JP6245481B2 - 非侵襲的イメージングのための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１２年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６２５，６７０号明細書、２０１２年９月４日に出願された米国仮特許出願第６１／６９６，５６０号明細書、および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９８，８５５号明細書の利益および優先権を主張する。前述の出願の各々の内容は、その全体を本明細書に援用する。

リポソームは、抗腫瘍薬などの様々な薬理学的に活性な分子を細胞、臓器または腫瘍に送達するのに有用なツールであることが証明されている。しかしながら、リポソームは、リポソームの腫瘍への付着が、患者間の異なるサブタイプの腫瘍間だけでなく、同じ患者内の類似のサブタイプの腫瘍間でも高度にばらつきが見られる場合があることが明らかになっている。したがってリポソームにより送達される治療薬の処置の結果は、対象となる患者にとってやや予測不可能である可能性がある。

リポソーム送達は、薬物動態プロファイルを改善し、特定の抗癌薬剤、特にアントラサイクリンクラスの治療係数を増大させることが示されている。有効性の改善は１つには、ＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果に基づく腫瘍部位への受動的ターゲティングによるものである。このプロセスを十分に利用するには、循環している間、薬剤を保持することで腫瘍に蓄積する前の早期の薬物放出を防止する一方、それでもひとたび腫瘍に近づけば薬剤を放出することができる薬剤キャリアを設計すべきである。ＨＥＲ２または上皮増殖因子受容体に対するイムノリポソームなどの抗体標的化ナノ粒子は、腫瘍細胞へのより効果的な薬物送達のもう１つの戦略の典型である。

しかしながら、腫瘍へのリポソーム薬剤の付着はばらつくことが明らかになっている。薬剤付着率のより高い腫瘍は、臨床転帰が改善すると考えられる。リポソーム薬剤は、ＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果と呼ばれるメカニズムを介して腫瘍に進入することが示されており、それによりリポソームは、漏出性の腫瘍血管系を介して血流から漏出して腫瘍間質に優先的に入り、その後その大きなサイズおよび機能的リンパ管の欠如のため腫瘍にトラップされる。しかしながら、リポソーム粒子が腫瘍に付着し得る程度は、前臨床腫瘍モデルおよび臨床試験の両方において高度にばらつきが見られることが示されており、それによりリポソームは、腫瘍付着のレベルおよびばらつきを定量するための造影剤として使用されてきた。本発明は、どの患者の腫瘍がリポソーム薬剤の付着率が低いかまたは高いか、そして最終的にどれが特定のリポソーム薬剤から効果を得られるかを予測するのに使用することができるリポソーム造影剤を提供する。

したがって、リポソームにより送達される治療薬が、処置前の患者に使用するのに好適であるかどうかを（たとえば、標的および非標的化リポソーム治療剤の臨床転帰を予測するため）判定するための非侵襲的方法が必要とされている。

本発明は、非侵襲的イメージング、より詳細には、リポソーム治療剤の非侵襲的イメージングのための組成物および方法を提供する。こうした組成物および方法は、癌または別の疾患のイメージング、および／または標的部位、たとえば癌性組織への薬物送達に有用である。

他の特徴と利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

一態様で提供されるのは、下記式ＩのＤＥＡＰ−ＡＳＴＣ化合物：

またはその薬学的に許容される塩である。一実施形態では、化合物は、−２０℃、−４℃、室温（２２〜２５℃）、３０℃、３７℃または４０℃の温度で貯蔵される。一実施形態では、化合物は、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間または６ヶ月間貯蔵される。別の実施形態では、４℃〜４０℃の温度で３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間または６ヶ月間の日数の貯蔵後、分解する化合物は、１５％未満である。一実施形態では、分解する化合物の％は高速液体クロマトグラフィーにより測定される。

別の態様で提供されるのは、下記式ＩＩのＤＥＡＰ−ＡＳＴＣ化合物であり：

式中、Ｍは原子価が２もしくは３もしくは４の金属イオンまたは金属酸化物イオンである。一実施形態では、Ｍは二価カチオン、たとえば銅カチオンである。別の実施形態では、ＭはＣｕ^２＋である。一実施形態では、Ｍは放射性同位元素、たとえば^６４Ｃｕもしくは^６７Ｃｕ、または別の好適な二価カチオンの同位元素である。

別の態様で提供されるのは、水性媒体（たとえば、薬学的に許容される媒体）中にリポソームを含む組成物であって、前記リポソームは各々、内部空間および前記内部を前記媒体から隔てる膜を有し、前記膜は１種または複数種の脂質を含み；さらに組成物中のリポソームの少なくとも１つのリポソームに内包されたキレート化された二価カチオンを含むまたは含まない式Ｉまたは式ＩＩ（または以下の式ＩＩＩ）の化合物を含む組成物である。二価金属カチオンがキレート化されている一実施形態では、組成物は少なくとも約０．１μＣｉの放射能を有する。別の実施形態では、Ｍは^６４Ｃｕおよび^６７Ｃｕから選択されるＣｕ^２＋の放射性同位元素である。なお別の実施形態では、組成物は、約０．０１μＣｉ、１μＣｉ、２μＣｉ、３μＣｉ、４μＣｉ、５μＣｉ、１０μＣｉ、１５μＣｉまたは２０μＣｉの放射能を有する。種々の実施形態では、膜は、コレステロールおよびホスファチジルコリンを含む。他の実施形態では、リポソームは３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月の貯蔵期間後に安定であり、安定性は機能表示値、たとえば、インビボ安定性または導入性により測定される。リポソームは、リポソームへの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入後、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの約９０％がサイズ排除クロマトグラフィー後にリポソーム画分に存在する場合、導入可能（安定）であると見なされる。一実施形態では、リポソームの膜は、コレステロールおよびホスファチジルコリンを含む。別の実施形態では、リポソームの膜は、非加水分解性脂質を含む。例示的な非加水分解性脂質はスフィンゴ脂質である。なお別の実施形態では、リポソームの膜はスフィンゴミエリン、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣおよび非加水分解性脂質の１つまたは複数を含む。

種々の態様では、水性媒体中のリポソームは式ＩＩＩの化合物が少なくとも１つのリポソームに内包される前に未導入リポソームとして調製され、未導入リポソームは３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月の貯蔵期間後に安定であり、安定性は、貯蔵期間後、式ＩＩＩの化合物をリポソームに導入した後に得られる機能表示値により評価される。機能表示値は、たとえば、リポソームへの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入効率であってもよく、導入後、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの少なくとも９０％がサイズ排除クロマトグラフィー後にリポソーム画分に存在する場合、リポソームは安定である。他の態様では、水性媒体中のリポソームは、式ＩＩＩの化合物が少なくとも１つのリポソームに内包される前に未導入リポソームとして調製され、複数の未導入リポソームは、その内部空間にＴＥＡ−ＳＯＳおよび硫酸アンモニウムのどちらか一方あるいは両方を含む。

本明細書で提供されるリポソームの組成物または方法の何れかでは、リポソームは、その内部空間に膜の内外に電気化学的勾配を形成するのに十分な量でＴＥＡ−ＳＯＳおよび硫酸アンモニウムのどちらか一方あるいは両方を含んでもよい。

別の実施形態では、化合物は下記式ＩＩＩの化合物であり：

式中、ＱはＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は各々独立にＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは置換もしくは非置換アリールから選択され、あるいは、（１）Ｒ_１およびＲ_２と（２）Ｒ_３およびＲ_４とのどちらか一方あるいは両方は一緒になって複素環式環を形成し；Ｍは原子価が２または３または４の金属カチオンであり、ｎは、各々独立して、１〜５の整数である。種々の実施形態では、Ｑは−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＲ_３Ｒ_４である。他の実施形態では、ＭはＣｕ^２＋である。他の実施形態では、組成物は少なくとも約０．１μＣｉの放射能を有する。

他の実施形態では、４℃〜４０℃の温度で少なくとも９０日間の貯蔵後、分解する化合物は１５％未満である。たとえば、いくつかの実施形態では、化合物は約２５℃の室温で貯蔵してもよいし、あるいは約３７℃でインキュベートしてもよい 一実施形態では、分解した化合物の％は、高速液体クロマトグラフィーにより測定される。いくつかの実施形態では、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月の貯蔵後、分解する化合物は１５％未満である。

