JP6261136B2 - 細胞内環境において向上した安定性を示す免疫グロブリンフレームワークおよびそれを同定する方法 - Google Patents
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Description
NH2-VL-リンカー-VH-COOHまたは
NH2-VH-リンカー-VL-COOH
を有する単一鎖フレームワーク試薬を提供する。
NH2-VL-リンカー-VH-第二のタンパク質-COOHまたは
NH2-第二のタンパク質-VL-リンカー-VH-COOH
の融合構築物を産生してもよい。
NH2-VH-CH-第二のタンパク質-COOHおよびNH2-VL-CL-COOH
の融合構築物を産生してもよい。
NH2-VL-リンカー-VH-COOH;または
NH2-VH-リンカー-VL-COOH
(ここでVHフレームワークは、サブタイプ1a、1bまたは3である)を有する単一鎖フレームワークを含むイントラボディのフレームワークが提供される。
NH2-VL-リンカー-VH-COOH;または
NH2-VH-リンカー-VL-COOH
(ここでVHフレームワークは、サブタイプ1a、1bまたは3であり、VLフレームワークは、サブタイプλ1、λ3またはκ1である)を有する単一鎖フレームワークを含むイントラボディのフレームワークが提供される。
NH2-VL-リンカー-VH-第二のタンパク質-COOH;または
NH2-第二のタンパク質-VL-リンカー-VH-COOH
(ここでVHフレームワークは、サブタイプ1a、1bまたは3であり、VLフレームワークは、サブタイプλ1、λ3またはκ1である)の融合構築物を産生する、単一鎖フレームワークを提供する。
NH2-VH-CH-第二のタンパク質-COOHおよびNH2-VL-CL-COOH
の融合構築物を産生してもよい。
(参考文献)
酵母において「クオリティーコントロール」システムを用いてヒトライブラリーをスクリーニングすることによるイントラボディフレームワークの選択
安定なフレームワークのため「クオリティーコントロール」システムを用いたスクリーニングを、Aufder Maur (WO0148017、Auf derMaur 2001、それぞれ参照により本明細書に組み込む) に詳細に記載されるとおり基本的に実施した。
インビボ性能の評価
a)酵母において
酵母において選択フレームワークの性能を定量分析するため(図1および3)、S.cerevisiae株ImmunaLHBを、標準的な酢酸リチウム形質転換プロトコールに従うことにより、pESBA-Act2ベクター上のLexA-Gal4-AD-融合構築物としての単離scFvsを用いて形質転換した(Agatep,1998)。形質転換の後、細胞をドロップアウトプレート(-Trp)に播いた(plate)。ドロップアウト培地(-Trp)中の2mL一晩培養物を、幾つかのコロニーを含有する培養物(streaks)から2回接種し、30℃で生育させた。培養物を、600nm(OD600)における光学濃度が0.7になるように、1mLドロップアウト培地(-Trp)で希釈した。その後、30℃で2時間生育させた。アッセイのために、100μLの細胞培養物を採取し、900μLバッファー、45μLクロロホルムおよび30μL 0.1%SDSと混合し、ボルテクスにかけ、室温で5分間インキュベートした。0.2mL ONPG(4mg/mL)の添加により発色を開始し、0.5mL Na2CO3(1M)で停止させた。アッセイ培養物のOD600、並びに使用した発色のインキュベーション時間および培養体積を考慮することにより活性を計算した。
ヒト細胞において、選択したフレームワークの性能を定量的に分析するためにHela細胞株を使用した(図2、4および7)。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、天然Gal4 UASの制御下にルシフェラーゼを含有する、同時トランスフェクトされるpGL3(Promega)レポータープラスミドから提供された。一過性トランスフェクションのために使用される哺乳類発現ベクターは、CMVプロモーターの制御下に、VP16-ADに対してC末端で融合したGal4(1-147)を含有する。単離されたscFvsを、Gal4(1-147)-VP16-融合物に対してC末端にフレームでクローニングし、発現によりGal4(1-147)-VP16-scFv-融合タンパク質を産生した。細胞を、2.5% FCSおよび2mM l-グルタミンを添加したDMEM中で培養した。一過性トランスフェクションは、Polyfect-protocol(Qiagen)に従って、60 mm組織培養プレートで、scFv構築物を含有する0.01-0.1μgのベクター、0.5μgのCMVプロモーター誘導Gal4(1-147)-VP16-scFv発現プラスミド、およびトランスフェクション効率のためのレファレンスとして0.5μgのLacZ発現ベクターを用いて行った。細胞を、トランスフェクションから24〜48時間後に集め、1000μLバッファー中に再懸濁し、3回の凍結−融解サイクルにより溶解させた。細胞溶解物を、遠心分離し、ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega)を用いてルシフェラーゼ活性について、および標準的プロトコールに従ってLacZ活性について、上清をアッセイした。得られたルシフェラーゼ活性は、LacZ活性を用いて修正し、トランスフェクション効率におけるばらつきを説明した。
マルチプルアラインメントおよび配列比較の分析
