JP6276862B2 - 高温で成熟胞子接種及び鉄イオン媒介ハーバー・ワイス反応によるヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチン生産量増進方法 - Google Patents

Description

本発明は、二段（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ）光培養工程でヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生産量を増進させる方法に関し、具体的には高温の独立栄養条件で成熟胞子（ｃｙｓｔ）の接種及び鉄イオン添加でヘマトコッカスプルビアリス細胞内アスタキサンチンの生産量を増進させる方法に関する。

一般に、赤みを帯びるケトカロテノイド（Ｋｅｔｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）であるアスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ、３，３’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−β，β’−ｃａｒｏｔｅｎｅ−４，４’−ｄｉｏｎｅ）は、β−カロテン（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ）のような化学的構造を持つカロテノイド系色素の一種で、有害活性酸素をなくす坑酸化機能性物質で、β−カロテンに比べて両側末端基にヒドロキシル基（−ＯＨ）とケトン基（＝Ｏ）を一つずつ多く持つ独特の分子構造的特性のために、既存の坑酸化物質よりも飛び切り高い坑酸化活性を持つ。アスタキサンチンは、代表的な抗酸化剤であるビタミンＥよりも５００倍、β−カロテンよりも２０倍程度高い坑酸化活性を持つ。このような高い坑酸化活性機能により、アスタキサンチンは、医薬品、食品添加剤及び動物と稚魚の飼料添加剤として広く使用されていて、その需要量及び活用範囲が急激に拡大すると予想されている。

このようなアスタキサンチンは、酵母菌株であるファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｔｈｏｄｏｚｙｍａ）とブレビバクテリウム（Ｂｅｒｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から生成されて、また、海洋動物と淡水動物に多く分布されているが、海老やザリガニなどの甲殻類から抽出されたアスタキサンチンは、含量が少なく、抽出過程が難しいため適用されずにいて、ファフィア・ロドザイマ菌株は、成長率が高いがアスタキサンチンの収率が低いという問題点を有している。

そこで、地球上でアスタキサンチンの蓄積含量と収率の側面で最も優れた微細藻類であるヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）を使用して光による二酸化炭素の固定化と同時にアスタキサンチンの生産性を高めるための様々な研究が行われている。

従来ＫＲ２００５−０００５３４１Ａでは、アスタキサンチンを生産することができる菌株を培養させ、このような菌株を利用して高含量のアスタキサンチンを生産するための方法で光照射量を増加させて微細藻類によるアスタキサンチンの生産量を増加させるための研究が行われたが、この場合、特別な形態の反応器が必要で、高い光照射量のためのエネルギー費用が大きい短所がある。また、ＫＲ２０１０−０１０５１９３Ａでは、放射線照射を利用してアスタキサンチンの生産方法を開示しているが、放射線照射費用を節減できない問題点がある。

一方、細胞成長及びアスタキサンチン合成に必要な炭素源としてただ二酸化炭素のみを利用する独立栄養条件で、アスタキサンチン生産誘導のためのヘマトコッカスプルビアリスの最も核心的なアスタキサンチン合成促進因子はまさに強力な光であるが、光源として太陽を活用した場合、温室ガスの主犯である二酸化炭素のアスタキサンチン転換工程へより経済性を与えることができ、強力な光によってアスタキサンチン合成が促進される反面、太陽光を吸収する微細藻類光培養器内培地の温度上昇により外部バクテリアによる汚染が加速化されるなどの様々な問題点が引き起こされる。

したがって、アスタキサンチン蓄積能力が優れたヘマトコッカスプルビアリスを屋外で太陽を活用して産業的に二酸化炭素転換工程に利用するためには、高温の独立栄養条件での遅いアスタキサンチン生産性問題を解決することが何より至急に必要であるのが現状である。

そこで、本発明者等は、ヘマトコッカスプルビアリスを屋外太陽光で培養して、アスタキサンチン生産収率向上方法を探そうと鋭意努力した結果、高温の独立栄養条件で成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種した後、鉄イオンを添加する二段（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ）光培養工程でヘマトコッカスプルビアリス細胞内のアスタキサンチンの生産量が顕著に増加するのを確認して本発明の完成に至った。

