JP6320684B2 - 陽性対照の概念 - Google Patents

Description

本発明は、増幅を用いる診断的核酸試験に関する対照概念に関する。

増幅により標的核酸を検出または定量化するための診断試験において、一般に異なる対照が用いられる。内部対照は、反応混合物に添加され、全ての単独の増幅反応の質に関して照査することおよび／またはその反応中の標的核酸を定量化することを可能にする対照核酸である。さらに、標的核酸を欠く陰性対照は、用いた試薬が標的核酸で汚染されていないことを保証するために運転される（ｒｕｎ）。最後に、その系（機器および試薬等）の正しい機能を保証するために陽性対照も用いられる。一般に、それぞれのアッセイに関して、対応する陽性対照が提供される。例えば、ＨＩＶアッセイに関して、ＨＩＶ核酸を含む陽性対照が提供される。ＨＢＶアッセイに関して、ＨＢＶ核酸を含む陽性対照が提供される。単一のバイアル中でのＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの同時の定性的および定量的検出のためのアッセイに関して、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの混合物を含む陽性対照が提供される。このように、その陽性対照は、それに関してそのアッセイが設計されている標的核酸を正確に含む。これはそれぞれのアッセイに関する陽性対照の別個の製造を必要とする。さらに、それぞれのアッセイに関する別個の対照バイアルが、標的核酸を検出または定量化するための方法が実施される機器システムに提供されなければならない。

一般的な記述
以下の工程を含む、別個のバイアル中で少なくとも２種類の異なる標的核酸を検出または定量化する方法を提供する：
ａ）前記の少なくとも２種類の標的核酸を増幅すること、ここで前記の第１標的核酸は第１バイアル中で前記の第２標的核酸を増幅せずに増幅され、前記の第２標的核酸は第２バイアル中で前記の第１標的核酸を増幅せずに増幅される；
ｂ）工程ａ）と並行して、第３バイアル中で第１陽性対照核酸を増幅すること、ここで前記の第１陽性対照核酸は前記の第１標的核酸に関する陽性対照であり、そして第４バイアル中で第２陽性対照核酸を増幅すること、ここで前記の第２陽性対照核酸は前記の第２標的核酸に関する陽性対照であり；ここで前記の第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸は、前記の第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を含む陽性対照バイアルからその第３バイアルおよび第４バイアルに増幅の前に提供される。

さらに、本明細書で記述するようなラックを含むキットを提供し、ここでそのラックは少なくとも２個の陽性対照バイアルを含む。その少なくとも２個の陽性対照バイアルは、前記のラックの前記の開口部中に保持されている。前記の陽性対照バイアルのそれぞれは、少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む。その少なくとも２種類の陽性対照核酸は、前記の分析器において実施される増幅反応における外部陽性対照としての使用のためのものである。そのキットはラベルを含み、ここで前記のラベルはキットの構成要素を用いて検出されるべき単一の標的核酸を示し、ここで前記の標的核酸はそのラックの陽性対照バイアル中の陽性対照核酸の１つである。そのキットはさらに、前記の標的核酸および対応する陽性対照核酸の増幅のための試薬を含むマスター混合物を含むマスター混合物バイアルを含む。そのキットは、そのラベル上に示されている前記の標的核酸と一致しないが前記の陽性対照バイアルのストック溶液中に存在する少なくとも１種類の陽性対照核酸に対応する標的核酸の増幅のための試薬を含むマスター混合物を含まない。

以下のものを含むキットも提供する：少なくとも２個の陽性対照バイアルを有するラック、ここで前記の陽性対照バイアルのそれぞれは少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む；前記のストック溶液中に存在する対応する陽性対照核酸のための全ての標的核酸を示すラベル。そのラベルは、その陽性対照核酸のストック溶液を含むラックがその標的核酸の１種類を検出するための方法における使用のためのものであって、対応する陽性対照核酸が単一のバイアル中でそのストック溶液中に含まれているその他の標的核酸を検出するための方法における使用のためのものではないことも示す。

混合物の使用を提供し、ここで前記の混合物は別個の陽性対照反応において少なくとも第１陽性対照核酸および第２陽性対照核酸を含み、ここで前記の第１対照核酸は前記の第２陽性対照核酸の増幅の非存在下で増幅され、前記の第２陽性対照核酸は前記の第１対照核酸の増幅の非存在下で増幅される。

試料調製の作業の流れ 少なくとも２種類の標的分析物の検出および陽性対照の検出のためのバイアルを含む分析系。 少なくとも３種類の標的分析物の検出および陽性対照の検出のためのバイアルを含む分析系。 陽性対照に対応する少なくとも２種類の標的分析物の検出および陰性対照のためのバイアルを含む分析系。 図５はバイアルを有するサーモブロックを示す。 図６は装填（ｌｏａｄｉｎｇ）ステーション、分離ステーション、増幅ステーションおよび陽性対照バイアルを有するラックを含む分析系を示す。 図７は陽性対照バイアルを有するラック、ラベルおよび増幅試薬を含む容器を有するキットを示す。

以下の工程を含む、別個のバイアル中で少なくとも２種類の異なる標的核酸を検出または定量化する方法を提供する：
ａ）前記の少なくとも２種類の標的核酸を増幅すること、ここで前記の第１標的核酸は第１バイアル中で前記の第２標的核酸を増幅せずに増幅され、前記の第２標的核酸は第２バイアル中で前記の第１標的核酸を増幅せずに増幅される；
ｂ）工程ａ）と並行して、第３バイアル中で第１陽性対照核酸を増幅すること、ここで前記の第１陽性対照核酸は前記の第１標的核酸に関する陽性対照であり、そして第４バイアル中で第２陽性対照核酸を増幅すること、ここで前記の第２陽性対照核酸は前記の第２標的核酸に関する陽性対照であり；ここで前記の第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸は、増幅の前に前記の第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を含む陽性対照バイアルからその第３バイアルおよびその第４バイアルに提供される。

