの分子末端に結合する生体分子部位は、いずれの一方であってもよい。
これらの対の中でも、特にビオチンとアビジンが好ましい。
本発明の上記生体分子親和性高分岐ポリマーは、その前駆体といえる活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーと、該活性化カルボキシ基と反応し得る官能基並びに相補的な生体分子部位の対のうちの一方の生体分子部位を有する化合物、すなわち、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子部位を有する化合物とを反応させることにより得られる。
なお本製造方法、並びに上記活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーもまた本発明の対象である。
公知の活性エステル化剤としては、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、N−ヒドロキシコハク酸イミド等が挙げられる。
上記反応を促進させるために、縮合剤を使用することが好ましい。このような縮合剤としては、カルボン酸の活性化により、アミノ基等と縮合反応を促進することのできる化合物であれば特に制限はない。例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)塩酸塩、カルボニルジイミダゾール、亜リン酸トリフェニル、ジフェニルジクロロリン酸、ジフェニル(2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−3−ベンゾキサゾリル)ホスホナート等が挙げられる。
また上記反応は常圧、加圧密閉下、又は減圧下で行われ、装置及び操作の簡便さから常圧下で行うのが好ましい。また、N2等の不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。
このとき、反応温度は−80乃至200℃、好ましくは0乃至100℃、より好ましくは10乃至50℃にて行うことが望ましく、反応時間は0.1乃至48時間、好ましくは0.2乃至40時間にて行うことが望ましい。
重合反応の終了後、得られた活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーを任意の方法で回収し、必要に応じて洗浄等の後処理を行う。反応溶液から高分子を回収する方法としては、再沈殿等の方法が挙げられる。
前記相補的な生体分子部位の対としては、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、そしてヘパリンとラミニンとの組合せの対を挙げることができ、中でもビオチンとアビジンが好ましい。
なお、前記活性化カルボキシ基と反応し得る官能基並びに相補的な生体分子部位の対のうちの一方の生体分子部位を有する化合物は市販品を用いることができ、或いは、公知の方法により上述の生体分子を誘導体化することにより得ることができる。
また前記活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーと前記活性化カルボキシ基と反応し得る官能基並びに相補的な生体分子部位の対のうちの一方の生体分子部位を有する化合物との反応は、ペプチド形成に用いられる活性エステル法等の公知の方法を適用することができる。
本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーより作製される薄膜を形成する具体的な方法としては、まず、生体分子親和性高分岐ポリマーを溶媒に溶解又は分散してワニスの形態(膜形成材料)とし、該ワニスを基材上にキャストコート法、スピンコート法、ブレードコート法、ディップコート法、ロールコート法、バーコート法、ダイコート法、スプレーコート法、インクジェット法、印刷法(凸版、凹版、平版、スクリーン印刷等)等によって塗布し、その後、ホットプレート又はオーブン等で乾燥して成膜する。
これらの塗布方法の中でもスピンコート法が好ましい。スピンコート法を用いる場合には、単時間で塗布することができるために、揮発性の高い溶液であっても利用でき、また、均一性の高い塗布を行うことができるという利点がある。