別の態様では、リポソーム造影剤を調製するための方法であって、
（ａ）一定量の下記式ＩＩＩの化合物を含む第１の溶液を用意するステップ

（式中、
ＱはＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＲ_３Ｒ_４であり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は各々独立にＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは置換もしくは非置換アリールから選択され、あるいは、（１）Ｒ_１およびＲ_２と（２）Ｒ_３およびＲ_４とのどちらか一方あるいは両方は一緒になって複素環式環を形成し；
Ｍは存在しないかまたは金属イオンであり、
かつ
ｎは、各々独立して、１〜５の整数である）と、
（ｂ）水性媒体中のリポソームの調製物を用意するステップであって、複数のリポソームは各々、内部空間および内部空間を媒体から隔てる膜を有し、内部空間は膜の内外に電気化学的勾配を作り出す第２の溶液を含むステップと、（ｃ）Ｍが存在する場合、第１の溶液をリポソームの調製物と組み合わせて混合物を調製し、一定量の式ＩＩＩの化合物の一部が複数のリポソームのうち少なくとも１つのリポソームに封入されてリポソーム造影剤を形成するような条件下で混合物をインキュベートするステップ、あるいは（ｄ）Ｍが存在しない場合、第１の溶液をリポソームの調製物と組み合わせて混合物を調製し、一定量の式ＩＩＩの化合物の一部が複数のリポソームのうち少なくとも１つのリポソームに封入されるように混合物をインキュベートし、続いてリポソーム造影剤を形成するため、放射性金属イオンが少なくとも１つのリポソームに封入されるように少なくとも１つのリポソームに放射性金属イオンを含む溶液を加えるステップとを含む方法を提供する。この方法のある態様では、混合物が調製される前に、第２の溶液は任意の金属キレート部分を本質的に含まない。他の態様では、混合物が調製される前に、第１の溶液は脂質を本質的に含まない。さらに他の態様では、条件は、４０℃もしくはそれを超える、または６０℃もしくはそれを超える温度を含む。これらの態様では、こうして調製された造影剤は、混合物の調製後に無菌化濾過以外の分画を行わずに、患者に注射するのに好適であり得る。追加の態様では、少なくとも１つのリポソームに封入される前に、式ＩＩＩの化合物は無電荷であり、少なくとも１つのリポソームに封入された後に、式ＩＩＩの化合物は電荷を有する。種々の実施形態では、インキュベート後に、混合物は、任意選択に濾紙濾過、膜濾過またはゲル濾過である濾過に供される。なお別の態様では、第１の溶液中の封入されない式ＩＩＩの化合物の割合は１５％未満または１０％未満である。この方法の種々の態様では、（ｂ）のリポソームの調製物は、その中の複数のリポソーム内に、任意に化学療法剤、たとえばドキソルビシンまたはイリノテカンである抗悪性腫瘍治療薬を含む。

リポソーム造影剤を調製する別の方法であって、（ａ）キレート剤によりキレート化された放射性金属である一定量の無電荷の組成物を含む第１の溶液を用意するステップと、（ｂ）水性媒体中のリポソームの調製物を用意するステップであって、複数の前記リポソームは内部空間および前記内部空間を前記媒体から隔てる膜を有し、前記内部空間は膜の内外に電気化学的勾配を作り出す第２の溶液を含むステップと、（ｃ）リポソーム造影剤を形成するため、第１の溶液をリポソームの調製物と組み合わせて混合物を調製し、一定量の組成物の一部が複数のリポソームのうち少なくとも１つのリポソームに封入されて電荷を有するような条件下、混合物をインキュベートするステップとを含む方法を提供する。

また、患者の組織のイメージングを行う方法であって、
（ａ）少なくとも０．１μＣｉの放射能の線量を患者に与えるのに十分な量の請求項９に記載の組成物を含むリポソーム造影剤を患者に注射するステップと、
（ｂ）注射後４８時間以内に、組織の画像を取得するため、放射性同位元素により放出される放射線を検出するスキャン法を用いて組織の位置をスキャンするステップとを含む方法も提供する。この方法のある態様では、組織は腫瘍である。

さらに、腫瘍を有する患者が抗悪性腫瘍リポソーム治療薬で処置されるべきかどうかを判定する方法であって、
（ａ）少なくとも０．１μＣｉの放射能の線量を患者に与えるのに十分な量の請求項９に記載の組成物を含むリポソーム造影剤を患者に注射するステップと、
（ｂ）注射後４８時間以内に、画像を取得するため、放射性同位元素により放出される放射線を検出するスキャン法を用いて腫瘍の位置をスキャンするステップと、
（ｃ）画像を検査するステップとを含む方法も提供する。画像からリポソーム造影剤がバックグラウンドより高いレベルで腫瘍に付着していることが示される場合、患者はリポソーム治療薬で処置されるべき患者であると判定される。バックグラウンドは、注射後４８時間以内に腫瘍を有さない筋肉組織をスキャンすることにより決定してもよい。種々の態様では、画像からリポソーム造影剤がバックグラウンドより高いレベルで腫瘍に付着していることが示される場合、患者はリポソーム治療薬で処置され、画像からリポソーム造影剤がバックグラウンドより高いレベルで腫瘍に付着していないことが示される場合、患者はリポソーム治療薬で処置されない。

また、リポソーム造影剤を調製するためのキットであって、
（ａ）下記式ＩＩＩの化合物を含む第１の容器

（式中、
Ｍは存在せず；
ＱはＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＲ_３Ｒ_４であり；Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は各々独立にＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは置換もしくは非置換アリールから選択され、あるいは、（１）Ｒ_１およびＲ_２と（２）Ｒ_３およびＲ_４とのどちらか一方あるいは両方は一緒になって複素環式環を形成し；およびｎは、各々独立して、１〜５の整数である）；および
（ｂ）薬学的に許容される媒体中のリポソームの調製物を含む第２の容器であって、前記リポソームは内部空間および前記内部を前記媒体から隔てる膜を有し、前記内部空間は膜の内外に電気化学的勾配を作り出す溶液を含む容器を含むパッケージを含むキットを提供する。キットは、順々に：（ｉ）Ｍが存在し金属イオンである式ＩＩＩの化合物を得るため、金属イオンと式ＩＩＩの化合物を組み合わせるステップ；（ｉｉ）Ｍが金属イオンである式ＩＩＩの化合物をリポソームの調製物と組み合わせて混合物を調製し、Ｍが金属イオンである式ＩＩＩの化合物がリポソームの調製物のリポソームに封入されるような条件下、混合物をインキュベートするステップ、（ｉｉｉ）Ｍが金属イオンである封入された式ＩＩＩの化合物を患者に投与するステップのための説明書をさらに含んでもよい。

追加の実施形態では、リポソーム造影剤を調製する方法であって、（ａ）キレート剤によりキレート化された放射性金属である一定量の無電荷の組成物を含む第１の溶液を用意するステップと、（ｂ）水性媒体中のリポソームの調製物を用意するステップであって、複数の前記リポソームは内部空間および前記内部空間を前記媒体から隔てる膜を有し、前記内部空間は膜の内外に電気化学的勾配を作り出す第２の溶液を含むステップと、（ｃ）リポソーム造影剤を形成するため、第１の溶液をリポソームの調製物と組み合わせて混合物を調製し、一定量の組成物の一部が複数のリポソームのうち少なくとも１つのリポソームに封入されて電荷を有するような条件下、混合物をインキュベートするステップとを含む方法を提供する。

