CN102596991A

CN102596991A - 来自酪氨酸激酶受体的胞外变构抑制剂结合结构域

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Publication number: CN102596991A
Application number: CN2010800397105A
Authority: CN
Inventors: P·卡梅利特; F·德斯梅特; J·施伊姆科维茨; F·劳索; C·赫伯特
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; Vrije Universiteit Brussel VUB; Sanofi Aventis France
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; Vrije Universiteit Brussel VUB; Universite Libre de Bruxelles ULB; Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: IL217155B; MX2012000298A; KR20120093146A; IL217155A0; BR112012000029A2; DK2448964T3; US20120094864A1; CA2766972C; US20160193192A1; CA2766972A1; JP2017036305A; SG10201403778TA; AU2010267590B2; AU2010267590A1; JP6255156B2; MX345715B; EP2448964A1; MY158993A; ES2631452T3; BR112012000029B1

Abstract

本发明涉及用于变构抑制剂的胞外结合结构域，其中所述结合结构域源自单跨膜酪氨酸激酶受体。更特别地，本发明涉及源自成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的胞外结构域。它还涉及该结构域用于鉴定其它酪氨酸激酶受体的胞外部分中相似结构域的用途，并且涉及用于鉴定小化合物变构抑制剂的筛选方法。

Description

来自酪氨酸激酶受体的胞外变构抑制剂结合结构域

本发明涉及用于变构抑制剂的胞外结合结构域，其中所述结合结构域源自单跨膜酪氨酸激酶受体。更特别地，本发明涉及源自酪氨酸激酶受体即成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)或血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)的胞外结构域。它还涉及该结构域用于鉴定其它酪氨酸激酶受体的胞外部分中相似结构域的用途，并且涉及用于鉴定变构抑制剂的筛选方法。

细胞表面受体是所有药物中的绝大多数的靶标(Overington，等，2006)。在历史上，药物发现程序主要着力开发在正构位点(orthostericsite)竞争结合内源配体的拮抗物。相比之下，与变构位点(即与正构配体(若靶标是受体)或底物(若靶标是酶)所利用的拓扑学上不同的结构域)结合并且调节蛋白活性的药物更难以鉴定。然而近年来表明经鉴定的用于配体门控离子通道和G蛋白偶联受体(GPCR)的变构调节剂数量增加(Christopoulos，2002；Kenakin，2010)。出人意料的是，尽管存在下列事实：该受体超家族在生物学上极其重要并且具有医学意义，以及变构药物比传统正构配体可提供显著的治疗优点，包括安全性和/或选择性更大，但迄今未鉴定针对生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)的小的化合物变构调节剂。至今，大多数靶向RTK的疗法集中于识别生长因子配体的单克隆抗体，或直接抑制受体的酪氨酸激酶活性的小分子化学化合物。

除其它之外，还有一个领域可从更有效和/或更具选择性的RTK小化合物抑制剂充分获益，即抗血管生成药物疗法领域。靶向VEGF的抗血管生成剂延长癌症患者的生存，但其总体成功受限于固有的不应性、经获得性抗性而逃避以及至少在临床前模型中对转移的刺激。已假定含有额外抗血管生成剂的组合疗法可有助于克服这些难题。首个被鉴定的血管生成因子即成纤维细胞生长因子(FGF)-2是引人关注的候选药物。实际上，FGFR信号转导涉及癌症和炎性疾病(Shin等，2006；Eswarakumar等，2005；Malemud等，2007；Carmeliet，2005)、促使肿瘤血管生成改变(Presta等，2005；Kubo等，2002；Shine等，2006；Lavine等，2006)以及在VEGF抑制剂治疗时挽救肿瘤血管化和复发(Casanovas等，2005)。然而，FGF家族未受到用于抗血管生成药物开发的充分关注，这部分是因为该18种配体和4种FGFR的超家族成员过多(Eswarakumar等，2005；Beenken和Mohammadi，2009；Cenni等，2005；Bossard等，2004；Compagni等，2000)。此外，FGFR酪氨酸激酶的选择性抑制剂还未被批准用于临床用途(Dimitroff等，1999；McDermott等，2005)。

发明概述

令人意想不到的是，本发明人已发现，通过与化学优化结合的高通量筛选，可鉴定RTK即FGFR的首个具有口服活性的小化合物变构抑制剂。该化合物称为SSR128129(简写为″SSR″)(图3)。

如通过基于SSR活性的详细研究所说明，SSR具有抑制同一家族目前为FGFR家族所有成员的能力。如以下实施例所示，SSR能抑制FGFR1活性(图4和6)、FGFR2活性(图8)、FGFR3活性(图9)和FGFR4活性(图7)。因此，该变构抑制剂与进化上保守的FGFR变构位点结合，该位点位于不同TKR成员共有的受体的胞外结构域中。该保守位点位于FGFR的结构域Ⅲ中(图11)。SSR与其结合位点的结合诱导″偏袒拮抗(biased antagonism)″。该作用通过以下事实而证实：SSR与变构结合位点的结合导致受体中特别是确定的受挫结构域(frustrated domain)中的构象变化。由于偏袒拮抗，如下文所述通过使用基于磷酸-信号转导途径(phospho-signalling pathway)测量的筛选试验，提供鉴定变构抑制剂的方法。自此，SSR是RTK变构抑制剂的首个实例。

对靶向FGFR上这样的位点以及靶向其它RTK例如VEGFR2和PDGFRβ中的相似位点的验证具有重要的实际意义并且将导致显著的治疗益处。

本发明的不同方面将在本发明详述和下列实施例中说明。

发明详述

本发明的第一方面是源自酪氨酸激酶受体的胞外结构域的变构结合位点。本文使用的变构结合位点是指这样的位点，其中在不对配体与受体的配体结合位点结合造成竞争性抑制的情况下，抑制剂优选小化合物可结合的位点。本文使用的源自是指变构结合位点由胞外结构域的一部分组成，但不包括完整的胞外结构域。优选地，变构结合位点的长度为10至200个氨基酸，更优选10至100个氨基酸，甚至更优选20至50个氨基酸，其中所述氨基酸是受体胞外结构域的一部分。

本文使用的小化合物是非聚合性质的化合物，优选分子量小于1000D，更优选小于900D，更优选小于800D，更优选小于700D，更优选小于600D，甚至更优选小于500D。

在本专利申请范围内，酪氨酸激酶受体和受体酪氨酸激酶(RTK)为等同术语。″酪氨酸激酶受体″用于表示受体，而″受体酪氨酸激酶″用于更具体地表示受体的激酶活性。酪氨酸激酶受体为本领域技术人员公知并且包括但不限于EGF、胰岛素样生长因子、PDGF、FGF、VEGF、HGF、Trk、AXL、LTK、TIE、ROR、DDR、PKT7、RYK、CCK4、Eph和MuSK受体家族的受体。优选地，所述变构结合位点源自具有Ig结构域的TKR包括AXL、FGFR、MuSK、PDGFR、PTK7、ROR、TIE和VEGFR...的胞外结构域；甚至更优选地所述变构结合位点源自胞质结构域中具有断裂(split)激酶结构域的TKR；本发明TKR的优选实施方案是成纤维细胞生长因子受体(FGFR)或其同源物、直向同源物或旁系同源物。

蛋白质的″同源物″包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其具有相对于未修饰的目标蛋白质的氨基酸取代、缺失和/或插入以及具有与它们源自的未修饰蛋白质相似的生物学和功能活性。″直向同源物和旁系同源物″包括用于描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是同一物种内通过祖先基因的复制而产生的基因；直向同源物是来自不同生物体的通过物种形成而产生并且也源自共同的祖先基因的基因。

包含SEQ ID NO.1的此类异构结合属于FGFR家族，更特别是FGFR2。优选地，所述变构抑制剂位点包含SEQ ID NO.1，甚至更优选地其由SEQ ID NO.1组成。

在另一方面，本发明由变构结合位点的同源物、旁系同源物或直向同源物组成。优选地，这些同源物、旁系同源物或直向同源物的多肽序列与SEQ ID NO.1共有至少70％、80％、90％、95％或更高的同源性。

作为实例，变构结合位点的此类旁系同源物存在于FGFR家族。

特别地，本发明的变构结合位点位于FGFR的结构域Ⅲ中。

同样地，VEGFR2的变构结合位点位于受体的Ig结构域6中，在包含赖氨酸609和赖氨酸648的区域中。

变构结合位点还存在于PDGFRβ并且位于邻近跨膜区域的区域，特别在Ig结构域3中，在包含亮氨酸383和赖氨酸387的区域中。优选地，变构抑制剂与变构结合位点的结合诱导偏袒拮抗。

