JP6246030B2 - 病理染色装置及び病理染色方法 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、病理染色装置及び病理染色方法に関する。

病理検査において免疫染色が利用されている。免疫染色は、検体に含まれる特定の抗原を抗体を利用して検出する方法である。抗原の発現の有無や多寡から、病変の詳しい病態を明らかにすることができる。免疫染色は、癌のサブタイプ分類や治療方針の最適化に利用されている。

免疫染色の結果は、色の濃さや染色された細胞又は組織の割合などにより評価される染色強度に基づいて決定される。染色強度は、抗原量、反応時間、及び温度に依存するが、実質的には検査に用いる抗体の活性（抗原に結合する能力）に影響される。そのため、同じ病理組織標本を、同じ抗原量、反応時間、及び温度で染色しても、抗原の活性が異なれば、染色強度が異なってしまう。染色強度の違いは診断のばらつきを引き起こし、誤った治療方針を立案してしまう恐れがある。

特開２００８−２０９４１９号公報 特開２０１２−１４１２８７号公報 特開２０１２−５８２６１号公報 特開２００８−１９７１１５号公報 特開平６−５８９２６号公報 特表２０１０−５２６３５１号公報 特表２００８−５３８６１１号公報 特表２００８−５３７１５０号公報 特表２００８−５３７１４９号公報 特表２００７−５１０８９３号公報 特表２００５−５２４０６８号公報

目的は、染色結果の信頼性を向上することが可能な病理染色装置及び病理染色方法を提供することにある。

本実施形態に係る病理染色装置は、検体を染色するための第１染色機構と、陽性染色対照標本を染色するための第２染色機構と、前記検体の染色に並行して前記陽性染色対照標本を染色するように前記第１染色機構と前記第２染色機構とを制御する機構制御部と、前記陽性染色対照標本を繰り返し光学撮影し、前記陽性染色対照標本に関する光学画像を繰り返し発生する光学撮影部と、前記繰り返し発生される光学画像の画素の画素値を閾値に対して比較し、前記画素値が前記閾値に到達した場合、前記画素値が前記閾値に到達したことを示す出力信号を発生する画像処理部と、を具備する。

本実施形態に係る病理染色装置の構成を示す図。 本実施形態に係る病理染色処理の典型的な流れを示す図。 本実施形態に係る抗原抗体反応を模式的に示す図。 本実施形態に係る検体及び陽性染色対照標本の反応系の外観を模式的に示す図。 図１のシステム制御部による制御のもとに行われる、本実施形態に係る検体染色処理の典型的な流れを示す図。 陽性染色対照標本を被写体とする光学画像を模式的に示す図。 穴領域が消去された光学画像を模式的に示す図。 光学画像に含まれる陽性染色対照標本領域と背景領域との標準的な明度の時間変化を示す図。 光学画像に含まれる比較対象領域の明度の典型的な時間変化を示す図。 変形例に係る病理染色装置の構成を示す図。

以下、図面を参照しながら本実施形態に係わる病理染色装置及び病理染色方法を説明する。

図１は、本実施形態に係る病理染色装置の構成を示す図である。図１に示すように、病理染色装置は、システム制御部１１を中枢として、検体用染色機構１３、検体用洗浄機構１５、ポジコン用染色機構１７、ポジコン用洗浄機構１９、光学撮影部２１、画像処理部２３、機構制御部２５、操作部２７、表示部２９、及び記憶部３１を有する。

検体用染色機構１３は、検体を染色するための染色機構である。検体は、検査対象の病理組織標本である。病理組織標本としては、如何なる部位の細胞組織が用いられても良い。例えば、細胞組織としては血液細胞や皮膚細胞、骨細胞、筋細胞、癌細胞等のあらゆる細胞が利用可能である。染色としては、抗原抗体反応を利用した免疫染色が用いられる。検体用染色機構１３は、機構制御部２５からの制御に従って作動する。検体用染色機構１３の詳細については後述する。

検体用洗浄機構１５は、検体を洗浄液で洗浄するための洗浄機構である。検体が洗浄されることにより検体の染色が終了される。検体用洗浄機構１５は、機構制御部２５からの制御に従って作動する。洗浄液としては、例えば、純水や生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）等が用いられると良い。検体用洗浄機構１５の詳細については後述する。

ポジコン用染色機構１７は、陽性染色対照標本（ポジティブ・コントロール・サンプル：以下、ポジコンと呼ぶことにする）を染色するための染色機構である。ポジコンとしては、過去に染色された病理組織標本であって、十分に強く染色され、また、予後などの病理検査以外の結果からも、その染色結果が正しいことが裏付けられている病理組織標本が用いられる。ポジコンとしては、過去に染色された時に強陽性の結果が得られたものが用いられる。ポジコン用染色機構１７は検体用染色機構１３による染色方法と同一の方法によりポジコンを染色する。ポジコン用染色機構１７は、機構制御部２５からの制御に従って作動する。洗浄液としては、検体用洗浄機構１５に用いられている洗浄液と同一のものが用いられると良い。ポジコン用染色機構１７の詳細については後述する。

ポジコン用洗浄機構１９は、ポジコンを洗浄液で洗浄するための洗浄機構である。検体が洗浄されることによりポジコンの染色が終了される。ポジコン用洗浄機構１９は、機構制御部２５からの制御に従って作動する。ポジコン用洗浄機構１９の詳細については後述する。

光学撮影部２１は、ポジコン用染色機構１７により染色されているポジコンを光学的に撮影する。光学撮影部２１は、ポジコンを繰り返し光学撮影し、ポジコンに関する光学画像を繰り返し発生する。光学撮影部２１としては、例えば、光学カメラが用いられる。

画像処理部２３は、光学撮影部２１により繰り返し発生される光学画像の画素の画素値を閾値に対して比較する。画像処理部２３は、画素値が閾値に到達した場合、その旨の信号（以下、停止信号と呼ぶ）を即時的に発生する。