細胞内適用に適したフレームワーク配列の一般的パターンを解明するため、すべてのポジティブクローン(すなわち、クオリティーコントロールシステムにおいて選択条件下で生育したクローン)を単離し、scFvsをコードする部分を配列決定した。その後、scFv配列を、軽鎖および重鎖の構成要素に分け、Honegger(2001)による免疫グロブリンドメインの構造調整ナンバリングスキームに従って、各ドメイン(表1および2)のアラインメントを可能にした。
シャッフルしたドメインのインビボ性能の評価
a)酵母および哺乳類細胞における細胞内アッセイでの性能
22の組み合わせを、例2に記載されるとおり、酵母および哺乳類細胞においてインビボ性能について試験した(図3および4)。
還元条件下での発現による可溶性タンパク質の産生量を比較するため、選択されたフレームワークを、酵母S.cerevisiaeの細胞質において、Gal4 ADとの融合体として発現させた。pESBA-Act2ベクター上の融合構築物は、一般構造Gal4 AD-scFvを有していた。その融合構築物を、上述のとおり酵母S.cerevisiae株JPY9に形質転換し、-Trp,ドロップアウトプレートに播いた。
E.coliにおけるペリプラズム発現行動を評価するため(図6)、単離されたscFvs−フレームワークを、cam抵抗性遺伝子(catR)およびlacIリプレッサー遺伝子(Krebber,1997)を担持する細菌ベクターに、N-末端のpelBリーダー配列およびC-末端のhis-tagを備えて、lacプロモーター/オペレーターの制御下にクローニングした。コンピーテントE.coli JM83を、これらプラスミドを用いて形質転換した。振盪フラスコ中で、35mg/Lクロラムフェニコールを含有する50mL dYT培地に、一晩培養物を1:40で接種し、30℃でインキュベートした。細胞を、1mM IPTGを用いてOD600 0.8に誘導し、遠心分離による導入の3時間後に収集した。沈殿を、50mMTris, pH 7.5、500mM NaClに再懸濁し、OD600を10に規格化した。各scFvフラグメントのサンプルを、直接(全抽出物)もしくは遠心分離に続く音波処理の後(可溶性フラクション)に、SDS-PAGEにより分析した。可溶性タンパク質の量は、クマシー染色されたゲルから評価した。
細胞外使用に関して優れた特性を有する5つの組み合わせの詳細な評価
酵母および哺乳類の細胞内アッセイの両方において優れた性能を示し、酵母およびE.coliにおいて発現の間に可溶性タンパク質を産生し、クオリティー・コントロールの間に優先的に選択されたサブグループに当てはまる、5つの組み合わせを例として選択した(2.4,4.4,5.2,6.4および7.3、詳細については表5参照)。我々は、これら組み合わせをより詳細に分析し、還元条件および酸化条件下におけるそれらの使用を更に評価した。
ヒト細胞における5つの組み合わせの性能の定量分析は、例2で実施したとおり、Hela細胞、ヒト骨肉腫細胞株Saos-2およびヒト胚性腎細胞株HEK293を用いて行った(図7)。
発現および精製
インビトロ性能を評価するため、5つの優れた組み合わせを、E.coliのペリプラズムで発現させた(図6)。振盪フラスコ中の35 mg/Lクロラムフェニコールを含有する0.1L dYT-培地に、一晩培養物を1:40で接種し、30℃でインキュベートした。細胞を、1mMIPTGを用いてOD550 1.5に誘導し、遠心分離による導入の2時間後に収集した。scFvsを精製するため、細胞の沈殿物を再懸濁し、音波処理により溶解させた。20krpm、4℃で30分間、SS34で遠心分離した後、上清を、Ni-MC-アフィニティーカラム(Hi-TrapTMChelatingHP,1ml,Amersham Pharmacia) にpH 7.5で適用し、Amersham PharmaciaからのAktaBasic systemを用いて、200mMイミダゾールで溶出した。scFvフラグメントの純度は、SDS-PAGEにより測定すると98%より高かった(データ示さず)。精製されたタンパク質の濃度は、280nmにおける計算減衰係数を用いて決定した。可溶性精製タンパク質の収率は、OD600 10の1L培養体積に規格化し、8から55mgまで変動した。
凝集に対する抵抗性は、インビトロにおける熱力学的安定性(Worn, 1999)およびマウスの異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍局在の効率(Willuda,1999)と関係することが示された。安定性、凝集に対する抵抗性、およびアンフォールディング(unfolding)の可逆性を試験するために、50mMTris, pH 7.5, 100 mM NaCl中、6μMの濃度の精製タンパク質の200μLサンプルを、4℃で4日間または37℃で4日間または4℃で3日間維持し、その後、100℃で15分または60分インキュベーションし、室温までゆっくり冷まし、4℃で一晩インキュベートした。その後、各サンプルのオリゴマー状態を、50mMTris, pH 7.5, 100 mM NaClを用いて平衡化したゲルろ過カラムで分析し、モノマー物質に対して凝集した量を評価した(図8)。タンパク質を、AktaBasicシステム(AmershamPharmacia)で、流速1mL/分、100μLの体積で、Superdex-75カラム(AmershamPharmacia)上に注入した。
治療適用にとって重要なパラメーターである、プロテアーゼ分解に対する単離フレームワークの安定性を決定するため、我々はヒト血清中で37℃において精製フレームワークをインキュベートした(図9)。
酵母における相互作用スクリーニングシステムでの、フレームワーク7.3上のランダム化CDRライブラリーのスクリーニングを介した抗原バインダーの選抜
