JP6288650B2 - 核酸配列決定用のフローセル - Google Patents

Description

本発明は、フローセルに関するものである。より詳細には、本発明は、非増幅で、超微量核酸配列の決定を実現するフローセルに関する。

細胞における転写物の解析は、細胞の特徴付けのために有効な手段である。細胞は通常均一な状態のものの集まりであると思われがちであるが、多くの場合は様々な種類の細胞の集合体として存在している。

例えば、がん細胞は血液やリンパの流れに乗って全身に転移することは広く知られている。がんが発生した元の場所である原発巣を外科手術で取り除いたとしても、がん細胞は血流を介して原発巣から離れた場所に移動し、全く別の場所にがん細胞の塊を形成しながら全身に拡がる。血中を循環している血中循環がん細胞（ＣＴＣ）の多くはアポトーシスで死んでいく。そのため、血中循環がん細胞は血液１０ｍｌあたり数個のレベルしか存在しない。血中循環がん細胞の情報は、手術後など、画像検査で診断できない多くの場合において、適切な抗がん剤を決定するための、重要な判断材料になる。近年では血中に存在する１億個ほどのがん以外の細胞の中から、数個の血中循環がん細胞を回収する技術が向上してきた。このようにして回収された個々の細胞中で発現される遺伝子を調べて細胞を特徴付けることができれば、適切な抗がん剤の決定などに有用である。しかし、個々の細胞から得られる転写物の量は非常に微量であり、その直接的な解析は困難であった。

従来、超微量の核酸サンプルの配列決定（シーケンシングともいう）などを行うためには、多数の細胞からサンプルを準備する方法と、少ないサンプルを、ＰＣＲ技術を用いて増幅する方法とが行われてきた。

多数の細胞からサンプルを準備する方法では、それぞれが異なる転写物組成を有する複数の細胞を使用する必要が生じる。この場合、それぞれの細胞の平均的な特徴を得ることはできても、各細胞の個別の情報は失われてしまうという不利益があった。すなわち、得られた情報が、どの細胞に由来するものなのかは、わからなかった。したがって、この方法では、例えば上記のような、１億個ほどのがん以外の細胞中から数個の血中循環がん細胞の特徴を捉えることは難しい。

一方、少ないサンプルをＰＣＲ増幅する方法においては、その性質上すべての核酸分子の定量性を保ちながら等しく増幅することはできない。すなわち、当初の細胞の定量性が増幅前の量比からかけ離れている場合があり、量的な情報を得られない不利益がある。この影響は、特に、生体から得られるサンプル量が少なくなればなるほど大きなものになる。このように、従来は細胞の集合体を計測する方法、または核酸サンプルを増幅方法しかなく、単一細胞レベルの核酸情報を直接解析できなかった。

核酸配列決定のための、一分子単位のシーケンシングの手法が知られている（特許文献１）。この手法は、Sequence by synthesis反応により各ヌクレオチドを蛍光標識し、ヌクレオチドごとに複製反応を１塩基ずつ１分子レベルで計測する手法である。しかし、この方法は多量のサンプルを同時に解析して大量の情報を得ることを目的としており、微量の核酸を網羅的に解析するといったことは意図されておらず、微量核酸の解析には適切ではなかった。

さらには、上記のような従来の方法を用いた場合、大量に準備した測定サンプルのうち、大部分のサンプルは、検出前のサンプル調製やサンプル固定などの各ステージにおいて損失され、実際に検出に用いられるのはわずかであった。

米国特許明細書第2010/0233697号

単一細胞レベル（およそ数十ｐｇ以下）に相当する超微量なサンプルから得られる核酸情報を直接解析できれば、単一細胞レベルで細胞を詳細に定義することができ、がん細胞、幹細胞、神経細胞、ｉＰＳ細胞をはじめとするあらゆる新しい細胞分類生物学を生み出すことができる。単一細胞レベルでの解析が望まれる具体例として血中循環がん細胞が挙げられる。がん細胞の有無だけでなく、ゲノムから得られる一塩基多型(SNP)、がん細胞の状態を反映するRNAの配列情報やメチル化のような核酸修飾などの個々の患者に対するあらゆる貴重な情報を得られる。従来技術においては、このような単一細胞レベルでの転写物の解析は意図されておらず、数十ｐｇ以下のサンプル中の全転写物を測定可能な装置は存在しなかった。本発明者らは、単一細胞レベルでの転写物解析の有用性を見出し、超微量なサンプルからの核酸情報を直接解析することを考えた。

そして、本発明者らは、従来技術に鑑みて、単一細胞に由来する核酸のような超微量の核酸分子の配列決定において、正確な測定をするためには非増幅によるものでなければならないと考えた。そこで、本発明者らは、特徴的な独自フローセルの作製と、それによる配列決定のための１分子シーケンサーを組み合わせることを考え、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、流体の入口と出口とを有する流路を備える核酸配列決定用のフローセルであって、前記流路の少なくとも一部が光透過性の面で形成され、前記光透過性の面の、流路に面した側面が、測定対象核酸分子に特異的に結合する捕捉オリゴヌクレオチドを備えてなる。

前記捕捉オリゴヌクレオチドが、１×１０^６／ｍｍ^２以上の密度で、前記光透過性の面の、流路に面した側面に固定されていることが好ましい。

前記捕捉オリゴヌクレオチドが、オリゴｄＴであることが好ましい。

前記光透過性の面の、流路に面した側面が、生体物質の非特異的付着を阻害する化学修飾基をさらに備えてなることが好ましい。

前記非特異的付着を阻害する化学修飾基が、ポリエチレングリコールまたはその誘導体であることが好ましい。

前記光透過性の面が、ガラスもしくはシリカであることが好ましい。

前記フローセルにおいて、前記流路が、一定の間隔で配置された対向する二つの平面によって形成され、少なくとも一方の平面が、前記光透過性の面で形成されることが好ましい。

前記流路が、第一基板と、少なくとも一部が光透過性の面で形成される第二基板と、前記第一基板と前記第二基板との間に設けられるスペーサーとにより画定され、前記流路の容積が１０μＬ以下であって、前記第一基板の流路に面した側面が、生体物質の非特異的付着を阻害する化学修飾基を備えることが好ましい。

前記スペーサーの厚みが、１０〜５０μｍであることが好ましい。

本発明は、別の実施形態によれば、核酸配列決定装置であって、
上述のいずれかの実施形態によるフローセルと、
複数種類の試薬を独立して前記フローセルに供給するポンプユニットと、
前記フローセルへの試薬の供給機構と、排出機構とを備えてなり、前記フローセルを着脱可能に載置するフローユニットと、
前記フローセルの温度調節を行う温度制御ユニットと、
前記フローセルからの蛍光を観察可能な顕微鏡と、駆動可能なステージとを備えるステージユニットと、
前記顕微鏡の焦点を合わせる自動焦点制御ユニットと、
励起光源とシャッターとを備える励起ユニットと、
前記顕微鏡の蛍光画像を、画像データとして取得する検出ユニットと、
前記ポンプユニットと、前記フローユニットと、前記ステージユニットと、前記自動焦点制御ユニットと、前記励起ユニットと、前記検出ユニットとに、作動可能に接続されたコンピュータであって、前記複数のユニットを制御し、前記検出ユニットで取得された画像データから、核酸配列を決定するコンピュータとを備えてなる。

前記検出ユニットが、時間遅延積分法式ラインスキャン装置であることが好ましい。

前記顕微鏡が、全反射照明蛍光顕微鏡であることが好ましい。

本発明は、また別の局面によれば、核酸配列決定方法であって、
ａ）上記のいずれかのフローセルに、前記捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する測定対象核酸分子を含んでなる核酸サンプル溶液を適用する工程であって、それにより前記フローセルの前記捕捉オリゴヌクレオチドに、前記測定対象核酸分子を結合する、工程と、
ｂ）前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合した測定対象核酸分子を核酸配列決定に供する工程とを含む。

前記工程ｂ）が以下の工程ｃ）およびｄ）を含む方法であることが好ましい：
ｃ）４種類のヌクレオチドモノマーを１種類ずつ順次使用して以下のｃ１）〜ｃ４）を繰り返して行う工程：
ｃ１）前記フローセルにおいて、蛍光色素が切断可能に結合された１種類のヌクレオチドモノマーと、ポリメラーゼとの存在下で、前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記測定対象核酸分子の配列依存的に伸長すること、
ｃ２）前記ｃ１）における未反応の物質を、前記フローセルから除去すること、
ｃ３）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得ること、
ｃ４）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去すること、および
ｄ）工程ｃ）で得られた画像を処理し、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖の核酸配列を得る工程。

前記捕捉オリゴヌクレオチドが１種類のヌクレオチドから構成されており、前記工程ｂが、前記工程ｃ）の前に以下の工程ｅ）〜ｉ）をさらに含む方法であることが好ましい：
ｅ）前記捕捉オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドと同一の１種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼとの存在下で、捕捉オリゴヌクレオチドから、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に伸長する工程、
ｆ）蛍光色素が切断可能に結合された、前記工程ｅ）における前記１種類のヌクレオチドモノマーとは異なる３種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
ｇ）前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
ｈ）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程、
ｉ）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。

前記捕捉オリゴヌクレオチドが２種類以上のヌクレオチドから構成されており、前記工程ｂが、前記工程ｃ）の前に以下の工程ｆ’）〜ｉ’）をさらに含む方法であることが好ましい：
ｆ’）蛍光色素が切断可能に結合された、４種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
ｇ’）前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
ｈ’）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程
ｉ’）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。

前記核酸サンプル溶液に含まれる測定対象核酸分子の量が、２０ｐｇ以下であることが好ましい。

前記核酸配列決定方法の前記工程ａ）において、核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子の１００％が、前記フローセルの前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合されることが好ましい。

前記核酸配列決定方法において、前記測定対象核酸分子が、非増幅核酸分子であることが好ましい。

前記核酸配列決定方法において、前記測定対象核酸分子が、単一細胞由来の核酸分子であることが好ましい。

前記核酸配列決定方法において、前記測定対象核酸分子が、ＲＮＡであり、前記ポリメラーゼが、逆転写酵素であることが好ましい。

前記核酸配列決定方法において、前記測定対象核酸分子が、ＤＮＡであり、前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。

