KR102249214B1

KR102249214B1 - 헤마토코쿠스의 적색세포로 부터 편모를 생성시키는 단계를 포함하는 배양생산방법

Info

Publication number: KR102249214B1
Application number: KR1020190074226A
Authority: KR
Inventors: 김대근; 최윤이; 홍창희
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 고려대학교산학협력단
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2021-05-07
Also published as: KR20200145348A

Abstract

본 발명은 아스타잔틴의 생산 등을 위해 배양되는 헤마토코쿠스의 새로운 접종 방법 및 이를 통한 바이오매스 생산에 관한 것이다. 헤마토코쿠스는 배양의 초기 단계에 세포의 성장이 느린 단점이 존재하므로 이를 극복하기 위해 새로운 형태의 접종 시드 (휴면단계의 적색 세포 및 이를 유도한 편모달린 적색 세포)를 적용하여, 적색광 조사를 통한 탈 휴면 단계 유도, 그리고 바이오매스 및 아스타잔틴의 효율적인 성장을 달성하였다.

Description

헤마토코쿠스의 적색세포로 부터 편모를 생성시키는 단계를 포함하는 배양생산방법{Culturing and producing method comprising a step to generate flagella on haematococcus red cells}

본 발명은 아스타잔틴의 생산 등을 위해 사용되는 헤마토코쿠스의 배양단계에 착안한 배양방법 및 바이오매스 생산에 관한 것이다.

기존에는 아스타잔틴의 생산량을 늘리기 위하여 헤마토코쿠스를 초기에 녹색 세포의 상태로 접종하여 특정 파장의 광을 조사하는 형태의 배양기술이 사용되었다.

하지만 헤마토코쿠스는 배양의 초기 단계에 세포의 성장이 느린 단점이 존재하므로 이를 극복하기 위해 새로운 형태의 접종 시드를 적용하여 바이오매스 및 아스타잔틴의 효율적인 성장을 달성하고자 한다.

본 발명은 기존과 달리 휴면기의 적색 세포를 접종세포로 설정하고, 이 적색세포로부터 세포 분열 및 편모를 보유한 적색 세포 상태로 만들어 바이오매스 및 아스타잔틴을 생산하는 일련의 과정을 포함한다. 적색 헤마토코쿠스의 편모를 생성시키는 방법은 헤마토코쿠스의 편모없는 적색 세포에 적색광을 24 내지 48시간 조사하는 단계를 포함한다.

본 발명의 편모를 생성시키는 방법에 있어서, 상기 편모 없는 적색 세포에 대하여 150umol/m²s 이하의 광량을 조사하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 편모를 생성시키는 방법에 있어서, 사용되는 OHM 배지의 10% 이상의 영양염이 공급되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 헤마토코쿠스의 배양방법은 헤마토코쿠스의 편모 없는 적색 세포를 활용하여 적색 편모 세포로 유도하여 접종하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 헤마토코쿠스의 배양방법은 적색 편모 세포를 배양하여 바이오매스 및 세포수를 증가시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 헤마토코쿠스를 250umol/m²s 이상의 광량에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 헤마토코쿠스 바이오매스는, 적색 편모 없는 세포 단계에서 적색광을 24 내지 48시간 조사하여 편모를 생성한 적색 세포를 만드는 단계와 상기의 적색 편모 세포를 배양에 적용하여 바이오매스 및 세포수를 높이는 단계를 포함하는 배양방법으로 얻어진다.

휴면단계의 헤마토코쿠스를 접종에 활용함으로서, 다른 접종 세포의 준비가 필요 없이 아스타잔틴 생산 공정이 마무리 된 세포를 바로 접종시킬 수 있다는 높은 활용성이 있다. 또한, 휴면단계의 적색세포를 접종하여, 적색 광 조사를 통하여 유도된 움직이는 적색 세포를 헤마토코쿠스 배양에 사용하는 것은 바이오매스 성장성 및 아스타잔틴 생산성의 증가에 효과적이다.