本文使用的″偏袒拮抗″是指，对于具有若干下游途径的受体而言，在变构抑制剂与变构抑制剂结合位点结合时，不是所有途径都受影响，也不是所有途径受影响的程度相同。在优选实施方案中，至少一条下游途径被抑制，而至少另外一条下游途径未受影响。

优选地，本发明的变构结合位点包含受挫结构域，优选基本上由受挫结构域组成，甚至更优选由受挫结构域组成。

本文使用的″受挫结构域″是指不能明确指定一种结构构象的蛋白结构域或其片段；受挫结构域为本领域技术人员公知，并且通过一个蛋白质二级结构预测程序中的含糊应答(ambiguous answer)；或通过两个不同的蛋白质二级结构预测程序之间的预测结果矛盾来检测受挫结构域的存在情况。优选地，通过来自蛋白质二级结构预测程序的预测结果与由蛋白质结构检测方法例如结晶和X射线衍射确定的真实结构之间矛盾来检测。作为非限制性实例，矛盾可为用一种方法表明是α螺旋而用另一种方法表明是β折叠。蛋白质的受挫最小；然而一些结构域诱导一些受挫(此处称为″受挫结构域″)并且那些结构域易于诱导蛋白质的构象变化。

在优选实施方案中，所述受挫结构域包含SEQ ID NO.2，优选地，由SEQ ID NO.2组成。该受挫结构域属于FGFR家族，特别为FGFR2。

可如上所述鉴定其它的受挫结构域。

本发明的另一方面是本发明变构结合位点的用途，用于诱导配体与变构结合位点所在的酪氨酸激酶受体结合位点结合时偏袒拮抗。本发明的再另一方面是本发明变构结合位点用于筛选来自随机文库并与所述位点结合的小化合物抑制剂的用途。

本发明的再一方面是用于鉴定酪氨酸激酶受体的胞外结构域中变构抑制剂结合位点的方法，其包括筛查所述胞外结构域中受挫结构域的存在情况。用于筛查受挫结构域的方法为本领域技术人员公知并且此方法的实例在实施例8中描述。作为非限制性实例，通过一个蛋白质二级结构预测程序中的含糊应答；或优选通过两个不同的蛋白质二级结构预测程序之间预测结果的矛盾，甚至更优选通过来自蛋白质二级结构预测程序的预测结果与由蛋白质结构检测方法例如结晶和X射线衍射确定的真实结构之间的矛盾来检测受挫结构域。用于蛋白质二级结构预测的程序为本领域技术人员公知；作为非限制性实例，此类程序参见Rost(2003)。优选地，所述受挫结构域位于所述变构结合位点附近；更优选地其与结合位点边界相距不多于20个氨基酸，甚至更优选不多于10个氨基酸，甚至更优选地其与所述结合位点相邻，甚至更优选地其与结合位点重叠，最优选地其包含在结合位点中。在确定可能的抑制剂位点之后，通过设计与该位点结合的并且其变构抑制功能可被检测的化合物例如小分子、小肽、肽模拟物(peptidomimetics)、抗体或纳米体(nanobody)，通过证实可能的抑制剂位点的功能，从而可完成筛查。

本发明的另一方面是用于鉴定与本发明酪氨酸激酶受体的胞外结构域中变构抑制剂位点结合的小化合物变构抑制剂的方法，其包括比较由两个不同下游途径诱导的两种不同报道物(reporter)，所述途径依赖于所述酪氨酸激酶受体的激活。报道物是任何产生可检测信号的基因、蛋白质化合物并且作为非限制性实例，可以是抗生素抗性基因、致使细胞死亡的毒素基因、编码荧光蛋白例如GFP的基因、或编码酶活性例如β-半乳糖苷酶的基因、或磷酸化或去磷酸化、乙酰化或去乙酰化或构象改变的蛋白质。在报道基因的情况下，编码序列置于受合适启动子的控制下，即由配体与受体结合诱导并因此诱导报道物途径的启动子；在双途径情况下，需要两个不同的启动子。作为非限制性实例，在变构抑制剂存在或不存在情况下比较蛋白质的磷酸化将产生偏袒拮抗所致的磷酸化差异，并且这些磷酸化差异可用作报道物。

在优选实施方案中，RTK变构抑制剂的鉴定可通过进行筛选试验进行，其包括以下步骤：

a)使RTK的变构结合位点与变构抑制剂候选化合物接触

b)测量至少两个依赖于所述酪氨酸激酶受体激活/抑制的下游途径的变化

c)比较针对至少两个不同下游途径的每一个的至少一种报道物状态的变化，所述下游途径依赖于所述酪氨酸激酶受体激活/抑制。

其中当与受体的配体结合结构域结合的配体存在下，至少一个下游途径被抑制而至少另外一条下游途径未受影响时，鉴定出变构抑制剂。报道物状态的变化取决于所用的报道物，并且作为非限制性实例可以是报道蛋白的磷酸化变化，或从基因的未诱导至诱导(或反之亦然)的转换。优选地，所述状态的变化是磷酸化状态的变化。

优选地，通过测量磷酸-信号转导途径，包括ERK1/2 etPLCγ信号转导途径的变化，进行下游途径变化的测量。

在另一实施方案中，采用基于如下所述SEC-LC/MS的亲和力筛选，可鉴定FGF-R的变构调节剂：

SEC-LC/MS方法是用于亲和力筛选的分析技术，其由以下联机偶联的二维系统组成：用于分离的与高效液相色谱偶联的尺寸排阻色谱，随后用于检测的电喷射离子化-飞行时间质谱。

该方法基于一些化合物与可溶多肽(包括肽、蛋白结构域或全长蛋白质)相互作用的能力。在将小化合物库与目标肽混合后，肽-配体复合体诱导质量漂移，使得能够通过尺寸排阻色谱分离未结合和结合的小化合物。随后，复合体解离并且结合物与肽分离并且采用用于精确质量测量的高分辨率LC/ESI-TOF(例如用Waters LCT Premier质谱仪)检测。数据去卷积算法(data deconvolution algorithm)使得能够通过质量检测分析来鉴定结合的分子。

为了鉴定FGFR的小化合物变构调节剂，该技术可应用于不同FGF-R(天然或突变)的胞外结构域。天然形式使得能够检测胞外结构域的所有结合剂。或者可通过采用与SSR结合位点邻近的FGF-R2螺旋″开放″形式筛选变构调节剂。通过稳定α-螺旋的Tyr328Arg-Ile329Lys突变，可获得所述″开放″形式，从而使得对SSR结合敏化。突变的FGF-R2随后代替野生型FGF-R2用于筛选。相似的策略可用于筛选FGF-R1、FGF-R3或FGF-R4，其具有对应于FGF-R2中的Tyr328和Ile329的氨基酸突变。在Tyr328Asp(FGF-R2)处的突变形式或在相应位置含有突变的其它FGF-R可用作对照。事实上，SSR未能结合在疏水袋附近的Tyr328Asp处突变的FGF-R2上。因此该突变形式可用于排除一部分与FGF-R2上的靶袋无相互作用的化合物。

在所有这些情况下，该策略导致鉴定能结合在目标肽靶袋上的小化合物。在第二步中，须评估对细胞中信号转导的作用。基于用来自R&D Systems的Proteome Profiler^TM Array″人磷酸激酶阵列试剂盒″鉴定的磷酸-信号转导途径，在不抑制用proteome profiler检测的未受影响激酶情况下，可通过ELISA(对细胞蛋白质提取物或直接对细胞进行)检验变构调节剂抑制FGF-2对HUVEC磷酸化激酶水平(对PYK2、eNOS、p53、c-jun、AKT、CREB、Erk1/2)作用的能力。

对于其它RTK可遵循相似方法：在鉴定受体胞外结构域中的一个或多个受挫结构域后，可在SEC-LC/MS方法中使用所述受挫结构域以鉴定受挫结构域区域中的结合剂。采用如上所述的磷酸图(phosphomap)方法或该途径的任何其它报道系统，随后可试验结合剂对信号转导途径的作用。

本发明的再一方面是小化合物，其与变构结合位点结合，也称作本发明的″变构抑制剂″，和/或用本发明方法鉴定。

″化合物″意指任何化学或生物化合物，包括简单或复杂有机和无机分子、肽、肽模拟物、蛋白质、抗体、碳水化合物、核酸或它们的衍生物。

附图简述

图1：A/对HUVEC的定量PCR实验仅显示FGFR1和FGFR4表达。B/RT-PCR分析鉴定同工型FGFR1β和FGFR4。FGFR1以IIIc变体的形式(C)。

