JP6255156B2 - チロシンキナーゼ受容体由来の細胞外アロステリック阻害剤結合ドメイン - Google Patents
チロシンキナーゼ受容体由来の細胞外アロステリック阻害剤結合ドメイン Download PDFInfo
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Description
a)RTKのアロステリック結合部位をアロステリック阻害剤候補化合物と接触させる段階、
b)前記チロシンキナーゼ受容体の活性化/阻害に依存する少なくとも2つの下流経路の変化を測定する段階、
c)前記チロシンキナーゼ受容体の活性化/阻害に依存する少なくとも2つの異なる下流経路の各々に対する少なくとも1つのレポーターの状態の変化を比較する段階
を含み、
受容体のリガンド結合ドメインに結合しているリガンドの存在下、少なくとも1つの下流経路が阻害されるのに対し、少なくとももう1つの下流経路は影響を受けない場合に、アロステリック阻害剤が同定される、スクリーニングテストを実施して行うことができる。レポーターの状態の変化は使用されるレポーターに依存し、非限定例としてレポータータンパク質のリン酸化の変化、または遺伝子の非誘導から誘導への(または逆も同様)スイッチであってもよい。好ましくは、前記状態の変化はホスホイレーション(phosphoylation)状態の変化である。
SEC−LC/MS方法論は、オンライン結合された2次元システム、分離のため高性能液体クロマトグラフィーに結合されたサイズ排除クロマトグラフィーと、これに続く検出のためのエレクトロスプレーイオン化−飛行時間型質量分析から成る、親和性スクリーニングに使用される分析技法である。
例に対する材料および方法
STD−NMR結合アッセイ
ヒトFGFR1遺伝子(P11362)の細胞外ドメイン(ECD;アミノ酸:39−358)をPCR増幅し、およびNdeIおよびBamHI制限部位を用いて、大腸菌(E. coli)ベクターpETTEV(N末端His−タグの後にTEVプロテアーゼ切断部位が続く)にクローン化した。タンパク質産生には、得られたプラスミド(pET FGFR1 D1D2D3)を大腸菌BL21(DE3)(Novagene社)に形質転換した。細胞はOD600が0.6に達するまで37℃で増殖させ、組換えタンパク質産生は1mM IPTG(イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド)を添加して誘導した。4時間誘導後、細胞を回収し、使用まで−80℃で貯蔵した。細胞ペレット(1L培養)を解凍し、リゾチーム(2mg)、および40Uベンゾナーゼ(Merck社)を含有する50ml緩衝液1(20mM Tris/HCl、pH7.5、200mM NaCl)に再懸濁した。細胞を超音波処理により破壊し、封入体(IB)を遠心分離(15,000g、20分、4℃)により沈降させ、得られたペレットを緩衝液1で2回洗浄した。IBペレットは20ml変性緩衝液(6Mグアニジン−HCl、20mM Tris/HCl、pH8.0、200mM NaCl)に室温で40分間溶解した。可溶性デブリを遠心分離(30,000g、30分)により除去し、上清を、製造者の推奨に従って緩衝液Aで事前に平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen社)に添加した。FGFR1 ECDは、500mMイミダゾールを含む変性緩衝液を用いてカラムから溶出した。ECDを含有する画分をプールし、50mM Tris/HCl、pH8.0、250mM NaCl、0.5M L−アルギニン、2mM EDTA、0.02%アジドへの可溶化タンパク質のフラッシュ希釈(flash−diluting)(希釈係数1:30)と、この後の24時間、4℃で穏やかな撹拌によるインキュベーションによりリフォールディングした。リフォールディング混合物を20分間、30,000gで遠心分離し、アミコン撹拌セル(Amicon stirred cell)でYM10膜を通じて濃縮し(最終タンパク質濃度1mg/ml)、25mMTris/HCl、pH8.0、2mM EDTA、0.02%アジドに対して透析し、HiTrapヘパリンHP 5ml(GE Healthcare社)に適用し、0から2M NaClへの直線勾配で溶出した。FGFR1 ECDの最終精製は、25mM Tris/HCl、pH8.0、200mM NaCl、25mM L−アルギニン、2mM EDTA、0.02%アジドで平衡化したHi Load26/60 75pGカラム(GE Healthcare社)を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより達成した。FGF1(アミノ酸:16−155)およびFGF2(アミノ酸9−155)およびTNF−Riαを発現させ、精製した。FGFR1 ECDの構造完全性は、ヘパリンカラム(上記参照)に結合する能力およびFGF1との複合体の形成により実証した。複合体形成は、サイズ排除クロマトグラフィーおよびこの後のSDS−PAGEでの分析により分析した。