この方法の利点は、少なくとも２種類の異なる標的核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を用いることにより、異なる標的核酸を検出または定量化するアッセイに関して個々の陽性対照を運転するために複数の陽性対照の単一の陽性対照ストック溶液のみが必要とされることである。これは、異なる試験キットのためにより大きな陽性対照のバッチを製造することができるため、製造に関して向上した効率および費用節約を提供する。それはまた、陽性対照の混合物を含む単一のバイアルを異なる標的核酸を検出または定量化するために用いることができるため、標的核酸を検出または定量化するための分析系を単純化する。

上記の方法において、前記の第１標的核酸を第１バイアル中で前記の第２標的核酸を増幅せずに増幅し、前記の第２標的核酸を第２バイアル中で前記の第１標的核酸を増幅せずに増幅して前記の少なくとも２種類の標的核酸を増幅することは、前記の第１標的核酸を特異的に増幅するためのプライマーのみを第１バイアルに添加することにより達成される。第２標的核酸またはあらゆるさらなる標的核酸を増幅するためのプライマーは第１バイアルには添加されず、従ってそれは第１バイアルには存在しない。第２標的核酸の増幅は、第２標的核酸を特異的に増幅するためのプライマーのみを第２バイアルに添加することにより達成される。第１標的核酸または第２標的核酸以外のあらゆるさらなる標的核酸を増幅するためのプライマーは第２バイアルには添加されず、従ってそれは第２バイアルには存在しない。同様に、第１標的核酸に関する陽性対照を増幅するためのプライマーのみが第３バイアルに添加され、第２標的核酸に関する陽性対照を増幅するためのプライマーのみが第４バイアルに添加される。他の標的核酸を検出するためのプライマーは、これらのバイアルには存在しない。同じ原理が第３または第４標的核酸ならびにそれらのそれぞれの陽性対照反応に適用されることは理解される。従って、第３標的核酸が増幅される場合、それは第３標的核酸に関する特異的なプライマーの存在下で、かつ第１または第２またはあらゆる他の異なる標的核酸に特異的なプライマーの非存在下で増幅される。特定の態様において、ある特異的な標的核酸に関して用いられるプライマーは、対応する陽性対照に関して用いられるプライマーと同じものである。

その陽性対照は並行して増幅される。これは、それらが同じ熱的プロフィールを用いて増幅されることを意味する。１態様において、その第１、第２、第３および第４バイアルは１つのマルチウェルプレートの器（ｖｅｓｓｅｌｓ）であり、そのマルチウェルプレートを置くサーモブロックはそのマルチウェルプレートの器の全てに同じ熱的プロフィールを適用する。陽性対照は、診断アッセイにおける標的核酸の検出または定量化の間の増幅試薬および条件の質を保証するために用いられる。

１つの特定の態様において、さらなる工程で、その標的核酸および陽性対照核酸を検出または定量化する。
用語“検出する”は、本明細書で用いられる際、試料中の標的核酸の存在または非存在を評価することを目的とする定性試験に関する。例として、検出はその標的核酸と結合する蛍光色素を測定することによることができる。

用語“定量化する”は、本明細書で用いられる際、試料中に存在する標的核酸の量または濃度の決定に関する。定量化は、既知の濃度の内部標準の増幅に基づいて実施される。
用語“増幅する”は、本明細書で用いられる際、一般に標的核酸からの複数の核酸分子の生成を指し、ここでプライマーがポリメラーゼによる伸長のための開始部位を提供するためにその標的核酸分子上の特定の部位にハイブリダイズする。増幅は当技術で一般的に知られているあらゆる方法により実施することができ、それは例えば以下の方法であるが、それらに限定されない：標準的なＰＣＲ、ロングＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび等温増幅法。他の増幅反応には、とりわけ、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、ギャップ−ＬＣＲ（Ｇａｐ−ＬＣＲ）、修復連鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、およびＱβ−増幅が含まれる。

用語“異なる標的核酸”は、本明細書で用いられる際、アッセイされる異なる標的に関する。標的核酸は、生物学的試料中に存在する可能性があり、そのアッセイにより標的とされる核酸である。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡ、二本鎖もしくは一本鎖核酸を含む。１態様において、その核酸はヒトまたは動物またはウイルスまたは微生物の核酸であってよい。従って、用語“異なる標的核酸”は、本明細書で用いられる際、アッセイされる異なる標的に関する。

２種類の標的核酸が別個のバイアル中で試験される場合、それは一方の標的核酸は一方のバイアル中で試験されるが他方のバイアル中では試験されず、第２標的核酸に関してもまた同じであることを意味する。

用語“バイアル”は、液体溶液を保持するための入れ物またはチューブまたは容器または器に関する。そのようなバイアルには、反応が起こるバイアルが含まれる。そのようなバイアルはまた、反応における使用のための溶液または混合物が、反応が起こる異なるバイアルに移される前に保管されるバイアルに関してもよい。一部の態様において、１個より多くのバイアルが一体的に形成されている。１態様において、反応が起こるバイアルはマルチウェルプレートの器である。別の態様において、バイアルは、貫通できるキャップを含んでいてよくラック中に保持されている個々のバイアルである。