도 1은 4단계 세포의 형태 (a:1단계, b:2단계, c:3단계, d:4단계)
도 2는 1단계 및 2단계 비교 바이오매스
도 3은 1단계 및 2단계 비교 세포 수
도 4는 우측에 광원을 배치한 결과
도 5는 2단계 및 3단계 비교 바이오매스
도 6은 2단계 및 3단계 비교 세포 수
도 7은 적색 세포의 시간에 따른 분화(a: 적색파장; b: 청색 및 백색 파장)
도 8은 광 파장에 따른 세포 수의 변화
도 9는 광량에 따른 세포의 변화
도 10은 영양염 공급에 따른 세포의 변화
도 11은 접종 세포 형태에 따른 바이오매스
도 12는 접종 세포 형태에 따른 세포 수

본 발명의 권리범위는 특허청구범위에 의하여 정해진다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기위해 기재된다. 따라서, 본 발명의 권리범위가 기재된 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 기재된 실시예에 근거하여 본 발명의 속하는 기술분야의 전문가에 의해 변형가능한 내용에 대하여도 본 발명의 권리가 미친다. 본 발명의 실시 예는 다음과 같다.

본 실험에 사용된 헤마토코쿠스 세포의 형태는 4단계(도 1)로 구분한다.

즉, 1 단계 세포는 편모 있는 녹색 세포(MG), 2단계 세포는 편모 없는 녹색 세포(IG), 3 단계 세포는 편모 없는 적색 세포(IR), 4단계 세포는 편모 있는 적색 세포(MR)이다.

1. 편모 유무에 따른 다양한 광 세기 조건에서 바이오매스 및 세포수 성장 비교

- 편모가 헤마토코쿠스 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해 1단계 및 2단계 세포를 각기 동일한 바이오매스로 접종하여 배양을 진행 하였다. 배양 결과 1단계 세포가 가장 높은 바이오매스 성장율을 보였으며(도 2), 특히 광량이 120umol/m²s 조건에서 240umol/m²s 조건보다 높은 바이오매스 생산성이 확인 되었는데, 이는 240umol/m²s 조건에서 4일차 세포수가 급격히 감소하는 것으로 보아 광 세기가 높아 광 저해 현상으로 인한 영향을 받은 것으로 판단 된다(도 3). 편모가 세포의 바이오매스 성장에 기여한 원인을 확인 하고자 주광성 테스트를 진행 하였다. 주광성은 편모가 있는 미세조류에서 보고되는 현상으로 세포의 필요에 의해 광이 있는 장소로 세포 스스로가 이동하는 현상을 의미한다. 플레이트 디쉬에 각기 1단계 및 2단계 세포를 배치하여 우측에서만 광을 조사하고 나머지 부분은 암막 처리 하여 30분을 방치 하였다. 그 결과 1단계 세포는 우측으로 녹색의 띠가 나타나 세포가 이동한 것을 확인 할 수 있었으며(도 4), 본 실험에서 1단계 세포가 가장 높은 바이오매스 성장을 나타낸 것이 세포가 광 조건에 따라 배양액 내부를 이동하며 광량에 대한 노출을 스스로 조절하였기 때문으로 판단된다.

2. 아스타잔틴 유무에 따른 다양한 광 세기 조건에서 바이오매스 및 세포수 성장 비교

- 헤마토코쿠스 세포 내 아스타잔틴 함량이 세포의 성장에 주는 영향을 확인하기 위해 2단계 및 3단계 세포를 서로 비교하였다. 그 결과 아스타잔틴을 함유하고 있는 3단계 세포가 가장 높은 바이오매스 생산성을 확인 하였다(도 5). 특히 배양 초기에는 3단계 세포보다 2단계 세포가 성장이 빠른 것으로 나타났는데, 접종 후 2일까지 세포수를 보면 3단계 세포는 세포 수 가 급격히 증가하는 것을 확인 할 수 있다(도 6). 세포수의 증가 이후에 세포의 감소 없이 바이오매스가 급격히 높아지는 것을 확인 하였다. 반면 240umol/m²s에서 2단계 세포는 초기 3일까지는 바이오매스의 증가가 가장 높게 나타났으나, 이후 세포수의 급격한 감소와 함께 바이오매스 성장이 낮아지는 것을 확인 하였다. 따라서 본 결과를 볼 때 높은 광에서 바이오매스의 증가를 유지하기 위해서는 세포의 사멸을 막는 것이 중요하며, 이때 아스타잔틴이 함유된 경우 높은 광 세기에서도 세포의 사멸을 억제하는 것으로 판단된다.