熱量測定実験は全て、以前に記載されているように45、VP−ITC滴定熱量計(MicroCal Inc.社、ノーサンプトン、MA)により30℃で実施した。滴定は、1.407mLの10−20μM相互作用タンパク質(すなわちFGFR2∂123、FGFR2∂23ならびにこの記載された変異体およびサブドメイン、FGFR3∂123、FGF1、FGF2ならびにホリスタチン(陰性対照として)を含有する溶液細胞への、4分間隔、回転撹拌器−シリンジを介した1.25mM SSRの10μLアリコートの添加を伴った。300rpmの一定撹拌速度を維持し、データをMicroCal社により供給された標準非相互作用一部位モデル(nが1.0に固定される。)に適合させた。測定は全て、10mM HEPES pH7.2、150mM NaClで実施し、タンパク質を以前に記載されているように(Pellegriniら、2000年)精製した。変異誘発は「部位特異的変異誘発キット」(Stratagene社)を用いて実施した。
フーリエ変換赤外線測定は、AquaSpecフローセルを備えたBruker Tensor 37 FT−IRスペクトロメーターを用いて実施した。試料コンパートメントは25℃に温度自動調節し、ノイズ比に対し良好なシグナルについて100スペクトルを平均化した。タンパク質は上記のように精製した。ゲル濾過直後、タンパク質を、SSRの存在下または非存在下、同じ調製の緩衝液(10mM Hepes pH7.2、150mM NaCl)で一晩透析した。透析緩衝液試料を使用してバックグラウンドシグナルを減算した。分析は、Brukerにより提供されたOPUSソフトウェアパッケージを用いて実施した。結果の解釈は記載されているように実施した{Barth、2002年 #60}。
HEK293細胞は、pcDNA3(Invitrogen社)にクローン化したhFGFR2IIIcaまたはhFGFR2IIIca−Y328Dを(FuGENE6、Roche社を用いて)一時的にまたは安定にトランスフェクトした。安定にトランスフェクト細胞はG418(400μg/ml)含有培地で増殖させた。刺激前、細胞を一晩、DMEM(0%血清)で飢餓状態にし、および必要とされる濃度でSSR128128Eと一緒にプレインキュベートした。細胞をこの後、1μMでのSSRまたはSU5402ありまたはなしにより37℃、5分間、FGF2(0.5−10ng/mlの間の濃度)で刺激した。ホスファターゼ阻害剤(Roche社)を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、細胞をRIPA緩衝液(製造者(Roche社)により記載されているようにホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する、Tris 30mM HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1%トリトン−X、0.5%w/vデオキシコール酸)で溶解した。細胞溶解物を10分間、12,000gで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質をNovexポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社、カールスバッド、CA)で分離し、この後Hybond ECLニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia社)に移した。PBSで5%非脂肪乳粉と一緒にインキュベーションした後、膜を以下の抗体:ホスホ−ERK1/2(CST:9101)、ホスホ−FRS2(CST:3861)、ホスホ−PLCγ(CST:2821)およびFGFR2(F0300、Sigma社)と一緒に一晩、4℃でインキュベートした。
この実験に使用されたBaF/3細胞の構築は、出願WO2007/080325に詳細に記載されている。