本発明の目的は、（ａ）ヘマトコッカスプルビアリスの成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種して増殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）させるステップ；及び（ｂ）窒素が欠乏して鉄イオンが添加された独立栄養条件で１００〜３００μＥ／ｍ^２／ｓの光度を照射してヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生成を誘導するステップを含む、ヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の培養によるアスタキサンチンの生産量を増進させる方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヘマトコッカスプルビアリスの成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種して増殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）させるステップ；及び（ｂ）窒素が欠乏して鉄イオンが添加された独立栄養条件で１００〜３００μＥ／ｍ^２／ｓの光度を照射してヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生成を誘導するステップを含む、ヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の培養によるアスタキサンチンの生産量を増進させる方法を提供する。

高温（３０℃、３６℃）の独立栄養条件で鉄イオン媒介ハーバー・ワイス反応を介したヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能力増大のための誘導過程を図式化した概略図である。 独立栄養条件でアスタキサンチン合成の間各々の温度条件（２３℃、３０℃、３６℃）と鉄イオンの添加によるヘマトコッカスプルビアリスのバイオマス及びアスタキサンチン生合成能力に及ぼす影響を示す結果である。 独立栄養条件でアスタキサンチン合成１８日目各々の温度条件（２３℃、３０℃、３６℃）と鉄イオンの添加によるヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン蓄積程度を示した光学顕微鏡イメージ結果である。（Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ＝４０μｍ） 独立栄養条件でアスタキサンチン合成１８日の間各々の温度条件（２３℃、３０℃、３６℃）と鉄イオンの添加によるヘマトコッカスプルビアリスのＤＣＦ含量、ＳＯＤ活性及びＭＤＡ含量に及ぼす影響を示す結果である。 ２３℃温度の独立栄養条件で、アスタキサンチン合成促進時、Ｏ_２ ⁻を人為的に放出するＭｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎの濃度と鉄イオン（Ｆｅ^２＋）増加によるヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン蓄積能力の減少及びこれと対照的に金属イオン媒介Ｆｅｎｔｏｎ反応によるアスタキサンチン蓄積能力の維持及び増加程度を示す結果である。 ２３℃でグリーンステージで培養された細胞を高温（２３．４〜３３．５℃）の独立栄養条件で鉄イオンを添加してヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産を確認した結果である。 高温（２３℃、３０℃、３３℃）条件で成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種を介したグリーンステージでヘマトコッカスプルビアリスのｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈを確認した結果である。 夏場高温の独立栄養条件でグリーンステージで１５日間培養後、鉄イオンを添加してレッドステージで６３日間培養でヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産量増加を確認した結果である。 屋外の中温及び高温（２３〜２８℃及び２８〜３３℃）条件で、二段（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ：グリーン及びレッドステージ）光培養を介したヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能力増大を誘導した過程及び結果を示したものである。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明では、高温の独立栄養条件でＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓの生産量を増加させて、アスタキサンチンを大量生産するために、成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種して、鉄イオンが添加された独立栄養条件のヘマトコッカスプルビアリス細胞に１０〜３００μＥ／ｍ^２／ｓの光度で照射することによって、ヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生成を誘導した。

本発明で使用した微細藻類であるＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、自然界に存在する生物体のうちアスタキサンチンの蓄積量が最も高いが、二酸化炭素を唯一の炭素源として使用する独立栄養条件ではアスタキサンチン生産性が低い短所がある。

特に、韓国のような夏場の太陽は、強い光と共に高い温度（３０〜４０℃）を伴うが、このような高温の独立栄養条件でヘマトコッカスプルビアリス細胞でアスタキサンチン合成時アスタキサンチン生合成能力が顕著に減少する現象が起きる。アスタキサンチン濃度及び生産性の持続的な減少で細胞が深刻な環境的ストレスに耐えられず結局細胞の死滅がもたらされて、高温（３０〜４０℃）で生育が活発なバクテリアによる汚染は、このような問題をさらに深刻にする。