本発明のフローセルは、２０ｐｇ以下といった超微量サンプル量であっても、サンプル中に含まれる多数の異なる塩基配列を有する核酸のすべてについて、個別に、かつ正確に、配列決定をすることができる。これにより、例えば、動物細胞１個あたりに含まれる全ＲＮＡ（１０〜３０ｐｇ）の配列を、増幅法を用いることなく解析することができる。さらには、本発明のフローセルにより、単一細胞レベルに含まれる全核酸の塩基配列の決定が可能となり、個々の単一細胞の、より詳細な特徴付けが可能になる。応用例としては、例えば、血中がん細胞数個単位にしか発現しない核酸の配列を特定することができ、がんの治療及び予防において有効な情報を得ることができる。
また、本発明による核酸配列決定方法は、従来技術による方法と比較して、１／１００００００以下のサンプル量で解析を行うことができ、細胞１個あるいは数個レベルにおける、核酸の迅速かつ正確な定量を可能となる。それゆえ、増幅法を必須とする従来技術による方法における、サンプルや試薬の損失を大幅に低減することができる。また、測定時間の短縮を可能にし、測定にかかるコストを大幅に抑えることができる。

図１は、本発明の第一実施形態に係るフローセルの構成を示す概念図である。 図２は、本発明の第一実施形態に係るフローセルの構成を示す説明図であって、（Ａ）はフローセルの平面図を示し、（Ｂ）は、ａ−ａ’による断面図を示し、（Ｃ）は、ｂ−ｂ’による断面図を示す。 図３は、本発明の第二実施形態に係る核酸配列決定装置の構成を示す概念図である。 図４は、本発明の第三実施形態に係る核酸配列決定方法における、捕捉オリゴヌクレオチドと測定対象核酸分子との結合状態の相違を示す図である。 図５は、本発明の第三実施形態に係る核酸配列決定方法における、フィルアンドロック（Ｆｉｌｌ ａｎｄ Ｌｏｃｋ）工程を説明する模式図である。 図６は、本発明の第三実施形態に係る核酸配列決定方法における、配列決定反応を説明する模式図である。 図７は、本発明の第三実施形態に係る核酸配列決定方法において、得られた画像から配列を決定する画像処理工程を模式的に示す図である。 図８は、本発明の実施例において、第一実施形態に係るフローセルが、テストプローブとしてのオリゴ（ｄＡ）_５０を捕捉する、捕捉率を示すグラフであり、（ａ）は、オリゴ（ｄＡ）_５０の濃度が５０ｐＭの時の捕捉画像、（ｂ）は、オリゴ（ｄＡ）_５０の濃度が２００ｐＭの時の捕捉画像、（ｃ）は、オリゴ（ｄＡ）_５０の濃度が２００ｐＭであって、９５℃でインキュベートした時の捕捉画像を示す。 図９は、第一実施形態に係るフローセルが、テストプローブとしてのオリゴ（ｄＡ）_５０を捕捉する場合の、オリゴ（ｄＡ）_５０濃度と捕捉率との関係を示すグラフである。 図１０は、第一実施形態に係るフローセルが、テストプローブとしてのオリゴ（ｄＡ）_５０を捕捉する場合の、適用するオリゴ（ｄＡ）_５０濃度、基板への結合の際に使用したオリゴ（ｄＴ）_５０濃度と捕捉率との関係を示すグラフである。 図１１は、第一実施形態に係るフローセルが、テストプローブとしてのオリゴ（ｄＡ）_５０を捕捉する場合の、オリゴ（ｄＡ）_５０濃度と捕捉率との関係、および従来技術によるフローセルがオリゴ（ｄＡ）_５０を捕捉する場合の、オリゴ（ｄＡ）_５０濃度と捕捉率との関係を比較して示すグラフである。 図１２は、蛍光色素Ｃｙ５で標識した捕捉オリゴヌクレオチドの濃度［Ｃｙ５−ｄＴ５０−ｂｉｏｔｉｎ］（単位はｐＭ）に対する、Ｃｙ５から発せられる蛍光の単位面積当たりのカウント数（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｃｏｕｎｔｓ／ｍｍ^２）を示すグラフである。 図１３（Ａ）は、蛍光標識された捕捉オリゴヌクレオチド溶液の濃度と、単位面積あたりの、蛍光標識された捕捉オリゴヌクレオチドの蛍光スポット個数を示すグラフであり、１３（Ｂ）は、蛍光標識された捕捉オリゴヌクレオチド溶液の濃度と、単位面積あたりの、蛍光標識された捕捉オリゴヌクレオチドの蛍光強度を示すグラフである。

以下に、本発明を、図面を参照して詳細に説明する。以下の説明は、本発明を限定するものではない。

本発明は、第一実施形態によるとフローセルである。第一実施形態に係るフローセルは、入口と出口とを有する流路を備え、前記流路の少なくとも一部が光透過性の面で形成され、前記光透過性の面の、流路に面した側面が、測定対象核酸分子に特異的に結合する捕捉オリゴヌクレオチドとを備えてなる。

フローセルは、少なくとも入口と出口とを有する流路を備える。流路の形状は、例えば、略直方体形状、管状、楕円状とすることができるが、特定の形状には限定されない。流路の容積が小さいことが好ましい。測定の対象となる微量の核酸を効率よくフローセルに捕捉させるためである。具体的には、容積は、例えば１０μＬ以下、好ましくは５μＬ以下、より好ましくは３μＬ以下である。また、容積は、例えば０．１μＬ以上、好ましくは０．５μＬ以上、より好ましくは、１μＬ以上である。流路における流体の流動性確保や、セルの洗浄を確実に行うためである。

フローセルを構成する少なくとも一部の面は、光透過性である必要がある。ここでいう、光透過性とは、フローセルの流路内の蛍光を、フローセルの外側から、顕微鏡で観察し、デジタル画像を取得可能な程度に光が透過し得ることをいう。流路内の核酸分子の配列情報を得るために、フローセルの外側から、光透過性の面をスキャンするためである。スキャンする光透過性の面の形状は、スキャンが可能であれば平面でも曲面でもよい。例えば、光透過性の面が、円柱（チューブ）状の曲面の少なくとも一部で構成される場合には、フローセルの光透過性の面を回転させながら焦点を合わせてスキャンすることができる。好ましくは、光透過性の面は平面である。光透過性の面は、その面積を、例えば、２〜１０００ｍｍ^２とすることができ、２０〜３００ｍｍ^２とすることが好ましい。

光透過性の面は、それ自体が蛍光を発することなく、顕微鏡で流路の内部の蛍光が観察可能な光透過性を有する材料から構成することができる。特には、光透過性の面は、全反射照明蛍光顕微鏡の対物レンズに接触し、流路から発される蛍光を観察するために必要な強度及び厚みを備えるものであることが好ましい。具体的には、光透過性の面は、例えば、ガラス、シリカから構成することができる。

光透過性の面は、好ましくは、その流路に面した側面に生体物質の非特異的付着を阻害する化学修飾基を備える。ここで、生体物質の非特異的な付着とは、細胞内に含まれる核酸、蛋白質、脂質等の物質が、核酸の水素結合を利用した相補的結合以外の結合により、流路内に捕捉されることをいう。生体物質の非特異的な付着は、サンプル溶液の流路を妨害し、また意図しない蛍光シグナルを発する原因となりうるため、好ましくないためである。サンプル溶液中の物質の非特異的吸着を阻害し、それ自体が蛍光を発するものでない任意の化学修飾基を用いることができる。

化学修飾基の一例としては、ポリマー、特にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体、例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられるが、これらには限定されない。ポリエチレングリコールを化学修飾物質として用いる場合は、例えば、数平均分子量が２０００〜１００００、好ましくは、数平均分子量が５０００程度の市販のポリエチレングリコールを用いることができる。

光透過性の面の、流路に面した側面における、非特異的付着を阻害する化学修飾基の密度は、生体物質の非特異的な付着防止ができる程度であればよい。化学修飾物質となりうるポリマーの分子量や形状にもよるが、１×１０^１１〜３×１０^１１分子／ｍｍ^２であることが好ましい。

生体物質の非特異的な付着を防止する化学修飾基の光透過性の面への結合は、例えば、光透過性の面をアミノシラン化した後に、生体物質の非特異的な付着を防止する化学修飾基が有するＮＨＳ反応基を光透過性の面上のアミノ基と反応させることによって行うことができる。化学修飾基の他の例として、変性タンパク質が挙げられる。変性タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やカゼインを用いることができ、これらを光透過性の面に固定する方法としては、変性タンパク質自体による光透過性の面への非特異吸着が挙げられるが、これらには限定されない。

生体物質の非特異的な付着を防止する化学修飾基は、光透過性の面のみならず、フローセル内の流路に面した任意の面に結合されていても良い。流路への、生体物質の非特異的な付着を防止するためである。好ましくは、フローセル内の流路に面したすべての側面に、生体物質の非特異的な付着を防止する化学修飾基を備える。フローセル内の流路を形成する各種材料に、上記のようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーあるいは、変性タンパク質を結合する方法は、当業者に既知の通常の方法を用いることができる。この場合の化学修飾基の密度も、光透過性の面の流路に面した側面における、非特異的付着を阻害する化学修飾基の密度と同様とすることができる。

光透過性の面には、測定対象核酸分子が特異的に結合する部位となるオリゴヌクレオチドを固定する。本明細書において、配列が決定される個々の核酸を、「測定対象核酸分子」、これらを含む溶液を、「核酸サンプル溶液」と指称する。「測定対象核酸分子」は、通常、異なる配列、塩基長を有する複数種類の核酸分子を指称する。また、セルに固定されているオリゴヌクレオチドであって、測定対象核酸分子が特異的に結合するオリゴヌクレオチドを、「捕捉オリゴヌクレオチド」と指称する。また、「捕捉オリゴヌクレオチド」が固定されている、光透過性の面の流路に面した側面を、「捕捉面」とも指称する。捕捉オリゴヌクレオチドは、長さが例えば２０〜２００、好ましくは３０〜１００、より好ましくは４０〜６０、さらに好ましくは約５０ヌクレオチドの核酸分子であって、単一の塩基から構成されるものであっても良く、複数種類の塩基から構成されるものであってもよい。核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子を確実に結合させることができる長さを有し、かつ、１個の捕捉オリゴヌクレオチドに対し、複数の測定対象核酸分子が結合しないようにするためである。例えば、測定対象となる核酸分子がＲＮＡの場合には、捕捉オリゴヌクレオチドとして、オリゴデオキシチミジンヌクレオチド（オリゴｄＴ）を用いることができる。ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡテイル、またはその他のＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）の３’末端に付加したポリＡテイルと相補鎖を形成して、測定対象となるＲＮＡを、捕捉オリゴヌクレオチドに固定することができるためである。