全RNAは、トリゾール試薬(Invitrogen社、USA)およびRNeasyキット(Qiagen社、ドイツ)を用いてHUVECから単離し、全RNAからこの後Quantitect Reverse Transcriptionキット(Qiagen社、ドイツ)を用いてcDNAを調製した。プライマーセットおよびFAM(商標)色素標識TaqMan(登録商標)MGBプローブ(Eurogentec社、ベルギー)を、ヒトFGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、およびTBP用に設計し、PCR反応は7500 FastリアルタイムPCRシステム(ABI社、ドイツ)で行った。各試料は、特定の標準対照および非テンプレート対照と一緒に三通りに分析した。増幅は、2×TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix、20×Assays−on−demand(商標)Gene Expression Assay Mixを用いて行った。各試料における最初のmRNAコピー数の計算は、サイクル閾値(CT)方法により行った。FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、mRNAのコピー数は、TBP mRNAレベルを用いて正規化した。
hFGFR1IIIcα−ヘマグルチニンを安定にトランスフェクトされたラット脂肪パッド内皮細胞を、80−90%培養密度に増殖させ、24時間血清飢餓状態にした(0.5%FBS)。刺激は、SSRまたはDMSO(対照として)と組み合わせて2ng/mlでのFGF2で5分間実施した。細胞溶解物を10分間、12,000gで遠心分離し、上清を回収した。HAタグ付タンパク質を、アガロース結合抗HA抗体の存在下、一晩、4℃で細胞培養物のインキュベーションにより免疫沈降させた。免疫複合体は1mlの溶解緩衝液で3回洗浄した。タンパク質は、50μlの2×SDS試料緩衝液と一緒のインキュベーションおよび煮沸を介して溶出した。タンパク質をNovexポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社、カールスバッド、CA)で分離し、この後Hybond ECLニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia社)に移した。PBSで5%非脂肪乳粉と一緒にインキュベーションした後、膜を以下の抗体:pFGFR(CST:3471)およびFGFR1(CST:3472)と一緒に一晩、4℃でインキュベートした。
SSRが、結合ポケットへのFGF1の結合を阻害するかどうかを評価するため、本発明者らはFcタグなしのFGFR2の全細胞外ドメイン(FGFR2∂123)を精製し、およびSSR(1mM)なし(青)またはあり(赤)のさまざまな濃度のFGFR2∂123の存在下、蛍光lumioタグ付FGF1(FGF1−lumio;1μMの定濃度)の反転速度(異方性のパラメーターとして)を測定した。FGFR2∂123をFGF1−lumioに添加した場合、リガンド/受容体複合体の反転速度は、該複合体のより大きなサイズのためFGF−lumio単独の反転速度より遅かった。SSRの大きなモル過剰(1000倍)は複合体の反転速度を変化させず、SSRがFGFRからFGFを移動させないことを確認した。
コンフルエントなHUVEC細胞を回収し、0.5%FCS(Hyclone社、SH30070.03)、2mMグルタミン、MEM非必須アミノ酸 1×(Gibco社、11140−035)、MEMピルビン酸ナトリウム 1×(Gibco社、11360−039)を含む100μl RPMI 1640(Invitrogen社、32404−014)中の5 104細胞を、一晩、96ウェルコラーゲンIコーティングプレート(Beckton Dickinson社、354650)にウェルごとに播種する。次いで、培地を除去し、ならびに2×FGF2(R&D社、234−FSE−025)、FGF4(R&D社、235−F4−025)またはFGF−19(自家製造)および50μlの2×SSR(200または600nM)を含有する50μlの培地に置換する。細胞をCO2チャンバーで3日間、37℃でインキュベートし、増殖を100μlの「Cell Titer GIo Luminescent細胞生存能」キット(Promega社、G7571)でATP含量を定量化して評価する。