機構制御部２５は、検体用染色機構１３において検体を染色し、ポジコン用染色機構１７においてポジコンを染色するように検体用染色機構１３とポジコン用染色機構１７とを制御する。より詳細には、機構制御部２５は、検体用染色機構１３における検体の染色に並行してポジコン用染色機構１７においてポジコンを染色するように検体用染色機構１３とポジコン用染色機構１７とを同期的に制御する。また、機構制御部２５は、検体とポジコンとを洗浄するように検体用洗浄機構１５とポジコン用洗浄機構１９とを同期的に制御する。この際、画像処理部２３により停止信号が発生された場合、機構制御部２５は、検体を洗浄するために検体用洗浄機構１５を制御する。

操作部２７は、入力機器によるユーザからの各種指令や情報入力を受け付ける。入力機器としては、キーボードやマウス、各種スイッチ等が利用可能である。

表示部２９は、染色条件の設定画面等を表示機器に表示する。また、表示部２９は、画像処理部２３により停止信号が発生された場合、検体の洗浄を促すメッセージを表示機器に表示しても良い。表示機器としては、例えばＣＲＴディスプレイや、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ、プラズマディスプレイ等が適宜利用可能である。

記憶部３１は、種々の情報を記憶するＨＤＤ（hard disk drive）等の記憶装置である。また、記憶部３１は、本実施形態に係る病理染色プログラム等を記憶する。

システム制御部１１は、病理染色装置の中枢として機能する。システム制御部１１は、本実施形態に係る病理染色プログラムを記憶部３１から読み出し、当該病理染色プログラムに従って各種構成要素を制御し、病理染色処理を実行する。

次に、本実施形態に係る病理染色装置の動作について詳細に説明する。

図２は、本実施形態に係る病理染色処理の典型的な流れを示す図である。なお、病理組織標本としては、抗原性保持及び形態保持のためにホルマリンで固定された組織塊から切り出された組織切片が使用される。また、組織塊は予め包理材により包理されているものとする。包理材としては、パラフィンや樹脂等が利用可能であるが、以下の説明を具体的に行うためパラフィンが用いられるとする。検体とポジコンとは別個の組織塊から切り出される。検体とポジコンとは別個のスライドガラスに載置される。また、図２の各工程には洗浄工程が存在するが説明の簡単のため省略する。また、図２の病理染色処理は検体とポジコンとに対して同時並行で行われる。

図２に示すように、まず、脱パラフィンが行われる（ステップＳＡ１）。脱パラフィンは、水溶性を有する染色液を検体及びポジコンに浸透しやくするため、疎水性を有するパラフィンを検体及びポジコンから除去する工程である。パラフィンは、例えば、エタノールとキシレンとを検体及びポジコンに添加することにより除去される。

ステップＳＡ１が行われると脱マスク処理が施される（ステップＳＡ２）。ホルマリン固定により蛋白質等に架橋が生成され抗原決定基にマスクが生起される。脱マスク処理は、マスクを除去して抗原の抗体結合部位を露出するために行われる。脱マスク処理は、検体及びポジコンに熱を与えたり、蛋白質分解酵素を添加したりすることに行われる。

ステップＳＡ２が行われると内因性ペルオキダーゼが阻止される（ステップＳＡ３）。検体及びポジコンには内因性のペルオキシダーゼが存在する。ペルオキシダーゼは、抗原抗体反応を検出する酵素等に反応して抗原の同定を阻害する。そのため、一次抗体の添加の前段において内因性のペルオキシダーゼを除去する必要がある。例えば、過酸化水素水、メタノールと過酸化水素水との混合液、又はブロッキング試薬を検体及びポジコンに添加することにより内因性ペルオキダーゼが除去される。

ステップＳＡ３が行われるとブロッキング処理が行われる（ステップＳＡ４）。ブロッキング処理は、二次抗体の添加による非特異的な発色を防止するために行われる。例えば、二次抗体を産生した動物と同一種の正常血清を検体及びポジコンに反応させ、二次抗体の標的蛋白質以外の蛋白質がブロックされる。

ステップＳＡ４が行われると第１の抗原抗体反応が行われる（ステップＳＡ５）。第１の抗原抗体反応は一次抗体を検体及びポジコンに添加することにより行われる。一次抗体としては、抗原の標的に特異的に結合する抗体が用いられる。一次抗体には標識が修飾されていないものとする。

ステップＳＡ５が行われると第２の抗原抗体反応が行われる（ステップＳＡ６）。第２の抗原抗体反応は二次抗体を検体及びポジコンに添加することにより行われる。二次抗体としては、一次抗体に結合可能であり、標識が修飾された抗体が用いられる。標識としては、発色反応で用いる酵素が用いられる。

ステップＳＡ６が行われると発色が行われる（ステップＳＡ７）。検体及びポジコンの各々に結合された二次抗体に標識として修飾された酵素に対応する基質を発色反応させ、この酵素と基質との反応により発色する。

ここで、図３を参照しながら、抗原抗体反応について詳細に説明する。なお、図３においては、病理組織標本として癌細胞が用いられているとする。また、一次抗体として、特定の癌細胞に発現する抗原Ａに特異的に結合する抗体が用いられるとする。一次抗体（抗Ａ抗体）には二次抗体が結合される。図３（ａ）に示すように、癌細胞が抗原Ａを発現している場合、抗原Ａに抗Ａ抗体が結合する。従って二次抗体が基質と反応して発色することにより、抗原Ａの存在を検出することができる。一方、図３（ｂ）に示すように、癌細胞が抗原Ａを発現せずに抗原Ｂを発現している場合、抗Ａ抗体は抗原Ｂに結合しない。従って、第１の抗原抗体反応後の洗浄工程により抗Ａ抗体が流され、癌細胞に二次抗体が結合されず、基質を添加しても発色反応が発生することはない。従って、抗原Ａに特異的に結合する一次抗体と当該一次抗体に結合する二次抗体とを添加することにより、抗原Ａを発現している癌細胞を特異的に検出することができる。