捕捉オリゴヌクレオチドの、光透過性の面、すなわち捕捉面への付着密度は、例えば、１×１０^６分子／ｍｍ^２以上とすることができ、好ましくは、１×１０^７分子／ｍｍ^２以上であり、さらに好ましくは、６×１０^７分子／ｍｍ^２以上である。核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子のすべてを、もれなく測定するために、捕捉オリゴヌクレオチド分子総数が、測定対象核酸分子総数の１００倍以上、好ましくは１０００倍以上となるようにするためである。本実施形態によるフローセルは、一つの目的として、１個の細胞に含まれるすべてのＲＮＡ分子をフローセル内に捕捉し、塩基配列を決定するために用いられる。１細胞当たりのＲＮＡ分子の総数が、約１×１０^５分子であるから、上記比率を達成するためには、捕捉オリゴヌクレオチド分子総数は、例えば、約１×１０^７分子以上、好ましくは、約１×１０^８分子以上である。

捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉面に結合させる。例えば、上記化学修飾基と同様、ＮＨＳ反応基を有するビオチン化ＰＥＧを介して、ビオチン−アビジン結合により結合されていることが好ましいが、この方法には限定されない。なお、捕捉オリゴヌクレオチドは、光透過性の面の表面から、５’→３’の向きに固定されていることが好ましい。捕捉オリゴヌクレオチドの捕捉面への結合は、捕捉オリゴヌクレオチドを含む溶液を捕捉面に適用することによって行うことができる。捕捉オリゴヌクレオチドを含む溶液の濃度を、１ｐＭ〜１０μＭの間で変化させることにより、捕捉面に結合される捕捉オリゴヌクレオチドの付着密度を、１×１０^５〜１×１０^１０分子／ｍｍ^２の所望の値とすることができる。

このような所望の捕捉オリゴヌクレオチドの付着密度を達成するために、本発明者らは、捕捉オリゴヌクレオチドを含む溶液の濃度と、捕捉面に結合される捕捉オリゴヌクレオチドの付着密度との関係を、予め実験的に求めた。図１２にグラフを示す。グラフは、捕捉オリゴヌクレオチドの一例として、蛍光色素Ｃｙ５で標識したオリゴｄＴを用いる場合の実験に基づく。Ｃｙ５標識したオリゴｄＴの濃度である［Ｃｙ５−ｄＴ５０−ｂｉｏｔｉｎ］（単位はｐＭ）に対して、Ｃｙ５から発せられる蛍光カウント数（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｃｏｕｎｔｓ／ｍｍ^２）を求めた。蛍光カウント数は捕捉オリゴヌクレオチド分子数に等しいと考えられるため、このグラフより、捕捉オリゴヌクレオチド分子を特定の濃度で含む溶液を捕捉面に適用すれば、特定の捕捉オリゴヌクレオチドを付着密度達成することができる。

図１２のグラフを得るための考え方についてさらに説明する。捕捉オリゴヌクレオチドの濃度が、低濃度、特には、１〜１０００ｐＭ程度の溶液をガラス基板などの捕捉面に結合させた場合、その捕捉オリゴヌクレオチドを蛍光標識して、観察領域の面積（Ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ：ＦＯＶ）における蛍光スポットの個数をカウントすることが可能である。図１３（ａ）は、観察領域の面積における、蛍光標識された捕捉オリゴヌクレオチドの蛍光スポット個数を示すグラフである。一方、１０００ｐＭ以上の高濃度の捕捉オリゴヌクレオチド溶液を捕捉面に共有結合させた場合、蛍光分子密度が高くなるため、蛍光スポット個数を観察し、カウントすることは難しい。そのため、１ｐＭ〜１０μＭの範囲の捕捉オリゴヌクレオチド濃度を有する溶液を捕捉面に適用した場合の、観察領域の面積における、蛍光標識された捕捉オリゴヌクレオチドの蛍光強度を求めた。その結果を図１３（ｂ）に示す。図１３（ｂ）のグラフ中、観察領域の面積における蛍光強度を、ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙとしている。これらの２つのグラフの傾斜を比較し、相関させて、捕捉オリゴヌクレオチド溶液の濃度と蛍光カウント数の関係を求めたものが、図１２のグラフである。

本実施形態によるフローセルの流路は、様々な形状、態様で構成することができるが、流体を通過させることができる空間を有していればよく、特定の構成には限定されない。例えば、２つの基板を、スペーサーを介して組み合わせて形成することができる。他に、スペーサーに相当する構造を備えた基板と平面の基板とを組み合わせる方法、成形によって流路を作製する方法や、管状の流路を形成する方法など、任意の方法で作製することが可能である。

次に、第一実施形態に係るフローセルの具体例として、対向する２枚の基板と、スペーサーとから主として構成されているフローセルについて、図面を参照して説明する。

図２は、本実施形態に係るフローセルの平面図（Ａ）、流路方向に垂直な断面図（Ｂ）、流路方向に並行な断面図（Ｃ）である。図２（Ａ）を参照すると、フローセル１は、第一基板１０と、第二基板２０と、スペーサー３０とから主として構成される。図２（Ｂ）及び図２（Ｃ）を参照すると、第一基板１０と、第二基板２０とは、間隔をあけて対向しており、第一基板１０と、第二基板２０との間にスペーサーが位置する。そして、第一基板１０と、第二基板２０と、スペーサー３０とが、略直方体形状の空間となる流路４０を構成する。すなわち、略直方体形状の流路のうち、対向する二つの側面が、第一基板１０、第二基板２０の表面で構成され、他の側面が、スペーサー３０で構成される。

本実施形態においては、流路４０の容量が十分に小さい必要がある。具体的には、スペーサー３０の厚みＬ１は例えば１０μｍ以上、好ましくは２０μｍ以上、かつ、例えば５０μｍ以下、好ましくは４０μｍ以下である。さらに好ましくは、Ｌ１は約３０μｍである。流路の幅Ｌ２が１〜３ｍｍであり、流路４０の長さＬ３が１０〜２５ｍｍであることが好ましい。本実施形態において、スペーサー３０の厚みＬ１とは、対向する第一基板１０と第二基板２０との距離をいう。流路の幅Ｌ２とは、流体の流れ方向Ｆに垂直な流路の寸法をいう。流路の長さＬ３とは、流体の流れ方向の流路４０の寸法をいう。

別の態様において、本実施形態の流路４０の幅Ｌ２及び流路の長さＬ３の寸法は、上記寸法に限定されることなく、流路４０の容積が特定の値になるように寸法を決定することができる。具体的には、流路４０の容積が、例えば、１０μＬ以下、好ましくは３μＬ以下、より好ましくは２μＬ以下、さらに好ましくは１μＬ以下になるように、流路の寸法Ｌ２、Ｌ３を決定することができる。特には、Ｌ２は１ｍｍ以上、Ｌ３は１０ｍｍ以上であることが好ましい。核酸分子配列決定法において、複数の分子からの蛍光を観察するために必要な領域を確保するためである。また、生体物質の非特異的吸着、ごみや空気の混入を防止する観点からも、かかる寸法とすることが好ましい。

次に、図２（Ａ）を参照すると、第一基板１０は、略矩形の光透過性の板状部材である。第一基板１０は、流体の入口１２と出口１３とを備えている。流体の入口１２及び出口１３は、第一基板１０に形成された小さな孔であってよい。孔の大きさは、特には限定されないが、各種試料を含む流体、特には、核酸及び酵素を含む緩衝液が、流通することができる大きさである。流体の入口１２と流体の出口１３とは、例えば、直径が１ｍｍ以下の円形もしくは一辺が１ｍｍ以下の矩形の孔であってよく、好ましくは、直径が約０．４〜０．７ｍｍ程度の円形の孔である。形状は円形や矩形には限定されないが、流体注入用の管及び流体排出用の管（図示しない）に適合しうる形状であることが好ましい。また、極微量の核酸サンプル溶液や、酵素を含む流体を損失無くフローセル１に導入するため、直径、長径もしくは一辺が１ｍｍ以下の孔であることが好ましい。

第一基板１０及び第二基板２０は、基板表面の化学修飾が可能であり、全反射照明蛍光顕微鏡による蛍光の観察が可能な、光透過性の部材である。例えば、第一基板１０は、ガラス基板、シリカ基板、ならびにプラスチック基板であってよいが、これらには限定されない。第二基板２０は、ガラス基板、シリカ基板であってよい。好ましくは、第一基板１０及び第二基板２０は、ガラス基板またはシリカ基板である。第二基板２０は、例えば、０．１５〜０．２ｍｍの厚さを有する対物レンズ用のガラス基板を用いることができる。第一基板１０はその強度や厚みにおいて特に制限はなく、汎用の１〜３ｍｍのガラス基板を用いることができる。

スペーサー３０は、所望の強度を持って第一基板１０及び第二基板２０に付着することができ、生体物質の非特異的な吸着を阻害し得る材料であって、それ自体が蛍光を発することなく、核酸サンプル溶液や分析に必要な試薬類の溶液が浸出しない部材により構成することができる。例えば、接着強度が３〜１０Ｎ／ｃｍで、厚みが１０〜５０μｍの両面テープをスペーサー３０として用いることができるが、これには限定されない。スペーサー３０となる両面テープは、フローセル１の、略直方体形状の流路４０の四面を構成する。例えば、ポリエステル、アクリルといった素材の両面テープは、生体物質の非特異的な吸着を生じることはないため好ましく用いられる。別の例として、スペーサー３０は、第一基板１０または第二基板２０に形成された高分子膜であってもよい。高分子膜でスペーサー３０を構成する場合もまた、厚みが１０〜５０μｍであって、均一な膜であり、かつ生体物質の非特異的な吸着を防止する材料であることが好ましく、例えば、ポリエチレン、ポリフェニレンサルファイド、芳香族ポリアミド(アラミド)フィルムからなる膜を挙げることができるが、これらには限定されない。

図１は、図２（Ｃ）に示す本実施形態によるフローセル１の断面の一部を、拡大して、模式的に示す図である。第一基板１０及び第二基板２０は、流路４０に面した側面に、生体物質の非特異的な付着を防止する化学修飾基１１、２１を備えるように構成されていることを特徴とするものである。一方、第二基板２０の流路４０に面した側面、すなわち捕捉面には、上記非特異的吸着を阻害する化学修飾基２１に加え、測定対象核酸分子が特異的に結合する部位を構成する捕捉オリゴヌクレオチド２２を固定する。以下の説明及び図面において、５０ヌクレオチドのオリゴデオキシチミジンヌクレオチド（オリゴｄＴ_５０）を捕捉オリゴヌクレオチドとして用いる場合を例として説明するが、本発明は特定の捕捉オリゴヌクレオチドに限定するものではない。捕捉オリゴヌクレオチド２２は、第二基板２０の表面から、５’→３’の向きに固定されている。本実施形態によるフローセル１において、捕捉面の面積は、上記流路の形状から決定することができ、例えば、１０〜２０ｍｍ^２とすることができる。