图2：当插入的FGFR被激活时，用FGFR1βIIIc-hMpI转染的BaF/3细胞能够增殖。仅FGF4(A)能诱导FGFR1βIIIc而FGF19不能(B)。

图3：SSR化合物图示。

图4：关于SSR对内皮细胞增殖活性的研究。A/仅FGF2和FGF4刺激HUVEC增殖，表明FGFR1促进这些细胞增殖。B/SSR抑制FGF2-诱导的HUVEC增殖，表明SSR对FGFR1的拮抗。C/在用FGFR1转染的大鼠脂肪垫内皮细胞(RFPEC)中，FGF2诱导FGFR1自磷酸化，其仅部分被SSR(即使在高剂量下)抑制。D/在PAEC转染的FGFR1或HUVEC中，该抑制不是由于SSR对FGF2结合的竞争作用。

图5：A/通过测量作为各向异性参数的翻转速度(tumblingspeed)，荧光lumio-标记的FGF1(FGF1-lumio)与不含Fc-标签的纯化FGFR2的ECD

的结合。未观察到SSR和FGF1-lumio之间的直接竞争。B/SSR不能抑制FGFR2多聚化或c/FGF2二聚化。

图6：关于SSR对内皮细胞趋化迁移的活性研究。A/仅FGF2和FGF4刺激HUVEC迁移，表明FGFR1促进这些细胞增殖。B/SSR抑制FGF2-诱导的HUVEC趋化迁移，这与其对FGFR1的拮抗作用相一致。

图7：关于SSR对内皮细胞体外血管生成的活性研究。A/仅FGF2和FGF19刺激HUVEC血管生成，表明FGFR4控制这些细胞中的分化步骤。B/SSR抑制FGF2-诱导的HUVEC体外血管生成，这与其对FGFR4的拮抗作用相一致。

图8：关于SSR对PANC02增殖和迁移的活性研究。在含或不含VEGF的FGF7刺激下，PANC02细胞增殖(A)或迁移(B)，表明该系统依赖于FGFR2IIIb。SSR抑制FGF7-诱导的PANC02增殖和FGF7+VEGF-诱导的细胞迁移，显示其抑制FGFR2IIIb的能力。

图9：SSR对B9骨髓瘤细胞增殖的活性研究。A/FGF1经FGFR3诱导B9骨髓瘤细胞增殖而SSR抑制该刺激作用，表明SSR能阻遏FGFR3。B/然而，SSR不能抑制用自体活性(autoactive)FGFR3突变体(激酶结构域被组成型地磷酸化)转染的B9细胞增殖。这些结果表明SSR的胞外作用。

图10：HUVEC迁移测定，其中SSR不能显著抑制由各种生长因子例如IGF、PDGF-BB、EGF或PIGF诱导的细胞迁移。SSR对FGFR是特异性的并且仅阻遏FGF-诱导的HUVEC迁移。

图11：NMR研究显示SSR结合到FGFR结构域Ⅲ上。A/SSR结合到FGFR1胞外结构域上的1D-和STD-NMR分析。用对照TNFR1α未观察到饱和。B/SSR结合到不同FGFR1结构域上的1D-NMR研究证明用FGFR1全长和用FGFR1结构域Ⅱ获得的波谱相似，表明结构域Ⅲ中存在相互作用位点。C/等温滴定量热法显示SSR结合到FGFR2和FGFR3(D)胞外结构域上的能力。

图12：NMR(A，C)和ITC(B)研究证明SSR不能与FGF1(A，B)和FGF2(C)相互作用。D/在加入肝素模拟物蔗糖八硫酸酯(sucroseoctasulfate)(SOS)之后，未观察到对SSR结合到FGFR1上的干扰，这证实SSR不与FGFR1的肝素结合位点相互作用。

图13：经计算机(In silico)建模和诱变鉴定邻近Y328氨基酸的针对SSR的变构结合位点。对野生型(WT)FGFR2胞外结构域的ITC实验(A)显示SSR和FGFR2之间的相互作用。当用Y328D突变体(B)实现测量时，该结合丧失，证实Y328D突变使FGFR2对SSR结合不敏感。

图14：用或不用100μM SSR(分别为黑线和灰线)对纯化的(A)FGFR2δ23-WT、(B)FGFR2-δ23-His、(C)FGFR2-δ23-Tyr、(D)FGFR2-δ23-H/T(H295L/Y328D双突变体)进行的傅里叶变换红外(FTIR)测量确定WT或His295L突变体两者存在构象变化而Y328D突变使FGFR2对该变化不敏感。

图15：在用具有全长FGFR2-WT或FGFR2-Y328D的稳定转染HEK293细胞的FGF2(0.5ng/ml，5分钟)刺激之后，对激活的Erk1/2的蛋白质印迹分析。密度测量法确定IC50值(平均值±sem；3个独立实验)，显示FGFR2-Y328D突变体受体(B)对SSR抑制的敏感度为FGFR2-WT(A)的约1/5。

图16：A/与FGFR酪氨酸激酶抑制剂SU5402相比较，SSR对用FGF2刺激的FGFR2转染HEK细胞的作用的蛋白质印迹分析。SU5402抑制PLCγ、FRS2和Erk1/2磷酸化而SSR不抑制PLCγ途径，表明SSR的偏袒拮抗(B)。

图17：SSR对HUVEC中FGF2-诱导的AKT磷酸化的作用的蛋白质印迹分析(A)，连同相应的定量图(B)。C/该作用还可用针对磷酸-AKT(Ser473)的对细胞的ELISA来定量。D/该作用不依赖于SSR不能与FGF竞争结合FGFR。

图18：采用软件程序AGADIR和突变分析，鉴定VEGF-R2受体中的推定受挫区域。(A)通过已鉴定一些易于经历结构变化(例如β-折叠至α-螺旋转变)的区域。(B)选择两个赖氨酸(K609和K648)，将其突变为天冬氨酸，这是由于它们与跨膜结构域邻近以及它们在突变后对螺旋度性质的最不利影响。

图19：采用软件程序AGADIR和突变分析，鉴定PDGF-Rβ受体中推定受挫区域。将赖氨酸387突变为天冬氨酸以及将亮氨酸383突变为天冬氨酸对螺旋度性质似乎具有最负影响。

图20：VEGF-R2和PDGF-Rβ受体信号转导途径经Erk1/2和PLCγ激活的示意图。(A)VEGF刺激之后的VEGFR2信号转导和(B)PDGF刺激之后的PDGF-Rβ信号转导。

图21：使用蛋白质印迹或surefire测定，过表达野生型或突变形式VEGF-R2或PDGF-Rβ受体的HEK293细胞中的Erk1/2磷酸化检测。(A)将在K609D或K648D处突变的小鼠野生型VEGF-R2稳定转染至HEK293细胞。在饥饿和不用(0)或用(+)小鼠VEGF刺激后，通过蛋白质印迹检测Erk1/2磷酸化。(B)用于检测蛋白质提取物的Erk1/2(左图)或PLCγ(右图)磷酸化的surefire测定的示意图。(C)在用10％FBS、1或50ng/ml PDGF-BB刺激之后或在无刺激的对照(0)中，PDGFRβ-转染的HEK293细胞中的完整或磷酸化Erk1/2的alphascreen surefire剂量。