また上記溶媒に溶解又は分散させる濃度は任意であるが、生体分子親和性高分岐ポリマーと溶媒の総質量(合計質量)に対して、生体分子親和性高分岐ポリマーの濃度は0.01乃至90質量%であり、好ましくは0.05乃至50質量%であり、より好ましくは0.1乃至20質量%である。
本発明はまた、前述の生体分子親和性高分岐ポリマー、及び親水性の低い熱可塑性樹脂を含む樹脂ブレンドに関する。
本発明の樹脂組成物に含まれる熱可塑性樹脂は特に限定されないが、好ましくは親水性の低い熱可塑性樹脂である。本発明における親水性が低い熱可塑性樹脂としては、例えばPE(ポリエチレン)、PP(ポリプロピレン)、EVA(エチレン−酢酸ビニル共重合体)、EEA(エチレン−アクリル酸エチル共重合体)などのポリオレフィン系樹脂;PS(ポリスチレン)、HIPS(ハイインパクトポリスチレン)、AS(アクリロニトリル−スチレン共重合体)、ABS(アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体)、MS(メタクリル酸メチル−スチレン共重合体)などのポリスチレン系樹脂;ポリカーボネート樹脂;塩化ビニル樹脂;ポリアミド樹脂;ポリイミド樹脂;PMMA(ポリメタクリル酸メチル)などの(メタ)アクリル樹脂;PET(ポリエチレンテレフタレート)、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート、PLA(ポリ乳酸)、ポリ−3−ヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート/アジペートなどのポリエステル樹脂;ポリフェニレンエーテル樹脂;変性ポリフェニレンエーテル樹脂;ポリアセタール樹脂;ポリスルホン樹脂;ポリフェニレンサルファイド樹脂等が挙げられる。
中でもポリスチレン樹脂又はポリメタクリル酸メチル樹脂であることが好ましい。
本発明の樹脂ブレンドは、該樹脂ブレンドを溶媒に溶解又は分散してワニスの形態(膜形成材料)とし、該ワニスを基材上に塗布(コーティング)することにより、薄膜、さらには成形体を形成できる。
前記基材上への塗布方法は、キャストコート法、スピンコート法、ブレードコート法、ディップコート法、ロールコート法、バーコート法、ダイコート法、スプレーコート法、インクジェット法、印刷法(凸版、凹版、平版、スクリーン印刷等)等を適宜選択し得、中でも短時間で塗布できることから揮発性の高い溶液であっても利用でき、また、均一性の高い塗布を行うことができるという利点より、スピンコート法を用いることが望ましい。なお事前に孔径が0.2μm程度のフィルタなどを用いて樹脂ブレンドを濾過した後、塗布に供することが好ましい。
上記ワニスにおける固形分は、例えば0.01乃至50質量%、0.05乃至30質量%、又は0.1乃至20質量%である。ここで固形分とはワニスの全成分から溶媒成分を除いたものである。
ここで用語「溶媒アニーリング(solvent annealing)」は、溶媒蒸気処理を指し、密閉容器中、室温又はさらに高い温度において、溶媒蒸気を含む空気に曝すことを指す。溶媒アニーリングは、一般に膜の表面状態を変化せしめることができ、本発明においては、膜表面の生体分子親和性高分岐ポリマーの存在量をより一層高めることができる。
また、アニーリング時の温度及びアニーリング時間(溶媒蒸気に曝す時間)は特に限定されないが、例えば室温(およそ25℃)乃至使用溶媒の沸点、10秒間乃至48時間の間で適宜選択可能である。
本発明の生体分子親和性高分岐ポリマーは、分子認識表面チップの材料として、特にビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子を認識可能な分子認識表面チップの材料として好適に使用可能である。
また本発明の分子認識表面チップは、前述の生体分子親和性高分岐ポリマーを含有する樹脂ブレンド(該樹脂ブレンドを溶媒中に含む液)を基材上に塗布し、塗膜を形成する工程、該塗膜を乾燥し溶媒を除去する工程、そして親水性媒体の雰囲気下で、得られた塗膜のアニーリングを行う工程を経ることによって形成可能である。
これらの詳細な手順は、前述の<生体分子親和性高分岐ポリマーを含有するワニス及び薄膜の製造方法>及び<樹脂ブレンドより作製される薄膜及びその形成法>を適用可能である。