用語“陽性対照核酸”は、本明細書で用いられる際、それぞれの標的核酸に関する陽性対照である対照核酸に関し、それは標的核酸と同じプライマーおよびプローブにより増幅された際に、その反応混合物および増幅条件がその標的核酸が存在する場合はその増幅および検出を可能にすることを示す検出可能なシグナルを結果としてもたらす。限定的でない例として、方法がＨＩＶの定量化に向けられている場合、その陽性対照核酸はＨＩＶ配列を含み、それは例えば装甲（ａｒｍｏｒｅｄ）粒子としてパッケージングされる。装甲粒子は当技術において既知であり、ＨＩＶのエンベロープを真似る。従って、その陽性対照核酸はその標的核酸に関する陽性対照の役目を果たす。その陽性対照は一般に別個のバイアル中でその標的核酸と並行して増幅される。

用語“陽性対照バイアル”は、本明細書で用いられる際、少なくとも第１および第２陽性対照核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を含むバイアルに関する。用語“単一の陽性対照ストック溶液”は、その第１および第２陽性対照核酸が２つの異なる個別の陽性対照ストック溶液中ではなく共通の陽性対照ストック溶液中に存在することを意味する。

従って、その第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸は、単一の共通の陽性対照ストック溶液から、例えばピペッターを用いたピペット操作により第３バイアルおよび第４バイアルに提供される。従って、異なる標的核酸に関する異なる個別のアッセイの運転に関して１つの陽性対照ストック溶液のみを必要し、それはその系を単純化する。

１つの特定の態様において、その方法は加えてａ）およびｂ）と並行して第５バイアル中で陰性対照を増幅することを含み、ここで前記の陰性対照は陰性対照バイアル中に含まれる第２の単一の陰性対照ストック溶液から提供される。

用語“陰性対照”は、本明細書で用いられる際、標的核酸が存在しない対照に関する。陰性対照の目的は、その方法を実施することができる分析器のあらゆる試薬または機器の部品が標的核酸で汚染されているかどうかを試験することである。

１態様において、その方法は自動化された分析器中で実施される。その方法が自動化された分析器中で実施される場合、その方法はその分析器に提供される異なる内容物を有する陽性対照バイアルの数を減らすことができるという利点を有する。従って、その分析器においてより少ないバイアルを装填、処理および同定すればよい。

生物学的試料は、本明細書で記述される方法において、その生物学的試料の分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）をバイアル中にピペットで移すことにより提供される。標的核酸は、細胞またはウイルス粒子から溶菌により放出させることができる。次いでその標的核酸を増幅の前に、例えば磁性粒子を用いる、カオトロピック化合物の存在下での固相分離により濃縮する（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）ことができる。あるいは、その標的核酸を他の物質から、その標的核酸に、またはポリＡに特異的にハイブリダイズし、固相、例えばポリマー物質またはガラス粒子に結合しているオリゴヌクレオチドを用いる標的捕捉により分離することができる。そのような方法は当技術において周知である。分離の後、その固相を洗浄して増幅反応に関する阻害物質を除去することができ、その結合した核酸を溶離し、次いで増幅を行うことができる。その陽性対照および陰性対照は、試験すべき核酸と同じ溶菌および濃縮工程を受けさせることができる。

用語“生物学的試料”は、それに対して核酸を標的とする診断アッセイを行うことができる物質に関し、通常は生物学的源に由来する。一部の態様において、前記の生物学的試料はヒトに由来し、体液である。本発明の１態様において、その生物学的試料はヒトの血液、尿、痰、汗、拭き取り検体、ピペットで扱うことができる便、または髄液である。その生物学的試料は、標的核酸を抽出することができる組織であってもよい。

“標的核酸”は、当業者に既知であるようなヌクレオチドの重合体化合物である。“標的核酸”は、本明細書において、分析されるべき試料中の核酸、すなわち試料中のその存在、非存在および／または量が決定されるべき核酸という意味で用いられる。その標的核酸は、ゲノム配列、例えば特定の遺伝子の一部、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。他の態様において、その標的核酸はウイルスまたは微生物の核酸であってよい。特定の態様において、その標的核酸はＨＩＶ、ＨＣＶおよび／またはＨＢＶであってよい。

用語“分割量”は、本明細書で用いられる際、試験のために用いられる液体の一部に関する。分割量は典型的にはピペットで液体の一部をバイアルに移すことにより生成され、次いでそこでさらなる処理を行う。液体の２個以上の分割量が必要である場合、例えばその液体のある量を吸引し、その量の一部を２個以上のウェルの中に放出することが可能である。あるいは、単一のバイアルに関して意図される液体の量のみを一度に分配する。

１つの特定の態様において、前記の陽性対照バイアルはラック中で提供され、前記の陰性対照バイアルはその陽性対照バイアルを含むラックとは異なる第２のラック中で提供される。

陽性対照バイアルはその分析器に、その分析器中に装填することにより提供される。従って、その陽性対照バイアルは、それらがその分析器中に装填される際にラック中に保持されている。別個のラック中の陽性対照バイアルおよび陰性対照バイアルを装填することは、陰性対照を陽性対照よりも高い頻度で運転することができるという利点を有する。これは、陽性または陰性対照バイアルを保持するラックの取り扱いのより高い効率をもたらす。従って、１態様において、前記の陽性対照バイアルを含むラック中に、陰性対照バイアルは存在しない。１態様において、前記の陰性対照バイアルを含むラック中に、陽性対照バイアルは存在しない。少なくとも１個の陽性対照バイアルを保持するラック中に陰性対照バイアルが存在しないことは、その陰性対照バイアルの汚染の危険性を低減する。