図１は、代表的なキレート剤単独の分子構造、および^６４Ｃｕと錯体を形成したときの分子構造を示す。 図２は、Ｃｕと錯体を形成したＡＴＳＭキレート剤の分子構造を示す。 図３は、標識リポソームを調製するためのプロトコルを図示した模式図である。 図４は、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣとモル過剰の^６４Ｃｕとのキレート化を図示する模式図である。 図５は、リポソーム導入のプロセスを示す模式図である。 図６は、リポソームＡの構造を模式化したものを示す。^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣキレート化錯体は赤色である。錯体形成していないプロトン化４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣはＶ２^＋として図示する。内部の水性空間は、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムを含む。 図７は、インスタント薄層クロマトグラフィーにより評価した４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの^６４Ｃｕキレート化効率を示すグラフである。 図８は、リポソームの例示的な脂質成分の化学構造を図示する。 図９Ａは、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の公開された薬物動態データにモデル結果をフィッティングさせたものを図示したグラフである。図９Ｂは、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の公開された薬物動態データにモデル結果をフィッティングさせたものを図示したグラフである。図９Ｃは、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の公開された薬物動態データにモデル結果をフィッティングさせたものおよび対応する感度解析を図示する棒グラフである。 図１０Ａは、報告された文献データから得たシミュレーションに基づき、リポソームＡの付着の動態および予測される付着のばらつきを図示したグラフを示す。図１０Ｂは、報告された文献データから得たシミュレーションに基づき、リポソームＡの付着の動態および予測される付着のばらつきを図示したグラフを示す。図１０Ｃは、報告された文献データから得たシミュレーションに基づき、リポソームＡの付着の動態および予測される付着のばらつきを図示したグラフを示す。 図１１は、４８時間後のヒト血漿中のリポソームＡの安定性を図示したグラフである。 図１２は、ＰＥＴ−ＣＴイメージングの位置合わせを行ってＰＥＴ−ＣＴ融合画像を作成する例を示す。 図１３は、腫瘍を有するマウスにおける^６４Ｃｕ導入リポソームＢのＰＥＴ−ＣＴイメージングを図示する。 図１４Ａは、ＣＤ−１マウスにおける２つのバッチのリポソームＡの薬物動態を図示するグラフを示す。図１４Ｂは、ＣＤ−１マウスの心臓、肝臓、肺、腎臓および脾臓におけるリポソームＡの体内分布を図示する棒グラフを示す。 図１５Ａは、ＣＤ−１マウスにおける錯体を形成していない^６４Ｃｕまたは^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの２つのバッチのリポソームＡの薬物動態を図示するグラフを示す。図１５Ｂは、ＣＤ−１マウスの心臓、肝臓、肺、腎臓および脾臓における錯体を形成していない^６４Ｃｕまたは^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの２つのバッチのリポソームＡの体内分布を図示する棒グラフを示す。 図１６Ａは、リポソームＡの薬物動態を、ＣＤ−１マウスにおけるドキソルビシンを含む^６４Ｃｕ標識リポソームＢのほか、ＮＣＩ−Ｎ８７マウス異種移植モデルおよびＢＴ４７４−Ｍ３マウス異種移植モデルの両方におけるリポソームＢと比較して図示するグラフを示す。図１６Ｂは、リポソームＡの体内分布を、ＣＤ−１マウスにおける^６４Ｃｕ標識リポソームＢと比較して示す棒グラフを示す。図１６Ｃは、リポソームＡの体内分布を、ＢＴ４７４−Ｍ３マウス異種移植モデルにおける^６４Ｃｕ標識リポソームＢと比較して示す棒グラフを示す。 図１７は、肝臓（四角）、心臓（黒塗りの丸）、腎臓（白丸）およびＢＴ４７４−ＭＦＰ腫瘍におけるリポソームＡの定量を示すグラフである。ｙ軸はメガベクレル（ＭＢｑ）／ｍＬ単位の強度であり、ｘ軸はＭＢｑ／グラム単位の臓器のカウント数である。 図１８は、Ｈ５２０（ＮＳＣＬＣ）およびＢＴ４７４−Ｍ３（乳房）腫瘍を有するリポソームＡを注射したマウスのＰＥＴ−ＣＴ画像を示す複合画像である。画像は注射から１０分後、６時間後および２０時間後に撮影した。 図１９Ａは、様々なｐＨの条件下で貯蔵された様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の安定性を示すグラフである。図１９Ｂは、様々な温度の条件下で貯蔵された様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の安定性を示すグラフである。図１９Ｃは、凍結乾燥の条件下で貯蔵された様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の安定性を示すグラフである。図１９Ｄは、マンニトールを用いた凍結乾燥の条件下で貯蔵された様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の安定性を示すグラフである。図１９Ｅは、不活性ガス／空気雰囲気の条件下で貯蔵された様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の安定性を示すグラフである。図１９Ｆは、不活性ガス／空気で満たした凍結乾燥製剤の条件下で貯蔵された様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の安定性を示すグラフである。 図２０Ａは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、様々な温度での１〜６ヶ月の貯蔵時のＨＳＰＣ製剤、ＤＳＰＣ製剤およびスフィンゴミエリン製剤の機能的安定性を示し、ＨＳＰＣ−硫酸アンモニウム製剤が４℃で貯蔵した際に少なくとも１５ヶ月間機能的に安定であることを図示する。図２０Ｂは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、様々な貯蔵温度での１〜５ヶ月後のＨＳＰＣ製剤およびＤＳＰＣ製剤における脂質の分解を示す（ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤにより測定された）。図２０Ｃは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、リポソーム調製物（放射能標識なし）を室温で最大６ヶ月貯蔵した後の^６４Ｃｕ−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入ＨＳＰＣリポソームのインビボでの安定性を示す。図２０Ｄは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、４℃で最大３ヶ月の貯蔵後のスフィンゴミエリン製剤の安定性を示す。図２０Ｅは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、３０℃で最大３ヶ月の貯蔵後のスフィンゴミエリン製剤の安定性を示す。図２０Ｆは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、３７℃で最大３ヶ月の貯蔵後のスフィンゴミエリン製剤の安定性を示す。図２０Ｇは、様々な賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。複数の脂質組成および２つの異なる内部緩衝液（硫酸アンモニウムおよびトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を試験した。図は、ＰＥＧ−ＤＳＧＥ、ＰＥＧ−ＤＳＧ、または予め形成したリポソームへの（減少量）ＰＥＧ−ＤＳＰＥの後挿入により製造されたリポソーム製剤の貯蔵安定性を示す。 図２１Ａは、様々な強度の電気化学的導入勾配を有する賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。図は、ＨＳＰＣリポソームの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入効率に対する導入勾配強度の影響を示す。図２１Ｂは、様々な強度の電気化学的導入勾配を有する賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。図は、ＤＳＰＣリポソームの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入効率に対する導入勾配強度の影響を示す。図２１Ｃは、様々な強度の電気化学的導入勾配を有する賦形剤リポソーム製剤の貯蔵安定性を示すグラフである。図は、スフィンゴミエリンを含むリポソームの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入効率に対する導入勾配強度の影響を示す。 図２２は、４ヶ月の期間にわたるスフィンゴミエリンリポソームの貯蔵安定性に対する貯蔵ｐＨの影響を、機能計測としてリポソームの導入性を用いて示すグラフである。 図２３は、リポソームＡがリポソーム治療剤に対する患者の処置反応を予測するためのイメージングマーカーであることを示すグラフである。グラフは、リポソームＡの腫瘍取り込みとリポソームＢの処置反応との相関関係を示す。 図２４Ａは、ＢＴ４７４−Ｍ３マウス異種移植腫瘍モデルの乳腺脂肪織腫瘍のリポソームＡの腫瘍付着における変化を示すグラフである。図２４Ｂは、ＢＴ４７４−Ｍ３マウス異種移植腫瘍モデルの皮下腫瘍のリポソームＡの腫瘍付着における変化を示すグラフである。図２４Ｃは、リポソームＡの腫瘍付着における変化を、投与３を投与１と比較して示すグラフである。 図２５は、リポソーム標的化はリポソームＢおよびその非標的化リポソームの総腫瘍付着に対して影響を与えないものの、腫瘍内の腫瘍細胞によるリポソーム取り込みを増加させること（挿入図）を示すグラフである。 図２６は、様々なレベルのＨＥＲ２を発現するマウス異種移植モデルにおけるリポソームＢの腫瘍付着を示すグラフである。リポソームＢの腫瘍付着はばらつきがあり、腫瘍内のＨＥＲ２発現と相関しないことが明らかになった。 図２５Ａは、ＣＤ−１マウスへの注射後のリポソームＡのインビボ安定性を示すグラフである。図２５Ｂは、ＣＤ−１マウスへの注射後のリポソームＢのインビボ安定性を示すグラフである。図２５Ｃは、ＣＤ−１マウスへの注射後のリポソームＣのインビボ安定性を示すグラフである。