上記のように構成される本実施形態によるフローセル１は、後に詳述する核酸配列決定方法において使用することができる。核酸配列決定方法では、本実施形態によるフローセル１を用いることで、細胞１個分に相当する数の、複数種類の配列未知の測定対象核酸分子を含む核酸サンプル溶液において、すべての核酸分子の塩基配列を個別に、かつ同時に決定することができる。

次に、本実施形態によるフローセル１について、製造方法の観点から説明する。本実施形態によるフローセル１の製造方法は、第一基板１０、及び第二基板２０を化学修飾する工程と、第一基板１０、スペーサー３０、第二基板２０を積層する工程とを備える。

第一基板１０及び第二基板２０を化学修飾する工程は、以下の手順に従って実施することができる。

すなわち、ガラス基板の水酸基にアミノシランを付加して、ガラス表面にアミノ基を導入する工程と、かかるアミノ基に、ＰＥＧまたはその誘導体を結合する工程とを含む。このような化学修飾方法における詳細な条件等は当業者には理解されており、通常の手順により実施することができる。一例として、以下に、ガラス基板の化学修飾プロトコルを示すが、本発明はこのプロトコルに限定されるものではない。

１．第一基板１０に、流体の入口１２、出口１３となる孔を形成する。
２．第一基板１０及び第二基板２０を炎にあてて、酸化処理する。
３．第一基板１０及び第二基板２０を、約１Ｍの水酸化カリウム中で、１０〜２０分間、超音波処理する。
４．上記３の工程を繰り返す。

５．第一基板１０及び第二基板２０を、脱イオン水中で、１０〜２０分間、超音波処理する。
６．シラン化剤を、溶媒中に約２〜１０体積％になるように溶解させた溶液で、第一基板１０及び第二基板２０をシラン化する。
７．水でガラス基板をすすぐ。
８．第一基板１０は、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸エステル）のみ、第二基板は、ｍＰＥＧ−ＳＰＡとビオチン化ＰＥＧを所定の割合で混合した溶液中でインキュベートする。混合割合は、第二基板２０に結合させる所望の捕捉オリゴヌクレオチドの濃度に応じて決定する。
９．第一基板１０及び第二基板２０を、脱イオン水中で洗浄後、乾燥し、真空保存する。

このようにして得られた、化学修飾された第一基板１０、第二基板２０の概念図を、図１に示す。第二基板２０においては、捕捉オリゴヌクレオチド２２の一例であるオリゴｄＴが所望の濃度で特異的に結合されており、第一基板１０、第二基板２０とも、生体物質の非特異的な付着を防止する化学修飾基１１、２１を備えている。なお、図１中の化学修飾基及びオリゴｄＴの数は概念的なものであり、特定の数に限定されることを意図するものではない。

次に、第一基板１０、スペーサー３０、第二基板２０を積層する工程においては、まず、第一基板１０上もしくは第二基板２０上に、スペーサー３０を積層する。このとき、スペーサー３０の形状が、流路４０の容積を決定し得る。一例として、両面テープ状のスペーサーを用いる場合には、流路４０となる部分を残してスペーサーを基板に積層する。あるいは、別の例として、高分子薄膜からなるスペーサーを用いる場合には、例えば既知の印刷技術を使用して、第一基板１０上もしくは第二基板２０上に、所望の流路４０部分を残して、均一な厚さでスペーサーを形成することができる。

次いで、前工程で形成したスペーサー３０に、対向する基板を積層する工程を経ることで、本実施形態に係るフローセルを製造することができる。

本発明の第一実施形態によるフローセルは、極微量の核酸サンプル溶液、例えば、約０．１〜１ｐＭの測定対象核酸分子を含む１μＬ以下の容量の核酸サンプル溶液を適用することで、セル流路内の捕捉面に、測定対象核酸分子を１００％捕捉することができる。本実施形態のフローセルは、ＰＣＲなどの核酸増幅によるバイアスを回避して、一分子シークエンシングを実施するために有効に用いることができ、核酸サンプル溶液に含まれる総ての核酸分子について、網羅的な検出を可能にするものである。

次に、本発明は、第二実施形態によれば、核酸配列決定装置である。図３は、第二実施形態による核酸配列決定装置を概念的に示す図である。図３を参照すると、核酸配列決定装置１００は、上述の第一実施形態のフローセル１と、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０と、ステージユニット１４０と、自動焦点制御ユニット１５０と、励起ユニット１６０と、検出ユニット１７０と、コンピュータ１８０とを備える。

ポンプユニット１１０は、第三実施形態において詳細に説明する核酸配列決定方法において使用する、核酸モノマーを含んだ緩衝液などの試薬類をフローセルに供給するためのユニットである。ポンプユニット１１０は、主として、必要な試薬類と、これらの試薬類を所定の量で、かつ所定の順番で、フローセル１に供給する供給ポンプとを備えるものである。少なくとも、２０〜３０種類の試薬を、５〜５０μＬ程度の極微量ずつフローセル１に供給する必要がある。このようなポンプユニット１１０の技術は既知であり、任意の微量分注ポンプユニットを用いることができる。ポンプユニット１１０は、コンピュータ１８０と作動可能に連結されており、試薬類を所定の量で、かつ所定の順番で、フローセル１に供給する機構は、コンピュータ１８０により制御される。

フローユニット１２０は、前記供給ポンプとフローセル１とを接続する流体の供給管と、フローセル１と、フローセル１で使用済みの流体をフローセル１から排出する排出管及び排出ポンプとから構成される。フローセル１は第一実施形態において詳述したものを使用する。例えば、フローセル１を用いる場合、入口１２、出口１３には、流体の供給管、排出管を着脱可能に接続することができる。接続の機構は詳細には示さないが、通常の方法を用いて、流体が漏出することのないように構成される。

温度制御ユニット１３０は、ヒーターと、温度調節器とから構成される。ヒーターは、通常、ステージユニット１４０を構成するステージに設けられ、ステージに着脱可能に載置されるフローセル１内の試料の温度を、例えば、約２５〜約６０℃の範囲で調整することができるものである。なお、ヒーターの温度調節範囲はこの範囲に限定されるものではない。ヒーターの一例としては、アルミ製のヒータープレートで、フローセルを挟み込み、ねじで固定する型のものを用いることができるが、これに限定するものではない。

ステージユニット１４０は、セル内の蛍光を観察可能な顕微鏡と、駆動可能なステージとから構成することができる。

顕微鏡の一例として、全反射照明蛍光顕微鏡が挙げられる。全反射照明蛍光顕微鏡は、一般的には、レーザー光をカバーガラスで全反射させることで得られる、カバーガラスの反対側に位置する水溶液層に浸み出すエバーネッセント光を利用し、カバーガラスのごく近傍の蛍光分子を励起して観察するものである。本発明におけるフローセルの光透過性の面が、カバーガラスに相当する機能を果たし、捕捉面に固定された捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖に結合される蛍光色素が励起される。顕微鏡の他の例としては、共焦点顕微鏡や落射蛍光顕微鏡を挙げることができるが、これらには限定されない。

ステージは、エンコーダ付電動ステージであってよい。分解能は０．０１〜０．１μｍ、移動量は３０〜１５０ｍｍであることが好ましい。

自動焦点制御ユニット１５０は、上記ステージユニットを構成する全反射照明蛍光顕微鏡の対物レンズの位置を調節するものである。一例として、自動焦点維持装置パーフェクトフォーカス機能を内蔵した対物レンズの位置を調節する機構を備え、リアルタイムでの焦点位置検出とフィードバックが可能で、高速画像取得をしながらの焦点維持が可能である特性を備えるものを用いることができる。

励起ユニット１６０は、励起原となるレーザーと、励起タイミングを調節するためのシャッターから構成される。レーザーは、例えば、連続波発振動作（ＣＷ）レーザーを用いることができるが、特定のレーザーには限定されない。レーザーの他の例としては、パルス光源レーザーといったレーザーを使用することもできる。レーザーの発振波長は、ヌクレオチドモノマーに結合された蛍光色素に対応する必要があり、当業者であれば、使用する蛍光色素の種類によって適切な発信波長を決定することができる。例えば、蛍光物質として、Ｃｙ５の励起に適した６３９ｎｍを発振するレーザーを用いて実施することが可能であるが、特定の波長に限定されない。

検出ユニット１７０は、前記顕微鏡で観察されたフローセルの内部からの蛍光の画像を、画像データとして取得する装置である。フローセル内の捕捉面全体にわたって、蛍光画像を取り込むことができるものであればよく、スキャンすることによって、捕捉面全体の蛍光画像を得ることができるものであることが好ましい。

一例として、検出ユニット１７０は、ＴＤＩ（時間遅延積分方式）ラインスキャン装置を備えるＣＣＤカメラから構成されるものであってよい。ＴＤＩラインスキャン装置によるラインスキャニング方法を用いることで、本発明のフローセル１の測定対象核酸分子が固定されている全域である、視野全体を捉えることができる。ＴＤＩラインスキャン装置は、広い面積にわたって、特定方向にスキャンしたストリップを併せて一つの画像を得ることができる装置であって、境界線のない大きな画像を得られることが特徴であるため、好ましい。ＴＤＩラインスキャン装置としては、市販の装置を用いることができる。

従来、核酸の配列決定手法において、ラインスキャン装置が用いられることはなかったが、本実施形態においては、ＴＤＩラインスキャン装置を備える検出ユニット１７０を用いることにより、捕捉面全体を網羅的に検出することができるようになり、効率的かつ正確な測定が可能になる。

コンピュータ１８０は、前述のすべてのユニットを制御し、核酸配列決定を実行させるとともに、検出ユニット１７０で得られた画像から、シグナルを検出し、さらに、各サイクルで得られた複数の画像から、シグナルの情報に基づいて、核酸塩基配列を決定する。シグナルの検出には、任意のアルゴリズムを用いることができ、例えば、市販の１分子位置検出ソフトウエアを用いることができる。

本発明の第二実施形態による核酸配列決定装置は、フローセルと、装置に含まれるすべてのユニットとを備えることで、短い測定時間で、一細胞分もしくはそれ以下に相当する分子数の核酸の配列決定を実施することができる。

次に、本発明の第三実施形態による核酸配列決定方法について説明する。かかる方法は、第一実施形態において説明したフローセルを用いて、フローセルの捕捉面に固定された測定対象核酸を検出及び／または解析することを特徴とする。