3. 아스타잔틴을 함유한 편모 있는 세포 유도에 대한 광 파장에 대한 연구

- 상기 결과를 볼 때 편모가 있는 세포를 활용하는 것이 세포가 효과적으로 광을 이용할 수 있으며, 아스타잔틴을 함유하고 있을 때 고 광량에서 세포의 사멸을 억제하며 바이오매스의 성장을 높일 수 있음을 확인 하였다. 따라서 이러한 결과를 바탕으로 적색 세포를 이용했을 때 일부 나타났던 편모가 있는 적색 세포를 유도하는 연구를 수행해 보았다.

- 빛은 다양한 파장으로 나누어지며, 파장에 따라서 세포에 대한 자극이 다르기 때문에 각각 660nm를 피크로 가지는 적색광, 450nm를 피크로 가지는 청색광, 그리고 일반적인 3파장 범위를 가지는 백색 광원을 사용하여 적색 편모 세포의 유도를 비교해 보았다. 그 결과 적색 파장 광원을 사용하였을 때 약 36시간 정도 시간이 지난후 대부분의 세포가 분화하여 적색 편모 상태가 된 것을 확인 할 수 있었다(도 7). 반면 백색과 청색의 파장에서는 현미경 및 세포수의 증가를 비교해 볼 때 적색 파장보다 낮은 분화율을 보이는 것으로 확인 되었다(도 8). 따라서 효과적으로 편모와 아스타잔틴을 함유한 세포를 만드는 방식은 적색 광을 이용했을 때가 가장 좋은 효과를 나타내는 것으로 판단된다.

4. 세포의 상태와 광 세기에 따른 움직이는 적색의 세포 생산 비교

- 미세조류의 분화 및 반응은 빛의 세기와 관련이 있을 수 있기 때문에 다양한 광량에서 4단계의 세포를 사용하여 초기 3일의 세포 형태의 변화를 비교하여 보았다(도 9, 도 10). 그 결과 3단계 적색 세포를 사용하여 150umol/m²s 이하의 광량을 조사하여 배양하였을 때 적색으로 움직이는 4단계 세포가 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 250umol/m²s 이상의 높은 광량에서는 여전히 세포가 광 자극을 받아 적색 구형의 세포 형태를 유지하는 것으로 나타나 150umol/m²s 이하의 낮은 광량의 조건에서 움직이는 세포가 생성되는 것으로 판단된다. 다만 4단계의 세포의 상태를 유지하기 위해서는 150umol/m²s 이하의 광량에서는 오히려 아스타잔틴 함량이 낮아져 버리는 현상이 나타났는데 250umol/m²s 이상의 광량에서는 적색을 유지하면서 성장하는 것을 확인 하였다. 따라서 일단 4단계의 세포를 확보한 다음에는 높은 광량에서 이를 유도할 수 있는 방법도 가능할 것으로 판단된다. 다만 이러한 움직이는 세포의 발생은 배지의 영양성분이 존재하는 조건에서만 나타나는 것으로 확인 되었다. 사용되는 OHM (Optimal Haematococcus Medium) 배지는 1L 당 KNO₃ 0.41g, Na₂HPO₄ 0.03g, MgSO₄·7H₂O 0.246g, CaCl₂·2H₂O 0.11g 과 Fe(III)citrate·H₂O 2.62mg, CoCl₂·6H₂O 0.011mg, CuSO₄·5H₂O 0.012mg, Cr₂O₃ 0.075mg, MnCl₂·4H₂O 0.98mg, Na₂MoO₄·2H₂O 0.12mg, SeO₂ 0.005mg 및 biotin 25ug, thiamine 17.5ug, B12 15ug 함유되어 있으며 이만큼 함유된 배지의 상태를 100%라고 할 때, 전체 영양성분의 10% 수준 이상 공급해 줄 경우 4단계 세포가 확인 되었다. 따라서 10% 이상의 영양염 공급이 필요한 것으로 판단 된다.