本発明は、非侵襲的イメージング、より詳細にはリポソーム治療剤の非侵襲的イメージングのための組成物および方法を提供する。

本発明は、少なくともある程度、ジアセチル４，４’ビス（３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）プロピル）チオセミカルバゾン（４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ）が、被検体がリポソーム治療剤による処置の候補であるかどうかを判定するための、およびリポソーム治療剤による被検体の処置をモニタリングするための非侵襲的イメージング試薬として有用であるという発見に基づく。

定義
特に記載がない限り、あるいは、文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用する場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当該技術分野における通常の許容差の範囲内、たとえば平均値の２標準偏差内にあると理解される。「約（ａｂｏｕｔ）」は、記載の値の１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内または０．０１％以内と理解することができる。他に文脈から明らかである場合を除き、本明細書に提供される数値はすべて「約（ａｂｏｕｔ）」により修飾されている。

「導入」は、キレート化剤、化学薬品、治療薬、核酸および／またはポリペプチドをエキソソーム、リポソームまたは小胞に組み込むプロセスを意味する。

「ナノ粒子」は、リポソーム、エキソソーム、ポリマーソーム、微小胞、アポトーシス小体、または膜が水性の内部を囲んでいる他の脂質もしくはポリマーシェル構造を意味する。こうしたナノ粒子は、合成的に作製しても、あるいは細胞または細胞集団から内因性に誘導してもよい。

本明細書で提供される範囲は、その範囲内にあるすべての値の簡潔表現と理解される。たとえば、１〜５０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群の任意の数字、数字の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。

リポソーム造影剤
一般的な態様では、本発明は、少なくとも２つの成分：（１）液体媒体（たとえば緩衝液または他の薬学的に許容されるキャリア）に懸濁または可溶化されるリポソーム；（２）金属イオンをキレート化できるキレート剤部分；および任意に（３）細胞、臓器または腫瘍へのリポソーム造影剤のインビトロまたはインビボでの取り込みをイメージングするまたは他の方法で評価するのに好適な金属イオンを有するリポソーム造影剤を提供する。いくつかの実施形態では、金属イオンは原子価が２または３または４である。例示的な実施形態では、金属イオンは、原子価２を有する。

リポソーム
本明細書に開示されたリポソーム造影剤のリポソームは、当該技術分野において公知または今後発見されるどのようなリポソームであってもよい。一般に、リポソームは、任意のリポソーム構造、たとえば、１つまたは複数の脂質二重層で外側の媒体から隔離された内空間を有する構造を有しても、あるいは親油性中心部を持つ半透過性膜を有し、膜が内部を隔離する任意のマイクロカプセルを有してもよい。脂質二重層では、親水部（親水性部分）および疎水部（疎水性部分）を特徴とする両親媒性分子はどのような配列であってもよい。通常、二重層の両親媒性分子は２次元シートとして配列され、疎水性部分はシートに対して内側に向いているのに対し、親水性部分は外側に向いている。本明細書に開示されたリポソームを形成する両親媒性分子は、公知または今後発見される任意の両親媒性分子、たとえば、合成由来もしくは天然由来の脂質または生体適合性脂質であってもよい。本明細書に開示されたリポソームはまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤、たとえば、ポリメロソームおよびニオソームによって形成することもできる。本開示において、以下に限定されるものではないが、これらのリポソーム形成材料を「脂質」ともいう。

ある種の実施形態では、リポソームは水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）（モル重量２０００）誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（３：１：０．０５モル比）を含む。

ある種の実施形態では、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）誘導体化ホスファチジルエタノールアミン、たとえば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］（アンモニウム塩）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］（アンモニウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］（アンモニウム塩）；または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］（アンモニウム塩）を含む。ある種の実施形態では、ＰＥＧの分子量は７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、３５００または５０００である。

ある種の実施形態では、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）誘導体化ジアシルグリセロール、たとえばたとえば１，２−ジステアロイル−グリセリル−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］ １，２−ジミリストイル−グリセリル−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］、１，２−ジパルミトイル−グリセリル−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］；または１，２−ジオレオイル−グリセリル−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］を含む。ある種の実施形態では、ＰＥＧの分子量は７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、３５００または５０００である。

ある種の実施形態では、リポソームは、１，２−ジオクタデシルグリセロ−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］、ジヘキサデシルグリセロ−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］ジテトラデシルグリセロ−Ｎ−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］を含む。ある種の実施形態では、ＰＥＧの分子量は７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、３５００または５０００である。

ある種の実施形態では、リポソームは、ＰＥＧ−セラミド、たとえばＮ−オクトデカノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシノイル［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］｝；Ｎ−テトラデカノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシノイル［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］｝；Ｎ−ヘキサデカノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシノイル［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］｝；Ｎ−オクトデカノイル−スフィンゴシン−１−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］；Ｎ−テトラデカノイル−スフィンゴシン−１−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］；またはＮ−ヘキサデカノイル−スフィンゴシン−１−［メトキシ（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］を含む。ある種の実施形態では、ＰＥＧの分子量は７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、３５００または５０００である。

本組成物または方法に使用してもよい脂質を形成する好適なナノ粒子またはリポソームの別の例には、以下のホスファチジルコリン、たとえばジアシル−ホスファチジルコリン、ジアルキルホスファチジルコリン、１，２−ジオレオイル−ホスファチジルコリン、１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイル−ホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンおよび１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン、たとえば１、２−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン、１−オレオイル−２−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、１−オレオイル−２−ステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミンおよびＮ−スクシニル−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン、たとえば１，２−ジオレオイル−ホスファチジルセリン、１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルセリン、１，２−ジミリストイル−ホスファチジルセリン、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルセリン、１−オレオイル−２−パルミトイル−ホスファチジルセリン、１−オレオイル−２−ステアロイル−ホスファチジルセリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリンおよび１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール、たとえば１，２−ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール、１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール、１，２−ジミリストイル−ホスファチジルグリセロール、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルグリセロール、１−オレオイル−２−パルミトイル−ホスファチジルグリセロール、１−オレオイル−２−ステアロイル−ホスファチジルグリセロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセロールおよび１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセロール；ｐｅｇ化脂質；ｐｅｇ化ホスポホ脂質、たとえばホファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］、ホファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、ホファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３０００］、ホファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］；リソ−ホスファチジルコリン、リソ−ホスファチジルエタノールアミン、リソ−ホスファチジルグリセロール、リソ−ホスファチジルセリン、セラミド；スフィンゴ脂質、たとえば、スフィンゴミエリン；リン脂質；糖脂質、たとえばガングリオシドＧＭＩ；グルコ脂質；スルファチド；ホスファチジン酸、たとえばジ−パルミトイル−グリセロホスファチジン酸；パルミチン脂肪酸；ステアリン脂肪酸；アラキドン脂肪酸；ラウリン脂肪酸；ミリスチン脂肪酸；ラウロレイン脂肪酸；フィセテル脂肪酸；ミリストレイン脂肪酸；パルミトレイン脂肪酸；ペトロセリン脂肪酸；オレイン脂肪酸；イソラウリン脂肪酸；イソミリスチン脂肪酸；イソステアリン脂肪酸；ステロールおよびステロール誘導体、たとえばコレステロール、コレステロールヘミスクシネート、コレステロールスルフェートおよびコレステリル−（４−トリメチルアンモニオ）−ブタノエート、エルゴステロール、ラノステロール；ポリ−オキシエチレン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレン脂肪酸アルコール；ポリ−オキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル；ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールオキシ−ステアレート；グリセロールポリエチレングリコールリシノレート；エトキシル化大豆ステロール；エトキシル化ヒマシ油；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン脂肪酸ポリマー；ポリオキシエチレン脂肪酸ステアレート；ジ−オレオイル−ｓｎ−グリセロール；ジパルミトイル−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−アルキル−２−アシル−ホスファチジルコリン、たとえばｉ−ヘキサデシル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン；１−アルキル−２−アシル−ホスファチジルエタノールアミン、たとえば１−ヘキサデシル−２−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン；１−アルキル−２−アシル−ホスファチジルセリン、たとえば１−ヘキサデシル−２−パルミトイル−ホスファチジルセリン；１−アルキル−２−アシル−ホスファチジルグリセロール、たとえば１−ヘキサデシル−２−パルミトイル−ホスファチジルグリセロール；１−アルキル−２−アルキル−ホスファチジルコリン、たとえば１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシル−ホスファチジルコリン；１−アルキル−２−アルキル−ホスファチジルエタノールアミン、たとえば１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシル−ホスファチジルエタノールアミン；１−アルキル−２−アルキル−ホスファチジルセリン、たとえば１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシル−ホスファチジルセリン；１−アルキル−２−アルキル−ホスファチジルグリセロール、たとえば１−ヘキサデシル＾−ヘキサデシル−ホスファチジルグリセロール；Ｎ−スクシニル−ジオクタデシルアミン；パルミトイルホモシステイン；ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド；セチルトリメチル−アンモニウムブロミド；ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド；Ｎ−［１，２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；１，２−ジオレオイルオキシ−３（トリメチル−アンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；ならびに１，２−ジオレオイル−ｃ−（４’−トリメチルアンモニウム）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）があるが、これに限定されるものではない。