コンフルエントなHUVEC細胞を回収し、およびFCS、2mMグルタミン、MEM非必須アミノ酸 1×(Gibco社、11140−035)、MEMピルビン酸ナトリウム 1×(Gibco社、11360−039)を含まないRPMI 1640(Invitrogen社、32404−014)に0.8 106細胞/mlで再懸濁する。250μlの細胞溶液を、内皮細胞遊走のための24ウェルBD Biocoat血管新生システム(BD Biocoat社、354144)の上のチャンバーに4×SSRで分配し、および750μlの培地を、FGF2(R&D社、234−FSE−025)、FGF4(R&D社、235−F4−025)またはFGF−19(自家製造)を含む下のチャンバーに67ng/mlで分配する。プレートをCO2チャンバーで22時間、37℃でインキュベートする。次いで、プレートインサートを除去し、および500μLのカルセイン(Molecular probes社、C−3100)を含有する新たな24ウェルプレート(Falcon社、353504)に90分間入れる。次いで遊走細胞が蛍光し、遊走を485nm励起および535nm発光後、ダウンステアズリーディング(downstairs reading)でルミノメーターにより測定する。
コラーゲン/マトリゲルゲルは、チャンバースライド(Biocoat Cellwareコラーゲン、タイプI、8ウェル培養サイド(cultureside):Becton dickinson社 354630)の各ウェルに、コラーゲンI(ラット尾コラーゲン、タイプI:Becton dickinson社 354236)中160μlの1/6希釈マトリゲル(増殖因子低減マトリゲル:Becton dickinson社 356230)を分配して調製する。重合が1時間、37℃で生じる。次いで、15.103HUVECを、400μl EBM培地(Clonetics社 C3121)+2%FCS+hEGF 10μg/mlにウェルごとに添加する。内皮細胞を、10ng/mlのFGF2(R&D社、133−FB−025)、FGF4(R&D社、235−F4−025)またはFGF19(R&D社、969−FG−025)で、CO2チャンバーで24時間、37℃で刺激する。次いで、完全長の偽細管をバイオイメージングシステム(Imagenia Biocom社、Courtaboeuf、フランス)を用いて定量化する。
HUVE細胞(Promocell社、C−12200)は、2%FBS(Clonetics社、CC−4101)、EGM singlequotsキット(Clonetics社、CC−4133)からの10μg/ml hEGF(Clonetics社、CC−4017)、1250ng/mlヘパリン(Sigma社、H3149)および375ng/ml ECGS(BD Biosciences社、356006)を含有する2mlのEBM培地(Clonetics社、CC−3121)中0.5.106細胞で、35mmコラーゲンIコーティングディスク(BD Biocoat、354456)に播種する。90%培養密度で、細胞を1.8mlのRPMI 1640(Invitrogen社、32404−014)、0.5%FCS、2mMグルタミン、1mM非必須アミノ酸(Invitrogen社、11140−050)、ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen社、11360−070)で一晩飢餓状態にする。翌日、細胞を、10×SSR(3μM)ありまたはなしの10×FGF−4(30ng/ml;R&D社、235−F4−025)を含有する200μlの平衡化飢餓培地により10分間刺激する。次に、細胞を冷PBSですすぎ、細胞を、2.5mMオルトバナジウム酸およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma社、P8340)を含有する75μl RIPAで溶解する。細胞溶解物を10分間、12,000gで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質を4−20%Novex Tris−グリシンポリアクリルアミドゲル(Invitrogen社)で分離し、この後ニトロセルロース膜(Invitrogen社、IB3010−01)に移した。TBS−0.05%Tween80で5%非脂肪乳粉と一緒にインキュベーションした後、膜を、TBSで1000×希釈した抗ホスホAKT(Ser473、CST、4058)、tween、1%BSAと一緒に一晩、4℃でインキュベートした。各スポットのシグナルがSuperSignal(登録商標)West Dura Extended Duration Substrate(Thermo Scientific社、34076)による化学発光検出後に得られ、スポット密度をBiolmaging System Chemigenius2(Syngene社)を用いて定量化する。