したがって、本発明は一観点で、（ａ）ヘマトコッカスプルビアリスの成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種して増殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）させるステップ；及び（ｂ）窒素が欠乏して鉄イオンが添加された独立栄養条件で１００〜３００μＥ／ｍ^２／ｓの光度を照射してヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生成を誘導するステップを含む、ヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の培養によるアスタキサンチンの生産量を増進させる方法に関する。

本発明において、前記培養温度は２５〜４０℃であることが好ましいか、これに限定されない。

通常の春の中温条件は、１７．５〜２７．７℃であり、夏の高温条件は、２３．４〜３３．５℃である。したがって、本発明のｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｅｍｐは、２３〜２８℃であり、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐは、２８〜３３℃であることが好ましいか、これに限定されない。

本発明において、前記独立栄養条件は、光合成のための無機炭素源として３〜４％の二酸化炭素を供給することが好ましいか、これに限定されない。

本発明において、前記ステップ（ａ）は、３５μＥ／ｍ^２／ｓ以下の光度を照射することが好ましいか、これに限定されない。

本発明のステップ（ａ）は、「グリーンステージ」を意味し、前記「グリーンステージ」は、窒素が含まれた独立栄養条件に３〜４％の二酸化炭素を供給しながら、３５μＥ／ｍ^２／ｓ以下の光度を照射する低ストレスの培養条件を意味する。

本発明のステップ（ｂ）は、「レッドステージ」を意味し、前記「レッドステージ」は、窒素が欠乏した独立栄養条件に３〜４％の二酸化炭素を供給しながら１００〜３５０μＥ／ｍ^２／ｓの光度を照射する高ストレスの培養条件を意味する。

本発明において、前記鉄イオンは、Ｆｅ_２ＳＯ_４、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３及びＦｅ_２（ＳＯ_４）_３からなる群から選択される１種以上であることが好ましいか、これに限定されない。また、前記鉄イオンの濃度は、４０〜８０μＭであることが好ましいか、これに限定されない。

本発明において、前記鉄イオンは、活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２含量に対して１００〜６００モール比で添加されることが好ましいか、これに限定されない。

本発明において、前記アスタキサンチンの含量は、ヘマトコッカスプルビアリス細胞内活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２が活性酸素Ｏ_２及びＯＨ・に転換によって増進されることを特徴とする。

通常、微細藻類は、高温の環境に露出時、光合成をつかさどる葉緑体内にチラコイド（ｔｈｙｌａｋｏｉｄｓ）の漏出（ｌｅａｋ）、酷い場合には分解（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が発生する。続いて、チラコイドの酸素吸収率（ｏｘｙｇｅｎ ｕｐｔａｋｅ ｒａｔｅ）が増幅されて、カルビン回路（ｃａｌｖｉｎ ｃｙｃｌｅ）を介して還元されることが出来なかった電子がＭｅｈｌｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｏ_２ ｕｐｔａｋｅ ＋ ｅｌｅｃｔｒｏｎ → Ｏ_２ ⁻）によって酸素と結合してＯ_２ ⁻がチラコイド中に多量に生成される。続いて、細胞は、過量生産されたＯ_２ ⁻から細胞成分を保護するために、ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を発現させるようになり、生成されたＯ_２ ⁻は、葉緑体内ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）によってＨ_２Ｏ_２で転換される。結果的に、高温の環境は、微細藻類細胞内多量のＨ_２Ｏ_２を発生させる。

Ｈ_２Ｏ_２はＯ_２ ⁻とは違って拡散を介した細胞膜透過が容易であるため、葉緑体器官から出てきたＨ_２Ｏ_２は、核酸、ミトコンドリア、液胞など他の細胞器官に細胞酸化関連シグナルを伝達するようになって、この時カロテン生成（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連した遺伝因子中Ｈ_２Ｏ_２に敏感な酵素を直接的に非活性化させて、結果的にヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン合成が阻害された可能性がある。