本明細書に開示されたリポソーム造影剤に含まれるリポソームは、非標的化リポソームでも、あるいは標的化リポソーム、たとえば、リポソームの表面に１つもしくは複数の標的化部分または体内分布調整剤を含むリポソームでもよい。標的化部分は、所望の標的に特異的に結合または相互作用することができるどのような作用物質であってもよい。一実施形態では、標的化部分はリガンドである。本発明によれば、リガンドは、リポソーム内包物質が所望の効果を発揮する細胞（標的細胞）に優先的に結合および／または内在化する。リガンドは通常、結合対の一方の構成要素であり、他方の構成要素は、標的細胞（単数または複数）上もしくは標的細胞（単数または複数）内または標的細胞を含む組織内に存在する。本発明に好適なリガンドの例には、葉酸、タンパク質、たとえば、トランスフェリン、増殖因子、酵素、ペプチド、受容体、抗体もしくは抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ’、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体）、または抗体分子の抗原結合配列（ＣＤＲ）を含む他の任意のポリペプチドがある。標的化部分が抗体またはその標的抗原結合フラグメントであるリガンド標的化リポソームは、イムノリポソームと呼ばれる。好ましい実施形態では、標的化部分、たとえば、リガンドを有するリポソームは、標的細胞に内在化される。なお別の実施形態では、標的化部分はチロシンキナーゼ受容体、たとえば、ＥＧＦＲ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＰＤＧＦＲ受容体、ＶＥＧＦＲ受容体、ＦＧＦＲ受容体またはＩＧＦＲ受容体と特異的に相互作用するリガンドである。さらに別の実施形態では、標的化部分は増殖因子受容体、血管新生因子受容体、トランスフェリン受容体、細胞接着分子、またはビタミン受容体と特異的に相互作用する。

ある種の実施形態では、リポソーム造影剤のリポソームは、勾配形成剤、たとえば置換アンモニウム化合物により形成される膜内外の勾配を示す。別の導入方式は、たとえば、米国特許第８，１４７，８６７号明細書に記載されている。好ましくは、高い方の濃度の勾配形成剤はリポソームの内部（内側）空間である。さらに、本明細書に開示されたリポソーム組成物は、本明細書に開示された置換アンモニウムおよび／またはポリアニオンにより形成される勾配に加えて、１つまたは複数の膜内外の勾配を含んでもよい。たとえば、本明細書に開示されたリポソーム組成物に含まれるリポソームは、膜内外のｐＨ勾配、イオン勾配、電気化学ポテンシャル勾配および／または溶解度勾配をさらに含んでもよい。

捕獲剤を使用する場合、金属キレート剤部分がリポソームに内包された後、過剰な勾配形成剤をリポソームから除去（たとえば、ダイアフィルトレーションにより）してもよいことが理解されよう。

金属キレート剤
リポソーム造影剤の金属キレート部分は、二価金属カチオンを安定にキレート化し、リポソームの内部に保持することができるどのような作用物質であってもよい。こうした金属キレート化部分の例には、下記化合物がある。

好適なキレート剤の別の例には、下記式（ＩＶ）で表される化合物がある：

（式中、
ＱはＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＲ_３Ｒ_４であり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は各々独立にＨ、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルまたは置換もしくは非置換アリールから選択され、あるいは、（１）Ｒ_１およびＲ_２と（２）Ｒ_３およびＲ_４とのどちらか一方あるいは両方は一緒になって複素環式環を形成し；
Ｍは金属イオンであり、
かつ
ｎは、各々独立して、１〜５の整数である）。

二価金属カチオン
いくつかの実施形態では、金属イオンは二価金属カチオンである。本明細書に開示されたリポソーム造影剤に使用される金属カチオンは、たとえば、アルカリ土類系列、遷移金属系列、ランタニド系列またはアクチニド系列の任意の好適な二価金属カチオンであってもよい。二価金属カチオンは、リポソーム造影剤の使用目的に応じて選択することができる。

たとえば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴスキャン）に使用する場合、ポジトロン放出放射性同位元素（たとえば^４４Ｓｃ^２＋、^６４Ｃｕ^２＋、^１１０Ｉｎ^２＋または^１２８Ｃｓ^２＋の二価イオン）を利用することができる。ある種の実施形態では、二価金属カチオンは^６４Ｃｕ^２＋である。

あるいは、二価金属カチオンは、細胞または臓器内に付着するとコントラストを与えることができる金属カチオンであってもよい（たとえば、Ａｕ^２＋またはＡｇ^２＋）。

リポソーム造影剤の調製
本発明によるリポソームを調製するには、電気化学的勾配がリポソーム内部における薬剤の蓄積を駆動する勾配を用いた薬剤導入技術を使用することができる。よって、カチオンキレート剤錯体をリポソーム調製物に加えることで、二価金属のカチオンキレート化錯体を、脂質二重層の内側と外側との間に電気化学的勾配を有するリポソームに導入してもよい。

したがって、膜内外の勾配系は、ポリマーアニオン捕獲剤（たとえばポリホスフェート）または非ポリマーアニオン捕獲剤（スクロースオクタスルフェート）を含んでもよい。リポソーム薬剤の保持を改善するため、ポリマーポリアニオン、たとえばヘパリンまたはデキストラン硫酸の使用も報告されている。しかしながら、ポリアニオン性ポリマー、たとえばヘパリンおよびデキストラン硫酸は、著しい抗凝固活性を有し、したがって、ヘパリンおよびデキストラン硫酸はそれほど好ましくない。多くの場合、スクロースオクタスルフェートを用いると、ポリアニオン性ポリマーよりカチオン性部分の保持が改善され、優れた封入安定性が得られる。スクロースオクタスルフェートは、たとえば、塩基性アルミニウム塩（スクラルファート）の公知の医薬成分である。好都合なことに、スクロースオクタスルフェートは化学的に詳細に定義されており、公知の抗凝固活性または抗マクロファージ活性を有さず、その塩は純粋な結晶体で製造することができる。

一般に、リポソームは、当該技術分野において公知の任意の方法に従い調製することができる。リポソームを製造および導入する方法は当該技術分野において公知である。たとえば、米国特許第４，１９２，８６９号明細書には、イノシトールヘキサホスフェート（ＩＨＰ）を導入した合成脂質小胞を作製する方法が記載されている。ナノ粒子／リポソームを作製するための他の方法も、当業者に公知である（たとえば、米国特許出願公開第２００３／０１１８６３６号明細書；同２００８／０３１８３２５号明細書；および同２００９／０１８６０７４号明細書、ならびに米国特許第４，１９２，８６９号明細書；同４，３９７，８４６号明細書；同４，３９４，４４８号明細書；同４，３９４，１４９号明細書；同４，２４１，０４６号明細書；同４，５９８，０５１号明細書；同４，４２９，００８号明細書；同４，７５５，３８８号明細書；同４，９１１，９２８号明細書；同６，４２６，０８６号明細書；同６，８０３，０５３号明細書；および同７，８７１，６２０号明細書を参照されたい。

あるいは、キレート剤部分（すなわち、キレート剤部分と錯体を形成した金属カチオンを含まない）をリポソームに導入し、続いて二価金属カチオンをリポソーム製剤に加えてもよい。一実施形態では、リポソーム内のｐＨは、^６４Ｃｕが脂質二重層に入り込み、リポソーム内部でキレート剤と錯体を形成するように調整される。