ステップＳＡ７が行われると核染色が行われる（ステップＳＡ８）。検体及びポジコンに核染色液が添加され、対比染色として検体及びポジコンの細胞の核が染色される。核染色液としては、例えば、ヘマトキシリンやメチルグリーン等が用いられる。

ステップＳＡ８が行われると脱水が行われる（ステップＳＡ９）。例えば、検体及びポジコンにエタノールを浸すことにより脱水が行われる。

ステップＳＡ９が行われると透徹が行われる（ステップＳＡ１０）。例えば、検体及びポジコンにキシレンを浸すことにより透徹が行われる。

以上で本実施形態に係る病理染色処理の動作例が終了する。

次に、本実施形態に係る病理染色装置における検体染色処理の詳細について説明する。本実施形態に係る検体染色処理は、図２のステップＳＡ５、ＳＡ６、及びＳＡ７を含むとする。まず、本実施形態に係る検体及びポジコンの反応系の外観について説明する。図４は、検体及びポジコンの反応系の外観を模式的に示す図である。図４に示すように、検体及びポジコンの反応系は、検体用染色機構１３、検体用洗浄機構１５、ポジコン用染色機構１７、及び光学撮影部２１を有する。本実施形態に係る検体用染色機構１３とポジコン用染色機構１７とは滴下式であるものとする。

図４に示すように、検体用染色機構１３にはスライドガラスＳＧ１が設置される。スライドガラスＳＧ１には検体が載置されている。また、検体用染色機構１３は、一次抗体を含む溶液（以下、一次抗体液と呼ぶ）を吐出するためのノズル（以下、一次抗体ノズルと呼ぶ）５１、二次抗体を含む溶液（以下、二次抗体液と呼ぶ）を吐出するためのノズル（以下、二次抗体ノズルと呼ぶ）５３、二次抗体に修飾された標識（酵素）に反応する基質を含む溶液（以下、基質液と呼ぶ）を吐出するためのノズル（以下、基質ノズルと呼ぶ）５５を有する。一次抗体ノズル５１は、ホース等の流路を介してポンプ（以下、一次抗体ポンプと呼ぶ）５７に接続されている。一次抗体ポンプ５７は、一次抗体液を収容するタンク（以下、一次抗体タンクと呼ぶ）５９にホース等の流路を介して接続されている。一次抗体ポンプ５７は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて一次抗体タンク５９から所定量の一次抗体液を吸引し、吸引された一次抗体液を一次抗体ノズル５１を介して検体が載置されたスライドガラスＳＧ１に吐出する。同様に、二次抗体ノズル５３は、ホース等の流路を介してポンプ（以下、二次抗体ポンプと呼ぶ）６１に接続されている。二次抗体ポンプ６１は、二次抗体液を収容するタンク（以下、二次抗体タンクと呼ぶ）６３にホース等の流路を介して接続されている。二次抗体ポンプ６１は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて二次抗体タンクから所定量の二次抗体液を吸引し、吸引された二次抗体液を二次抗体ノズル５３を介してスライドガラスＳＧ１に吐出する。同様に、基質ノズル５５は、ホース等の流路を介してポンプ（以下、基質ポンプと呼ぶ）６５に接続されている。基質ポンプ６５は、基質液を収容するタンク（以下、基質タンクと呼ぶ）６７にホース等の流路を介して接続されている。基質ポンプ６５は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて基質タンク６７から所定量の基質液を吸引し、吸引された基質液を基質ノズル５５を介してスライドガラスＳＧ１に吐出する。

ポジコン用染色機構１７には、検体用染色機構１３と同様に、ポジコンが載置されたスライドガラスＳＧ２が設置される。スライドガラスＳＧ２にはポジコンが載置されている。また、検体用染色機構１３は、検体用染色機構１３と同様に、一次抗体液を吐出するための一次抗体ノズル７１と二次抗体液を吐出するための二次抗体ノズル７３、基質液を吐出するための基質ノズル７５を有する。

一次抗体ノズル７１は、ホース等の流路を介して一次抗体ポンプ７７に接続されている。一次抗体ポンプ７７は、一次抗体タンク５９にホース等の流路を介して接続されている。一次抗体タンク５９は、検体用染色機構１３の一次抗体ノズル５１とポジコン用染色機構１７の一次抗体ノズル７１とで共用される。一次抗体ポンプ７７は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて一次抗体タンク５９から所定量の一次抗体液を吸引し、吸引された一次抗体液を一次抗体ノズル７１を介して、ポジコンが載置されたスライドガラスＳＧ２に吐出する。このように、一次抗体ノズル５１と一次抗体ノズル７１とで一次抗体タンク５９を共用することで、検体とポジコンとに略同一の液性の一次抗体液を添加することが可能となる。なお、検体への一次抗体液とポジコンへの一次抗体液との液性に厳密な同一性を要求しないのであれば、一次抗体ノズル５１と一次抗体ノズル７１とを別個の一次抗体タンク５９に接続しても良い。

同様に、二次抗体ノズル７３は、ホース等の流路を介して二次抗体ポンプ７９に接続されている。二次抗体ポンプ７９は、二次抗体液を収容する二次抗体タンク６３にホース等の流路を介して接続されている。二次抗体タンク６３は、検体用染色機構１３の二次抗体ノズル５３とポジコン用染色機構１７の二次抗体ノズル７３とで共用される。二次抗体ポンプ７９は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて二次抗体タンク６３から所定量の二次抗体液を吸引し、吸引された二次抗体液を二次抗体ノズル７３を介してスライドガラスＳＧ２に吐出する。このように、二次抗体ノズル５３と二次抗体ノズル７３とで二次抗体タンク６３を共用することで、検体とポジコンとに略同一の液性の二次抗体液を添加することが可能となる。なお、検体への二次抗体液とポジコンへの二次抗体液との液性に厳密な同一性を要求しないのであれば、二次抗体ノズル５３と二次抗体ノズル７３とを別個の二次抗体タンク６３に接続しても良い。