实施例

实施例的材料和方法

STD-NMR结合测定

PCR扩增人FGFR1基因(P11362)的胞外结构域(ECD；氨基酸：39-358)并且使用Nde I和BamH I限制酶切位点将其克隆到大肠杆菌(E.coli)载体pETTEV(N-末端His-标签后有TEV蛋白酶切割位点)。为产生蛋白质，将所得质粒(pET FGFR1 D1D2D3)转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagene)中。使细胞在37℃下生长直至OD600达到0.6并且通过加入1mM IPTG(异丙基-b-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导重组蛋白产生。在诱导4小时后，收集细胞并且将其保存在-80℃直至使用。将细胞沉淀(1L培养物)解冻并重悬于50ml含溶菌酶(2mg)和40U benzonase(Merck)的缓冲液1(20mM Tris/HCl，pH 7.5，200mMNaCl)。用超声破碎细胞，通过离心使包涵体(IB)沉降(15,000g，20min，4℃)并且用缓冲液1洗涤所得沉淀两次。在室温下将IB沉淀溶于20ml变性缓冲液(6M胍-HCl，20mM Tris/HCl，pH 8.0，200mMNaCl)40分钟。通过离心(30,000g，30min)除去不可溶碎片并且将上清液上样到根据制造商建议用缓冲液A预平衡的Ni-NTA柱(Qiagen)。使用变性缓冲液与500mM咪唑将FGFR1 ECD从柱洗脱。通过将溶解的蛋白质(稀释因子1∶30)快速稀释到50mM Tris/HCl，pH 8.0，250mM NaCl、0.5M L-精氨酸、2mM EDTA、0.02％叠氮化物中来将含有ECD的流份合并并再折叠，随后在4℃在轻柔搅拌下孵育24h。在30,000g下将再折叠混合物离心20min，在Amicon搅拌室中通过YM10膜(蛋白终浓度为1mg/ml)浓缩，针对25mMTris/HCl、pH 8.0、2mM EDTA、0.02％叠氮化物透析、将其施用到HiTrap Heparin HP 5ml(GE Healthcare)并且用0至2M NaCl的线性梯度洗脱。FGFR1 ECD的最终纯化通过尺寸排阻色谱采用Hi Load26/60 75pG柱(GE Healthcare)而实现，该柱用25mM Tris/HCl、pH8.0、200mM NaCl、25mM L-精氨酸、2mM EDTA、0.02％叠氮化物平衡。表达并纯化FGF1(氨基酸：16-155)和FGF2(氨基酸9-155)和TNF-R1α。FGFR1ECD的结构完整性通过其结合肝素柱(参见上文)的能力和与FGF1形成复合体而证明。通过尺寸排阻色谱和对SDS-PAGE的后续分析来分析复合体形成。

所有STD-和1D-NMR实验均在标准温度298K下在BRUKER三通道DRX600和BRUKER四通道DRX800光谱仪上进行，并且参照内标3-三甲基-2，2，3，3-四氘核丙酸钠盐(TSP)。通常，NMR样品包含25mM Tris/HCl(pH 8.0)、200mM NaCl、25mM L-精氨酸、2mMEDTA、0.02％叠氮化物(在95％H₂O/5％D₂O中)中的0.5ml蛋白质(20-300mM)。对于蛋白质配体1D STD NMR测量，用1mM配体SSR128129E(100mM DMSO贮存液)和40mM蛋白质记录波谱，其中对单独的蛋白质甲基共振进行弱2s RF辐照。采用标准的BrukerWATERGATE 3-9-19序列进行Water suppression。采用Bruker程序xwin NMR软件处理NMR数据

等温滴定量热(ITC)测量

如先前所述⁴⁵，所有量热实验均在30℃下用VP-ITC滴定量热计(MicroCal Inc.，Northampton，MA)进行。滴定涉及将10μl等分试样的1.25mM SSR每隔4分钟经旋转搅拌器-注射器加入含1.407ml 10-20μM相互作用蛋白(即及其描述的突变体和亚结构域、

FGF1、FGF2)和促滤泡素抑制素(作为阴性对照)的溶液室。保持恒定搅拌速度300rpm并且将数据与MicroCal提供的标准非相互作用单一位点模型拟合，其中将n固定为1.0。所有测量均在10mM HEPES pH7.2、150mM NaCl中进行，并且如先前所述纯化蛋白质(Pellegrini等，2000)。采用“定点诱变试剂盒”(Stratagene)进行突变。

傅里叶变换红外测量

采用配备有AquaSpec flowcell的Bruker Tensor 37FT-IR光谱仪进行傅里叶变换红外测量。使样品室恒温至25℃，将100光谱平均化以得到良好的信噪比。如上所述纯化蛋白质。凝胶过滤后随即将蛋白质在SSR存在或不存在下于相同缓冲液制品(10mM Hepes pH7.2，150mM NaCl)中透析过夜。透析缓冲液样品用于减去本底信号。使用由Bruker提供的OPUS软件包进行分析。如{Barth，2002#60}所述进行结果的解读。

HEK293转染和Erk1/2、PLCγ和FRS2磷酸化研究

用克隆在pcDNA3(Invitrogen)中的hFGFR2IIIca或hFGFR2IIIca-Y328D瞬时或稳定转染(使用FuGENE 6，Roche)HEK293细胞。使稳定转染的细胞在含有G418(400μg/ml)的培养基中生长。在刺激前，将细胞在DMEM(0％血清)中饥饿过夜，并且用所需浓度的SSR128128E预孵育。随后在37℃下，在含或不含1μM SSR或SU5402情况下，用FGF2(浓度介于0.5-10ng/ml之间)刺激细胞5分钟。在用含磷酸酶抑制剂(Roche)的冰冷磷酸盐缓冲盐水洗涤后，将细胞在RIPA缓冲液(Tris 30mM HCl pH 7.5，150mM NaCl，1mMEDTA，1％triton-X，0.5％w/v脱氧胆酸盐，含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂，如制造商(Roche)所述)中裂解。将细胞裂解物在12,000g离心10分钟，并且收集上清液。在Novex聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分离蛋白质并且随后转移至Hybond ECL硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia)上。在用含5％脱脂奶粉的PBS孵育后，在4℃下用以下抗体孵育膜过夜：磷酸-ERK1/2(CST：9101)、磷酸-FRS2(CST：3861)、磷酸-PLCγ(CST：2821)和FGFR2(F0300，Sigma)。

FGFR-转染的BaF/3细胞增殖：

用于本实验的BaF/3细胞的构建已在申请WO2007/080325中详述。

实时定量PCR

使用Trizole试剂(Invitrogen，USA)和RNeasy试剂盒(Qiagen，Germany)从HUVEC分离总RNA，随后使用Quantitect ReverseTranscription试剂盒(Qiagen，Germany)由总RNA制备cDNA。设计人FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和TBP的引物组和FAM^TM染料标记的TaqMan

MGB探针(Eurogentec，Belgium)，并且在7500FastReal-time PCR system(ABI，Germany)上进行PCR反应。分析每一样品与特定标准和无模板对照，重复三次。使用2X TaqMan

UniversalPCR Master Mix，20X Assays-on-demand^TM Gene Expression Assay Mix进行扩增。根据循环阈值(cycle threshold)(CT)方法计算每一样品中mRNA的起始拷贝数。使用TBP mRNA水平，将FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4的mRNA拷贝数标准化。

FGFR1磷酸化测量

将用hFGFR1IIIcα)-凝血素稳定转染的大鼠脂肪垫内皮细胞培养至80-90％汇合并且使其血清饥饿(0.5％FBS)24h。在5分钟内用2ng/ml的FGF2与SSR或DMSO(作为对照)进行刺激。将细胞裂解物在12,000g离心10分钟，并且收集上清液。在琼脂糖缀合的抗-HA抗体存在下在4℃通过将细胞裂解物孵育过夜而使HA-标记的蛋白质免疫沉淀。用1ml裂解缓冲液将免疫复合体洗涤三次；通过用50μl的2x SDS样品缓冲液孵育并煮沸来洗脱蛋白质。在Novex聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分离蛋白质并且随后转移至HybondECL硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia)上。在用含5％脱脂奶粉的PBS孵育后，在4℃下用以下抗体孵育膜过夜：pFGFR(CST：3471)和FGFR1(CST：3472)。

各向异性测量

为评估SSR是否抑制FGF1与其结合袋的结合，我们纯化了不含Fc-标签的FGFR2的整个胞外结构域

并且在含(蓝色)或不含(红色)SSR(1mM)的不同浓度存在下，测量荧光lumio-标签的FGF1(FGF1-lumio；恒定浓度1μM)的翻转速度(作为各向异性的参数)。当将

加入FGF1-lumio时，由于配体/受体复合体尺寸较大，其比单独FGF-lumio的翻转速度慢。摩尔过量大(1000倍)的SSR未能改变复合体的翻转速度，这证实SSR未将FGF与FGFR分离。

HUVEC增殖

收集汇合的HUVEC细胞并且将含0.5％FCS(Hyclone，SH30070.03)、2mM谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸1x(Gibco，11140-035)、MEM丙酮酸钠1x(Gibco，11360-039)的100μl RPMI 1640(Invitrogen，32404-014)中的5 10⁴细胞接种到96-孔胶原I-包被板的每孔中(Beckton Dickinson，354650)，过夜。随后移出培养基并且用50μl含2x FGF2(R&D，234-FSE-025)、FGF4(R&D，235-F4-025)或FGF-19(自制)和50μl 2x SSR(200或600nM)的培养基替换。在37℃下将细胞孵育在CO₂室中达3天并且通过用100μl的″Cell Titer GloLuminescent cell viability″试剂盒(Promega，G7571)定量ATP含量来评估增殖。