一方、植物体でカロテノイドは、色素体（ｐｌａｓｔｉｄ）内で排他的に合成されると報告されているが、ヘマトコッカスプルビアリスは、ストレス反応によって色素体の外の脂質小包（ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ｇｌｏｂｕｌｅｓ）にアスタキサンチンを含むカロテノイドを蓄積する。先述したようにＨ_２Ｏ_２は、Ｏ_２ ⁻とは違って拡散を介した細胞膜透過が容易であるため、鉄イオン媒介ペントン反応（Ｆｅ^２＋＋Ｈ_２Ｏ_２→Ｆｅ^３＋＋ＯＨ・）は、色素体の外でも十分に発生する。したがって、ヘマトコクス細胞は、鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を介して過量生成されたＯＨ・による深刻な脂質酸化から自己防御のために、アスタキサンチン合成を促進させた可能性が高い。

また、Ｏ_２、ＯＨ・は、Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２よりも反応性が高いと報告された。ＯＨ・は、０．３ｍｓｅｃ（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈｓ ｏｆ １．７−２０μｍ）の非常に短い寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を持つ反面、Ｈ_２Ｏ_２は。Ｅ＝１．７７Ｖ、ｐＫａ １１．６の強力な二つの電子酸化剤（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｏｘｉｄａｎｔ）であるが、生物学的分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に対する反応性が低いため、多くのＨ_２Ｏ_２による細胞損傷は、Ｆｅ^２＋のような遷移金属（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌ）や酵素（ｅｎｚｙｍｅ）の媒介としてＨ_２Ｏ_２のＯ_２及びＯＨ・転換を誘導して発生する。Ｏ_２ ⁻も適宜に高いｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（Ｅ＝０．９４Ｖ）を持っているにも関わらず依然として生物学的分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に対する反応性が低い。

したがって、高温の培養条件（３０〜４０℃）で細胞内多量生成されたＬＲＯＳ（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）から鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導して、相当部分転換されたＭＲＯＳ（Ｏ_２、ＯＨ・）は、ＰＵＦＡ（不飽和脂肪酸）をはじめとする各種細胞成分を酸化させて、結果的にＭＤＡ含量が増加した可能性が大きい。さらに室温（２３℃）の条件でＦｅＳＯ_４を追加的に添加しなかった細胞が、ＦｅＳＯ_４を追加的に添加した細胞に比べてＭＤＡ、カロテノイド含量がさらに高い点から推察して脂質酸化は、Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応時鉄イオン濃度とＬＲＯＳ（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）の調節を介して加速化されて、鉄イオンとＬＲＯＳ含量比調節（ｒａｔｉｏ ｃｏｎｔｒｏｌ）が独立栄養条件でヘマトコッカスプルビアリス細胞のアスタキサンチン生産のために大変重要な要素であることに間違いなく、これにより、細胞内Ｏ_２ ⁻のＨ_２Ｏ_２含量を綿密に制御することができる。

本発明の一実施例では、前記鉄イオンは、活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２含量に対して１００〜６００モール比で添加されることが好ましく、前記範囲からずれて活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２含量に対して１００モール比未満に添加される場合には、アスタキサンチン蓄積効率が落ちる問題点があって、活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２含量に対して６００モール比を超えて添加される場合には副反応が起きてアスタキサンチン合成が阻害される問題点があり得る。

本発明において、前記アスタキサンチンの含量は、ヘマトコッカスプルビアリス細胞内活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２が活性酸素Ｏ_２及びＯＨ・に転換によって増進されることを特徴とする。

本発明の他の実施例では、より効率的なアスタキサンチンの生産量増進のために、高温の培養条件でグリーンステージで成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種を介したヘマトコクス細胞の生産量を調べて、そこで２８〜３０℃の高温独立培養条件のグリーンステージで成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種及びレッドステージで鉄イオンの添加は、ヘマトコクス細胞の生産量と生産収率を顕著に増進させることができる。