同様に、基質ノズル７５は、ホース等の流路を介してポンプ（以下、基質ポンプと呼ぶ）８１に接続されている。基質ポンプ８１は、基質液を収容するタンク（以下、基質タンクと呼ぶ）６７にホース等の流路を介して接続されている。基質タンク６７は、検体用染色機構１３の基質ノズル５５とポジコン用染色機構１７の基質ノズル７５とで共用される。基質ポンプ８１は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて基質タンク６７から所定量の基質液を吸引し、吸引された基質液を基質ノズル７５を介してスライドガラスＳＧ２に吐出する。このように、基質ノズル５５と基質ノズル７５とで基質タンク６７を共用することで、検体とポジコンとに略同一の液性の基質液を添加することが可能となる。なお、検体への基質液とポジコンへの基質液との液性に厳密な同一性を要求しないのであれば、基質ノズル５５と基質ノズル７５とを別個の基質タンク６７に接続しても良い。

検体用染色機構１３には検体用洗浄機構１５が設けられている。検体用洗浄機構１５は、洗浄液を吐出するためのノズル（以下、洗浄ノズルと呼ぶ）９１を有する。洗浄ノズル９１は、ホース等の流路を介してポンプ（以下、洗浄ポンプと呼ぶ）９３に接続されている。洗浄ポンプ９３は、洗浄液を収容するタンク（以下、洗浄タンクと呼ぶ）９５にホース等の流路を介して接続されている。洗浄ポンプ９３は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて洗浄タンク９５から所定量の洗浄液を吸引し、吸引された洗浄液を洗浄ノズル９１を介してスライドガラスＳＧ１に吐出する。

同様に、ポジコン用染色機構１７にはポジコン用洗浄機構１９が設けられている。ポジコン用洗浄機構１９は、洗浄液を吐出するための洗浄ノズル９７を有する。洗浄ノズル９７は、ホース等の流路を介して洗浄ポンプ９９に接続されている。洗浄ポンプ９９は、洗浄液を収容する洗浄タンク１０１にホース等の流路を介して接続されている。洗浄ポンプ９９は、機構制御部２５からの吐出信号の供給を受けて洗浄タンク１０１から所定量の洗浄液を吸引し、吸引された洗浄液を洗浄ノズル９７を介してスライドガラスＳＧ２に吐出する。

ポジコン用染色機構１７には光学カメラ２１が設けられている。光学カメラ２１はポジコンが載置されたスライドガラスが撮影視野に含まれるように位置決めされる。光学カメラ２１は、ポシコンの染色中に繰り返し光学撮影し、ポジコンに関する光学画像を繰り返し発生する。光学画像は画像処理部２３に供給される。

上記の通り、本実施形態に係る病理染色装置は、検体用染色機構１３の他にポジコン用染色機構１７を装備している。本実施形態に係る病理染色装置は、検体用染色機構１３による検体の染色に並行して、ポジコン用染色機構１７によりポジコンを染色し、検体の染色の終了タイミングをポジコンの染色強度に基づいて決定する。

次に、システム制御部１１による制御のもとに行われる、本実施形態に係る検体染色処理の動作例について説明する。図５は、システム制御部１１による制御のもとに行われる本実施形態に係る検体染色処理の典型的な処理の流れを示す図である。

まずシステム制御部１１は、機構制御部２５に検体の染色とポジコンの染色とを同時に開始させる（ステップＳＢ１）。ステップＳＢ１において機構制御部２５は、検体用染色機構１３を作動し、検体が載置されたスライドガラスに、一次抗体液、二次抗体液、及び基質液を順番に滴下させ、それに並行して、ポジコンが載置されたスライドガラスに、一次抗体液、二次抗体液、及び基質液を順番に滴下させる。

より詳細には、機構制御部２５は、図２のステップＳＡ５において検体用染色機構１３の一次抗体ポンプ５７とポジコン用染色機構１７の一次抗体ポンプ７７とに同時に吐出信号を供給する。一次抗体ポンプ５７と一次抗体ポンプ７７とは個別に一次抗体タンク５９から所定量の一次抗体液を吸引する。一次抗体ポンプ５７は、検体が載置されたスライドガラスＳＧ１に一次抗体液を一次抗体ノズル５１を介して吐出し、一次抗体ポンプ７７は、ポジコンが載置されたスライドガラスＳＧ２に一次抗体液を一次抗体ノズル７１を介して吐出する。所定時間の経過後、機構制御部２５は、検体用洗浄機構１５の洗浄ポンプ９３とポジコン用洗浄機構１９の洗浄ポンプ９９とに吐出信号を供給し、洗浄ポンプ９３は、スライドガラスＳＧ１に洗浄ノズル９１を介して洗浄液を吐出し、洗浄ポンプ９９は、スライドガラスＳＧ２に洗浄ノズル９７を介して洗浄液を吐出する。廃液は図示しない廃液タンクに流入する。

次に、機構制御部２５は、図２のステップＳＡ６において検体用染色機構１３の二次抗体ポンプ６１とポジコン用染色機構１７の二次抗体ポンプ７９とに同時に吐出信号を供給し、二次抗体ポンプ６１は、検体が載置されたスライドガラスＳＧ１に二次抗体液を吐出し、二次抗体ポンプ７９は、ポジコンが載置されたスライドガラスＳＧ２に二次抗体液を吐出する。所定時間の経過後、機構制御部２５は、検体用洗浄機構１５の洗浄ポンプ９３とポジコン用洗浄機構１９の洗浄ポンプ９９とに吐出信号を供給し、洗浄ポンプ９３は、スライドガラスＳＧ１に洗浄ノズル９１を介して洗浄液を吐出し、洗浄ポンプ９９は、スライドガラスＳＧ２に洗浄ノズル９７を介して洗浄液を吐出する。廃液は図示しない廃液タンクに流入する。