HUVEC趋化迁移

收集汇合的HUVEC细胞并且以0.8 10⁶细胞/ml将其重悬于不含FCS、含2mM谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸1x(Gibco，1 1140-035)、MEM丙酮酸钠1x(Gibco，1 1360-039)的RPMI 1640(Invitrogen，32404-014)中。将250μl细胞溶液与4x SSR分配在用于内皮细胞迁移的24-孔BD Biocoat Angiogenesis System(BD Biocoat，354144)的上室中，并且将750μl培养基与67ng/ml的FGF2(R&D，234-FSE-025)、FGF4(R&D，235-F4-025)或FGF-19(自制)分配在上室中。在37℃下将板在CO₂室中孵育22h。随后，移出板插入物并且将其放置在含500μl钙黄绿素(Molecular probes，C-3100)新24-孔板(Falcon，353504)中达90分钟。随后在485nm激发和535nm发射后迁移的细胞发荧光并且通过光度计用downstairs读数测量迁移。

HUVEC体外血管发生

通过在室玻片(Biocoat Cellware胶原，I型，8-孔培养玻片：Becton dickinson 354630)的每一个孔中分配含160μl的1/6稀释的基质胶(生长因子减少的基质胶：Becton dickinson 356230)的胶原I(大鼠Tail collagene，I型：Becton dickinson 354236)来制备。在37℃下进行聚合1h。随后将15.10³HUVEC加入含400μl EBM培养基(CloneticsC3121)+2％FCS+hEGF 10μg/ml的每孔中。在37℃下在CO₂室中将内皮细胞用10ng/ml的FGF2(R&D，133-FB-025)、FGF4(R&D，235-F4-025)或FGF19(R&D，969-FG-025)刺激24h。随后，采用生物成像系统(Imagenia Biocom，Courtaboeuf，France)定量假性小管(pseudotubule)的全长。

HUVEC中AKT磷酸化的蛋白质印迹分析

将在含2％FBS(Clonetics，CC-4101)、来自EGM singlequots试剂盒(Clonetics，CC-4133)的10μg/ml hEGF(Clonetics，CC-4017)、1250ng/ml肝素(Sigma，H3149)和375ng/ml ECGS(BD Biosciences，356006)的2ml EBM培养基(Clonetics，CC-3121)中的HUVE细胞(Promocell，C-12200)以0.5.10⁶细胞接种到35mm胶原I包被的圆盘(BD Biocoat，354456)中。在90％汇合时，将细胞在1.8ml RPMI 1640(Invitrogen，32404-014)、0.5％FCS、2mM谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)、丙酮酸钠(Invitrogen，1 1360-070)中饥饿过夜。这天过后，用200μl包含10x FGF-4(30ng/ml；R&D，235-F4-025)含或不含10x SSR(3μM)的平衡饥饿培养基将细胞刺激10分钟。接着，用冷PBS冲洗细胞并且用75μl含2.5mM正钒酸盐和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P8340)的RIPA裂解细胞。将细胞裂解物在12,000g离心10分钟并且收集上清液。在4-20％Novex Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上分离蛋白质并且随后转移至硝酸纤维素膜(Invitrogen，IB3010-01)上。在用含5％脱脂奶粉的TBS-0.05％吐温80孵育后，在4℃下用在TBS、吐温、1％BSA中稀释1000x的抗-磷酸AKT(Ser473，CST，4058)孵育膜过夜。在用SuperSignalWest Dura Extended Duration Substrate(Thermo Scientific，34076)的化学发光检测之后获取每一点的信号并且采用BioImaging SystemChemigenius2(Syngene)定量点密度。

对细胞的AKT磷酸化ELISA

收集汇合的HUVEC细胞并且将含0.5％FCS(Hyclone，SH30070.03)、2mM谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸1x(Gibco，11140-035)、MEM丙酮酸钠1x(Gibco，11360-039)的50μl RPMI 1640(Invitrogen，32404-014)中的5 10⁴细胞接种到96-孔胶原I-包被平板的每孔中(Beckton Dickinson，354650)，过夜。用100μl包含20ng/mlFGF4和600nM SSR而不含FCS的平衡饥饿培养基刺激细胞5分钟。随后加入50μl含PFA 8％的PBS(Polysciences，18814)，在室温下保持15min分钟并且用200μl PBS洗涤细胞3次，每次2分钟。在室温下，用PBS、triton 0.3％、普通山羊血清0.1％(Zymed，50-062Z)封闭非特异性位点1h并且抽出封闭缓冲液并用在PBS、triton 0.3％中1/500稀释的抗磷酸-AKt(Ser473)抗体(CST，4058)来代替，过夜。随后除去第一抗体并且用200μl PBS洗涤3次，每次2分钟。在室温下，将HRP-缀合的抗-兔第二抗体(CST，7074)在PBS、0.3％triton中1/2000稀释后用于检测AKT磷酸化达2小时。随后用PBS冲洗细胞并且在暗室加入100μl HRP底物(Uptima，UP664781)保持20分钟。用100μl终止缓冲液(Uptima，UPS29590)终止酶促反应并且在450nm测量OD。

FGFR-转染的300-19细胞中的FGF2结合：

按照买方建议用Alexa Fluor 488C5-马来酰亚胺(Invitrogen，A10254)标记FGF2。

将该AF488-FGF2以10ng/ml用于鼠前-B 300-19细胞的结合实验，细胞用含FGFR1或FGFR4构建体的pEF6-V5/His Topo质粒(Invitrogen)转染。在4℃下，将SSR(终浓度为300nM)与细胞在150rpm搅拌下在含10％FCS(Hyclone，SH30070.03)、2mM谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸1x(Gibco，1 1140-035)、MEM丙酮酸钠1x(Gibco，1 1360-039)和150mM一硫代甘油(Sigma，M6145)的RPMI1640(Invitrogen，32404-014)中预孵育20分钟。随后，加入FGF2(终浓度为10ng/ml)保持30分钟并且使用FACS Calibur流式细胞计数仪(Beckton Dickinson)测量结合。还分析了每一条件下的荧光中值。

用各种生长因子的细胞迁移

通过改进的Boyden室测定，采用包含具有聚碳酸酯膜(Costar，Corning Inc.)8μm孔大小transwell可渗透支架的24-孔插入物来评估细胞迁移。将指数增长的细胞在含0.2％FBS的培养基中饥饿16小时并且以5x 10⁵细胞/ml重悬于相同的低血清培养基中。将100μl细胞悬浮液接种于上室中，而将化学引诱物和/或SSR置于下室中。试验的化学引诱物包括：人PDGF-BB、IGF-I、PIGF、EGF，均为100ng/ml，含或不含SSR(1μM)。含10％FBS的培养基用作阳性对照。在37℃下孵育6小时后，用棉花拭子刮落膜上侧的细胞，而下表面上的迁移细胞用含1％低聚甲醛的PBS固定并且用DAPI对细胞核染色，用于使用荧光显微镜的定量。通过获取5张放大倍数为10x的随机图像并且通过计算细胞核的数目进行定量。

PANC02增殖和迁移：

对指数增长的细胞进行细胞增殖分析，所述指数增长的细胞已在100μl含0.2％FBS(Hyclone，SH30070.03)、2mM谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸1x(Gibco，11140-035)、MEM丙酮酸钠1x(Gibco，11360-039)的RPMI 1640(Invitrogen，32404-014)中饥饿16小时并且以4,000细胞/孔接种到96-孔微量培养板中。在暴露于促分裂原和/或SSR达72小时后，根据制造商的说明用CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，Madison，Wisconsin，USA)评估细胞增殖。通过采用包含具有聚碳酸酯膜(Costar，Corning Inc.)的8μm孔径transwell可渗透支架的24-孔插入物，用改进的Boyden室测定来评估细胞迁移。指数增长的细胞在含0.2％FBS的培养基中饥饿16小时并且以5x 10⁵细胞/ml重悬于相同的低血清培养基中。将100μl细胞悬浮液接种于上室中，而将化学引诱物和/或SSR置于下室中。含10％FBS的培养基用作阳性对照。在37℃下孵育6小时后，用棉花拭子刮落膜上侧的细胞，而下表面上的迁移细胞用4％的甲醛固定并且用DAPI对细胞核染色，用于定量。