コンフルエントなHUVEC細胞を回収し、0.5%FCS(Hyclone社、SH30070.03)、2mMグルタミン、MEM非必須アミノ酸 1×(Gibco社、11140−035)、MEMピルビン酸ナトリウム 1×(Gibco社、11360−039)を含む50μl RPMI 1640(Invitrogen社、32404−014)中の5 104細胞を、一晩、96ウェルコラーゲンIコーティングプレート(Beckton Dickinson社、354650)にウェルごとに播種する。細胞は、20ng/ml FGF4および600nMSSRを含有するFCSなしで100μl平衡化飢餓培地で5分間刺激する。次いで、50μlのPFA8%をPBS(Polysciences社、18814)に室温で15分間添加し、細胞を200μl PBSで2分間、3回洗浄する。非特異的部位は、PBS、トリトン0.3%、正常ヤギ血清0.1%(Zymed社、50−062Z)により室温で1時間ブロックし、ブロッキング緩衝液を作製し、およびPBSで1/500希釈した抗ホスホ−AKT(Ser473)抗体(CST、4058)、トリトン0.3%に一晩置換する。一次抗体を次いで除外し、および200μl PBSで2分間、3回洗浄した。HRP結合抗ウサギ二次抗体(CST、7074)を使用して、PBS、0.3%トリトンで2時間、室温で1/2000希釈した後、AKTリン酸化を検出する。次いで、細胞をPBSですすぎ、100μlのHRP基質(Uptima社、UP664781)を暗室で20分間添加する。酵素反応を100μlの停止緩衝液(Uptima社、UPS29590)で停止し、ODを450nmで測定した。
FGF2は、購入者の推奨に従ってAlexa Fluor488 C5−マレイミド(Invitrogen社、A10254)で標識した。
細胞遊走は、ポリカーボネート膜(Costar、Corning Inc.社)を有する8μm孔径トランスウェル透過性支持体を含有する24ウェルインサートを用いて、改変ボイデンチャンバーアッセイにより評価した。指数関数的に増殖している細胞を0.2%FBS含有培地で16時間飢餓状態にし、および同じ低血清培地に5×105細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を上のチャンバーに播種したのに対し、化学誘引物質および/またはSSRは下のチャンバーに入れた。テストした化学誘引物質には、ヒトPDGF−BB、IGF−I、PIGF、EGF(SSR(1μM)の存在下または非存在下、全て100ng/ml)が含まれる。10%FBS含有培地は陽性対照として使用した。37℃で6時間インキュベーションした後、膜の上側の細胞は綿棒を用いて擦り取ったのに対し、下表面の遊走細胞はPBS中1%パラホルムアルデヒドで固定し、および蛍光マイクロソープ(microsope)を用いた定量化のためDAPIで核染色した。定量化は、10×の倍率で5枚のランダム画像を作製しおよび核の数をカウントして実施する。
細胞増殖は、0.2%FBS(Hyclone社、SH30070.03)、2mMグルタミン、MEM非必須アミノ酸 1×(Gibco社、11140−035)、MEMピルビン酸ナトリウム 1×(Gibco社、11360−039)を含む100μl RPMI 1640(Invitrogen社、32404−014)で16時間飢餓状態にしおよび96ウェルマイクロプレートに4,000細胞/ウェルで播種した、指数関数的に増殖している細胞で分析した。分裂促進因子および/またはSSRに72時間曝露した後、細胞増殖をCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社、マジソン、ウィスコンシン、USA)を使用して製造者の指示に従ってアッセイした。細胞遊走は、ポリカーボネート膜(Costar、Corning Inc.社)を有する8μm孔径トランスウェル透過性支持体を含有する24ウェルインサートを用いて、改変ボイデンチャンバーアッセイにより評価した。指数関数的に増殖している細胞を0.2%FBS含有培地で16時間飢餓状態にし、および同じ低血清培地に5×105細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を上のチャンバーに播種したのに対し、化学誘引物質および/またはSSRは下のチャンバーに入れた。10%FBS含有培地は陽性対照として使用した。37℃で6時間インキュベーションした後、膜の上側の細胞は綿棒を用いて擦り取ったのに対し、下表面の遊走細胞は4%ホルムアルデヒドで固定し、および定量化のためDAPIで核染色した。