本発明の用語「独立栄養条件」とは、植物が体外で無機物を養分として摂取してそれを有機物に合成できるようにする培地の状態を意味して、「独立栄養培養条件」とも表現し、一般に独立栄養条件で光合成のための無機炭素源としては、二酸化炭素を供給して、培地組成は、Ｃａ（ＮＯ_３）_２またはＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、ＫＮＯ_３またはＫＣｌ、Ｎａ_２Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ・５Ｈ_２Ｏ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、Ｔｒｉｓ−ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ、Ｔｈｉａｍｉｎｅ、Ｂｉｏｔｉｎ、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２、ＰＩＶ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｎａ_２ＥＤＴＡ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ及びＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏを含むことができるが、これに限定されない。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

材料
本発明に使用された菌株は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ＮＩＥＳ−１４４であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎから購入して使用した。

本実施例に使用された培地の種類は、全部でＮＩＥＳ−Ｃ培地及びＮＩＥＳ−Ｎ培地の二つで、これらの構成成分を下記の表１に示した。
下記の表１で、
−ＮＩＥＳ−Ｃ培地：ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（独立栄養培地、目的：生長）
−ＮＩＥＳ−Ｎ培地：ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（独立栄養培地、目的：生育抑制、光誘起、アスタキサンチン生産）
−ＣＯ_２ ｓｕｐｐｌｙ：３％（ｖ／ｖ）
−光条件：２０μＥ／ｍ^２／ｓ（ｆｏｒ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）；１５０μＥ／ｍ２／ｓ（ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）
−ＦｅＳＯ_４：４５０μＭ
−ＭＶ（ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ）：１０^−１１Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−７Ｍ（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏ２−ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）
−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（ｃａｒｂｏｘｙ−２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）５μＭ
−ＤＣＦ：Ｈ２ＤＣＦＤＡが活性酸素（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）により酸化されて生成される物質
−ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕａｓｅ）：ＳＯＤは、細胞内でＯ_２ ⁻をＨ_２Ｏ_２に転換する酵素
−ＭＤＡ（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）：ＭＤＡは、細胞内ＰＵＦＡ（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）が酸素（Ｏ_２）及び活性酸素（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２及びＯＨ・）により酸化されて転換される２次代謝物質であり、細胞内ＭＤＡ量を通して細胞の酸化程度を間接的に確認できる一種の酸化指標である。

実施例１：独立栄養条件で多様な高温の培養条件及び鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応がヘマトコッカスプルビアリスのバイオマス及びアスタキサンチン蓄積に及ぼす影響
独立栄養条件で多様な高温の培養条件及び鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応がヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン蓄積に及ぼす影響を調べてるために、下記の実験を行った。

有機炭素源が欠乏したＮＩＥＳ−Ｃ培地で低光度の光（２０μＥ／ｍ^２／ｓ）と、ただ二酸化炭素のみを唯一炭素源として生育して対数期に達した細胞培養液（ＯＤ_６８０＝約０．８）内細胞をＮＩＥＳ−Ｎ培地に移して増殖を抑制して、強い光（１５０μＥ／ｍ^２／ｓ）と共に通常の室温の培養温度（２３℃）と高温の培養温度（３０℃、３６℃）、そしてこれと共に各々の温度条件に鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導する物質ＦｅＳＯ_４（４５０μＭ）を添加した場合としなかった場合を分けて培養１８日間バイオマス増加量及びアスタキサンチン蓄積程度を分析した。

１−１：バイオマス
図２（Ａ）に示したように、独立栄養条件で温度の増加によるヘマトコッカスプルビアリスのバイオマス生産能力は、２３℃に比べて３０℃で３０％、３６℃で５７％減少することが確認された反面、培養温度が３０℃で、Ｆｅ^２＋を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した場合、ヘマトコッカスプルビアリスのバイオマス生産能力はＦｅ^２＋を添加せず、培養温度が２３℃である場合に比べて９％増加したことが確認され、Ｆｅ^２＋を添加せず、培養温度が３０℃である場合に比べて４１％増加したことが確認された。