B9骨髓瘤细胞增殖：

对指数增长的细胞进行细胞增殖分析，所述指数增长的细胞已在含IMDM(Invitrogen，31980048)、0.2％FBS、2mM谷氨酰胺的培养基中饥饿16小时并且以4,000细胞/孔接种到96-孔微量培养板中。在暴露于促分裂原和/或SSR达72小时后，根据制造商的说明用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，Madison，Wisconsin，USA)评估细胞增殖。

Alphascreen SureFire测定

第0天：以10000细胞/孔将HEK293:mVEGFR2wt或HEK293:PDGFRβ细胞铺板(96孔板Cell binding Costar)并且使其贴壁过夜。

第1天：在DMEM(0％血清)中使细胞饥饿最少3小时；制备含50ng/ml VEGF164或PDGF-BB的DMEM(0％血清)混合物并且刺激5或15分钟；在来自SureFire测定(Perkin Elmer)的裂解缓冲液中裂解细胞：在50μl缓冲液中裂解细胞，在室温下搅动平板10分钟并且随后在-20℃冷冻直至再次使用；根据制造商的说明制备裂解缓冲液与蛋白的混合物并且用pERK1/2、总ERK1/2和定制设计的pPLCγ和总PLCγ分析。

实施例1：作为变构、多-FGFR抑制剂的SSR128129E的鉴定

本研究的目的是开发与FGFR胞外结构域(ECD)结合并且抑制FGFR信号转导的低分子量化学化合物。很难设想，小化合物如何能通过对于正构位点的单纯空间位阻与大得多的多肽(即FGF)相互作用，鉴于此，利用多配体结合测定形式以确定任何鉴定的化合物是否通过变构机制而正构地起作用。我们最初开发了高通量闪烁逼迫结合测定法(SPA)以鉴定抑制¹²⁵I-FGF2与FGFR1-ECD结合的化合物，FGFR1-ECD由3个Ig-样结构域D1-3组成，并且与Fc-片段

偶联。在筛选＞20,000种化合物以及化学优化后，一种化合物即SSR128129E(在此简称为″SSR″)抑制¹²⁵I-FGF2结合。在另外的SPA测定中，SSR作为多-FGFR抑制剂，阻遏不同FGF配体与各种FGFR的结合而不抑制具有相关结构同源性或完全不同化学组成的＞100种不同配体与它们的同族受体结合；该发现提示为竞争性(正构)机制或者是以高的负协同性为特征的变构相互作用(Christopoulos和Kenakin，2002)。

变构相互作用的一个标志是“探针-依赖”现象即变构相互作用的大小和方向的变化取决于与调节剂相互作用的正构配体-受体复合体的性质(May等，2007)。为确定SPA中SSR对¹²⁵I-FGF2结合的作用是否取决于铺在人造基底上经工程改造的FGFR/Fc融合蛋白的构型，我们接着通过测量作为各向异性参数的翻转速度，研究SSR是否抑制荧光lumio-标记的FGF1(FGF1-lumio)与不含Fc-标签的纯化FGFR2的ECD

的结合。当将

加入FGF1-lumio时，由于尺寸更大，配体/受体复合体比单独FGF-lumio的翻转速度慢。若SSR抑制配体结合，则翻转速度应再增加。然而，即使在＞1,000倍摩尔过量下，SSR未能改变复合体的翻转速度，表明SSR和FGF1-lumio之间缺乏直接竞争(图5A)。最后，用I¹²⁵-FGF2对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或过表达FGFR1的猪主动脉内皮细胞(PAE-FGFR1)进行的结合测定也表明，当受体以其更天然的构象在完整细胞中表达时，SSR(即使在高μM浓度下)不能抑制I¹²⁵-FGF2与其受体的结合；然而，中和的αFGF2抗体是有效的。在该后一实验范例中，与SPA对比，SSR也未能拮抗另外FGF配体与其它FGFR(即FGF2或FGF4与FGFR2；FGF2与FGFR4)的结合。

总之，这些结果表明SSR对FGF配体结合的抑制活性极大取决于FGFR的构象，并且与依赖于重叠结合结构域空间位阻的单纯竞争性机制不一致。先前已在GPCR领域报道了小化合物变构调节剂依赖于测定条件的差异性地影响正构配体结合的能力(如本文所述针对FGFR)(Litschig等，1999；Price等，2005)。可能的是，通过SSR的结合，

以这样一种构象存在，其使得通过SSR结合传递对¹²⁵I-FGF2亲和力的负变构作用，而不存在Fc标签或在其天然环境中整个完整受体的表达却不如此。

实施例2：SSR是变构和多-FGFR抑制剂

因为通过采用特异性引物的定量PCR(图1A)和RT-PCR检测FGFR基因表达(图1B)和FGFR1变体(图1C)对HUVEC细胞(C-12200，Promocell)的FGFR表达分析仅证明FGF-R4和FGF-R1β3c的表达，所以我们首先使用了HUVE细胞以研究SSR对不同FGFR的拮抗活性。已知FGF19特异性地刺激FGFR4，但FGF4(而不是FGF19)仅激活用FGFR1-hMpl融合蛋白转染的BaF/3细胞中的FGF-R1(图2A)而FGF19不能(图2B)。因此，可分别用FGF4和FGF19刺激HUVEC中的FGFR1和FGFR4。

用FGF2和FGF4而非FGF19可刺激HUVEC增殖(图4A)，表明HUVEC增殖受FGFR1的控制。SSR能抑制FGF2-诱导的HUVEC增殖，表明SSR抑制FGFR1β3c受体(图4B)。用I¹²⁵-FGF2对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或过表达FGFR1的猪主动脉内皮细胞(PAE-FGFR1)进行的结合测定进一步表明，SSR(即使在高μM浓度下)不能抑制I¹²⁵-FGF2与其受体的结合；然而，中和的αFGF2抗体是有效的(图4D)。我们还分析了SSR是否抑制FGFR的自磷酸化，这是FGFR信号转导中的关键步骤。大鼠脂肪垫内皮细胞中表达的FGFR1的免疫沉淀，以及随后的磷酸化FGFR1的免疫印迹表明纳摩尔浓度范围内的SSR极大降低了FGF2-诱导的FGFR1酪氨酸磷酸化(图4C)。值得注意的是，即使在高剂量下，SSR也不完全消除FGFR1酪氨酸磷酸化，使残余水平低(图4C)。分析了SSR对lumio-标记的FGF1结合FGFR2胞外结构域的作用并且SSR不抑制FGF1/FGFR2相互作用(图5A)。同样地，SSR不能抑制FGFR2或FGF2二聚化(图5B和5C)。

HUVEC的迁移还可被FGF2-和FGF4而非FGF19刺激(图6A)。在本文中，SSR还能抑制FGFR1活性，导致FGF2-诱导的HUVEC趋化迁移减少(图6B)。

相反地，FGF2和FGF19可刺激体外血管生成而FGF4无活性，这表明在该测定中FGFR4控制体外血管生成(图7A)。在低纳摩尔范围，SSR阻遏FGF2-诱导的HUVEC血管生成，证明SSR能抑制FGFR4-控制的细胞过程(图7B)。

为评估SSR对FGFR2和对FGFR2-IIIb变体的活性，已使用PANC02细胞的增殖和迁移，因为100ng/ml FGF7(FGFR2-IIIb的特异性配体)可刺激这些细胞应答(图8A和8B)。通过加入100nM SSR阻遏用或不用VEGF的FGF7诱导，表明SSR能抑制FGFR2受体和3b变体(图8A和8B)。

为研究SSR对FGFR3的作用，通过用FGF1(25ng/ml)的刺激测定表达FGFR3_WT或FGFR3_TD(K650E突变诱导的组成性激活的FGFR3变体，即使不存在任何配体的情况下；Truedel等；blood 2006)的B9-骨髓瘤细胞的增殖。尽管B9-FGFR3_WT细胞系可由FGF1诱导并且被0.1μM SSR抑制(图9)，但B9-FGFR3_TD细胞系对SSR不敏感(图9)，表明SSR可抑制FGFR3受体并且证实SSR不对FGFR的激酶结构域起作用。