１態様において、前記の陽性対照バイアルを含むラックは少なくとも２個の陽性対照バイアルを含み、ここで前記の少なくとも２個の陽性対照バイアルの全てが同一の陽性対照核酸の混合物を含む。用語“同一の”は、その陽性対照核酸が同じ陽性対照核酸を含むことに関するが、１つの陽性対照バイアルは同じラック中の別の陽性対照バイアルとは異なる濃度の陽性対照核酸を有していてよい。この態様の陽性対照バイアルのいずれも、同じラックのその他の陽性対照バイアル中に含まれていない陽性対照核酸は含まない。これにより、１つのラックは同じ陽性対照核酸を含む陽性対照バイアルのみを保持しているため、その自動化された系の複雑さが低減される。さらに、これは異なる陽性対照核酸の混合物を含むバイアル間の交差汚染の危険性も低減する。

１態様において、少なくとも３種類の異なる標的核酸が検出または定量化され、それは追加で工程ａ）において第３標的核酸を第６バイアル中で前記の第１または第２標的核酸を増幅せずに増幅すること、および工程ｂ）において追加で第３陽性対照核酸を増幅することを含み、ここで前記の第３陽性対照核酸は前記の第３標的核酸に関する陽性対照であり、ここで前記の第３陽性対照核酸は第７バイアル中で増幅され、ここで前記の第１陽性対照核酸、前記の第２陽性対照核酸および前記の第３陽性対照核酸は第３バイアル、第４バイアルおよび第７バイアルに、前記の第１陽性対照核酸、前記の第２陽性対照核酸および前記の第３陽性対照核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を含む陽性対照バイアルから増幅の前に提供される。従って、この方法により、１つの対照の混合物を用いて、３種類の異なる標的核酸をそれぞれ個別に別個のバイアル中で検出または定量化する３つの異なるアッセイに関して陽性対照反応を実施することができる。

１つの特定の態様において、前記の第１ラック中に含まれる全ての陽性対照バイアルは、１×１０Ｅ５〜１×１０Ｅ８コピー／ｍｌの、または１×１０Ｅ２〜５×１０Ｅ３コピー／ｍｌの濃度の前記の陽性対照核酸を含む。その濃度は他の単位、例えばＩＵ／ｍｌで提供されてもよい。コピー／ｍｌをＩＵ／ｍｌに変換するための係数はその特定の標的に依存し、１．０から１６までの範囲であってよい。従って、そのラックはより高い濃度の陽性対照核酸またはより低い濃度の陽性対照核酸のどちらかを含む。これは、本明細書で明記したように、より高い濃度の陽性対照核酸を含むバイアルとより低い濃度の陽性対照核酸を含むバイアルの間のあらゆる交差汚染の危険性を低減する。上記で記述したより高い濃度の陽性対照核酸のみを有するバイアルは、定量アッセイのために用いられる。その陽性対照混合物は、その反応混合物中にその反応のストリンジェンシーに影響を及ぼす可能性のあるより多くの増幅されない核酸が存在するという事実にも関わらず、用いることができる。

上記で記述した方法において、その実施される試験は、１つのラックのバイアル中の陽性対照核酸の混合物の組成に合うアッセイの群に分類することができる。
本発明はまた、少なくとも１個の高濃度陽性対照バイアルおよび／または少なくとも１個の低濃度陽性対照バイアルを含むラックに関し、ここで前記の高濃度陽性対照バイアルは１×１０Ｅ５〜１×１０Ｅ８コピー／ｍｌの濃度の少なくとも２種類の異なる陽性対照核酸の混合物を含み、前記の低濃度陽性対照バイアルは１×１０Ｅ２〜５×１０Ｅ３コピー／ｍｌの濃度の同じ２種類の異なる陽性対照核酸の混合物を含む。このラックを用いて、高陽性対照核酸および／または低陽性対照核酸の混合物を、自動化された分析器に、異なるバイアル中で少なくとも２種類の異なるパラメーターの定量および／または定性アッセイを実施するために提供することができる。１態様において、１個のラックは等しい数の高陽性対照核酸および低陽性対照核酸を含む。用語“高陽性対照核酸”は、本明細書で記述したようなより高い濃度の陽性対照核酸に関し、“低陽性対照核酸”は、本明細書で記述したようなより低い濃度の陽性対照核酸に関する。

本発明はさらに、自動化された核酸分析器中に装填するのに適合したラックに関する。そのラックは、少なくとも２個のバイアルを受け入れるための少なくとも２個の開口部を含む。その少なくとも２個のバイアルは、前記のラックの前記の開口部中に保持される。前記のバイアルのそれぞれは、少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む。その少なくとも２種類の陽性対照核酸は、前記の分析器中で実施される増幅反応中の外部陽性対照としての使用のためのものである。その利点は本明細書で記述した通りである。