また、培養温度が３６℃である場合、Ｆｅ^２＋を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した時、ヘマトコッカスプルビアリスのバイオマス生産能力はＦｅ^２＋を添加せず、培養温度が２３℃である場合に比べて３％増加したことが確認され、Ｆｅ^２＋を添加せず、培養温度が３０℃である場合に比べて７７％増加したことが確認された。

１−２：アスタキサンチン蓄積
図２（Ｂ）に示したように、独立栄養の条件で温度の増加によるヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能力は、培養温度が２３℃である場合に比べて３０℃で２３％、３６℃で４２％減少することが確認された反面、培養温度が３０℃で、Ｆｅ^２＋を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した場合、ヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能力は、Ｆｅ^２＋を添加せず、培養温度が２３℃である場合に比べて１７％増加したことが確認され、Ｆｅ^２＋を添加せず、培養温度が３０℃である場合に比べて６６％増加したことが確認された。

また、培養温度が３６℃である場合、Ｆｅ^２＋を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した時、ヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能力は、Ｆｅ^２＋を添加せず、培養温度が２３℃である場合に比べて７％減少したが、Ｆｅ^２＋を添加せず、培養温度が３０℃である場合に比べて１５２％増加したことが確認された。

さらに、２日間アスタキサンチン合成を行ってヘマトコクス細胞のアスタキサンチン蓄積程度を示す光学顕微鏡写真で確認した結果、図３に示したように、高温の条件が、独立栄養条件でヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産に適しないことを意味すると同時に高温でＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応の導入がヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能力の維持に効果的であることを確認した。

実施例２：独立栄養条件で多様な高温の培養条件及び鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応がヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン合成初期細胞内活性酸素含量、ＳＯＤ活性度、脂質酸化度及びカロテノイド含量に及ぼす影響
高温の独立栄養条件でアスタキサンチン合成時、ヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生合成阻害現象を解明するために、下記の実験を行った。

まず有機炭素源が欠乏したＮＩＥＳ−Ｃ培地で低光度の光（２０μＥ／ｍ^２／ｓ）とただ二酸化炭素のみを唯一炭素源として生育して対数期に達した細胞培養液（ＯＤ_６８０＝約０．８）をＮＩＥＳ−Ｎ培地に移して増殖を抑制して、強い光（１５０μＥ／ｍ^２／ｓ）と共に通常の室温の培養温度（２３℃）と高温の培養条件（３０℃、３６℃）、そしてこれと共に各々の温度条件に鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導する物質ＦｅＳＯ_４（４５０μＭ）を添加した場合としなかった場合を分けてアスタキサンチン合成条件を作った後、培養二日間細胞内活性酸素含量（ＤＣＦ含量）、ＳＯＤ活性度、脂質酸化度（ＭＤＡ含量）及びカロテノイド蓄積程度を分析した。

その結果、図４（Ａ）に示したように、ＤＣＦ含量（活性酸素含量−Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）は、高温の条件（３０℃、３６℃）で急激に上昇したが、高温の培養条件にＦｅＳＯ_４（４５０μＭ）を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した場合、活性酸素含量は急激に減少した。

また、図４（Ｂ）に示したように、アスタキサンチン合成過程中ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性は全体的に増加する様子を見せたが、高温の培養条件（３０℃、３６℃）でＳＯＤ活性は急激に上昇した反面、高温の培養条件にＦｅＳＯ_４（４５０μＭ）を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した場合ＳＯＤ活性は顕著に減少した。これは、細胞内過量発生したＯ_２ ⁻が鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を通してＯ_２に効果的に転換されたためと見られる。

さらに、図４（Ｃ）に示したように、ＭＤＡ（ｍａｌｏｄｉａｌｄｈｙｄｅ）含量は、高温の条件（３０℃、３６℃）でＤＣＦ含量（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）と正比例して上昇したが、高温の培養条件（３０℃、３６℃）にＦｅＳＯ_４（４５０μＭ）を添加してＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導した場合ＭＤＡ含量はさらに増加することが確認された。これは高温で生産された活性酸素Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２が、鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応によって迅速にＯ_２、ＯＨ・に転換されて細胞内ＰＵＦＡ（不飽和脂肪酸）と速く反応してＭＤＡ形成を加速化したためと見られる。