装置:東ソー(株)製 HLC−8220GPC
カラム:昭和電工(株)製 Shodex(登録商標)GPC KF−804L、GPC KF−805L
カラム温度:40℃
溶媒:テトラヒドロフラン
検出器:RI
(2)1H NMRスペクトル
装置:日本電子データム(株)製 JNM−ECA700(合成例1)
日本電子データム(株)製 JNM−ECP400(合成例2、実施例1,2)
溶媒:CDCl3(実施例1)、(CD3)2SO(合成例1,2、実施例2)
基準:CHCl3(7.26ppm)(実施例1)
テトラメチルシラン(0.00ppm)(合成例1,2、実施例2)
(3)スピンコーター
装置:ミカサ(株)製 1H−D7
(4)乾燥器
装置:(株)いすゞ製作所製 ISUZU−SVK−10S
(5)X線光電子分光測定(XPS)
装置:アルバック・ファイ(株)製 ESCA 5800
測定条件:14.0kV、14mA
中和条件:bias(V)6.00
Extractor(V)30
X=19.5
Y;角度により変更
4DMA:ポリエチレングリコールジメタクリレート(エチレンオキシド数≒4)[日油(株)製 ブレンマー(登録商標)PDE−200]
ACVA:4,4’−アゾビス(4−シアノバレリン酸)[和光純薬工業(株)製 V−501]
NHS:N−ヒドロキシコハク酸イミド[和光純薬工業(株)製]
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド[東京化成工業(株)製]
BAHA:6−[(+)−ビオチンアミド]ヘキシルアミン
PMMA:ポリメタクリル酸メチル[Polymer Source社製 重量平均分子量:315,000]
IPA:2−プロパノール
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
PGME:プロピレングリコールモノメチルエーテル
THF:テトラヒドロフラン
200mLの反応フラスコに、PGME53gを仕込み、撹拌しながら5分間窒素を流し込み、内液が還流するまで(およそ120℃)加熱した。
別の100mLの反応フラスコに、4DMA6.6g(20mmol)、ACVA2.8g(10mmol)及びPGME53gを仕込み、撹拌しながら5分間窒素を流し込み窒素置換を行い、氷浴にて0℃まで冷却を行なった。
前述の200mLの反応フラスコ中の還流してあるPGME中に、4DMA、ACVAが仕込まれた前述100mLの反応フラスコから、滴下ポンプを用いて、内容物を30分間かけて滴下した。滴下終了後、さらに1時間撹拌した。
次に、この反応液からロータリーエバポレーターを用いて仕込んだPGMEのおよそ80%(86g)を留去後、冷水297gに添加してポリマーを粘稠物として沈殿させた。この粘稠物をデカンテーションにより単離し、メタノール20gに再溶解させた。この溶液を冷水297gに添加して、再度ポリマーを粘稠物として沈殿させた。この粘稠物をデカンテーションにより単離し、メタノール20gに再溶解後、減圧留去、真空乾燥して、白色粉末の目的物(高分岐ポリマー1)4.5gを得た。
得られた目的物の、GPCによるポリスチレン換算で測定される重量平均分子量Mwは4,200、分散度:Mw(重量平均分子量)/Mn(数平均分子量)は2.2であった。また、水酸化ナトリウム水溶液による中和滴定から求めた目的物一分子中のカルボキシ基数は5であった。この目的物の1H NMRスペクトルの測定結果を図1に示す。
50mLの反応フラスコに、ビオチン[和光純薬工業(株)製]1.0g、NHS0.59g及びDMF19gを仕込み、50℃で撹拌して溶解させた。この溶液にDCC1.0gを加え、窒素雰囲気下、50℃で24時間撹拌した。次に、この反応液から濾過により不溶物を除去し、DMFを留去した。得られた残渣をジエチルエーテル3gで洗浄した後、IPA15gから再結晶させた。得られた白色結晶を減圧濾過、真空乾燥して、ビオチンN−ヒドロキシコハク酸イミドエステル1.0gを得た。
このエステル1.0gをDMF24gに溶解させた溶液を、ヘキサメチレンジアミン[和光純薬工業(株)製]2.4gをDMF10gに溶解させた溶液中に、滴下漏斗を用いて40分間かけて滴下した。滴下終了後さらに18時間撹拌した。次に、この反応液からDMFを留去した。得られた残渣をエタノール10gで洗浄し、真空乾燥して、白色粉末の目的物(BAHA)0.82gを得た。この目的物の1H NMRスペクトルの測定結果を図2に示す。