そして機構制御部２５は、図２のステップＳＡ７において検体用染色機構１３の基質ポンプとポジコン用染色機構１７の基質ポンプとに同時に吐出信号を供給する。検体用染色機構１３の基質ポンプ６５とポジコン用染色機構１７の基質ポンプ８１とは個別に基質タンク６７から所定量の基質液を吸引する。検体用染色機構１３の基質ポンプ６５は、スライドガラスＳＧ１に基質液を基質ノズル５５を介して吐出し、基質ポンプ８１は、スライドガラスＳＧ２に基質液を基質ノズル７５を介して吐出する。基質ノズル５５及び基質ノズル７５からは同量の基質液が同時に吐出される。基質液の吐出により発色が開始される。

ステップＳＢ１が行われるとシステム制御部１１は、光学カメラ２１に光学撮影を開始させる（ステップＳＢ２）。ステップＳＢ２において光学カメラ２１は、ポジコンが載置されたスライドガラスＳＧ２を繰り返し光学撮影し、ポジコンを被写体とする光学画像を繰り返し発生する。光学画像はカラー撮影により発生される。光学画像の画素には画素値としてＲＧＢ値が割り当てられている。すなわち、各画素にＲ（Red）値、Ｇ（Green）値、Ｂ（Blue）値の各々が割り当てられている。Ｒ値、Ｇ値、Ｂ値の各々のビット数は幾つであっても構わないが、説明を具体的に行うため、８ビットにより定義されているとする。この場合、Ｒ値、Ｇ値、Ｂ値の各々は、０〜２５５の間の数値で規定される。

図６は、ポジコンを被写体とする光学画像Ｉ１を模式的に示す図である。図６に示すように、光学画像Ｉ１は、ポジコンに関する画素の集合であるポジコン領域Ｒ１を含んでいる。ポジコン等の病理標本の組織切片はマイクロメートルのオーダーの厚さで切り出されているため穴が存在する。そのため光学画像Ｉ１のポジコン領域Ｒ１には穴に関する画素の集合である穴領域Ｒ２が含まれる。また、光学カメラ２１の撮像視野にはスライドガラスのポジコンが載置されていない部分を含まれる。従って光学画像Ｉ１のポジコン領域Ｒ１の周囲には、スライドガラス等のポジコン以外の背景に関する画素の集合である背景領域Ｒ３が分布する。

ステップＳＢ２が行われるとシステム制御部１１は、画像処理部２３に画素値の閾値に対する比較を行わせる（ステップＳＢ３）。ステップＳＢ３において画像処理部２３は、まず、光学画像に含まれる比較対象領域を設定する。比較対象領域は、ユーザにより操作部２７を介してポジコン領域に設定される。具体的には、画像処理部２３は、ポジコン領域に含まれる複数の画素の各々についてＲＧＢ値に基づいて明度を算出する。明度Vは下記の（１）式に基づいて算出される。

V=Max(R,G,B)/255 ・・・（１）
ここで、Max(R,G,B)は、Ｒ値、Ｇ値、及びＢ値のうちの最大値である。明度はポジコンの染色強度を反映する。なお、（１）式は、Ｒ値、Ｇ値、及びＢ値の各々が８ビットで定義されている場合に成立する。例えば、Ｒ値、Ｇ値、及びＢ値の各々が１６ビットで定義されている場合、（１）式中の“２５５”は“５１１”に修正される。

比較対象領域は、画像処理部２３による画像処理により自動的に設定されても良い。自動設定方法としては、例えば、次の方法が可能である。スライドガラスＳＧ２の下には白色プレートが設置されている。そのため、発色反応の開始直前あるいは開始直後における光学画像では、典型的には、ポジコン領域の画素の明度が低く、背景領域の画素の明度が相対的に高い。このようなポジコンを被写体とする光学画像の明度の空間分布の特質を利用して、画像処理部２３は、ポジコン領域を比較対象領域に自動的に設定する。具体的には、画像処理部２３は、背景領域の画素が典型的に有する明度範囲よりも低い明度を有する画素の集合を比較対象領域に設定する。あるいは、画像処理部２３は、ポジコン領域の画素が典型的に有する明度範囲に属する画素の集合を比較対象領域に設定しても良い。背景領域の画素が典型的に有する明度範囲とポジコン領域の画素が典型的に有する明度範囲とは、予めユーザにより操作部２７等を介して設定される。

上記の通り、ポジコン領域には穴領域が存在する。そのため、上記の方法の場合、穴領域が比較対象領域に設定されてしまう場合がある。これを防止するため、画像処理部２３は、光学画像に含まれる穴領域を消去しても良い。例えば、画像処理部２３は、光学画像にモルフォロジー演算を施して穴領域を消去することが可能である。図７は、穴領域が消去された光学画像Ｉ２を模式的に示す図である。図７に示すように、ポジコン領域Ｒ４にはモルフォロジー演算により穴領域が存在しない。モルフォロジー演算後、画像処理部２３は、光学画像Ｉ２の前景領域をポジコン領域Ｒ４として特定し、特定されたポジコン領域Ｒ４を比較対象領域に設定する。これにより、比較対象領域に含まれるノイズがより低減される。