总之，这些结果表明SSR能抑制所有FGFR同工型(FGFR1、R2、R3和R4)和FGFR变体。

实施例3：SSR不能抑制由其它生长因子诱导的细胞应答

因为SSR差异性地抑制FGF-依赖性信号转导效力，我们接着研究其是否还影响体外FGF依赖性细胞应答。使用HUVEC，SSR抑制FGF2的趋化作用。

SSR不影响由PIGF、EGF、PDGF-BB和IGF(已知这些均激活酪氨酸激酶受体家族成员)诱导的细胞应答(图10)。

实施例4：SSR128129E结合至FGFR胞外区域的Ig-样结构域D3中的变构位点：

因为SSR是多-FGFR抑制剂，我们使用各种(人)FGFR亚型的多肽片段。SSR的饱和转移差异NMR(STD-NMR)波谱表明SSR与FGFR1的ECD

结合(图11A)。这通过一维(1D)-NMR谱的分析而证实，其表明在加入SSR时，信号峰拓宽(图11A)。该结合是特异性的因为用TNF-R1胞外蛋白未观察到结合(图11A)。我们然后使用FGFR的ECD片段以对SSR与三个Ig-结构域之一的结合位点绘图。仅含结构域D3

的片段的1D-NMR测量鉴定了该近-膜结构域中的SSR结合位点(图11B)。事实上，

和

产生相同的信号(宽谱线)，这意味着我们得到了对于这些蛋白质的相同亲和力而

和产生锐谱线(图11B)。采用两个ECD片段即

(由结构域D2和3组成)和

的等温滴定量热法(ITC)表明SSR与FGFR2和FGFR3结合(图11C和11D)。

SSR与FGFR的结构域D3的结合是特异性的，这是由于当用ITC或STD-NMR分析时，该化合物未能与FGF-配体(FGF1和FGF2；图12A、12B和12C)结合。此外，肝素不干扰SSR与FGFR的结合，这是由于在肝素类似物蔗糖八硫酸酯(SOS，图12D)存在或不存在情况下，STD-NMR显示SSR与FGFR可比的信号。

实施例5：SSR的变构结合诱导FGFR的构象变化。

我们然后探究了我们是否可获得由SSR与上述实验鉴定的区域的结合介导的FGFR构象变化的直接证据。因此，我们对FGFR2的ECD片段进行了傅里叶变换红外(FTIR)光谱测量，该片段由结构域结构域D2-3

组成。向任一变体加入SSR导致FTIR光谱的酰胺I带的振幅增加，其中最大值约1,640cm^-1，这与全局构象变化一致(图12A)。

我们接着探究了SSR是否结合至构成D3中正构位点一部分的氨基酸残基或结合至另外的变构位点。起初，我们采用了软件包MOLEGRO、Autodock和YASARA的分子停靠算法以及可得到的结晶学数据。采用两种方法进行的SSR对

的停靠运行(dockingrun)鉴定了两个推定的结合位点，一个集中在His²⁹³附近并且另一个集中在Tyr³²⁸附近；相对于FGF配体结合位点，这些推定结合位点位于受体的反面并且在离正构结合位点约

处形成疏水袋。值得注意的是，两个残基与正构FGF结合袋的残基不重叠。为评估两个推定SSR结合位点的功能相关性，我们使用了分子力场FoldX软件(Schymkowitz等，2005)以设计可减少或消除变构配体结合的突变，但在不扰乱结构的整体构象稳定性情况下：(i)通过用带负电的天冬氨酸替代芳族残基来消除与SSR的疏水相互作用；(ii)

其从SSR的其它推定结合位点除去关键残基；和(iii)

双突变体(称为

)。ITC结合实验表明SSR未能与

结合(图13B和13C)。这些发现与这样的模型一致：其中SSR结合至由正构配体结合位点附近的疏水袋形成的变构位点，并且其中残基Tyr³²⁸对于介导SSR与FGFR2之间的相互作用似乎是关键的。我们还分析了上述突变FGFR2片段的FTIR光谱。这些单个突变或双突变无一诱导FTIR光谱的重大移位，表明这些FGFR变体的整体三维构型是相当的。SSR诱导

和天然

片段的FTIR光谱的可比移位(图14A和14B)，表明将His293突变为Leu293不足够显著或者His293不是全然涉及与SSR的相互作用。与此相反，SSR未能诱导突变的

或

片段FTIR光谱的这一变化(图14C和14D)，表明残基Tyr³²⁸在介导结合SSR时FGFR2的变构构象变化方面确实是关键的。

实施例6：变构SSR结合位点的突变降低SSR对FGFR信号转导的抑制

为评估变构位点在调节FGFR信号转导方面的功能重要性，我们制备了表达功能FGFR2^WT或

变体的稳定HEK293细胞系，并且分析了SSR是否抑制这些细胞系中FGF2对ERK1/2的活化。免疫印迹显示，相对于SSR在FGFR2^WT细胞的抑制潜能(IC₅₀值：28±12nM)，SSR对

细胞中FGF2诱导的ERK1/2磷酸化的抑制降低(IC50值：121±30nM)(图15A和15B)，表明该变构位点不仅与体外SSR与纯化FGFR2片段的结合相关，而且与其对细胞内(in cellulo)生理条件下FGFR2信号转导的抑制活性也相关。Y³²⁸D突变不会完全消除SSR的抑制活性，此事实可表明当FGFR2在生理环境下表达时，除Tyr³²⁸之外还有其他邻近残基促成SSR的结合。

实施例7：SSR是FGFR-依赖性磷酸-信号转导的″偏袒″抑制剂

为评估SSR对FGFR-控制的磷酸-信号转导的作用，已用FGFR2转染HEK293细胞并且将SSR与已发表的FGFR酪氨酸激酶抑制剂SU5402(其被描述为抑制FGFR-依赖性FRS2和PLCγ级联)相比较，用蛋白质印迹研究FGFR自磷酸化后两条主要的途径PLCγ和FRS2(Zhen等，Oncogene 2007)。在此类细胞中，FGF诱导FRS2、Erk1/2和PLCγ磷酸化。SU5402阻遏所有这些诱导而SSR仅抑制FRS2途径(图16A和16B)，说明用SSR获得的偏袒拮抗。更一般地，这些磷酸化差异可用作报道物以评估变构调节剂。

实施例8：寻找酪氨酸激酶受体的胞外结构域中受挫结构域的方法

实施例5中所述构象变化的可能分子机制之一，涉及受挫结构域(参见上述定义)的存在情况。当采用AGADIR(螺旋稳定性预测算法；

V.& Serrano，L.1994)分析人FGFR2的结构域D2和D3时，我们鉴定了从Tyr³¹⁹至Arg³³⁰的残基序列，(因而包括关键残基Tyr³²⁸)，作为易于经历从β-折叠至α-螺旋转变的唯一区域。与此理论模型相一致的是，如FTIR分析所检测的，用天冬氨酸代替Tyr³²⁸(其被AGADIR预测可降低α螺旋性并且因而减少结构域的受挫)确实阻止了所观察到的构象变化。另外的生长因子受体(除其它TKR之外还包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3和PDGFRβ)的类似序列分析，包含相对高的AGADIR分数区域，通过将该区域的关键残基突变为天冬氨酸可使分数逆转。我们拥有一些VEGFR2的初步数据，其中将K609D和K648D突变导致用VEGF刺激时ERK1/2信号转导减弱。

实施例9：通过SEC-LC/MS亲和力筛选FGF-R变构调节剂以及经鉴定化合物的活性评估

SEC-LC/MS方法是用于亲和力筛选的分析技术，其依赖于联机偶联的二维系统：与高效液相色谱联合的尺寸排阻色谱和随后用于检测的电喷射离子化-飞行时间质谱。

其基于一些化合物与可溶多肽(肽、蛋白结构域或全长蛋白质)相互作用的能力。将小化合物库与目标肽混合之后，肽-配体复合体诱导质量移位，通过尺寸排阻色谱使未结合和结合的小化合分离。随后，复合体解离并且采用精确测量质量的高分辨率LC/ESI-TOF检测结合剂(例如用Waters LCT Premier质谱仪)。数据去卷积算法使得经质量检测分析鉴定结合的分子。

为鉴定FGF-R变构调节剂，该技术可应用于不同(天然或突变的)FGF-R的胞外结构域。天然形式允许检测所有胞外结构域的结合剂。实现变构调节剂筛选的另一方式可通过采用与SSR128129结合位点邻近的FGF-R2螺旋的″开放″形式来进行，其用稳定α-螺旋的突变Tyr328Arg-Ile329Lys获得，致使对SSR128129结合敏化。在该情形中，该突变的FGF-R2可替代WT FGF-R2。类似的策略可用于对FGF-R1、FGF-R3或FGF-R4(在对应于FGF-R2中Tyr328和Ile329氨基酸处具有突变)进行筛选。Tyr328(FGF-R2)处的突变形式或其它FGF-R中相应突变的氨基酸可用于反筛选(counterscreen)。因为SSR128129未能结合在FGF-R2(在邻近疏水袋的Tyr328Asp处突变)上，该突变形式可用于排除一部分不与FGF-R2上靶袋相互作用的化合物。