細胞増殖は、IMDM(Invitrogen社、31980048)、0.2%FBS、2mMグルタミン含有培地で16時間飢餓状態にしおよび96ウェルマイクロプレートに4,000細胞/ウェルで播種した、指数関数的に増殖している細胞で分析した。分裂促進因子および/またはSSRに72時間曝露した後、細胞増殖をCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社、マジソン、ウィスコンシン、USA)を使用して製造者の指示に従ってアッセイした。
0日目:HEK293:mVEGFR2wt細胞またはHEK293:PDGFRβ細胞を10000細胞/ウェル(96ウェルプレート細胞結合Costar)でプレーティングし、一晩接触させる
1日目:細胞をDMEM(0%血清)で最低3時間飢餓状態にする:50ng/mlのVEGF164またはPDGF−BBの混合物をDMEM(0%血清)で調製し、5または15分間刺激する:シュアファイアアッセイ(Perkin Elmer社)からの溶解緩衝液で細胞を溶解する:50μlの緩衝液で細胞を溶解し、プレートをRTで10分間撹拌し、次いでさらなる使用まで−20℃で凍結する;タンパク質と溶解緩衝液の混合物を作製し、および製造者の指示に従ってpERK1/2、合計ERK1/2ならびにカスタムデザインされたpPLCγおよび合計PLCγで分析する。
この試験の目的は、FGFR細胞外ドメイン(ECD)に結合しおよびFGFRシグナル伝達を阻害する低分子量化学化合物を開発することであった。小分子化合物が、オルソステリック部位に対する単純な立体障害を介してはるかに大きなポリペプチド(すなわちFGF)とどのように相互作用できるかを構想することは困難であることから、複数のリガンド結合アッセイフォーマットを利用して、任意の同定された化合物がアロステリック機構を介してオルソステリックに作用しているかどうかを判定した。本発明者らは最初に、ハイスループットシンチレーション近接結合アッセイ(SPA)を開発して、Fc−フラグメントに結合した、3つのIg様ドメインD1−3(FGFR1∂123/Fc)から成る、FGFR1−ECDへの125I−FGF2の結合を阻害する化合物を同定した。>20,000化合物のスクリーニングおよび化学的最適化の後、1つの化合物、SSR128129E(以後「SSR」と略す)が、125I−FGF2結合を阻害した。追加のSPAアッセイでは、SSRは、さまざまなFGFRへの種々のFGFリガンドの結合をブロックする一方で、関連した構造相同性または全く異なる化学組成を有する>100の異なるリガンドと同種受容体との結合を阻害しない、マルチFGFR阻害剤として作用した。この知見は、競合的(オルソステリック)機構、または高い負の協同性(ChristopoulosおよびKenakin、2002年)を特徴とする他のアロステリック相互作用のどちらかを示唆した。
FGFR遺伝子発現(図1B)およびFGFR1バリアント(図1C)を検出する特定のプライマーを用いた定量的PCR(図1A)およびRT−PCRによるHUVEC細胞(C−12200、Promocell社)でのFGFR発現分析は、FGF−R4およびFGF−R1β3cの発現のみを実証したことから、本発明者らは、HUVE細胞を最初に用いて異なるFGFRでのSSRの拮抗活性を試験した。FGF19はFGFR4を特異的に刺激することが知られているのに対し、FGF4(FGF19ではなく)はFGFR1−hMpl融合タンパク質をトランスフェクトしたBaF/3細胞においてFGF−R1のみを活性化する(図2A)一方、FGF19は活性化できない(図2B)。したがって、HUVECにおいてFGFR1およびFGFR4は、それぞれFGF4およびFGF19で刺激することができる。
SSRがFGF依存性シグナル伝達効果を示差的に阻害したことから、本発明者らは次に、SSRがインビトロでのFGF依存性細胞反応にも影響するかどうかを調査した。HUVECを用いると、SSRはFGF2の走化性効果を阻害した。