第三実施形態による核酸配列決定方法は、
ａ）第一実施形態に記載のフローセルに、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する測定対象核酸分子を含んでなる核酸サンプル溶液を適用する工程であって、それにより前記フローセルの前記捕捉オリゴヌクレオチドに、前記測定対象核酸分子を結合する、工程と、
ｂ）前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合した測定対象核酸分子を核酸配列決定に供する工程とを含む。

前記工程ｂ）は、以下の工程ｃ）およびｄ）を含んでもよい：
ｃ）４種類のヌクレオチドモノマーを１種類ずつ順次使用して以下のｃ１）〜ｃ４）を繰り返して行う工程：
ｃ１）前記フローセルにおいて、蛍光色素が切断可能に結合された１種類のヌクレオチドモノマーと、ポリメラーゼとの存在下で、前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記測定対象核酸分子の配列依存的に伸長すること、
ｃ２）前記ｃ１）における未反応の物質を、前記フローセルから除去すること、
ｃ３）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得ること、
ｃ４）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去すること、および
ｄ）工程ｃ）で得られた画像を処理し、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖の核酸配列を得る工程。

前記捕捉オリゴヌクレオチドが１種類のヌクレオチドから構成されている場合、前記工程ｂ）が、工程ｃ）の前に以下の工程ｅ）〜ｉ）（以下、これらをまとめて「フィルアンドロック工程」ともいう）をさらに含んでもよい：
ｅ）前記捕捉オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドと同一の１種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼとの存在下で、捕捉オリゴヌクレオチドから、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に伸長する工程、
ｆ）蛍光色素が切断可能に結合された、前記工程ｅ）における前記１種類のヌクレオチドモノマーとは異なる３種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
ｇ）前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
ｈ）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程
ｉ）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。

最初に、本発明において配列を決定する対象となる核酸サンプル溶液について説明する。核酸サンプル溶液は、生体細胞から得た、多種多様な核酸分子を含むものであってよい。本発明においては、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれであっても測定することができる。好ましくは、核酸は単一の細胞に由来する全てのＲＮＡである。また、本発明において、核酸サンプル溶液は、ＰＣＲ等による増幅をしていないものであることが好ましい。したがって、例えば、配列の異なる、６０，０００〜１５，０００，０００分子の核酸を含む試料を測定することができる。

必要に応じて、本発明の核酸配列決定方法を実施する前に、核酸サンプル溶液を構成する各測定対象核酸分子の３’末端に、フローセルに固定された捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を、酵素処理などにより付加する前処理工程を含むことが好ましい。核酸サンプル溶液を構成する各測定対象核酸分子を、フローセルの捕捉オリゴヌクレオチドに強固に結合させるためである。捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、５０〜２００塩基数であることが好ましく、１００〜２００塩基数であることがさらに好ましい。捕捉オリゴヌクレオチド２２との結合を強固にするためである。捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の配列特性は、捕捉オリゴヌクレオチド２２に依存して決定される。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドがオリゴｄＴである場合、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列としてポリＡが付加される。この場合、酵素処理には、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手可能であり市販される大腸菌ポリＡポリメラーゼターミナルトランスフェラーゼ等のようなポリメラーゼが有用である。これらのポリメラーゼを用いる酵素処理は、製造業者の指示書に従って実施することができる。なお、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、捕捉オリゴヌクレオチドに対し、十分な結合強度を有しているものであれば、完全な相補鎖でなくとも、一塩基または数塩基の塩基対ミスマッチが存在してもよい。

前処理工程は、測定対象分子が本来３’末端にポリＡテイルを有するｍＲＮＡである場合や、測定対象核酸分子中の特定の配列を、捕捉オリゴヌクレオチドとの結合部位として用いる場合には、必要がない場合もある。このような場合には、測定対象核酸分子中に、「捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列が備わっている」ということができる。また、例えば、天然の配列特性として、３’末端に１以上のＡ残基が存在し、そこに上記前処理工程によりさらにＡ残基を付加した場合には、天然の配列特性において備わっているＡ残基と、付加したＡ残基を含めて捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列ということができる。ここでは、一例としてＡについて述べたが、Ｕ、Ｃ、Ｇ並びに、ＤＮＡ分子におけるｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧにおいても同様の定義を適用することができる。

必要に応じて、前述のように前処理をした測定対象核酸分子は、緩衝液中に溶解して、上記工程ａ）に供する核酸サンプル溶液とする。緩衝液は、ｌｘＳＳＣ／１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳといった組成とすることが好ましいが、かかる組成に限定されることはない。

工程ａ）の捕捉オリゴヌクレオチドに測定対象核酸分子を結合する工程では、第一実施形態において詳述したフローセル１に、核酸サンプル溶液を適用することにより、測定対象核酸分子をフローセル１の捕捉オリゴヌクレオチド２２に結合する。かかる工程ａ）においては、フローセル中の溶液の塩濃度および温度（例えば５０℃）を一定に維持して所定の時間（例えば１時間）インキュベーションすることが好ましい。このとき、フローセルに固定された捕捉オリゴヌクレオチドと、測定対象核酸分子の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列とが相補的な結合を形成することにより、複数の測定対象核酸分子がフローセル１に固定される。第二実施形態による核酸配列決定装置１００を用いて本実施形態による方法を実施する場合、工程ａ）は、コンピュータ１８０を用いて、所定の条件を設定することより、主として、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

次いで、前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合した測定対象核酸分子を核酸配列決定に供する。核酸配列決定の方法は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した測定対象核酸分子を利用できるものであれば特に限定されず、１分子のポリメラーゼの複製反応をリアルタイムに検出する１分子シークエンシング方法や、核酸の取り込みによって排出されるリン酸を捉えるパイロシークエンシング方法が挙げられる。

例えば、以下の工程ｃ）およびｄ）を含む方法によって実施することができる：
ｃ）４種類のヌクレオチドモノマーを１種類ずつ順次使用して以下のｃ１）〜ｃ４）を繰り返して行う工程：
ｃ１）前記フローセルにおいて、蛍光色素が切断可能に結合された１種類のヌクレオチドモノマーと、ポリメラーゼとの存在下で、前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記測定対象核酸分子の配列依存的に伸長すること、
ｃ２）前記ｃ１）における未反応の物質を、前記フローセルから除去すること、
ｃ３）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得ること、
ｃ４）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去すること、および
ｄ）工程ｃ）で得られた画像を処理し、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖の核酸配列を得る工程。

工程ｃ）は、４種類のヌクレオチドモノマーを１種類ずつ順次使用して以下に詳述するｃ１）〜ｃ４）を繰り返して行うことによって、前記捕捉オリゴヌクレオチドから、前記測定対象核酸分子の配列依存的に伸長し、蛍光画像を得るものである。本発明において、「捕捉オリゴヌクレオチドから、測定対象核酸分子の配列依存的に伸長する」、とは、工程ａ）で結合させた捕捉オリゴヌクレオチドと、測定対象核酸分子との複合体において、測定対象核酸分子を鋳型として、ポリメラーゼにより、捕捉オリゴヌクレオチドの３’側に伸長鎖を形成することをいう。

ｃ１）において、前記フローセルにおいて、蛍光色素が切断可能に結合された１種類のヌクレオチドモノマーと、ポリメラーゼとの存在下で、前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記測定対象核酸分子の配列依存的に伸長する。

蛍光色素が切断可能に結合されたヌクレオチドモノマーは、例えば、Ｃｙ５などの蛍光色素が、例えば、Ｓ−Ｓ結合で共有結合的に、かつ切断可能に結合された核酸塩基を有するヌクレオチドモノマーである。例えば、国際公開ＷＯ2009／124254Ａ１号公報の第９２頁に記載のものを用いることができるが、これらには限定されない。国際公開ＷＯ2009／124254Ａ１号公報に記載のヌクレオチドモノマーは、組み込み効率、精度ともに高いという点で有利である。同様の機能を有するモノマーであれば、当業者が新たに合成して製造することもできるし、改変することもできる。ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素であってよい。測定対象核酸分子がＤＮＡの場合は、ＤＮＡポリメラーゼを用いることができ、測定対象核酸分子がＲＮＡの場合は、逆転写酵素を用いることができる。

ここでは、蛍光色素が切断可能に結合されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのいずれかと、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばクレノウ酵素）とにより、測定対象核酸分子の配列依存的に、１塩基分だけ、伸長する。図６（ａ）は、ｃ１）が終了した時点のフローセル内を模式的に示す図である。１種類のヌクレオチドモノマーとしては、蛍光色素が切断可能に結合されたｄＣＴＰを使用している。ｄＣＴＰを用いて、測定対象核酸分子依存的に、１塩基分だけ伸長するため、測定対象核酸分子の配列の１本鎖部分の５’側にＧが存在する、右側の伸長鎖のみが伸長されている。左側、真ん中の伸長鎖は、伸長されない。第二実施形態による核酸配列決定装置１００を用いて本実施形態による方法を実施する場合、ｃ１）は、コンピュータ１８０を用いて、所定の条件を設定することより、主として、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

ｃ２）において、前記ｃ１）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する。未反応の物質の除去は、例えば、フローセルに３回、各々１×ＳＳＣ／１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）を含む溶液及び、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を含む溶液を導入することで実施することができる。ｃ２）も、ｃ１）と同様に、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

ｃ３）において、前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る。図６（ｂ）は、ｃ３）が終了した時点のフローセル内を模式的に示す図である。測定対象核酸分子の配列中のＧに依存して伸長された、３’末端がＣとなっている伸長鎖のみに蛍光色素が結合している。そして、図６（ｂ）の下のパネルに見られるように、３’末端がＣとなっている伸長鎖のみが、蛍光シグナルを発している状態を、画像として捉えることができる。ｃ３）では、励起ユニット１６０を機能させ、ステージユニット１４０、自動焦点制御ユニット１５０、検出ユニット１７０により、フローセル内の蛍光をスキャンして画像を得る。

ｃ４）において、前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する。蛍光色素の切断は、例えば、５０ｍＭ ＴＣＥＰ(ｔｒｉｓ(２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ)ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ)といった試薬をフローセル中に導入し、５分間待つことで、行われ得るが、用いる試薬は特定の物には限定されない。当業者であれば、蛍光色素部分を選択的に切断することができ、他の物質に影響を与えない試薬を選択することができる。除去は、例えば、ｃ２）と同様に、フローセルに３回、各々１×ＳＳＣ／１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）を含む溶液及び、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を含む溶液を導入することで実施することができる。ｃ４）も、ｃ１）、ｃ２）と同様に、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