本発明は、少なくとも２個の陽性対照バイアルを受け入れるための少なくとも２個の開口部を含むラックにも関する。その少なくとも２個の陽性対照バイアルは、前記のラックの前記の開口部中に保持される。前記の陽性対照バイアルのそれぞれは、少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む。その少なくとも２種類の陽性対照核酸は、前記の分析器中で実施される増幅反応中の外部陽性対照としての使用のためのものである。１態様において、そのラックはそのラックの開口部中に保持された少なくとも２個の陽性対照バイアルを含み、ここで少なくとも１個の陽性対照バイアルは高濃度陽性対照バイアルであり、１個の陽性対照バイアルは低濃度陽性対照バイアルであり、ここで前記の高濃度陽性対照バイアルは１×１０Ｅ５〜１×１０Ｅ８コピー／ｍｌの濃度の少なくとも２種類の異なる陽性対照核酸の混合物を含み、前記の低濃度陽性対照バイアルは１×１０Ｅ２〜５×１０Ｅ３コピー／ｍｌの濃度の同じ２種類の異なる陽性対照核酸の混合物を含む。その利点は本明細書で記述した通りである。１態様において、そのラックは、陽性対照バイアルをそのラックの開口部中に受け入れた後閉じることができるカバーを含む。さらなる態様において、その陽性対照バイアルは蓋を含む。特定の態様において、その対照バイアルの蓋はホイルのようなもろい密封材を含む。

本明細書で記述したようなラックを含むキットも開示し、ここでそのラックは少なくとも２個の陽性対照バイアルを含む。その少なくとも２個の陽性対照バイアルは前記のラック中に保持されている。前記の陽性対照バイアルのそれぞれは、少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む。その少なくとも２種類の陽性対照核酸は、前記の分析器中で実施される増幅反応における外部陽性対照としての使用のためのものである。そのキットはラベルを含み、ここで前記のラベルはそのキットの構成要素を用いて検出されるべき単一の標的核酸を示し、ここで前記の標的核酸はそのラックの陽性対照バイアル中の陽性対照核酸の１種類である。そのキットはさらに、前記の標的核酸および対応する陽性対照核酸の増幅のための試薬を含むマスター混合物を含むマスター混合物バイアルを含む。そのキットは、そのラベル上に示されている前記の標的核酸と一致しないが前記の陽性対照バイアルのストック溶液中に存在する少なくとも１種類の陽性対照核酸に対応する標的核酸の増幅のための試薬を含むマスター混合物を含まない。１態様において、そのキットは、本明細書で記述したような高濃度の陽性対照核酸を有する陽性対照バイアルおよび低濃度の陽性対照核酸を有する陽性対照バイアルを含む。１態様において、そのラックは少なくとも２個の陽性対照バイアルを受け入れるための少なくとも２個の開口部を含む。

用語“増幅試薬”は、本明細書で用いられる際、核酸の増幅を可能にする化学的または生化学的構成要素に関する。そのような試薬には、核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、モノヌクレオチド、例えばヌクレオシド三リン酸、例えばオリゴヌクレオチドプライマーのようなオリゴヌクレオチド、塩類およびそれらのそれぞれの溶液、検出プローブ、色素等が含まれてよいが、それらに限定されない。

１つの特定の態様において、そのマスター混合物は、その試薬により増幅される予定の標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
“オリゴヌクレオチド”には“修飾オリゴヌクレオチド”（または“オリゴヌクレオチド類似体”）が含まれてよい。それらはオリゴマー化合物の亜集団である。この発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”は、それらの単量体単位としての複数のヌクレオチドから形成された構成要素を指す。そのホスフェート基は一般にそのオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものとして言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または主鎖は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。本発明に有用なオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド（下記参照）は、主に当技術で記述されており当業者に既知であるように合成することができる。特定の配列のオリゴマー化合物を調製するための方法は当技術で既知であり、それには例えば適切な配列のクローニングおよび制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）ならびに直接的な化学合成が含まれる。化学合成法には、例えばNarang S. A. et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98により記述されたホスホトリエステル法、Brown E. L., et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151により開示されたホスホジエステル法、Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859において開示されたホスホラミダイト法、Garegg et al., Chem. Scr. 25 (1985) 280-282において開示されたＨ−ホスホネート法、および米国特許第４，４５８，０６６号において開示された固体支持体法が含まれてよい。

本発明に従う方法において、そのオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されていてよく、すなわちそのプライマーおよび／またはプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む。そのプローブまたはそのプライマーはその場合修飾オリゴヌクレオチドである。

別の態様において、キットは以下のものを含む：少なくとも２個の陽性対照バイアルを有するラック、ここで前記の陽性対照バイアルのそれぞれは少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む；対応する陽性対照核酸が前記のストック溶液中に存在する全ての標的核酸を示すラベル。そのラベルは、その陽性対照核酸のストック溶液を含むラックがその標的核酸の１種類を検出するための方法における使用のためのものであって、対応する陽性対照核酸が単一のバイアル中でそのストック溶液中に含まれているその他の標的核酸を検出するための方法における使用のためのものではないことも示す。１態様において、そのキットは本明細書で記述したような高濃度の陽性対照核酸を有する陽性対照バイアルおよび低濃度の陽性対照核酸を有する陽性対照バイアルを含む。１態様において、そのラックは少なくとも２個の陽性対照バイアルを受け入れるための少なくとも２個の開口部を含む。

用語“ラベル”は、そのキットおよび／またはラックおよび／または陽性対照バイアルに取り付ける、または張り付けることができるあらゆるタイプのラベルに関する。そのラベルは、その上に情報が操作者が読むことができる様式で印刷されている面、およびキット、ラックおよび／または陽性対照バイアルへの張り付けのための接着剤を含む第２の面を含んでいてよい。

１つの特定の態様において、陰性対照溶液を含む陰性対照バイアルは前記のラックに存在しない。陰性対照バイアルが少なくとも１個の陽性対照バイアルを保持するラック中に存在しないことは、その陰性対照バイアルの汚染の危険性を低減する。