SSRはマルチFGFR阻害剤であったことから、本発明者らは、さまざまな(ヒト)FGFRサブタイプのポリペプチドフラグメントを使用した。SSRの飽和移動差NMR(STD−NMR)スペクトルは、SSRがFGFR1のECD(FGFR1∂123)に結合することを明らかにした(図11A)。これは、一次元(1D)−NMRプロファイルの分析により確認され、これがSSRの添加時のFGFR1∂123シグナルのピーク拡大を明らかにした(図11A)。この結合はTNF−R1細胞外タンパク質では観察されないため、この結合は特異的である(図11A)。本発明者らは次いで、FGFRのECDフラグメントを使用して3つのIgドメインの1つに対するSSRの結合部位をマッピングした。ドメインD3(FGFR1∂3)のみを含有するフラグメントの1D−NMR測定は、この膜近傍ドメインにおいてSSRの結合部位を同定した(図11B)。事実、FGFR1∂3およびFGFR1∂123は、本発明者らがこれらのタンパク質について同じ親和性を得たことを意味する同一のシグナル(太線)を与えるのに対し、FGFR1∂12およびFGFR1∂2は明確な線(図11B)をもたらす。2つのECDフラグメント、FGFR2∂23(ドメインD2および3から成る)およびFGFR3∂23を用いた等温滴定熱量測定(ITC)は、SSRがFGFR2およびFGFR3に結合することを明らかにした(図11Cおよび11D)。
本発明者らは次いで、先行実験で同定された領域へのSSRの結合により媒介されたFGFRの立体構造変化の直接的証拠を、本発明者らが得ることができるかどうかを調べた。したがって、本発明者らは、ドメインドメインD2−3(FGFR2∂23)から成る、FGFR2のECDフラグメントのフーリエ変換赤外線(FTIR)分光測定を実施した。どちらかのバリアントへのSSRの添加は、全体的な立体構造変化と一致する、1,640cm−1周辺で最大となる、FTIRスペクトルのアミドIバンドの振幅の増加をもたらした(図12A)。
FGFRシグナル伝達の調節におけるアロステリック部位の機能的重要性を評価するため、本発明者らは、機能的FGFR2WTまたはFGFR2∂23−Y328Dバリアントのどちらかを発現する安定なHEK293細胞系を作製し、SSRがこれらの細胞系でFGF2によるERK1/2の活性化を阻害するかどうかを分析した。免疫ブロッティングは、SSRによるFGFR2∂23−Y328D細胞でのFGF2誘導ERK1/2リン酸化の阻害が、FGFR2WT細胞での阻害能力(IC50値:28±12nM)と比べて低減する(IC50値:121±30nM)ことを明らかにした(図15Aおよび15B)。これは、このアロステリック部位が、インビトロでの精製FGFR2フラグメントへのSSR結合に関係がないだけでなく、インセルロ(in cellulo)での生理条件ではFGFR2シグナル伝達に対する阻害活性にも関係がないことを示している。Y328D変異が、SSRの阻害活性を完全には無効にしなかったという事実は、FGFR2が生理学的文脈で発現される場合に、Tyr328に加えて他の隣接残基もSSRの結合に寄与することを示唆している可能性がある。
FGFR制御リン光体−シグナル伝達に対するSSR効果を評価するため、HEK293細胞をFGFR2でトランスフェクトし、FGFR依存性FRS2およびPLCγカスケードを阻害することが記載された公表FGFRチロシンキナーゼ阻害剤SU5402(Zhenら、Oncogene 2007年)と比較して、FGFR自己リン酸化後の2つの主要経路、PLCγおよびFRS2をウェスタンブロットにより試験した。このような細胞では、FGFは、FRS2、Erk1/2およびPLCγリン酸化を誘導する。SU5402が全てのこれらの誘導をブロックするのに対し、SSRはFRS2経路を阻害するのみであり(図16Aおよび16B)、SSRにより得られた偏った拮抗作用を説明している。より一般的には、リン酸化のこれらの違いは、アロステリック調節因子を評価するためのレポーターとして使用することができる。
例5からの記載された立体構造変化の考えられる分子機構の1つは、フラストレートされたドメイン(定義については上記参照)の存在を含む。AGADIR(ヘリックス安定性予測アルゴリズム;Munoz,V.&Serrano,L. 1994年)を用いてヒトFGFR2のドメインD2およびD3を分析した時、本発明者らは、βシートからαヘリックスへのシフトを起こす蛍光がある唯一の領域として、Tyr319からArg330の範囲の(故に必須残基Tyr328を含む)残基の配列を同定した。アルファヘリカリティ(helicality)を低減し故にドメインのフラストレーションを低減することがAGADIRにより予測されたアスパラギン酸によるTyr328の置換(FGFR2∂23−Y328D)は、このような理論モデルと一致して、FTIR分析により検出されたような観察された立体構造変化を実際に妨げた。他のTKRのうち、VEGFR1、−2および−3ならびにPDGFRβを含む別の増殖因子受容体の類似の配列分析は、比較的高いAGADIRスコアの領域を含有した。該領域はこの領域からアスパラギン酸に必須残基を変異させることで逆になり得る。本発明者らは、K609DおよびK648Dを変異させることが、VEGFによる刺激時にERK1/2シグナル伝達の低減をもたらした、VEGFR2の幾つかの予備データを持っている。