図６（ｃ）は、ｃ４）の終了時点でのフローセル中を模式的に示す図である。蛍光色素や未反応のモノマー分子は存在せず、ｃ１）からｃ４）までの１サイクルが終了した状態である。図６（ｃ）のパネルは、この時点で、全反射蛍光鏡画像を取得したときの画像である。理論的には、蛍光色素が結合した核酸は存在せず、蛍光シグナルがない状態である。なお、図６（ｃ）中に観察される蛍光は、完全に除去することのできない非特異吸着を示している。この非特異吸着蛍光は各サイクル毎にその蛍光位置を不規則に変えるため、画像処理の段階で除去することが可能である。

工程ｃ）では、４種類のヌクレオチドモノマーを１種類ずつ順次使用して上記のｃ１）〜ｃ４）を繰り返して行う。ここで、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰの４種のヌクレオチドモノマーを用いて、４サイクルを実施する単位を、１ラウンドと指称する。図６（ｄ）は、ｄＣＴＰによる第１サイクルが終了したのち、ｄＡＴＰによる第２サイクルのｃ１）を実施した状態を示す。なお、４種のヌクレオチドモノマーのサイクルの順序は問わず、例えば、第１サイクルで、ｄＣＴＰ、第２サイクルで、ｄＡＴＰ、第３サイクルでｄＧＴＰ，第４サイクルでｄＴＴＰによる伸長を行うことができる。しかし、各ラウンドにおいてサイクルの順序を変えることは好ましくない。

前記工程ｃ）においては、１ラウンドを繰り返して、伸長鎖を、さらに伸長していく。ラウンドの繰り返し数は、一例として、測定対象核酸分子の塩基長に依存してもよい。例えば、ラウンドを繰り返し、各サイクルの工程ｃ）で、蛍光が観察されなくなったら、終了することができる。あるいは、細胞中の全ての転写物の配列が既知であれば、決定された配列に基づいて遺伝子を同定するのに十分な情報が得られるまでラウンドを繰り返すことができる。さらには、最大のラウンド数を予め設定して実施することもできる。ラウンド数は、当業者が、測定対象核酸分子の特性および測定の目的に応じて、適宜決定することができる。前述の装置１００を用いる場合には、コンピュータ１８０において、所望の設定を行うことができる。

工程ｄ）は、工程ｃ）で得られた画像を処理し、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖の核酸配列を得る工程である。工程ｄ）を、図７を用いて説明する。図７（ｂ）は、第１サイクルでヌクレオチドＣに結合した蛍光分子の蛍光シグナルを捉えた画像を模式的に示す図、図７（ｃ）は、第２サイクルでヌクレオチドＡに結合した蛍光分子の蛍光シグナルを捉えた画像を模式的に示す図、図７（ｄ）は、第３サイクルでヌクレオチドＴに結合した蛍光分子の蛍光シグナルを捉えた画像を模式的に示す図、図７（ｅ）は、第４サイクルでヌクレオチドＧに結合した蛍光分子の蛍光シグナルを捉えた画像を模式的に示す図である。ここで、Ｓｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ４は、蛍光シグナルが観察される位置であって、これは、１分子の測定対象核酸分子が固定されている位置に等しい。そして、これらの画像を重ね合わせることによって、Ｓｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ４のそれぞれにおいて、伸長鎖の塩基の種類及び順番が呼び出される。図７（ａ）は、第１サイクルから第４サイクルまでの１ラウンドで、Ｓｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ４のそれぞれにおいて、呼び出された塩基を示すものである。Ｓｐｏｔ１では、伸長鎖は、５’側から、Ｃ、Ａ、Ｔの順に配列していることがわかる。同様に、Ｓｐｏｔ２では、伸長鎖は、Ｔ、Ｓｐｏｔ３では、伸長鎖は、Ｔ、Ｓｐｏｔ４では、伸長鎖は、Ｇである。これを、次のラウンドについても同様に行うことで、伸長鎖の初期状態の次の塩基から、３’末端の塩基までのすべての核酸塩基配列を呼び出すことができる。工程ｄ）は、コンピュータ１８０を用いて実施することができる。

追加の工程として、工程ｄ）で得られた伸長鎖の核酸塩基配列をさらに解析したり、伸長鎖の核酸塩基配列に基づいて測定対象核酸分子の塩基配列を得たりする工程を設けても良い。コンピュータ１８０において、任意の追加のアルゴリズムを実行させることで、様々な計算や解析が可能になる。

前記捕捉オリゴヌクレオチドが１種類のヌクレオチドから構成されている場合、工程ｃ）の前にフィルアンドロック工程を行ってもよい。工程ａ）の終了後の、セルの状態の概念図を、図４に示す。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドがオリゴｄＴ_５０であり、測定対象核酸分子がポリＡからなる捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を備える場合を例として説明する。なお、図４のＴは、説明の便宜上、ｄＴの５塩基分を表すものとする。このとき、５０塩基のオリゴｄＴのすべてが、ポリＡと相補的な結合を作っているとは限らない。例えば、図４（ａ）のように５０塩基のうち２０塩基のみが相補鎖を形成している分子、図４（ｂ）のようにオリゴｄＴの５０塩基すべてが相補鎖を形成している分子など様々な場合があり得る。さらに、図４（ａ）のように相補鎖を形成している塩基数が少ないために、結合安定性が不足し、図４（ｃ）のようにより多くの塩基が相補鎖を形成するようにずれが生じる場合もあり得る。このように、工程ａ）を経た状態において、各分子の結合状態は均一ではなく、多種多様でありうる。フィルアンドロック工程は、このような多種多様の結合状態から、各分子について測定が開始できる初期状態にまで捕捉オリゴヌクレオチドを伸長するとともに、捕捉オリゴヌクレオチドと、測定対象核酸分子との結合のずれが生じないように確実に固定することを意図するものである。

図５（ａ）は、図４と同様に、各分子の結合状態が初期状態にない場合の図を概念的に示すものである。「初期状態」とは、捕捉オリゴヌクレオチドが、測定対象核酸分子の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に伸長され、さらに、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側の１ヌクレオチド依存的に伸長された状態をいうものとする。図４においてオリゴｄＴとポリＡについて説明したように、複数の測定対象核酸分子は、それぞれ、捕捉オリゴヌクレオチドへの結合状態が異なるため、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に初期状態まで伸長される場合の伸長される塩基数も、分子によって異なることとなる。

フィルアンドロック工程は、以下の工程ｅ）〜ｉ）を含む：
ｅ）前記捕捉オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドと同一の１種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼとの存在下で、捕捉オリゴヌクレオチドから、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に伸長する工程、
ｆ）蛍光色素が切断可能に結合された、前記工程ｅ）における前記１種類のヌクレオチドモノマーとは異なる３種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
ｇ）前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
ｈ）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程、
ｉ）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。

工程ｅ）において、使用するヌクレオチドモノマーは、核酸塩基に蛍光色素が結合されていないものであって、デオキシヌクレオチド三リン酸を使用することが好ましく、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を用いることができる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列が、ポリＡの場合は、蛍光色素が結合されていないｄＴＴＰを用いることができる。ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであるクレノウ酵素を用いることができる。緩衝液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０μＭ ＭｎＳＯ_４、１０ｍＭ(ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び５０Ｕ／ｍＬクレノウフラグメント（ｅｘｏ−）とすることができる。緩衝液中のヌクレオチドモノマーの濃度は、それぞれ、５０〜２００ｎＭとすることが好ましい。フローセルへの適用の温度条件、伸長反応時間等は、フローセル中で、ポリメラーゼによって捕捉オリゴヌクレオチドを伸長することができる条件であればよく、具体的には、３７〜５０℃、４〜１０分間といった条件とすることができる。工程ｅ）は、コンピュータ１８０を用いて、所定の条件を設定することより、主として、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

次に、工程ｆ）では、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列に相補的なヌクレオチド以外の、３種のヌクレオチドモノマーを同時に、ポリメラーゼとともにフローセルに供給する。これにより、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列とは別の種類のヌクレオチドに依存して、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖がさらに１塩基分だけ組み込まれる。工程ｆ）も、工程ｅ）と同様に、主として、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

図５（ｂ）は、上述の工程ｅ）及びｆ）を経て、初期状態となった、捕捉オリゴヌクレオチドと測定対象核酸分子との複合体を概念的に示す図である。捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖と相補的に結合している。そして、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチドもまた、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖と、相補鎖を形成している。そして、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖の３’末端には、蛍光色素が結合したヌクレオチドが位置している。伸長鎖の３’末端にある蛍光色素が結合したヌクレオチドの種類は、測定対象核酸分子の配列に依存するため、それぞれの伸長鎖で異なっている。

次いで、工程ｇ）において前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去し、工程ｈ）において前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る。図５（ｂ）のパネルは、この時点で、全反射蛍光鏡画像を取得したときの画像である。理論的には、測定対象核酸分子のすべてが、蛍光色素が結合した伸長鎖と複合体を形成している状態であり、核酸サンプル溶液中のすべての測定対象核酸分子に相当する、蛍光シグナルを捉えている状態である。工程ｇ）は、主として、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させることにより、工程ｈ）は、主として、励起ユニット１６０と、ステージユニット１４０と、自動焦点制御ユニット１５０と、検出ユニット１７０とを機能させることにより実施することができる。

次に、蛍光色素を切断、除去する工程ｉ）を実施する。切断および除去はｃ４）について上記したのと同様に行われる。図５（ｃ）は、工程ｉ）の終了後、３種の核酸塩基の蛍光色素が切断された状態の複合体を示す。また、図５（ｃ）のパネルは、この時点で、全反射蛍光鏡画像を取得したときの画像である。理論的には、蛍光色素が結合した核酸は存在せず、蛍光シグナルがない状態である。工程ｉ）は、ポンプユニット１１０と、フローユニット１２０と、温度制御ユニット１３０とを機能させて実施することができる。

上記フィルアンドロック工程においては、初期状態とすることで、すべての測定対象核酸分子からのシグナルを得る。これにより、測定対象核酸分子の各々のセル中での位置、及び核酸配列を決定すべき測定対象核酸分子の総数およびその基板上の結合位置が得られる。

捕捉オリゴヌクレオチドが１種類のヌクレオチドから構成されている場合以外には、上記工程ｅ）〜ｉ）に替えて、初期状態とする工程のみを行えばよい。具体的には、捕捉オリゴヌクレオチドが２種類以上のヌクレオチドから構成されている場合は、下記の工程ｆ’）〜ｉ’）を実施する。
ｆ’）蛍光色素が切断可能に結合された、４種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
ｇ’）前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
ｈ’）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程
ｉ’）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。