実施例３：室温（２３℃）の独立栄養条件でＯ_２ ⁻の人為的な発生と鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応がヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン合成初期細胞内アスタキサンチン蓄積に及ぼす影響
室温（２３℃）の独立栄養条件でアスタキサンチン合成時ヘマトコッカスプルビアリス細胞内ＬＲＯＳ（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）の増加によるアスタキサンチン生合成阻害現象を解明するために、有機炭素源が欠乏したＮＩＥＳ−Ｃ培地で低光度の光（２０μＥ／ｍ^２／ｓ）とただ二酸化炭素のみを唯一炭素源として生育して対数期に達した細胞培養液（ＯＤ_６８０＝約０．８）をＮＩＥＳ−Ｎ培地に移して増殖を抑制して、強い光（１５０μＥ／ｍ^２／ｓ）と共に様々な濃度（１０^−１１〜１０^−７Ｍ）のＭｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎを添加してＯ_２ ⁻を人為的に強度毎で発生させて、これと共に通常の室温の培養温度（２３℃）で鉄イオン媒介Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を誘導する物質ＦｅＳＯ_４（４５０μＭ）を添加した場合としなかった場合を分けてアスタキサンチン合成条件を作った後、培養４日目細胞内アスタキサンチン蓄積程度を分析した。

その結果、図５に示したように、ヘマトコッカスプルビアリスは大変少ない量のＭｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎにも敏感に反応して過量のＯ_２ ⁻が発生する条件でアスタキサンチン蓄積能力が減少することが確認されたが、その反面鉄イオンの添加によるＬＲＯＳ（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）のＭＲＯＳ（Ｏ_２、ＯＨ・）に迅速な転換は、ヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン蓄積能力を増進させた。これは、室温（２３℃）の独立栄養条件でヘマトコッカスプルビアリスセポの効果的なアスタキサンチン生産のためには、アスタキサンチン合成時、細胞内Ｏ_２ ⁻のＨ_２Ｏ_２含量の綿密な制御が必要であることを意味する。

実施例４：高温の独立栄養条件で成熟胞子（ｃｙｓｔ）の接種及び鉄イオン添加によるアスタキサンチン生産増加
４−１：グリーンステージで成熟胞子（ｃｙｓｔ）の接種
本実施例では、二段（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ）光培養工程で、ヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生産量が増進されることを確認した。

春（中温条件：１７．５〜２７．３℃）及び夏（高温条件：２３．４〜３３．５℃）の平均光度と温度の変化を調べて、春と夏の光度は同じに維持して、温度は特に調節しないまま、屋外でヘマトコクスを活用したより経済的な生物学的二酸化炭素除去のための工程の条件を調べた。

グリーンステージ（窒素が含まれた独立栄養条件に３〜４％二酸化炭素を供給しながら３５μＥ／ｍ^２／ｓ以下の光度を照射する低ストレスの培養条件）の間２３℃で培養されたｇｒｅｅｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ細胞を屋外夏場高温条件であるレッドステージ（窒素が欠乏した独立栄養条件に３〜４％二酸化炭素を供給しながら１００〜３５０μＥ／ｍ^２／ｓの光度を照射する高ストレスの培養条件）で鉄イオンを添加して３６日間アスタキサンチンの生産量を調べた。

その結果、５０μＭの鉄イオン濃度で効果的にヘマトコクス細胞のアスタキサンチン生合成が効果的に進行されることを確認し（図６）、その反面鉄イオンが添加されなかった光反応期内ヘマトコクス細胞はアスタキサンチン生合成が阻害された。

さらに効果的なアスタキサンチンの生産量増進のために、高温の培養条件でグリーンステージで成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種を通してヘマトコクス細胞のｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ可能性の有無を２１日間インドアラボスケールで確認した。その結果、たとえ高温の培養条件で成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種時２３℃培養温度条件よりｌａｇ ｐｈａｓｅは二日程度長くなったが、グリーンステージが成功的に進行された（図７）。