また、画像処理部２３は、ポジコンを被写体とする光学画像の明度の時間変化の特質を利用して比較対象領域を設定しても良い。図８は、光学画像に含まれるポジコン領域と背景領域との標準的な明度の時間変化を示す図である。図８の縦軸は明度Vに規定され、横軸は時間に規定される。図８に示すように、ポジコン領域は時間の経過に伴い明度が上昇し、背景領域は時間が経過しても明度が一定である。このようなポジコン領域と背景領域との明度の時間変化の態様の違いを利用して画像処理部２３は、光学画像からポジコン領域を特定する。すなわち、画像処理部２３は、繰り返し発生される光学画像の複数の画素の明度をモニタリングし、明度が上昇する画素を特定する。そして画像処理部２３は、時間経過に伴い明度が上昇する画素の集合を比較対象領域に設定する。この際、画像処理部２３は、上記のモルフォロジー演算を光学画像に施し、モルフォロジー演算が施された光学画像において、明度が上昇する画素を特定すると良い。これにより、比較対象領域に含まれるノイズがより低減される。

明度が算出されると画像処理部２３は、算出された明度と明度に対する閾値（以下、明度閾値と呼ぶ）とを画素毎に比較する。明度閾値は実験的又は経験的に定められた任意の値に操作部２７を介して設定可能である。例えば、明度閾値は、染色済みのポジコンが載置されたスライドガラスを用いて決定される。具体的には、検体染色処理の実行前においてポジコン用染色機構１７に染色済みのポジコンが載置されたスライドガラスが設置され、光学カメラ２１により当該ポジコンを被写体とする光学画像が発生される。そして光学画像のポジコン領域の明度が画像処理部２３により明度閾値に設定される。明度閾値は記憶部３１に記憶される。このような、明度閾値の設定処理は、検体免疫処理とは別の測定モードにおいて行われると良い。

ステップＳＢ４において明度が明度閾値よりも小さいと判定された場合（ステップＳＢ４：ＮＯ）、システム制御部１１は、ステップＳＢ３に戻り、次に光学カメラ２１により発生された光学画像について明度の算出と明度閾値に対する比較とを画像処理部２３に行わせる。このようにして画像処理部２３は、光学カメラ２１により繰り返し発生される光学画像について明度の算出と明度閾値に対する比較とを経時的に実行する。

図９は、光学画像に含まれる比較対象領域の画素の明度の典型的な時間変化を示す図である。図９の縦軸は明度Vに規定され、横軸は時間に規定される。画像処理部２３は、繰り返し発生される光学画像の比較対象領域の複数の画素の各々について明度を算出し、算出された明度を明度閾値Tbに対して比較する。画像処理部２３は、明度が明度閾値Tbに到達するまで、明度の算出と明度閾値Tbに対する比較とを繰り返す。

停止信号の発生の時期的基準は、ユーザにより任意に設定可能である。すなわち、比較対象領域に含まれる複数の画素のうちの何れか一つの画素の明度が明度閾値Tbに到達した場合に停止信号を発生しても良いし、所定数（２以上）の画素の明度が明度閾値Tbに到達した場合に停止信号を発生しても良い。当該所定数は、実験的あるいは経験的に定められた値に操作部２７を介してユーザにより設定可能である。

また、画像処理部２３は、比較対象領域に含まれる複数の画素の明度の統計値を明度閾値Tbに対して比較しても良い。統計値としては、複数の画素の明度の最大値、最小値、中央値、平均値、又は重心値から任意に設定可能である。

そしてステップＳＢ４において明度が明度閾値以上であると判定されたた場合（ステップＳＢ４：ＹＥＳ）、画像処理部２３は、明度が明度閾値Tbに到達したことを契機として停止信号を即時的に発生する。システム制御部１１は、停止信号を機構制御部２５に供給し、機構制御部２５に検体の洗浄を行わせる（ステップＳＢ５）。具体的には、機構制御部２５は、検体用染色機構１３の検体用洗浄機構１５の洗浄ポンプ９３に吐出信号を供給する。吐出信号を受けた洗浄ポンプ９３は、検体が載置されたスライドガラスＳＧ１に洗浄液を、洗浄ノズル９１を介して即時的に吐出する。洗浄により基質液が検体から流し落とされ、発色反応が終了する。これにより検体の染色（発色）が終了する。

以上により、本実施形態に係る検体染色処理の動作例の説明を終了する。

なお、上記の実施形態において画像処理部２３は、ステップＳＢ３における画素値の閾値に対する比較を行う際、画素値として明度を用いるとした。しかしながら、本実施形態はこれに限定されない。例えば、画像処理部２３は、画素値として彩度を用いても良い。以下、画素値として彩度を用いる場合のステップＳＢ３及びＳＢ４について説明する。

画像処理部２３は、光学画像の比較対象領域の画素のＲＧＢ値に基づいて彩度を算出する。彩度は、下記の（２）式に基づいて算出される。

S=(Max(R,G,B)-Min(R,G,B))/Min(R,G,B) ・・・（２）
ここで、Min(R,G,B)は、Ｒ値、Ｇ値、及びＢ値のうちの最小値である。彩度はポジコンの染色強度を反映する。

各画素の彩度が算出されると画像処理部２３は、算出された彩度と彩度に対する閾値（以下、彩度閾値と呼ぶ）とを比較し、算出された彩度と彩度閾値とを比較する。そして光学画像の比較対象領域の画素の彩度が明度閾値以上であると判定されるまで、各光学画像について彩度の算出と彩度閾値に対する比較とが繰り返される。そして、比較対象領域の画素の彩度が彩度閾値以上であると判定された場合、機構制御部２５の制御のもとに検体が洗浄液で洗浄される。

彩度閾値は実験的又は経験的に定められた任意の値に操作部２７を介して設定可能である。例えば、彩度閾値は、染色済みのポジコンが載置されたスライドガラスを用いて決定される。具体的には、検体染色処理の実行前においてポジコン用染色機構１７に染色済みのポジコンが載置されたスライドガラスを設置し、光学カメラ１９により当該ポジコンを被写体とする光学画像を発生する。そして光学画像のポジコン領域の彩度が彩度閾値に設定される。彩度閾値は記憶部３１に記憶される。このような、彩度閾値の設定処理は、検体免疫処理とは別の測定モードにおいて行われると良い。なお、彩度閾値の設定は、上記の明度閾値の設定時に並行して行われても良い。