本明細書で記述したラックの１態様において、核酸が存在しない溶液を含む陰性対照バイアルはそのラックのどの開口部にも保持されていない。その利点は本明細書で記述した通りである。

別個のバイアル中で少なくとも２種類の異なる標的核酸を検出または定量化するための分析系も開示する。その分析系は、標的核酸の検出、陽性対照および陰性対照の検出のためのバイアルを含む。１態様において、そのバイアルは一体的に形成されている。増幅のためのバイアルの特定の態様は、マルチウェルプレートの器である。本明細書で記述した方法は、分析系において実施することができる。１つの特定の態様において、その分析系は本明細書で記述したような陽性対照バイアルを含むラックを含む。特定の態様において、その分析系はさらに本明細書で記述したような陰性対照バイアルを含むラックを含む。その分析系の構成要素の特定の態様は本明細書で記述されている。そのラックの特定の態様も本明細書で記述されている通りである。

１つの特定の態様において、その分析系は前記のラックをその分析系中に装填するための装填ステーション、および前記のラック中に保持されている陽性対照バイアル中の陽性対照核酸のストック溶液の分割量を前記の陽性対照バイアルから標的核酸の増幅のためのバイアルに移すためのピペット操作ステーションを含む。１つの特定の態様において、その分析系はさらに核酸を単離するためのステーションを含む。さらなる特定の態様において、その分析系は標的核酸を増幅および／または検出するためのステーションを含む。

装填ステーションは、その中に陽性対照バイアルを含むラックを手作業で、または自動的にのどちらかで装填することができ、それからそのラックを分析系内のピペット操作ステーションに移すことができるステーションに関する。

ピペット操作ステーションは、ピペット操作装置を含むステーションに関する。ピペット操作装置は、液体をバイアル、例えば陽性対照バイアルから吸引することができ、その液体を異なるバイアル中に分配することができる。

核酸を単離するためのステーションは、核酸を検出または定量化すべき生物学的試料中に含まれる他の物質から核酸を分離することができるステーションに関する。そのような核酸を単離するためのステーションに関する限定的でない例は、核酸を固体支持体、例えば磁性粒子に結合させ、磁場を適用することによりその生物学的試料中の他の物質から分離する磁気分離ステーションである。その結合した核酸を洗浄して増幅の阻害物質を除去することができる。その核酸は、増幅の前にその固体支持体から溶離してよく、またはその固体支持体の存在下で増幅してもよい。

核酸を増幅および／または検出するためのステーションは、１態様において、その中でその標的核酸が増幅される恒温器に関する。その恒温器は、等温増幅法が用いられる場合は一定の温度で保たれている恒温器、またはサーモサイクラーであってよい。１態様において、核酸を増幅するためのステーションには、その増幅された核酸を検出するためのステーションも含まれる。限定的でない例として、そのようなステーションは、検出モジュールに組み込まれたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラーまたは等温恒温器であってよい。さらなる態様において、その分析系は別個の検出ステーションを含み、その中でその増幅された核酸が検出される。

その分析系には、１つの特定の態様において、その標的核酸の存在または非存在を決定するのに適合したコンピューター制御装置も含まれる。特定の態様において、そのコンピューター制御装置はその標的核酸および内部標準の増幅の間または後に検出される蛍光シグナルに基づいてその標的核酸を定量化するのに適合している。さらに、そのコンピューター制御装置は前記の標的核酸に関する陽性対照核酸の検出に基づいてその標的核酸の増幅に関する増幅試薬および増幅条件の質を決定するのに適合している。

１態様において、そのラックは本明細書で記述した方法において用いられる。そのラックは本明細書で記述したような自動化された分析器において用いられてもよい。
本発明は、別個の陽性対照反応における少なくとも第１陽性対照核酸および第２陽性対照核酸の混合物の使用にも関し、ここで前記の第１対照核酸は前記の第２陽性対照核酸の増幅の非存在下で増幅され、前記の第２陽性対照核酸は前記の第１対照核酸の増幅の非存在下で増幅される。これにより、個々の標的に関する別個の陽性対照反応が単一の陽性対照ストック溶液に基づくことができる。

１態様において、その混合物は本明細書で記述した方法において用いられる。１つの特定の態様において、その混合物は高濃度混合物または低濃度混合物である。高および低濃度混合物の態様は上記で記述されている。１態様において、高濃度混合物および低濃度混合物は並行して用いられる。従って、並行した異なる標的核酸の定量アッセイおよび／または定性アッセイに関して単一の混合物を用いることができる。

試料調製
この実施例は、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を用いて、第１、第２および第３標的核酸を別個のバイアル中で単離し、同時に増幅するためのプロセスを記述する。同じ陽性対照ストック溶液を、ＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶを個別に定量化するためのそれぞれのアッセイを伴う３つの個別の運転において評価する。

簡潔には、示した態様において、試料調製およびリアルタイムＰＣＲをＨＩＶ標的ＲＮＡ、ＨＣＶ標的ＲＮＡおよびＨＢＶ標的ＤＮＡを含む陽性対照ストック溶液に対して同一の条件下で同時に実施する。以下の陽性対照ストック溶液および陰性対照ストック溶液を分析した（ＨＰＣ：高濃度陽性対照；ＬＰＣ：低濃度陽性対照）：