25mLの反応フラスコに、合成例1で得られた高分岐ポリマー1 0.40g、NHS0.11g及びDMF6gを仕込み、撹拌して溶解させた。この溶液にDCC0.20gを加え、窒素雰囲気下、室温(およそ25℃)で40時間撹拌した。
次に、この反応液から濾過により不溶物を除去し、DMFを留去した。得られた残渣をクロロホルム4.5gに溶解させ、この溶液をジエチルエーテル30gに添加した。析出した粘稠物をデカンテーションにより単離し、クロロホルム3.5gに再溶解後、減圧留去、真空乾燥して、白色粉末の目的物(高分岐ポリマー2:活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマー)0.38gを得た。
なお、得られた目的物のGPCによるポリスチレン換算で測定される重量平均分子量Mwは、測定中に活性エステル部分が分解してしまうため測定できなかった。この目的物の1H NMRスペクトルの測定結果を図3に示す。
25mLの反応フラスコに、実施例1で得られた高分岐ポリマー2 0.19g及びTHF2gを仕込み高分岐ポリマー溶液を調製した。
別の50mLの反応フラスコに、合成例2で得られたBAHA0.13g及びメタノール11gを仕込み、60℃で撹拌して溶解させた。この溶液へ上述の高分岐ポリマー溶液を加え、窒素雰囲気下、室温(およそ25℃)で18時間撹拌した。
次に、ロータリーエバポレーターを用いてこの反応液の溶媒を留去し、乾固させた。この残渣をメタノール4gに溶解させ、ジエチルエーテル36gに添加してポリマーをスラリー状態で沈殿させた。このスラリーを減圧濾過し、再度メタノール4gに溶解、ジエチルエーテル36gに添加してポリマーをスラリー状態で沈殿させた。このスラリーを減圧濾過し、真空乾燥して、白色粉末の目的物(高分岐ポリマー3:生体分子親和性高分岐ポリマー)0.09gを得た。
なお、得られた目的物のGPCによるポリスチレン換算で測定される重量平均分子量Mwは、目的物の溶媒溶解度が低く測定できなかった。この目的物の1H NMRスペクトルの測定結果を図4に示す。
実施例2で得られた高分岐ポリマー3を、1質量%濃度となるようにTHF−メタノール混合溶液(質量比9:1)に溶解させ、フィルタ濾過し、ワニスを調製した。このワニスを、シリコンウエハー上にスピンコーティング(3,000rpm×60秒間)した。この塗布膜を、室温(およそ25℃)で24時間真空乾燥することで溶媒を除去し、分子認識膜を得た。
実施例2で得られた高分岐ポリマー3及びPMMAを質量比2:8で混合した。この混合物を、1質量%濃度となるようにTHF−メタノール混合溶液(質量比9:1)に溶解させ、フィルタ濾過し、ワニスを調製した。このワニスを、シリコンウエハー上にスピンコーティング(3,000rpm×60秒間)した。この塗布膜を、室温(およそ25℃)で24時間真空乾燥することで溶媒を除去し、分子認識膜を得た。得られた膜の表面組成を、角度分解XPS測定に基づき評価した。結果を図5に示す。
実施例4で得られた膜を、メタノール5mLを入れたビーカーを内部に置いた内容積およそ50mLのデシケーター中に収め、室温(およそ25℃)で1時間溶媒アニーリング処理を施した。乾燥後、得られた膜に対して角度分解XPS測定を実施し、X線の入射角に対する炭素原子と窒素原子の強度比で表される膜の表面組成を評価した。結果を図5に併せて示す。sinθの値が小さいほど膜表面近傍の強度比を表す。
図5に示すように、メタノールで1時間溶媒アニーリング処理を施すことにより、膜表面付近において、炭素原子に対する窒素原子の割合が増加する結果が得られ、すなわち、窒素原子を含有する末端にビオチンを有する前記高分岐ポリマー3が膜の表面近傍に多く存在していることが確認された。
実施例5で得られた分子認識膜を、50μmol/Lのストレプトアビジン[和光純薬工業(株)製]/pH7.3リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液に、室温(およそ25℃)で15分間浸漬した。この分子認識膜を水洗、乾燥して得られた膜、及びストレプトアビジン溶液浸漬前の膜に対してXPS測定を実施し、膜の表面組成を評価した。結果を図6(浸漬前)、図7(浸漬後)に示す。