診断薬
本発明は、リポソームを用いた候補治療に対する患者の層別化または患者の適合性の判定を行う方法を提供する。本発明はまた、患者がリポソーム治療薬を用いた治療の候補であるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）リポソーム造影剤を患者に注射するステップと、
（ｂ）患者の体内のリポソーム造影剤の分布を判定するため、患者のイメージングを行うステップと、
（ｃ）リポソーム治療薬を必要とする患者の体内のある位置にリポソーム造影剤が分布している場合、患者がリポソーム治療薬を用いた治療の候補であることを判定するステップと
を含む方法も提供する。

別の態様では、本発明は、患者内のある位置のリポソーム治療薬による処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）リポソーム造影剤リポソーム造影剤を患者に注射するステップと、
（ｂ）患者のイメージングを行うステップとを含み、患者内のある位置へのリポソーム造影剤の分布を減少またはなくす処置は効果的と判定される
方法を提供する。

一般に、本明細書に開示されたリポソーム造影剤は、以下に限定されるものではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞性肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、リンパ腫、乏突起膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など種々の新生物のイメージングのために使用することができる。

別の実施形態では、リポソーム造影剤は、種々の感染性因子、以下に限定されるものではないが、細菌、真菌およびウイルスにより引き起こされた血管損傷のイメージングのために使用してもよい。同様に、リポソーム造影剤は、血管障害、たとえば一部の化学療法薬剤の副作用である手足症候群（手掌・足底発赤知覚不全（ＰＰＥ）、足底手掌毒性、掌蹠角化症および皮膚毒性とも呼ばれる）の処置中の患者をモニターするために使用してもよい。手足症候群は、少量の抗腫瘍薬が手の手掌および足の足底の最も細い血管から漏出すると生じる。手および足の毛細管中の薬剤の量は、摩擦およびその後それらの四肢に生じる熱により増加する。その結果、これらの領域の毛細管からより多くの薬剤が漏出することがある。化学療法薬剤は血管から出ると、組織周囲を損傷させる。リポソーム造影剤はこうした損傷のイメージングに使用してもよく、それを踏まえて薬剤用量の調整あるいは抗炎症治療剤の投与など補助的療法の増加により、患者の処置を調整することができる。リポソーム造影剤はまた、こうした副作用を経験する可能性が最も高い患者の予測に使用してもよく、予防の補助的療法を利用してもよい。

標的細胞または組織のイメージングに必要なリポソーム組成物の量は、通常のインビトロおよびインビボ方法により判定することができる。こうした組成物の安全性試験は、薬剤試験の技術分野において一般的な方法と類似する。典型的には、本明細書に開示されたリポソーム組成物の投与量は、体重１キログラム当たり約０．０００７〜約１０ｍｇのリポソームの範囲である。例示的実施形態では、投与量は体重１キログラム当たり約０．０００７ｍｇのリポソームである。

典型的には、本明細書に開示されたリポソーム医薬組成物は、液体溶液または懸濁液として局所用医薬組成物または注射用医薬組成物として調製される。しかしながら、注射前の液体ビヒクルの溶液または懸濁液に好適な固体形態を調製してもよい。

本明細書に開示されたリポソーム組成物は、医学的に許容可能な任意の方法で投与することができ、イメージング対象の新生物によって異なってもよい。考えられる投与経路として、非経口経路、たとえば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、硬膜外腔、髄膜内または他の経路により注射のほか、経口、経鼻、点眼、直腸、経膣、局所または、たとえば、吸入による経肺がある。本組成物はまた、組織表面に直接適用してもよい。

キット
本発明は、本明細書に記載の診断方法に使用されるキットを提供する。

一態様では、本発明は、患者がリポソーム治療薬を用いた治療の候補であるかどうかを判定するためのキットであって、
（ａ）二価金属キレート部分を含む容器；
（ｂ）薬学的に許容される媒体中のリポソームの調製物であって、前記リポソームは内部空間および前記内部を前記媒体から隔てる膜を有し、前記内部空間は薬学的に許容される媒体に対して電気化学的勾配を有する溶液を含む調整物；および
（ｃ）下記ステップのための説明書
（ｉ）二価金属キレート部分を二価金属と組み合わせて、二価金属キレート部分と錯体を形成した二価金属の溶液を形成するステップ；
（ｉｉ）リポソーム造影剤が調製されるような条件下で、二価金属キレート部分と錯体を形成した二価金属の溶液をリポソームの調製物と組み合わせるステップ；および
（ｉｉｉ）患者がリポソーム治療薬を用いた治療候補であるかどうかを判定するため、リポソーム造影剤を患者に投与するステップ
を含むキットを提供する。

一般に、キットは、技術者が患者に投与する前にリポソーム造影剤を現場で調製できるように提供される。このため、キットは一般的には、二価金属キレート部分（二価金属キレート部分の溶液であってもよい）；薬学的に許容される媒体中のリポソームの調製物；および二価金属キレート部分と錯体を形成した二価金属の溶液を形成するため、二価金属キレート部分を二価金属と組み合わせるステップと、リポソーム造影剤が調製されるような条件下、二価金属キレート部分と錯体を形成した二価金属の溶液をリポソームの調製物と組み合わせるステップとのための説明書を含む少なくとも１つの容器を含む。二価金属カチオンが短い半減期を有する放射性同位元素である場合、技術者はキットを用いて、患者へのリポソーム造影剤の投与の直前にリポソーム造影剤を調製することができる。二価金属カチオンが安定な同位元素である場合、キットは任意に、二価金属カチオンを含む容器をさらに含んでもよい。あるいは、二価金属カチオンが安定な同位元素である場合、キットは、既に二価金属キレート部分と錯体を形成した二価金属の溶液を含んでもよい。

以下の例は、本明細書に記載のアッセイ方法、スクリーニング方法および治療方法をどのように製造および使用するかに関する完全な開示および記載を当業者に提供するために提示するものであり、本発明者らがその発明と見なす内容の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１：ジアセチル４，４’ビス（３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）プロピル）チオセミカルバゾン（４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ）の調製
図１は、ジアセチル４，４’ビス（３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）プロピル）チオセミカルバゾン（４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ）の化学構造、および^６４Ｃｕと錯体を形成した４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの構造を示す。キレート剤４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣは、スキーム１に示すように２段階合成により調製することができる：

スキーム１
ステップ１。ジアセチルジヒドラゾンの合成
Ｂｕｓｃｈ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ Ｂａｉｌａｒ，Ｊ．Ｃ．Ｊｒ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖ．７８，ｐ．１１３７−１１４２，１９５６）により記載された一般的な方法に従い、ジアセチルジヒドラゾンの合成を行った。

加熱マントル、磁気撹拌子、直線筒還流冷却器、および冷却器の上端に装着された滴下漏斗を備えた１００ｍｌの丸底フラスコに、６０ｍＬの２００ｐｒｏｏｆの試薬エタノールおよび７．７ｍｌ（７．９ｇ）のヒドラジン水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この溶液を撹拌および還流させながら沸騰させ、漏斗から５ｍｌのブタン−２，３−ジオン（ジアセチル、Ｉ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を約３０分の期間にわたり８秒に約１滴の速度で加え、この時点で添加を終了した。次いで反応混合物を１時間還流してから、５０ｍｌの蒸留水を加えた。冷却器を蒸留位置に変え（Ｋｌａｉｓｅｎ型アダプターを使用）、引き続き加熱しながら約７０ｍｌの溶媒（エタノール）を周囲圧力で留出させた（沸騰範囲８０〜９５℃）。残渣を短時間ロータリーエバポレーターに入れたところ、真空を適用後あまり時間をおかずに、溶液がおびただしく結晶化した。冷蔵庫（約４℃）で２時間後、結晶を吸引下、ポリプロピレンフリット漏斗で濾別し、風乾した。この黄色の生成物を７５ｍｌの２００ｐｒｏｏｆの沸騰エタノールに溶解させ、放冷して再結晶化した。冷蔵庫（約４℃）で一晩インキュベーション後、再結晶化した生成物を吸引下、濾別し、４ｍｌの冷エタノールで４回洗浄し、風乾してから１１０μｍ Ｈｇで１時間インキュベートした。この合成により、計算分子量１１４を有するＩＩのほぼ無色の結晶４．２７ｇ（ジアセチルに対して６３％）が得られた。