。
それぞれの試料（２００ｕｌ）を手作業でピペットでディープウェルプレート中に移した。それぞれのウェルに５０ｕｌの内部定量標準を手作業で添加した。ＨＩＶおよびＨＣＶアッセイに関して、定量対照の役目を果たすＲＮＡを添加した（６×Ｅ４装甲粒子／試料）。定量的ＨＢＶアッセイに関して、定量標準の役目を果たすＤＮＡを添加した（１×Ｅ４ラムダ粒子／試料）。標準核酸の配列は全ての場合で同一であった。ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶを検出するための適切な配列、ならびに標準に関する配列およびその標準を検出するための配列は、ＥＰ２４２６２２２において開示されている。同じ標準を定性的および定量的決定の両方に関して用いることができる。

試料調製を、図１で示したスキームに従う作業の流れに従って実施した。合計３つの個別の運転を実施した；ＨＩＶアッセイのための１つの運転、ＨＢＶアッセイのための１つの運転およびＨＣＶアッセイのための１つの運転。全ての運転は、同じ陽性対照ストック溶液および同じ陰性対照ストック溶液を用いて実施された。

増幅および検出
それぞれの運転の最後の試料調製工程の後、その単離された核酸を含有する流体を増幅を実施するためにマイクロウェルプレートの対応するウェルに移し、その単離された核酸を増幅試薬を含有するそれぞれのマスター混合物Ｒ１およびＲ２と混合した。

増幅および検出のため、そのマイクロウェルプレートを自動化されたプレートシーラーを用いて密封し、そのプレートを分析的サイクラー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）に移した。

全てのアッセイに関して以下の熱サイクルプロフィールを用いた：

その前ＰＣＲプログラムは、９４℃における最初の変性およびＲＮＡ鋳型の逆転写のための５５℃、６０℃および６５℃における保温を含む。３種類の温度における保温は、より低い温度においてわずかにミスマッチした標的配列（例えば生物の遺伝的変異体）も転写され、一方でより高い温度においてＲＮＡの二次構造の形成が抑制され、そうしてより効率的な転写がもたらされるという好都合な作用を組み合わせている。

ＰＣＲサイクルは２つの測定に分けられ、ここで両方の測定は１工程構成（アニーリングおよび伸長を組み合わせる）を適用する。５５℃における最初の５サイクルはわずかにミスマッチした標的配列を予め増幅することにより向上した包括性（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）を可能にし、一方で第２測定の４５サイクルは５８℃のアニーリング／伸長温度を用いることによる増大した特異性を提供する。

このプロフィールを上記で言及した全てのアッセイにおいて用いて、全てのアッセイおよび試料に関して増幅および検出を達成した。
以下の表４は、その定量標準と一緒でのＨｘＶ ＬＰＣおよびＨｘＶ ＨＰＣの試料調製および増幅の結果を示す。ＨｘＶ ＬＰＣおよびＨｘＶ ＨＰＣが全ての場合においてうまく増幅され、その定量標準を用いてうまく定量化されたことを理解することができる。

図２〜４は、本方法を実施するための分析系の典型的な態様を示す。図２は分析系（９）を示す。その分析系はさらに、標的１（Ｔ１）が決定されるバイアル（１）、標的２（Ｔ２）が決定されるバイアル（２）を含む。さらに、それは標的１（Ｔ１）に対応する陽性対照（ｐ１）が決定されるバイアル３、および標的２（Ｔ２）に対応する陽性対照（ｐ２）が決定されるバイアル４を含む。その陽性対照（ｐ１）および（ｐ２）は、（ｐ１）および（ｐ２）の混合物を含む陽性対照バイアル（ｐ）からバイアル３および４に添加される。

図３は、３種類の標的（Ｔ１）、（Ｔ２）および（Ｔ３）が決定されることを除いて図２の分析系に類似した分析系（９）を示し、ここで第３標的（Ｔ３）はバイアル（６）中で決定され、三種類の陽性対照（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）が（ｐ）の混合物中にあり、バイアル（３）、（４）および（７）に分配される。

図４は、少なくとも２種類の標的（Ｔ１）および（Ｔ２）が決定される分析系（９）を示す。系（９）は、ラック（１０）および（１１）を含む。ラック（１０）は少なくとも１個のバイアル（ｐＨ）および（ｐＬ）を有する開口部（１２）を含む。バイアル（ｐＨ）は本明細書で開示したような高濃度の陽性対照を含み、バイアル（ｐＬ）は本明細書で開示したような低濃度の陽性対照を含む。ラック（１１）は少なくとも１個の陰性対照を有するバイアル（ｎ）を含む。陽性対照（ｐ１）および（ｐ２）は同じ陽性対照ストックバイアル（ｐＨ）からバイアル（３）および（４）に添加される。当然、低濃度の陽性対照が望まれるならば、それらは陽性対照ストックバイアル（ｐＬ）から添加されてもよい。バイアル（１）、（２）、（３）、（４）および（５）は一体的に形成された器、例えばマルチウェルプレートの一部であってよく、バイアル（１）、（２）、（３）、（４）および（５）の内容物は同時に、および並行して処理され、反応する。

図５は、標的核酸（Ｔ１）、標的核酸（Ｔ２）、陽性対照（ｐ１）、陽性対照（ｐ２）および陰性対照（ｎ）を含むバイアル（１）、（２）、（３）、（４）および（７）にサーモブロック（Ｔ）中で同じ熱的プロフィールを施す態様を示す。

図６は、分析器（２９）を有する分析系（９）を示す。その分析器はラック（１０）を装填するための装填ステーション（２２）を有する。さらに、その分析器は、分離ステーション（２１）およびピペット操作装置（２５）を有するピペット操作ステーション（２８）を有する領域（２８ａ）を含む。さらに、輸送装置（２６）およびバイアル（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、...が存在する。次いで、分析器はさらに増幅ステーション（Ｔ）を有する増幅領域（２７）を含む。その系（９）はコンピューター制御装置（２４）も含む。