在所有情形中，该策略导致鉴定能结合在目标肽中靶袋上的分子。下一步，须评估细胞作用。首先，选择的化合物必须抑制FGF-诱导的途径，例如HUVEC细胞中的AKT磷酸化，如蛋白质印迹实验中用SSR观察到的(图17A和17B)。HUVEC细胞中AKT的磷酸化状态可用对细胞的ELISA方法测量。内部开发该测定形式，用于直接检测各种细胞例如HUVEC中AKT磷酸化并且允许检测SSR对FGF4-刺激的HUVEC的作用(图17C)。FGFR变构调节剂的典型特征是它们不能竞争结合FGF。为评估这一特征，详尽阐述对用FGFR转染的鼠前-B 300-19细胞进行的结合测定。通过流式细胞分析，10ng/ml AlexaFluor488-标记的FGF2与300-19细胞(其天然不表达任何FGFR)上表达的FGFR1或FGFR4结合，并且300nM的SSR不能竞争该FGFR1或FGFR4结合(图17D)。

实施例10：VEGF-R2受体中推定受挫区域的鉴定以及推定受挫区域的突变分析

将开发用于FGF-R的策略应用于另一受体TK：VEGF-R2或KDR。作为鉴定可包含推定变构靶位点的区域的初步方法，我们利用软件程序AGADIR¹，使用可得到的鼠VEGF-R2受体的一级氨基酸序列(Entrez登记号NP_034742.2)来鉴定易于经历结构变化(例如β-折叠至α-螺旋转变)的区域。这产生若干具有较高螺旋倾向的区域，但应预期Ig-结构域结构中主要是β-折叠结构。Agadir分析的结果示于图18A。

随后，在用天冬氨酸残基(D)将来自VEGF-R2的每一氨基酸相继经计算机突变后，我们再次分析了AGADIR分数并且选择那些突变(i)其导致的螺旋倾向变化最大(最负)和(ii)其位于那些与跨膜结构域最近的Ig-结构域中。在这些中，两个位于mVEGF-R2的结构域IgD6中的残基K609D和K648D(图18B)，产生的螺旋倾向减小最大并且进一步用于细胞内分析(参见进一步的实施例12)。

实施例11：鉴定PDGF-Rβ受体中推定受挫区域以及推定受挫区域的突变分析

作为鉴定可包含推定变构靶位点的区域的初步方法，我们利用软件程序AGADIR¹，使用可得到的人PDGFRβ受体的一级氨基酸序列(Entrez登记号NP_002600.1)来鉴定易于经历结构变化(例如β-折叠至α-螺旋转变)的区域。这产生若干具有较高螺旋倾向的区域，但应预期Ig-结构域结构中主要是β-折叠结构(图19)。随后，在用天冬氨酸残基(D)将来自PDGFRβ的每一氨基酸相继经计算机突变后，我们再次分析了AGADIR分数并且选择那些突变(i)其导致的螺旋倾向变化最大(最负)和(ii)其位于那些与跨膜结构域最近的Ig-结构域中。在这些中，两个位于hPDGFRβ的结构域IgD3中的残基L383D和K387D，产生的螺旋倾向减小最大(图19)。

实施例12：鉴定诱导″偏袒″信号转导的化合物的筛选方法

VEGF或PDGF-BB的结合诱导各自同族受体的二聚化，其自身诱导细胞内激酶结构域的磷酸化。随后两条主要的途径(与FGF-R偏袒拮抗物SSR一致的目标途径)包括ERK1/2途径(图21A和21C)和PLCγ途径(图示于图20)被激活。在存在或不存在可能抑制剂的情况下，通过抑制信号转导途径中的仅一条，测量每一条途径的激活从而鉴定诱导″偏袒″信号转导的化合物。

对于VEGF-R2，使实施例10中鉴定的两个突变VEGFR2受体(VEGFR2^K609D和VEGFR2^K648D)和VEGF-R2野生型形式稳定表达于HEK293细胞中。通过激活ERK1/2磷酸化，VEGFR2^WT受体显著应答。尽管VEGFR2^K609D突变体经ERK1/2的信号转导能力降低(但足以用于反筛选测定)，但VEGFR2^K648D突变体失去了该能力。这些结果总结于图21A。

对于PDGF-Rβ，按照Alphascreen surfire程序，用不含添加剂(″0″)、含10％胎牛血清(10％FBS)、50ng/ml PDGF-BB(50ng/ml)或1ng/ml PDGF-BB(1ng/ml)的培养基刺激过表达hPDGFRβ细胞的HEK293细胞(图21B)。在图21C中，左边组再次表示用于检测刺激时活化的或总体的ERK1/2蛋白的混合物的示意图。右边组表示按照alphascreen surefire检测方法测量的在用PDGF-BB刺激细胞后所检测到的测量结果。这显示当用10％FBS或50ng/ml PDGF-BB刺激细胞时，可检测到明显的信号，而用或不用1ng/ml PDGF-BB刺激下，存在弱得多的信号。用类似的方式测量PLCγ应答。

用于鉴定对VEGF-R2或PDGF-Rβ诱导″偏袒″信号转导的化合物(例如SSR对FGF-R)的筛选方法可基于Erk1/2和PLCγ应答。在存在和不存在候选变构抑制剂下，比较ERK1/2和PLCγ应答可鉴定作为偏袒抑制剂的化合物：仅抑制两条信号转导途径中的一条。VEGF-R2或PDGF-Rβ的突变构建体可用于反筛选测定以证实已鉴定的变构调节剂的作用机制。对突变的受体，化合物必须丧失它们的受体调节能力。

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Claims

1.变构抑制剂结合位点，其源自酪氨酸激酶受体的胞外结构域。

2.权利要求1的变构抑制剂结合位点，其中所述结合位点源自具有Ig结构域的酪氨酸激酶受体。

3.权利要求1或2的变构抑制剂结合位点，其中抑制剂与所述结合位点的结合诱导偏袒拮抗。

4.前述权利要求中任一项的变构抑制剂结合位点，其中所述结合位点包含受挫结构域。

5.前述权利要求中任一项的变构抑制剂结合位点，其中所述酪氨酸激酶受体是成纤维细胞生长因子受体、血管内皮生长因子受体或血小板衍生生长因子受体或它们的同源物、旁系同源物或直向同源物。

6.前述权利要求中任一项的变构抑制剂结合位点，其存在于SEQ ID NO.1中：

His Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr

Leu Lys Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile

Glu Val Leu Tyr Ile Arg Asn

或呈现与SEQ ID NO.1至少70％、80％、90％或95％同源性的序列中。

7.权利要求4的受挫结合位点，其存在于SEQ ID NO.2中：

Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg

Asn

或呈现与SEQ ID NO.2至少70％、80％、90％或95％同源性的序列中。

8.权利要求1-6的变构抑制剂结合位点用于诱导酪氨酸激酶受体途径中偏袒拮抗的用途。

9.权利要求1-7的变构抑制剂结合位点用于筛选小化合物抑制剂的用途。

10.用于鉴定酪氨酸激酶受体的胞外结构域中变构抑制剂结合位点的方法，其包括筛查所述胞外结构域中的受挫结构域。

11.用于鉴定与权利要求1-7的酪氨酸激酶受体的胞外结构域中变构抑制剂位点结合的小化合物变构抑制剂的方法，其包括比较由两个不同下游途径诱导的至少两种不同报道物，所述下游途径依赖于所述酪氨酸激酶受体的激活/抑制。

12.用于鉴定RTK的变构抑制剂的方法，其包括以下步骤：

a)使RTK的变构结合位点与小化合物变构抑制剂候选化合物接触；

b)测量至少两个依赖于所述酪氨酸激酶受体激活/抑制的下游途径的变化；

c)比较关于至少两个不同下游途径的至少一个报道物状态的变化，所述下游途径依赖于所述酪氨酸激酶受体的激活/抑制。

其中当与受体的配体结合结构域结合的配体存在下，至少一个下游途径被抑制而至少另一个下游途径未受影响时，鉴定出变构抑制剂。

13.权利要求12的用于鉴定RTK的变构抑制剂的方法，其中所述两个不同下游途径对应于ERK1/2信号转导途径和PLCγ信号转导途径。

14.权利要求1-6中任一项的与变构结合位点结合的化合物，其中所述化合物是小分子。