また、画像処理部２３は、明度と彩度との両方が閾値以上になった場合に検体が洗浄液で洗浄されても良い。具体的には、画像処理部２３は、ステップＳＢ３において、光学画像の比較対象領域の画素の明度と彩度とを算出する。明度と彩度とを算出すると画像処理部２３は、明度を明度閾値に対して比較し、彩度を彩度閾値に対して比較する。そして明度が明度閾値以上であり且つ彩度が彩度閾値であると判定された場合、機構制御部２５の制御のもとに検体が洗浄液で洗浄される。このように明度と彩度との両方を考慮することにより、ポジコンの染色強度をより精確に染色の終了タイミングを検出することが可能となる。

また、上記の実施形態において検体の洗浄は検体用洗浄機構１５により行われるとした。しかしながら、本実施形態はこれに限定されない。すなわち、検体の洗浄はユーザにより行われても良い。この場合、システム制御部１１は、画素値（明度や彩度）が閾値以上であると判定された場合（ステップＳＢ３：ＹＥＳ）、表示部２９に停止信号を供給する。停止信号の供給を受けた表示部２９は、「検体を洗浄して下さい」等の検体の洗浄を促すメッセージを表示させる。当該メッセージを確認することによりユーザは、適切なタイミングで検体の洗浄を行うことが可能となる。

上記の説明の通り、本実施形態に係る病理染色装置は、検体用染色機構１３、ポジコン用染色機構１７、機構制御部２５、光学撮影部２１、及び画像処理部２３を有している。検体用染色機構１３は、検体を染色するための染色機構である。ポジコン用染色機構１７は、ポジコンを染色するための染色機構である。機構制御部２５は、検体の染色に並行してポジコンを染色するように検体用染色機構１３とポジコン用染色機構１７とを制御する。光学撮影部２１は、ポジコンを繰り返し光学撮影し、ポジコンに関する光学画像を繰り返し発生する。画像処理部２３は、繰り返し発生される光学画像の画素の画素値を閾値に対して比較し、当該画素値が閾値に到達した場合、当該画素値が閾値に到達したことを示す停止信号を発生する。

上記の構成により、病理染色装置は、検体用染色機構１３による検体の染色に際し、ポジコン用染色機構１７によりポシコンを並行して染色し、光学撮影部２１によりポジコンを繰り返し光学撮影する。画像処理部２３は、繰り返し発生される光学画像を通じてポジコンの染色強度を光学的に測定する。そして画像処理部２３は、ポジコンの染色強度が閾値に到達したことを契機として、例えば、光学画像の画素の画素値が閾値に到達したことを契機として停止信号を発生する。停止信号の供給を受けた機構制御部２５は、検体用洗浄機構１５を作動して検体を染色し、検体の染色を終了させる。あるいは、停止信号の供給を受けた表示部２９は、検体の洗浄を促すメッセージを表示する。すなわち、本実施形態に係る画像処理部２３は、ポジコンの染色強度が閾値に到達したときを検体の染色の終了時に決定している。

一般的にポジコンであっても抗体液の種類、抗体液のロット番号、抗原抗体反応の経過時間等により同一の発色反応時間であっても染色強度が異なる。このような種々の要因に影響される染色強度のばらつきを完全に無くすことは難しい。一方、本実施形態に係る病理検体装置は、検体を染色するに際してポジコンを並行して染色し、ポジコンの光学画像の画素の画素値が閾値に到達したときを検体の染色の終了時刻と見做している。従って、本実施形態によりユーザは、ポジコンの染色強度を基準として検体の染色強度を評価することが可能となる。そのため、本実施形態に係る病理染色装置は、染色強度に影響する種々の要因を調整する必要なく、信頼性の高い染色結果を提供することが可能となる。

発色反応の時間を制御する他の方法として、使用される抗体の力価を測定し、当該力価の測定結果に基づいて抗原抗体反応の時間を制御する方法が考えられる。力価の測定は、抗体を産生した動物の結成を用いて行われている。力価の測定結果のばらつきを無くすためには、血清の品質を検定する必要がある。このため、力価の測定に基づく処理を病理染色装置に組み込む必要があり、装置の複雑化・大型化を招き、製造コストが増加してしまう。

一方、本実施形態に係る病理染色装置は、ポジコンの染色機構等を追加することのみで、検体の発色反応の時間を制御している。このため、抗体の力価の測定を要する場合に比して装置の複雑化・大型化、製造コストの増加が制限される。

かくして、本実施形態によれば、染色結果の信頼性を向上することが可能となる。

なお、上記の説明においては、酵素抗体法による免疫染色として、一次抗体と二次抗体とを用いる間接法を用いるとした。しかしながら、本実施形態はこれに限定されず、抗原に直接的に結合する抗体に標識を修飾する直接法を用いても良い。また、本実施形態に係る病理染色処理としては、酵素が修飾された抗体を用いる酵素抗体法に限定されず、蛍光抗体法でも良い。蛍光抗体法においては、第２の抗原抗体反応工程（ＳＡ６）において蛍光色素が修飾された二次抗体を検体に添加し、発色工程（ＳＡ７）において蛍光色素に対応する励起波長の光を検体及びポジコンに照射する。励起波長の光の照射を受けて検体及びポジコンは、蛍光を発生する。蛍光を発生するポジコンを光学カメラ２１により光学撮影して当該ポジコンを被写体とする光学画像を発生する。そしてシステム制御部１１による制御のもと、上述と同様の方法により、ステップＳＢ３、ＳＢ４、及びＳＢ５が行われる。かくして、蛍光抗体法においても、酵素抗体法と同様に、本実施形態に係る検体染色処理を実行可能である。