図７は、陽性対照バイアル（ｐＨ、ｐＬ）を含むラック（１０）、ラベル（３１）および増幅試薬（Ｍ）を有する容器またはバイアルを有するキット（３０）を示す。

Claims (12)

1. 別個のバイアル中で少なくとも２種類の異なる標的核酸を検出または定量化する方法であって、
   ａ）前記の少なくとも２種類の標的核酸を増幅すること、ここで前記の第１標的核酸は第１バイアル中で前記の第２標的核酸を増幅せずに増幅され、前記の第２標的核酸は第２バイアル中で前記の第１標的核酸を増幅せずに増幅される、
   ｂ）工程ａ）と並行して、第３バイアル中で第１陽性対照核酸を増幅すること、ここで前記の第１陽性対照核酸は前記の第１標的核酸に関する陽性対照であり、そして第４バイアル中で第２陽性対照核酸を増幅すること、ここで前記の第２陽性対照核酸は前記の第２標的核酸に関する陽性対照であり、
   ここで前記の第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸は、増幅の前に、前記の第１陽性対照核酸および前記の第２陽性対照核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を含む陽性対照バイアルから、前記第３バイアルおよび前記第４バイアルに提供される、
   を含んでなり、
   前記の陽性対照バイアルは自動化された分析器においてラック中で提供され、陰性対照バイアルは該陽性対照バイアルを含むラックとは異なる第２のラック中で提供され、前記の陽性対照バイアルを含むラック中に陰性対照バイアルは存在しない、陰性対照を前記の陽性対照よりも高い頻度で運転する、そして、前記方法は自動化された分析器において実施されることを特徴とする、前記方法。
2. 加えてａ）およびｂ）と並行して第５バイアル中で陰性対照を増幅することを含み、前記の陰性対照が陰性対照バイアル中に含まれる単一の陰性対照ストック溶液から提供される、請求項１に記載の方法。
3. 前記の陰性対照バイアルを含む前記ラック中に陽性対照バイアルが存在しない、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記の陽性対照バイアルを含む前記のラックが少なくとも２個の陽性対照バイアルを含み、前記の少なくとも２個の陽性対照バイアルの全てが同一の陽性対照核酸の混合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも３種類の異なる標的核酸が検出または定量化され、追加で工程ａ）において第３標的核酸を第６バイアル中で前記の第１または第２標的核酸を増幅せずに増幅すること、および工程ｂ）において追加で第３陽性対照核酸を増幅することを含み、ここで前記の第３陽性対照核酸は前記の第３標的核酸に関する陽性対照であり、ここで前記の第３陽性対照核酸は第７バイアル中で増幅され、ここで前記の第１陽性対照核酸、前記の第２陽性対照核酸および前記の第３陽性対照核酸は、増幅の前に、前記の第１陽性対照核酸、前記の第２陽性対照核酸および前記の第３陽性対照核酸の混合物を含む単一の陽性対照ストック溶液を含む陽性対照バイアルから、第３バイアル、第４バイアルおよび第７バイアルに提供される、前記方法。
6. 前記の第１ラック中に含まれる全ての陽性対照バイアルが１×１０Ｅ５〜１×１０Ｅ８コピー／ｍｌの、または１×１０Ｅ２〜５×１０Ｅ３コピー／ｍｌの濃度の前記の陽性対照核酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 少なくとも２個の陽性対照バイアルを含むラック、ここで前記の陽性対照バイアルのそれぞれは少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む、
   キットの構成要素を用いて検出されるべき単一の標的核酸を示すラベル、ここで前記の標的核酸は前記のストック溶液中の陽性対照核酸の１種類に対応する、ならびに
   前記の標的核酸および対応する陽性対照核酸の増幅のための試薬を含むマスター混合物を含むマスター混合物バイアル
   を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を実施するために用いるキットであって、該キットが該ラベル上に示されている前記の標的核酸と一致しないが前記の陽性対照バイアルのストック溶液中に存在する少なくとも１種類の陽性対照核酸に対応する標的核酸の増幅のための試薬を含むマスター混合物を含まない、前記キット。
8. 少なくとも２個の陽性対照バイアルを含むラック、ここで前記の陽性対照バイアルのそれぞれは少なくとも２種類の陽性対照核酸の混合物のストック溶液を含む、
   前記のストック溶液中に存在する対応する陽性対照核酸のための全ての標的核酸を示すラベル
   を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を実施するために用いるキットであって、前記のラベルが該陽性対照核酸のストック溶液を含むラックが該標的核酸の１種類を検出するための方法における使用のためのものであって、対応する陽性対照核酸が単一のバイアル中で該ストック溶液中に含まれているその他の標的核酸を検出するための方法における使用のためのものではないことも示す、前記キット。
9. 前記のラックが前記の少なくとも２個の陽性対照バイアルを受け入れるための少なくとも２個の開口部を含む、請求項７に記載のキット。
10. 加えて、陰性対照バイアルを含む第２のラックを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。
11. 前記陽性対照バイアルはラック中に提供され、そして前記陰性対照バイアルは該陽性対照バイアルを含む該ラックとは異なる第２のラックに提供される、請求項１０に記載のキット。
12. 陽性対照バイアルを含む前記ラック中に陰性対照バイアルが存在しない、請求項１１に記載のキット。

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