抗原バインダーの相互作用システムを用いたスクリーニングは、以前に詳細に記載されるとおりに本質的に実施した(Auf der Maur, 2002)。
新規scFvフレームワークから誘導したFab構築物のインビボ性能の評価
様々な抗体フォーマットにおいて安定な可変ドメインフレームワークを使用する有利な効果を評価するため、酵母相互作用スクリーニングで使用するためのFab発現ベクターを構築した。
2種類の発現ベクターを構築し、異なる発現レベルを可能にした。ベクターは、yEplac112(2ミクロン)またはyCplac22(ars/cen)バックボーンのいずれかに基づくものである(Gietz,1998)。いずれのベクターも、細菌システムで扱うために、酵母TRP1栄養性マーカー、誘導性二方向性Gal1/Gal10プロモーター、細菌の複製起点およびamp抵抗性遺伝子を含有する。一方向において、フレームワーク7.3のVHドメインを、C末端システインを含むIgG1のCH1-ドメインに対してN末端にクローニングし、その後に、リンカー、およびSV40 T-抗原を含むGal4活性化ドメイン(ADアミノ酸768-881)が続く。一方、フレームワーク7.3のVLドメインを、C末端システインを含むCL(ラムダ)ドメインに対してN末端にクローニングした。ターミネーターは、重鎖の側ではGal11ターミネーターであり、軽鎖の側ではサイクリン1ターミネーターである。
酵母においてscFvおよびFabフォーマットにおける抗原バインダーの性能を定量的に分析するため(図1および3)、S. cerevisiae株ImmunaLHBを、標準的な酢酸リチウム形質転換プロトコールに従うことにより、pESBA-Act2ベクター上のGal4-AD-融合構築物としての単離scFvsと、LexA-hPLK1-KD融合物を含有するbaitベクターとを用いて同時形質転換した(Agatep,1998)。形質転換の後、細胞をドロップアウトプレート(-Trp、-Ura、Glc)に播いた。ドロップアウト培地(-Trp、-Ura、Glc)中の2mL一晩培養物を、幾つかのコロニーを含有する培養物(streaks)から2回接種し、30℃で生育させた。培養物を、600nm(OD600)における光学濃度が0.7になるように、1mLドロップアウト培地(-Trp、-Ura、Gal)で希釈した。それを30℃で5時間生育させた。アッセイは上述のとおり行った。
還元条件下での発現による可溶性タンパク質の産生量を比較するため、scFvとFab構築物を、hPLK1-KD-baitベクターと一緒に、上述のとおり、酵母S.cerevisiaeの細胞質において発現させた。それを、上述のとおり酵母株YDE173に形質転換し、グルコースを含有する-Trp、-Ura、ドロップアウトプレートに播いた。
Claims (11)
- 抗体またはその抗原結合フラグメントのVH可変ドメインと、該抗体またはその抗原結合フラグメントのVL可変ドメインであって、
該VHフレームワーク配列は、配列番号11に示されるアミノ酸配列に見いだされるVHフレームワークアミノ酸配列を有し、該VHフレームワーク配列は、3つの重鎖抗体CDRによって連続的に連結されることを特徴とし、
該VLフレームワーク配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列に見いだされるVLフレームワークアミノ酸配列を有し、該VLフレームワーク配列は、3つの軽鎖抗体CDRによって連続的に連結されることを特徴とする、
VH可変ドメインとVL可変ドメイン。 - 請求項1に記載の可変ドメインであって、前記VHおよび/またはVLフレームワークが、還元環境における安定性および可溶性を維持しながら、請求項1に記載のそれぞれのフレームワークに対して90%またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を示す変異体である、可変ドメイン。
- 抗体またはその抗原結合フラグメントの細胞内適用に使用するための、請求項1または2に記載の可変ドメインを含む組成物であって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記フレームワークを含む、組成物。
- 還元環境において抗体またはその抗原結合フラグメントを安定化させるための、請求項1または2に記載の可変ドメインを含む組成物であって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記フレームワークを含む、組成物。
- 還元環境において抗体またはその抗原結合フラグメントを可溶化させるための、請求項1または2に記載の可変ドメインを含む組成物であって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記フレームワークを含む、組成物。
- 現存の抗体から超可変ループを移植するための、または還元環境における適用のためのライブラリーを作成するための、請求項1または2に記載の可変ドメインを含む組成物。
- ターゲットの検証あるいは抗体またはその抗原結合フラグメントのライブラリー構築に使用するための、請求項1または2に記載の可変ドメインを含む組成物。
- 請求項1または2に記載の可変ドメインをコードする核酸分子。
- 請求項8に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項8に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 遺伝子治療に使用するための、請求項8に記載の核酸分子を含む組成物。
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