図6、7に示すように、浸漬前後においてストレプトアビジンに起因する窒素原子(N1s)のピーク(398eV付近)の増加が観測された。この結果より、分子認識膜表面にストレプトアビジンが固定(認識)されていることが確認された。
Claims (13)
- 分子内にアルキレンオキシド及び2個以上のラジカル重合性二重結合を有する、ジビニル化合物又はジ(メタ)アクリレート化合物であるモノマーを、該モノマーのモル数に対して5モル%以上200モル%以下のアゾ系重合開始剤の存在下で重合させることにより得られる高分岐ポリマーであって、その分子末端に、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子部位を有する、生体分子親和性高分岐ポリマー。
- 前記重合開始剤が4,4’−アゾビス(4−シアノバレリン酸)である、請求項1又は請求項2に記載の生体分子親和性高分岐ポリマー。
- 請求項1乃至請求項3のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーを含有するワニス。
- 請求項1乃至請求項3のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーより作製される薄膜。
- (a)請求項1乃至請求項3のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマー、及び(b)親水性の低い熱可塑性樹脂を含む樹脂ブレンド。
- 請求項6に記載の樹脂ブレンドより作製される薄膜。
- 請求項1乃至請求項3のうち何れか一項に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーより作製される薄膜の製造方法であって、
該生体分子親和性高分岐ポリマーを溶媒中に含む液をスピンコート法により基材上に塗布し、塗膜を形成する工程、及び
該塗膜を乾燥し溶媒を除去する工程
を含む、薄膜の製造方法。 - 請求項6に記載の樹脂ブレンドより作製される薄膜の製造方法であって、
該樹脂ブレンドを溶媒中に含む液をスピンコート法により基材上に塗布し、塗膜を形成する工程、
該塗膜を乾燥し溶媒を除去する工程、及び
親水性媒体の雰囲気下で、得られた塗膜のアニーリングを行う工程
を含む、薄膜の製造方法。 - 請求項8又は請求項9に記載の薄膜を基材上に備え、これにより、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子を認識可能な、分子認識表面チップ。
- 分子内にアルキレンオキシド及び2個以上のラジカル重合性二重結合を有する、ジビニル化合物又はジ(メタ)アクリレート化合物であるモノマーを、該モノマーのモル数に対して5モル%以上200モル%以下の分子内にカルボキシ基を有するアゾ系重合開始剤の存在下で重合させることにより得られるカルボキシ基含有高分岐ポリマーを、N−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることにより得られる、該カルボキシ基の一部又は全部がヒドロキシコハク酸イミドエステル化された、活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマー。
- 請求項11に記載の活性化カルボキシ基含有高分岐ポリマーと、
該活性化カルボキシ基と反応し得る官能基、並びにビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドとその相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリン
とフィブロネクチン、及びヘパリンとラミニンとの組合せの対からなる群から選ばれる少なくとも何れか一種の対の一方の生体分子部位を有する化合物とを反応させることを特徴とする、請求項1に記載の生体分子親和性高分岐ポリマーの製造方法。 - 前記活性化カルボキシ基と反応し得る官能基がアミノ基である、請求項12に記載の製造方法。
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