SEC−LC/MS方法論は、オンライン結合された2次元システム、高性能液体クロマトグラフィーに結合されたサイズ排除クロマトグラフィーと、これに続く検出のためのエレクトロスプレーイオン化−飛行時間型質量分析に依存する、親和性スクリーニングに使用される分析技法である。
FGF−R用に開発された戦略が、別の受容体TK、すなわちVEGF−R2またはKDRに適用される。想定されるアロステリック標的部位を持つことができる領域を同定する最初のアプローチとして、本発明者らは、マウスVEGF−R2受容体由来の利用可能な一次アミノ酸配列(EntrezアクセッションNP_034742.2)を用いて、構造変化(例えばβシートからαヘリックスへの転移)を起こす傾向がある領域を同定するソフトウェアプログラムAGADIR1を利用した。これは、高い螺旋傾向を有する幾つかの領域をもたらしたが、Igドメイン構造では主にβシート構造が期待されるはずである。Agadir分析の結果は図18Aに示されている。
想定されるアロステリック標的部位を持つことができる領域を同定する最初のアプローチとして、本発明者らは、ヒトPDGFRβ受容体由来の利用可能な一次アミノ酸配列(EntrezアクセッションNP_002600.1)を用いて、構造変化(例えばβシートからαヘリックスへの転移)を起こす傾向がある領域を同定するソフトウェアプログラムAGADIR1を利用した。これは、高い螺旋傾向を有する幾つかの領域をもたらしたが、Igドメイン構造では主にβシート構造が発現されるはずである(図19)。この後、PDGFRβ由来の各アミノ酸をアスパラギン酸残基(D)により連続的にインシリコ変異させた後、本発明者らは、AGADIRスコアを再び分析し、ならびに(i)螺旋傾向の変化が最大(最もネガティブ)であるおよび(ii)膜貫通ドメインに最も近傍に位置するようなIgドメインに位置するような変異を選択した。これらから、L383DおよびK387D(両方の残基ともhPDGFRβのドメインIgD3にある)は螺旋傾向の最大の低下をもたらした(図19)。
VEGFまたはPDGF−BBの結合は、それぞれの同種受容体の二量体化を誘導し、これが今度は細胞内キナーゼドメインのリン酸化を誘導する。この後(FGF−Rの偏ったアンタゴニストSSRに一致する目的とする)2つの主要経路が、ERK1/2経路(図21Aおよび21C)およびPLCγ経路(図20に概略的に示されている)を含め活性化される。各経路の活性化の測定は、考えられる阻害剤の存在下または非存在下、シグナル伝達経路の1つのみの阻害により、「偏った」シグナル伝達を誘導する化合物の同定をもたらす。
Claims (2)
- a)FGFRの細胞外ドメインを小分子化合物アロステリック阻害剤候補化合物と接触させる段階、
b)前記FGFRの活性化/阻害に依存する少なくとも2つの下流経路の変化を測定する段階、
c)前記FGFRの活性化/阻害に依存する少なくとも2つの異なる下流経路に対する少なくとも1つのレポーターの状態の変化を比較する段階を含み、
受容体のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下、少なくとも1つの下流経路が阻害されるのに対し、少なくとももう1つの下流経路が影響を受けない場合に、アロステリック阻害剤が同定され、ここで、該2つの異なる下流経路は、ERK1/2シグナル伝達経路及びPLCγシグナル伝達経路に相当する、
FGFR−1、FGFR−2、FGFR−3又はFGFR−4から選択されるFGFRのアロステリック阻害剤の同定方法。 - 段階a)のFGFRの細胞外ドメインが、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる、又は配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%又は95%の同一性を示すアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の方法。
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