また、本実施形態に係る検体用染色機構１３とポジコン用染色機構１７とは滴下式であるとした。しかしながら、本実施形態はこれに限定されない。検体用染色機構１３とポジコン用染色機構１７とはオイルカバースリップ方式あるいは毛細管現象方式であっても良い。

また、上記の実施形態においては、光学画像の画素にＲＧＢ値等のカラー値が割り当てられているとした。しかしながら、本実施形態はこれに限定されない。ポジコン領域と他の領域とが画像処理により判別可能であれば、画素にはグレー値が割り当てられても良い。

また、上記の実施形態においてはステップＳＡ５、ＳＡ６、及びＳＡ７について検体用染色機構１３、検体用洗浄機構１５、ポジコン用染色機構１７、及びポジコン用洗浄機構１９を用いた機構制御部２５による自動的な検体染色処理を説明した。しかしながら、本実施形態はこれに限定されない。すなわち、機構制御部２５は、他のステップＳＡ１、ＳＡ２、ＳＡ３、ＳＡ４、ＳＡ８、ＳＡ９、及びＳＡ１０の少なくとも一つの工程についても検体用染色機構１３、検体用洗浄機構１５、ポジコン用染色機構１７、及びポジコン用洗浄機構１９を用いて自動的に行っても良い。

また、上記の実施形態においては明度閾値及び彩度閾値の設定に際し、検体染色処理の前段においてポジコン用染色機構１７に染色済みのポジコンが載置されたスライドガラスを設置し、当該ポジコンを光学撮影するとした。しかしながら、本実施形態はこれに限定されない。例えば、図１０に示すように、本実施形態に係る病理染色装置は、染色済み標本配置器３３と光学撮影部３５とをさらに備えていても良い。染色済み標本配置器３３は、染色済みのポジコンが載置されたスライドガラスが配置される器である。光学撮影部３５は、染色済み標本配置器３３に載置された染色済みのポジコンを光学撮影し、染色済みのポジコンを被写体とする光学画像を発生する。染色済みのポジコンの光学撮影は、検体の免疫染色の前段に行われる。画像処理部２３は、染色済みのポジコンを被写体とする光学画像に含まれるポジコン領域の画素の画素値を特定し、特定された画素値を、ステップＳＢ３において用いられる閾値に設定する。具体的には、染色済みのポジコンを被写体とする光学画像に含まれるポジコン領域の画素のＲＧＢ値に基づいて明度を算出し、算出された明度を明度閾値に設定し、ポジコン領域の画素のＲＧＢ値に基づいて彩度を算出し、算出された彩度を彩度閾値に設定する。設定された閾値は記憶部３１に記憶される。

このように、染色済みのポジコンを光学撮影するための機構を独立して搭載することにより、ポジコン用染色機構１７を用いて染色済みのポジコンの光学撮影する場合に比して、測定モードの複雑化を避けることが可能となる。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

１１…システム制御部、１３…検体用染色機構、１５…検体用洗浄機構、１７…ポジコン用染色機構、１９…ポジコン用洗浄機構、２１…光学撮影部、２３…画像処理部、２５…機構制御部、２７…操作部、２９…表示部、３１…記憶部、３３…染色済み標本配置器、３５…光学撮影部。

Claims (10)

1. 検体を染色するための第１染色機構と、
   陽性染色対照標本を染色するための第２染色機構と、
   前記検体の染色に並行して前記陽性染色対照標本を染色するように前記第１染色機構と前記第２染色機構とを制御する機構制御部と、
   前記陽性染色対照標本を繰り返し光学撮影し、前記陽性染色対照標本に関する光学画像を繰り返し発生する光学撮影部と、
   前記繰り返し発生される光学画像の画素の画素値を閾値に対して比較し、前記画素値が前記閾値に到達した場合、前記画素値が前記閾値に到達したことを示す出力信号を発生する画像処理部と、
   を具備する病理染色装置。
2. 前記検体を洗浄液で洗浄するための洗浄機構をさらに備え、
   前記機構制御部は、前記出力信号が発生された場合、前記洗浄機構に前記検体の洗浄を開始させる、請求項１記載の病理染色装置。
3. 前記画像処理部は、前記光学画像のうちの前記検体に関する画像領域に限定して前記画素値を前記閾値に対して比較する、請求項１記載の病理染色装置。
4. 前記画像処理部は、前記検体に関する画像領域の標準的な画素値又は前記検体に関する画像領域以外の画像領域の標準的な画素値を前記閾値とする閾値処理により、前記光学画像から前記検体に関する画像領域を抽出する、請求項３記載の病理染色装置。
5. 前記画像処理部は、前記光学画像に含まれる複数の画素の各々の時間変化態様に基づいて前記光学画像から前記検体に関する画像領域を特定する、請求項３記載の病理染色装置。
6. 前記画像処理部は、前記光学画像にモルフォロジー演算を施した後に前記検体に関する画像領域を抽出する、請求項３記載の病理染色装置。
7. 前記画像処理部は、前記光学画像に含まれる複数の画素の各々について前記画素値に基づいて明度と彩度とを算出し、前記明度を第１閾値に対して比較し、前記彩度を第２閾値に対して比較し、前記明度が前記第１閾値に到達した場合、前記彩度が前記第２閾値に到達した場合、又は前記明度が前記第１閾値に到達し且つ前記彩度が前記第２閾値に到達した場合、前記出力信号を発生する、請求項１記載の病理染色装置。
8. 前記閾値は、染色済みの他の陽性染色対照標本の光学画像の画素の画素値に設定される、請求項１記載の病理染色装置。
9. 前記出力信号が発生された場合、前記検体の洗浄を促すメッセージを表示する表示部、をさらに備える請求項１記載の病理染色装置。
10. 検体を染色し、
    前記検体の染色に並行して陽性染色対照標本を染色し、
    前記陽性染色対照標本の染色強度が閾値に到達したことを契機に前記検体の染色を終了する、
    ことを具備する病理染色方法。

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