捕捉オリゴヌクレオチドが１種類のヌクレオチドから構成されている場合以外には、捕捉オリゴヌクレオチドと捕捉対象核酸との間で、結合位置がずれる可能性が低いため、いわゆる、フィルアンドロックが必要ない。しかし、この場合にも、初期状態として、すべての捕捉オリゴヌクレオチドからの蛍光を捉える工程を含むことが好ましい。

なお、上記の方法は、測定対象核酸分子が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）からなる核酸分子である場合について具体的に説明した。上記の方法に有用な既知のおよび従来のＤＮＡポリメラーゼには、限定的ではないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴｈｅｒｍｏＳｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、ＵＩＴｍａＤＮＡポリメラーゼ、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、古細・BR>ロＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ＤＮＡポリメラーゼＩＩが含まれる。測定対象核酸分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）からなる核酸分子である場合には、上記工程のうち、ＤＮＡポリメラーゼを用いて測定対象核酸分子依存的に捕捉オリゴヌクレオチドを伸長する工程に替えて、逆転写酵素を用いて測定対象ＲＮＡ分子依存的に捕捉オリゴヌクレオチドを伸長する工程とすることで、本発明の方法を実施することができる。逆転写酵素の種類としては、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ、およびその他のレトロウイルスからの逆転写酵素を用いることができるが、これらには限定されない。

本実施形態にかかる方法においては、微量の測定対象核酸分子の配列を決定できる。本発明の方法に従って配列をできる核酸の量は、例えば１ｐｇ以下、好ましくは１００ｆｇ以下、より好ましくは１０ｆｇ以下である。ただし、本発明によれば、より多量（例えば１μｇ以下）の核酸を使用することもできる。本発明の方法により、測定対象核酸分子の例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上、なお好ましくは約１００％が、捕捉オリゴヌクレオチドに結合され、配列決定に今日される。このように、微量の測定対象核酸分子を配列決定できるので、増幅していない（非増幅の）核酸分子を使用することができる。従来技術では、核酸サンプル溶液をセルに供給する前の時点で、ＰＣＲによる核酸増幅が必須であり、それに伴い定量性が失われるものであったが、本発明においては、フローセルによりこのような問題点を解決したものである。また、本発明の方法では単一細胞由来の核酸分子を配列決定に供することができる。

以下に、本発明を、実施例を用いてさらに具体的に説明する。以下の実施例は、本発明の例示であり、本発明は実施例に記載された範囲に限定するものではない。

［フローセルの作製］
最初に、第一基板１０、第二基板２０として、ガラス基板を用意し、これらに化学修飾を行った。第一基板１０の厚さが１〜３ｍｍ、および第二基板２０の厚さ０．１２〜０．１７ｍｍのガラス基板を、ベクタボンド（ベクター社製）を用いてアミノシラン化し、アミノ基を反応させた。その後、ＮＨＳ反応基の結合したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ（Ｎａｎｏｃｏｓ社製、製品名ＢＩＯＴＩＮ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｍ．Ｗ．５０００ＤＡ））とＰＥＧ（Ｎａｎｏｃｏｓ社製、製品名ＭＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｍ．Ｗ．５０００ＤＡ））を、１：１００で混合した、濃度が１０％ｗ／ｖの溶液を第二基板に相当するガラス基板の片方の側面のみに反応させた。第一基板に相当するガラス基板には、予め流体の入口、出口となる小孔を、電着ダイヤモンドバー（ミニター社製、ＡＤ２１０３）を用いて形成し、その後に、ＰＥＧ（Ｎａｎｏｃｏｓ社製、ＭＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｍ．Ｗ．５０００ＤＡ））を、片方の側面のみに反応させた。次に、捕捉オリゴヌクレオチドとして、末端をビオチン化した濃度が１０００ｐＭのオリゴｄＴ_５０溶液を用意し、ストレプトアビジンを介して基板へと結合させた。この場合、基板上のオリゴｄＴ_５０の付着密度は、およそ４×１０^６分子／ｍｍ^２となる。

これらのガラス基板を用いて、図２に示したフローセルを作製した。２枚の修飾を行ったガラス基板を複数回のフローに耐えることのできる、厚さが３０μｍの両面テープ（３Ｍ社製、フィルム基材両面テープ（一般用）９３１３ＢＴ）によって挟み込み、容量が約１μＬの流路を備えるフローセルを作成した。

通常は第一基板に相当するガラス基板としては非修飾のガラス基板を用いるが、今回は超微量の核酸サンプル溶液をロスさせないために、第一基板に相当するガラス基板にも非修飾ＰＥＧを修飾させて挟み込む構造を構築した。その結果、第一基板に非特異的に捕捉される測定対象核酸分子が激減し、第二基板のみに測定対象核酸分子を捕捉することに成功した。

［フローセルの測定対象核酸分子の捕捉率］
次に、上記実施例１で作製したフローセルの、捕捉オリゴヌクレオチドとしての修飾オリゴＴの密度と捕捉率を調べるために、Ｃｙ５で蛍光標識したオリゴｄＡ_５０を用いて結合の１分子可視化を行った。図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、シグナル輝点密度がオリゴｄＡ_５０濃度に比例し上昇した。２００ｐＭ条件下で、シグナル輝点の観察により結合を確認した後、フローセルを９５度でインキュベーションしオリゴ結合を解離させた。その結果、図８（ｃ）に示すように、輝点は消失した。これは非特異結合がないことを示している。

次に、オリゴｄＡ_５０が、どの程度の効率でフローセルに結合しているのかを調べるために、オリゴｄＡ_５０の、第二基板への捕捉率を調べた。捕捉率は、以下の式により計算することができる。

捕捉率（％）＝[AB]/[A]₀
[K_d]=[A][B]/[AB]
[AB]=([A]₀+[B]₀+K_d)-{([A]₀+[B]₀+K_d)²-4[A]₀[B]₀}^1/2

上記式中、[A]は、オリゴ（ｄＡ_５０）のモル濃度、[A]₀は、オリゴ（ｄＡ_５０）の初期モル濃度、[B]はオリゴ（ｄＴ_５０）のモル濃度、[B]₀はオリゴ（ｄＴ_５０）の初期モル濃度を表し、[AB]は、オリゴ（ｄＡ_５０）とオリゴ（ｄＴ_５０）とが結合した複合体のモル濃度を表す。K_dは、解離定数を表す。

導入前の核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子数に対して輝点数の比を計算した。核酸サンプル溶液を変化したところ２０ｐＭオリゴ（ｄＴ_５０）において図９に示したように核酸サンプル溶液の濃度が低いほど捕捉率が高くなることを突き止めた。また、理論計算上、捕捉オリゴヌクレオチドであるオリゴｄＴ_５０の濃度が５０、２００、５００、１０００ｐＭと濃くなるにつれて測定対象核酸分子の捕捉率は著しく上昇することがわかった。理論計算の結果を、図１０に示す。

この結果を踏まえて、１０００ｐＭのオリゴｄＴ_５０を、ストレプトアビジンを介して、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ基板に固定した。そして、核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子に相当するｄＡ_５０の濃度を変えて、上記式１にしたがって、捕捉率を測定した。結果を図１１に示す。測定は、各々のフローセル、ｄＡ_５０の濃度において、２０〜３０回実施し、標準偏差をエラーバーで示している。図１１を参照すると、ｄＡ_５０の濃度を高くすることで、捕捉率を大きく上げることができることがわかった。この結果、本発明のフローセルを用いることで、核酸サンプル溶液の濃度が０．１ｐＭ、及び１ｐＭの濃度で、ほぼ全ての核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子を捕獲することに成功した。図１１には、従来技術のフローセルを用いた場合の捕捉率についても併記している。従来技術においては、最大でも３０％程度の捕捉率であったのに対し、捕捉率を１００％にまで上げることに成功した。捕捉率の向上は、核酸サンプル溶液中のすべての測定対象核酸分子について、塩基配列決定をするために欠かせない特性であり、本発明のフローセルの大きな利点となる。

［１ｐｇの超微量サンプルを用いたシーケンシング実施例］
これらの手法を総合し、実際に超微量サンプルを用いて配列決定実験を行った。そのためにシーケンシングに必要な化学サイクル及び安定的なシグナル取得に欠かせない装置を構築した。シーケンシングサイクルは、図５及び６に模式的に示したように、１塩基ずつフローコントロールによって各蛍光ヌクレオチド画像を取得し、どのフローのタイミングで蛍光ヌクレオチドが結合したかを画像レベルで統合することで実際に分子ごとの配列を呼び出した。用いた核酸配列決定装置の概略は、図３に示した。核酸配列決定装置１００において、ポンプユニット１１０、フローユニット１２０は、ＴＥＣＡＮ社製のユニットＸＬＰ６０００を用いた。温度制御ユニット１３０は、東海ヒット製ユニットを用いた。ステージユニット１４０、自動焦点制御ユニット１５０は、ＮＩＫＯＮ社製のユニットパーフェクトフォーカスユニット ＴＩ−ＮＤ６−ＰＦＳを用いた。励起ユニット１６０は、コヒーレント社製の連続波発振動作（ＣＷ）レーザーを用いた。検出ユニット１７０は、浜松ホトニクス社のＩｍａｇＥＭ−１Ｋ−Ｎ ＴＤＩ−ＥＭ−ＣＣＤカメラを用いた。これらのユニットは、すべてコンピュータ（ＰＣ）１８０により一括制御した。コンピュータ１８０の作動には、また、浜松ホトニクス社の１分子位置検出ソフトウエアを用いた。シーケンシングに必要な化学サイクル、温度制御、スキャン、画像取得の各動作は、本発明の方法を順で自動制御することができるシステムを構築した。

蛍光標識ヌクレオチドは、国際公開ＷＯ2009／124254Ａ１号公報の第９２頁に記載のものを用いた。これらの蛍光標識ヌクレオチドは１塩基ずつ画像取得を行った後、Ｓ−Ｓ結合を切断することによって次の塩基位置にポリメラーゼの移動が可能となる重要な化学物質である。

（サンプル結合工程）
上記実施例１で作製したフローセルをステージユニットに設置し、配列決定実験を行った。フローセルへの緩衝液の導入はフローセルの排出口に接続したポンプユニットにより行った。まずフローセルに、緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を７５μｌ流し、５０℃の温度に保った。次に、緩衝溶Ｂ（１×ＳＳＣ／１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ）中に、２５ｐＭとした核酸サンプル溶液を１μｌ、フローセルに流し、１時間放置した。放置の後、このフローセルに各７５μｌの緩衝溶液Ｂ（１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ）を２回流した。次いで各７５μｌの緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を２回流した。以降、このフローセルの温度は、３７℃に保った。