5. 적색 편모 세포(4단계)를 활용한 아스타잔틴의 생산 비교

- 위 연구를 통해 얻어진 4단계의 편모 있는 적색 세포를 활용하여 광 세기에 따른 바이오매스 및 세포 수의 변화를 확인 해 보았다(도 11, 도 12). 그 결과 4단계 적색 편모를 가진 세포를 활용하여 접종하였을 때 가장 높은 바이오매스의 성장을 보이는 것을 확인 하였다. 특히 세포 수 역시 초기에 빠르게 증가하여, 바이오매스가 증가함에도 세포수의 감소가 2단계 녹색 세포의 경우처럼 높게 나타나지 않음을 확인 하였다. 아스타잔틴 생산성도 4단계 편모 적색 세포의 경우 초기 1.6% 수준의 아스타잔틴 함량으로 시작해서 5일 후 배양이 종료되는 시점까지 유사한 수준의 아스타잔틴 함량을 유지하고 있었으며, 이 결과는 3단계 적색 세포의 아스타잔틴 함량과 비교해도 차이가 없는 수준이다. 오히려 바이오매스 생산성이 4단계 세포가 더 높아 최종 아스타잔틴 생산성은 4단계 세포가 21.4mg/L 수준으로 가장 높은 아스타잔틴 생산성을 보이는 것을 확인 하였다(표 1).

배양 조건에 따른 아스타잔틴 함량의 변화 (%)

	광량	0	1	2	3	4	5	mg/L 환산
mg80	80	0.00	0.00	0.00	0.00	0.30	0.54	4.4
mg120	120	0.00	0.00	0.00	0.14	0.40	0.60	5.5
mg240	240	0.00	0.00	0.19	0.56	1.18	1.28	10.7
mr80	80	1.64	0.97	0.25	0.00	0.00	0.22	1.6
mr120	120	1.63	1.22	0.37	0.22	0.32	0.43	3.9
mr240	240	1.61	1.43	1.28	1.42	1.65	1.97	21.4
ig80	80	0.00	0.00	0.00	0.00	0.05	0.35	1.9
ig120	120	0.00	0.00	0.00	0.00	0.10	0.35	2.1
ig240	240	0.00	0.00	0.07	0.25	0.58	0.98	6.5
ir80	80	2.25	1.48	1.13	0.33	0.00	0.17	1.1
ir120	120	2.27	1.50	1.38	0.38	0.27	0.42	3.2
ir240	240	2.27	1.93	1.83	1.73	1.77	1.93	17.3

1: 1단계 세포
2: 2단계 세포

Claims

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헤마토코쿠스에 적색파장의 광을 조사하는 배양생산방법에 있어서,
편모 없는 적색의 헤마토코쿠스 세포에 24시간 내지 48시간 동안 적색파장의 광을 조사하여 편모를 생성시키는 편모유도단계;
상기 단계에 연속하여 상기 편모를 갖는 적색의 헤마토코쿠스 세포에 250umol/m²s 이상의 광량을 아스타잔틴의 함량이 유지되는 5일 이내의 기간 동안 조사하는 바이오매스증가단계;와
상기 적색의 편모가 있는 세포 상태로 배양을 종료하는 종료단계;를 포함하며, 상기 편모유도단계와 바이오매스증가단계와 종료단계가 연속으로 진행되는 배양생산방법.