ステップ２。ジアセチルの４，４−ビス−（３−ジエチルアミノ）プロピル）チオカルバゾンの合成。
ジアセチルの４，４−ビス−（３−ジエチルアミノ）プロピル）チオカルバゾンの合成は、たとえば、１９６７年５月６日に出願されたＦａｒｂｗｅｒｋｅ Ｈｏｅｃｈｓｔ Ａ．Ｇへの仏国特許出願公開第１，５２８，９６８号明細書に記載されているように、ジケトンと置換イソチオシアネートとの反応によりチオセミカルバゾンを調製する一般的な手順によった。

ステップ１と同じ還流−添加の組み立てを使用した。１．１７１ｇのジアセチルのビス−ヒドラゾンを１０ｍｌの２００ｐｒｏｏｆの試薬エタノールに懸濁し、沸騰させ、すべての固体が溶解するまでさらにエタノールを加えた（総量１８ｍｌのエタノール）。３．８ｍｌ（３．６ｇ）のジエチルアミノプロピルイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ、９７％）を２．５ｍｌのエタノールに溶解させ、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５濾過助剤の層を吸引下で通した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を２ｍｌのエタノールで２回リンスし、リンス液をイソチオシアネート溶液と組み合わせた。この溶液を約１滴／秒の速度でジアセチルビス−ヒドラゾンの沸騰溶液に滴下して加え、還流を合計２．５時間継続した。次いで還流を蒸留に変えて、約１３ｍｌのエタノールを留出させた。残りの反応混合物を氷上で冷却し、冷却混合物から反応生成物を結晶化させた。冷蔵庫（約４℃）で１時間後、結晶沈殿物を吸引しながらＰＰ多孔性プレート漏斗で濾別し、４ｍｌの冷エタノールで２回洗浄し、風乾した。粗生成物ＩＩＩを淡褐色の粉末として２．０５ｇ得た。

次いで１．０３ｇの粗生成物ＩＩＩを１．５ｍｌの３Ｎ ＨＣｌおよび３ｍｌの水と混合した。１滴の３Ｎ ＨＣｌの添加時、溶液は透明でｐＨ約３（試験紙により判定された）であった。溶液をＷｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｎｏ．２濾紙で濾過し、濃縮Ｎａ_２ＣＯ_３を加えてｐＨを約９．５に上げた。沈殿した生成物をＰＰ漏斗で濾去し、２ｍｌの冷水で２回洗浄し、短時間風乾し、得られたペーストを２０ｍｌのバイアルに移し、４ｍｌの沸騰エタノールに溶解させた。冷却すると、生成物は結晶化した。氷浴上で３０分後、沈殿物を吸引下、漏斗で濾別し、２ｍｌの冷エタノールで２回、２ｍｌの無水エーテルで２回洗浄し、約１時間真空乾燥させた。合成のこの段階で、計算分子量４５８を有する０．７０１ｇを得た。ＩＩＩの水溶液にＣｕＳＯ_４溶液を添加すると、黄褐色（紅茶のよう）が生じることから、銅錯体の形成が示される。ＩＩの水溶液に硫酸銅溶液を添加すると、緑色の錯体が得られる。

ＡＴＳＭの合成
比較のため、Ｇｉｎｇｒａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．４０，ｐ．１０５３−１０５９，１９６２に本質的に記載されているようにジアセチル４−メチルチオセミカルバゾン（ＡＴＳＭ）を合成した。最初に、０．０８７ｍｌ（８６ｍｇ、ｄ＝０．９９０、１ｍＭｏｌ）のジアセチルを５ｍｌのエタノールに溶解させた。次いで０．２１ｇの４−メチルチオセミカルバゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５ｍｌの水および０．４ｍｌの氷酢酸に溶解させ、約４０℃で撹拌しながらジアセチル溶液に加えた。約１分後、結晶沈殿物が形成し始めた。室温で１時間撹拌後、この反応ミックスを一晩冷蔵庫（約４℃）に入れた。翌日、沈殿物を吸引下、ＰＰフリット漏斗で濾別し、３ｍｌの水で２回、３ｍｌのエタノールで２回、３ｍｌのアセトンで１回洗浄し（この段階で沈殿物の一部が溶解することがが観察された）、風乾した。１１０μｍ Ｈｇ真空で３０分間さらに乾燥後、収量は０．１９３４ｇ（７４％理論収率）で分子量２６０（計算）であった。^６４Ｃｕと錯体を形成したＡＴＳＭの構造を図２に示す。

実施例２：リポソーム造影剤の調製
３つの成分を組み合わせてリポソーム造影剤を注射用に調製した（たとえば、ラジオファーマシー（ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｙ）にて）：
１．^６４Ｃｕ、放射性化学物質として提供された（たとえば、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから）；
２．キレート剤４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ（たとえば、Ａｌｂａｎｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ａｌｂａｎｙ，ＮＹから、または本明細書に記載するように調製）；および
３．賦形剤リポソーム（すなわち、キレート化された^６４Ｃｕを含まないリポソーム）。

２段階手順（図３を参照）に従い、これらの成分を順次組み合わせて臨床使用用のリポソーム造影剤を調製した。第１のステップでは、放射性化学物質として０．１Ｍ ＨＣｌ中に提供された錯体を形成していない^６４Ｃｕを、キレート化剤、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを含むｐＨ緩衝液に加えて、錯体を形成した^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを調製した。図１は、錯体を形成していないキレート化剤および錯体を形成したキレート化剤の化学構造を示す。一実施形態では、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣへの^６４Ｃｕのキレート化は、混合物を６５℃で短時間加熱し、続いて氷水浴で冷却することにより促進される。別の実施形態では、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣへの^６４Ｃｕのキレート化を室温（２２〜２５℃）で行う。図４は、モル過剰のキレート剤が^６４Ｃｕと反応する反応の模式図を示す。次いで第２のステップでは、キレート化された^６４Ｃｕ溶液を、０．２μｍのフィルターを通して、リポソームへの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入効率＞９０％を可能にする化学的勾配を用いて調製したＰＥＧ化リポソームに加えてリポソーム造影剤を作製した。図５は、リポソーム導入の模式図を示し、硫酸アンモニウムによるｐＨ勾配を有する賦形剤リポソームに入り込んだ、錯体を形成したキレート剤および錯体を形成していないキレート剤を図示する。図５に示したように、この２つのキレート剤種はアンモニウムイオンからプロトンを受け取った後正電荷を有し、リポソームにトラップされる一方、遊離無電荷アンモニアはリポソームから出て行くことができる。

放射性金属を用いた試験のための４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ溶液の調製。
ＰＴＦＥライナー付きスクリューキャップを備えた１ｄｒのガラスバイアルに、１６．９ｍｇの４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ（実施例１）を１．８５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、２４μｌの３Ｎ ＨＣｌを加え、２０ｍＭの４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを最終濃度とする溶液を得た。この溶液は最初黄色であったが、酸の添加時に無色になった。あるいは、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ溶液は、インビボ試験を目的にＤＭＳＯの非存在下で調製することもできる。一例では、１０ｍｇの４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを１ｍＬの０．０５Ｍのクエン酸（４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。次いでこの濃縮溶液を他のｐＨ緩衝液（たとえば、０．０２〜０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ５〜８）に使用するのに望ましい濃度で希釈してもよい。