（フィルアンドロック工程）
国際公開ＷＯ2009/124254Ａ１号公報に記載のヌクレオチド類似体（１００ｎＭ ｄＣＴＰ類似体、１００ｎＭ ｄＧＴＰ類似体、５００ｎＭ ｄＵＴＰ類似体）、及び１ｍＭ ｄＴＴＰを含むヌクレオチド溶液(組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｍＭ ＨＣｌ、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５０Ｕ／ｍｌクレノウ（ｅｘｏ＋）ポリメラーゼ）を３０μｌ、フローセルに流し、３７℃の温度において、４分間待った。その後、このフローセルに各７５μｌの緩衝溶液Ｂ（１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ）を２回流した。次いで各７５μｌの緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を２回流した。続いて、緩衝液Ｄ（３０％アセトニトリル、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６７ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＭＥＳ、１２ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ、５ｍＭ ＤＡＢＣＯ、８０ｍＭグルコース、５ｍＭ ＮａＩ、０．１Ｕ／μｌグルコースオキシダーゼ、ｐＨ７．０を含む）を７５μｌ流した。初期状態の位置の画像化は、６３９ｎｍ照射レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）によって蛍光分子を励起することで行った。その後、このフローセルに各７５μｌの緩衝溶液Ｂ（１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ）を２回流した。次いで各７５μｌの緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を２回流した。次に、７５μｌの５０ｍＭ ＴＣＥＰ溶液をフローセルに流し、５分間待つことでＣｙ５蛍光色素を取り込まれたヌクレオチド類似体より切り離した。その後、このフローセルに各７５μｌの緩衝溶液Ｂ（１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ）を２回流した。次いで、各７５μｌの緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を２回流した。さらに、７５μｌの５０ｍＭヨードアセトアミド溶液をフローセルに流し、５分間待つことで、ヌクレオチド類似体を保護し、切り離されたＣｙ５蛍光分子との再結合を防いだ。その後、このフローセルに各７５μｌの緩衝溶液Ｂ（１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ）を２回流した。次いで各７５μｌの緩衝液Ａ（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を２回流した。

（シークエンス工程）
フィルアンドロック工程後のフローセルに、ｄＣＴＰ類似体溶液(組成：１００ｎＭ ｄＣＴＰ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｍＭ ＨＣｌ、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５０Ｕ／ｍｌクレノウ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ）を３０μｌ流し、３７℃の温度において、５分間待った。以下、蛍光分子画像化、切断、保護といった過程は上記フィルアンドロック過程と同様にして行った。以降、ヌクレオチド類似体のみ変更することでｄＣＴＰ類似体、ｄＡＴＰ類似体、ｄＧＴＰ類似体、ｄＵＴＰ類似体の順でこれらの工程を繰り返した。

（配列呼び出し工程）
上記過程において得られた蛍光分子画像を１分子解析ソフトウエア（浜松ホトニクス）によって解析した。

下記の表１に具体的なシーケンシング実施例を示した。これらのシーケンシング実験は繰り返し実験が可能で非常に再現性が高かった。下記の表中、○の表示は、シグナルが検出されたことを、−の表示はシグナルが検出されなかったことを示し、スポット＃は、図７で模式的に示したように、測定対象核酸分子の位置に対応させた番号である。F&Lはフィルアンドロック工程を、１ｓｔ、２ｎｄ、３ｒｄはそれぞれ第１、第２、第３ラウンドを示す。Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔは各ラウンド中のサイクルを示す。Obtainedは、第１ラウンドから第３ラウンドで伸長された、呼び出された核酸配列を示す。

本実施例では、予め配列が既知の測定対象核酸分子を用い、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖について、核酸配列を決定したが、伸長鎖の正確な核酸配列を得ることができた。

本願の基礎出願である、２０１３年３月１９日出願の日本国特許出願である特願2013-056690号の内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。また、本明細書において引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物の内容も、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

１ フローセル
１０ 第一基板
１１ 化学修飾基
１２ 入口
１３ 出口
２０ 第二基板
２１ 化学修飾基
２２ 捕捉オリゴヌクレオチド
３０ スペーサー
４０ 流路
１００ 核酸配列決定装置
１１０ ポンプユニット
１２０ フローユニット
１３０ 温度制御ユニット
１４０ ステージユニット
１５０ 自動焦点制御ユニット
１６０ 励起ユニット
１７０ 検出ユニット
１８０ コンピュータ

Claims (19)

1. 流体の入口と出口とを有する流路を備える核酸配列決定用のフローセルであって、
   前記流路が、第一基板と、少なくとも一部が光透過性の面で形成される第二基板と、前記第一基板と前記第二基板との間に設けられるスペーサーとにより画定され、前記流路の容積が１０μＬ以下であって、
   前記第一基板の流路に面した側面が生体物質の非特異的付着を阻害する化学修飾基を備え、
   前記第二基板の前記光透過性の面の、流路に面した側面が、測定対象核酸分子に特異的に結合する捕捉オリゴヌクレオチドを備えてなり、前記捕捉オリゴヌクレオチドが、１×１０ ^６ ／ｍｍ ^２ 以上の密度で、前記流路に面した側面に固定されている、フローセル。
2. 前記捕捉オリゴヌクレオチドが、オリゴｄＴである、請求項１に記載のフローセル。
3. 前記光透過性の面の、流路に面した側面が、生体物質の非特異的付着を阻害する化学修飾基をさらに備えてなる、請求項１に記載のフローセル。
4. 前記非特異的付着を阻害する化学修飾基が、ポリエチレングリコールまたはその誘導体である、請求項１に記載のフローセル。
5. 前記光透過性の面が、ガラスもしくはシリカである、請求項１に記載のフローセル。
6. 前記スペーサーの厚みが、１０〜５０μｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のフローセル。
7. 核酸配列決定装置であって、
   請求項１〜６のいずれか１項に記載のフローセルと、
   複数種類の試薬を独立して前記フローセルに供給するポンプユニットと、
   前記フローセルへの試薬の供給機構と、排出機構とを備えてなり、前記フローセルを着脱可能に載置するフローユニットと、
   前記フローセルの温度調節を行う温度制御ユニットと、
   前記フローセルからの蛍光を観察可能な顕微鏡と、駆動可能なステージとを備えるステージユニットと、
   前記顕微鏡の焦点を合わせる自動焦点制御ユニットと、
   励起光源とシャッターとを備える励起ユニットと、
   前記顕微鏡の蛍光画像を、画像データとして取得する検出ユニットと
   前記ポンプユニットと、前記フローユニットと、前記ステージユニットと、前記自動焦点制御ユニットと、前記励起ユニットと、前記検出ユニットとに、作動可能に接続されたコンピュータであって、前記複数のユニットを制御し、前記検出ユニットで取得された画像データから、核酸配列を決定するコンピュータとを備えてなる、核酸配列決定装置。
8. 前記検出ユニットが、時間遅延積分法式ラインスキャン装置である、請求項７に記載の装置。
9. 前記顕微鏡が、全反射照明蛍光顕微鏡である、請求項７に記載の装置。
10. 核酸配列決定方法であって、
    ａ）請求項１〜６のいずれかに記載のフローセルに、前記捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する測定対象核酸分子を含んでなる核酸サンプル溶液を適用する工程であって、それにより前記フローセルの前記捕捉オリゴヌクレオチドに、前記測定対象核酸分子を結合する、工程と、
    ｂ）前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合した測定対象核酸分子を核酸配列決定に供する工程と
    を含む、方法。
11. 前記工程ｂ）が以下の工程ｃ）およびｄ）を含む、請求項１０に記載の方法：
    ｃ）４種類のヌクレオチドモノマーを１種類ずつ順次使用して以下のｃ１）〜ｃ４）を繰り返して行う工程：
    ｃ１）前記フローセルにおいて、蛍光色素が切断可能に結合された１種類のヌクレオチドモノマーと、ポリメラーゼとの存在下で、前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記測定対象核酸分子の配列依存的に伸長すること、
    ｃ２）前記ｃ１）における未反応の物質を、前記フローセルから除去すること、
    ｃ３）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得ること、
    ｃ４）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去すること、および
    ｄ）工程ｃ）で得られた画像を処理し、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長鎖の核酸配列を得る工程。
12. 前記捕捉オリゴヌクレオチドが１種類のヌクレオチドから構成されており、前記工程ｂ）が、前記工程ｃ）の前に以下の工程ｅ）〜ｉ）をさらに含む、請求項１１に記載の方法：
    ｅ）前記捕捉オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドと同一の１種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼとの存在下で、捕捉オリゴヌクレオチドから、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列依存的に伸長する工程、
    ｆ）蛍光色素が切断可能に結合された、前記工程ｅ）における前記１種類のヌクレオチドモノマーとは異なる３種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
    ｇ）前記工程ｆ）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
    ｈ）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程、
    ｉ）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。
13. 前記捕捉オリゴヌクレオチドが２種類以上のヌクレオチドから構成されており、前記工程ｂ）が、前記工程ｃ）の前に以下の工程ｆ’）〜ｉ’）をさらに含む、請求項１１に記載の方法：
    ｆ’）蛍光色素が切断可能に結合された、４種類のヌクレオチドモノマーとポリメラーゼの存在下で、測定対象核酸分子中の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５’側に隣接する１ヌクレオチド依存的に、捕捉オリゴヌクレオチドから伸長する工程、
    ｇ’）前記工程ｆ’）における未反応の物質を、前記フローセルから除去する工程、
    ｈ’）前記蛍光色素を励起し、蛍光画像を得る工程、
    ｉ’）前記蛍光色素を切断し、切断した蛍光色素を前記フローセルから除去する工程。
14. 前記核酸サンプル溶液に含まれる測定対象核酸分子の量が、２０ｐｇ以下である、請求項１０に記載の方法。
15. 前記工程ａ）において、核酸サンプル溶液中の測定対象核酸分子の１００％が、前記フローセルの前記捕捉オリゴヌクレオチドに結合される、請求項１０に記載の方法。
16. 前記測定対象核酸分子が、非増幅核酸分子である、請求項１０に記載の方法。
17. 前記測定対象核酸分子が、単一細胞由来の核酸分子である、請求項１０に記載の方法。
18. 前記測定対象核酸分子が、ＲＮＡであり、前記ポリメラーゼが、逆転写酵素である、請求項１１に記載の方法。
19. 前記測定対象核酸分子が、ＤＮＡであり、前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。

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