４−２：グリーンステージで成熟胞子（ｃｙｓｔ）細胞の接種及びレッドステージで鉄イオン添加
実施例４−１の結果により、夏場高温の独立栄養条件のグリーンステージで成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種及びレッドステージで鉄イオン添加を通して、ヘマトコクス細胞のアスタキサンチン生産量を調べた。グリーンステージ培養は、１５日間行って、鉄イオン添加後レッドステージ培養は６３日間行った。

その結果、成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種及び５０μＭの鉄イオン添加によってヘマトコクス細胞のアスタキサンチン生産量（ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）は、春季中温の条件で屋外培養は、２．２４ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで、高温培養条件では、３．２９ｍｇ／Ｌ／ｄａｙと１４７％増加したことが分かった（図８）。

図９は、屋外の中温及び高温（２３〜２８℃及び２８〜３３℃）条件で、二段（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ：グリーン及びレッドステージ）光培養を通したヘマトコッカスプルビアリスのアスタキサンチン生産能増大を誘導した過程及び結果を示したもので、中温のグリーンステージ及び鉄イオンが添加されなかったレッドステージ培養条件（５７日間２．２４ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）に比べて高温の独立栄養グリーンステージで成熟胞子（ｒｅｄ ｃｙｓｔ）接種及びレッドステージの鉄イオン添加培養条件は、アスタキサンチン生産量及び生産収率の顕著な増加（２７日間５．５３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）を示した。

本発明によると、屋外培養時独立栄養条件で太陽を利用したアスタキサンチン生産で成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種した後、鉄イオンを添加する二段（ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ）光培養工程は、高温の条件で多量発生するＬＲＯＳ（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）を効果的にＭＲＯＳ（Ｏ_２、ＯＨ・）に転換して細胞内脂質酸化信号を増幅して、ＬＲＯＳ（Ｏ_２ ⁻、Ｈ_２Ｏ_２）の過量発生によるアスタキサンチン合成を阻害する問題点を解決することができるので、より経済的にアスタキサンチン生産を増進させることができ、このようなアスタキサンチンは、強力な抗酸化物質として様々な産業分野で有用である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (6)

1. 下記のステップを含む、ヘマトコッカスプルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の培養によるアスタキサンチンの生産量を増進させる方法：
   （ａ）ヘマトコッカスプルビアリスの成熟胞子（ｃｙｓｔ）を接種して、３５μＥ／ｍ ^２ ／ｓ以下の光度を照射して増殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）させるステップ；及び
   （ｂ）窒素が欠乏して鉄イオンが添加された独立栄養条件で、１００〜３００μＥ／ｍ^２／ｓの光度を照射して、２８〜３３℃で培養して、ヘマトコッカスプルビアリス内のＨ _２ Ｏ _２ 生成を誘導し、生成されたＨ _２ Ｏ _２ により、ヘマトコッカスプルビアリス内アスタキサンチンの生成を誘導するステップ。
2. 前記独立栄養条件は、光合成のための無機炭素源として３〜４％の二酸化炭素を供給することを含む請求項１に記載のアスタキサンチンの生産量を増進させる方法。
3. 前記鉄イオンは、Ｆｅ_２ＳＯ_４、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３及びＦｅ_２（ＳＯ_４）_３からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のアスタキサンチンの生産量を増進させる方法。
4. 前記鉄イオンの濃度は、４０〜８０μＭであることを特徴とする請求項１に記載のアスタキサンチンの生産量を増進させる方法。
5. 前記鉄イオンは、活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２含量に対して１００〜６００モル比で添加されることを特徴とする請求項１に記載のアスタキサンチンの生産量を増進させる方法。
6. 前記アスタキサンチンの含量は、ヘマトコッカスプルビアリス細胞内活性酸素Ｏ_２ ⁻及びＨ_２Ｏ_２が活性酸素Ｏ_２及びＯＨ・に転換することによって増進されることを特徴とする請求項１に記載のアスタキサンチンの生産量を増進させる方法。

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