勾配を有するリポソームへのＣｕ−ＩＩＩの導入性のバリデーション
勾配を有するリポソームへのＣｕ−ＩＩＩの導入性を試験するため、以下の使用溶液を調製した：
１．２０ｍＭのＣｕＳＯ_４水溶液；５．０ｍｇ／ｍｌのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ蒸留水溶液；１６．７ｍｇのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏを３．３４ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏに溶解させたもの。
２．２０ｍＭのＤＥＡＰＡＴＳＣ（ＩＩＩ）：９．１６ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＰＡＴＳＣを含むＤＭＳＯ＋ジヒドロクロリドになるＩＩＩの遊離塩基を滴定するための当量の３Ｎ ＨＣｌ。（遊離塩基溶液は黄色、ジヒドロクロリドはほぼ無色である。）２８．２ｍｇのＩＩＩを３．０８ｍｌのＤＭＳＯ（Ａｌｄｒｉｃｈ ４７１２６７ ｌｏｔ ５２５９６ＡＫ）に溶解させ、４３μｌの３Ｎ ＨＣｌを加えた。
３．２０ｍＭのＡＴＳＭ５．２ｍｇ／ｍｌを含むＤＭＳＯ。１４．８ｍｇを２．８４ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。
４．１０ｍＭのヒスチジン−１００ｇ／Ｌのスクロース緩衝液、ｐＨ６．５（ＨＳ緩衝液）。風袋を測定した２５０ｍｌの乾燥メスフラスコに、スクロース（Ｓｉｇｍａ）２５．０３ｇ（理論値２５ｇ）およびＬ−ヒスチジンＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）０．３８６７ｇ（理論値０．３８８ｇ）を加え、次いで蒸留水を加え、スクロースおよびＬ−ヒスチジンを溶解させ、２５０ｍｌの目盛とした。次いでメスフラスコを秤量したところ、溶液重量は２５９．０ｇであった。水の重量が２３３．６ｇであることに基づき、計算密度は１．０３６であった。溶液をビーカーに移し、ｐＨを１滴の濃ＨＣｌおよび３滴の３Ｎ ＨＣｌで６．５０に調整した。溶液を、ＳｔｅｒｉＴｏｐ（登録商標）／ＳｔｅｒｉＣｕｐ（登録商標）を２５０ｍｌ、０．２２μｍを用いて真空下で濾過した。
５．リポソーム：ＨＳＰＣ−Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ（２０００）ＤＳＰＥ（モル比３：１：０．０５）リポソームを、１０ｖｏｌ％エタノール／９０ｖｏｌ％ ２５０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４中の１００ｍＭのＨＳＰＣおよび６５℃で、１×２００ｎｍおよび６×１００ｎｍの積層ＰＣＴＥ膜を２回通してエタノール注入ＭＬＶを押し出すことにより調製した。

Ｃｕ２＋の錯体化およびアンモニウム勾配リポソームへの導入。
勾配を有するリポソームを以下の通り作製した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍを含む新しいＰＤ−１０カラムを２ＣＶのＨＳ緩衝液で平衡化した。１ｍｌのＨＳＰＣ−Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ（２０００）ＤＳＰＥ（モル比３：１：０．０５）リポソーム（上記を参照）を充填し、ＨＳで溶出した。リポソーム画分を３〜５．５ｍｌを集めて、ＨＳで７．５ｍｌに調整し、約１２．５ｍＭのリン脂質を得た。

Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣおよびＣｕ：ＡＴＳＭは、以下の通り形成した。１ｍＬのＨＳに５μＬの２０ｍＭのＣｕＳＯ４および５μｌの２０ｍＭの４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ（ＤＭＳＯ中）または５μＬの２０ｍＭのＡＴＳＭ（ＤＭＳＯ中）を加えた。ＡＴＳＭのサンプルは濁って褐色の沈殿物が生じた。４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣサンプルは黄褐色になったが、透明なままで、何ら沈殿する様子はなかった。キレート剤およびＣｕの濃度は０．１ｍＭであった。

４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ−Ｃｕの２ｍＭの使用溶液は以下の通り調製した。０．８ｍｌのＨＳ、０．１ｍＬの２０ｍＭの４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ溶液、および０．１ｍＬの２０ｍＭのＣｕＳＯ_４溶液を混合し、１分間６０℃で加熱し、周囲室温まで冷却した。黄褐色の溶液を得た。

リポソームは以下の通り導入した。勾配を有する０．５ｍＬのリポソーム（上記ステップ１）を０．１ｍｌの２ｍＭのＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ−Ｃｕキレートと混合し、６０℃の水浴で５分間加熱し、次いで氷上で冷却した。ＨＳ緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラムにリポソームを充填した。目で検出可能な色のＣｕ：ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体はすべてボイドボリューム画分で溶出した（３〜４．５ｍｌ）。この画分を集めて保存した。これらの結果から、Ｃｕ：ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣがアンモニウム勾配を有するリポソームに効率的に導入されたことが示される。

Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体のＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）を用いたクロマトグラフィー。０．１ｍｌの２ｍＭのＤＥＡＰＡＴＳ−Ｃｕを０．５ｍＬのＨＳ緩衝液で希釈し、上記のようなＰＤ−１０カラムを用いたクロマトグラフィーに供した。錯体は明確に視認できる黄褐色のバンドとして移動し、約１０ｍｌ（総カラムベッドボリューム）の溶出液に現れ始め、約３．５ｍｌで溶出した。

ラジオファーマシー（ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｙ）で調製されると、リポソーム造影剤は、^６４Ｃｕを含む長時間循環するナノリポソームの注射可能な滅菌非経口用液剤となる。単層リポソーム粒子の平均的な大きさは７５〜１００ｎｍの範囲であり、完全水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよび少量のポリ（エチレングリコール）（Ｍｏｌ．重量２０００）誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）で構成された二分子膜からなる。リポソーム膜は、キレート化された^６４Ｃｕが含まれる内部空間を囲い込む。リポソーム造影剤を模式化したものを図６に示す。リポソーム造影剤は、薬理学的に活性な医薬成分を含まない。リポソーム造影剤は、^６４Ｃｕに加えて１０．２ｍｇ／ｍＬのＨＳＰＣ、３．３９ｍｇ／ｍｌのコレステロール、０．１８ｍｇ／ｍＬのメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、等張性を維持するための１５０ｍＭの塩化ナトリウム、濃度０．８ｍｇ／ｍＬ未満の硫酸アンモニウム、濃度０．８ｍｇ／ｍＬ未満の硫酸ナトリウム、および濃度１．５ｍｇ／ｍｌ未満クエン酸ナトリウムを含む。

実施例３：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣは^６４Ｃｕをキレート化し、リポソームに導入される
以下のデータから、図３に記載のステップに従い、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣが^６４Ｃｕをキレート化し、続いてリポソームに導入されることが可能であることが立証される。

例示的なラジオファーマシー（ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｙ）のプロトコルに概説された条件下、１０９ｎｍｏｌの４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを使用して２０ミリキュリー（ｍＣｉ）の^６４Ｃｕを１分間６５℃でキレート化し、目標とした比放射能約０．２ｍＣｉ／ｎｍｏｌを得た。インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）アッセイを使用して、キレート化混合物の錯体を形成していない６４Ｃｕおよび６４Ｃｕ（ＩＩ）−４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体の画分を定量した。錯体を形成していない^６４Ｃｕは溶媒先端で検出することができる一方、^６４Ｃｕ（ＩＩ）−４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体はサンプルがスポットされる原点にとどまった。

上述のＩＴＬＣアッセイ（図７）を用いて、キレート化の効率が、０．０７〜０．３ｍＣｉ／ｎｍｏｌの範囲の比放射能を有する^６４Ｃｕの調製物に対して９４〜９９％の範囲であることが観察された（表１を参照）。

より一般的には、リポソーム造影剤の調製のための重要な成分は、図３に概説されたステップに従い組み合わせればよい。この標識手順を始める前に、以下の準備ステップに従うべきである：６５℃の熱浴および氷水浴を準備する。^６４Ｃｕバイアルの内容物をキレート剤バイアルに加える。^６４Ｃｕ−キレート剤バイアルを６５℃の熱浴に１分間入れるか、あるいは室温で１分間インキュベートする。加熱する場合、氷浴を用いて室温まで冷却する。全内容物を、たとえば、濾過用シリンジを用いてリポソームバイアルに移す。リポソームバイアルを６５℃の熱浴に１０分間入れ、次いで氷浴で室温まで冷却する。サンプルを取り出して導入効率を調べる。

実施例４：リポソームへの^６４Ｃｕの導入効率
ステップ２のリポソームの導入効率（図３を参照）を判定した。リポソームに^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ：脂質比０．０１３〜４．２モル％の範囲にわたり導入した。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、封入された（リポソームの）放射能を総放射能から分離した。これにより、表２に示すように４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ：脂質比＜２ｍｏｌ％で^６４Ｃｕの＞９０％がリポソームに導入されることが判定された。これらのデータから、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣと脂質との比を０．０７ｍｏｌ％であるように選択した。

例示的実施形態では、^６４Ｃｕは表３に示した仕様に適合する。

放射性核種の純度は、^４０Ｋ、^５５Ｃｏ、^５６Ｃｏ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^６０Ｃｏおよび^６７Ｇａの測定によりその分析証明書に示されたように評価する。体積２０〜１００μＬおよび比放射能５０〜４００ｍＣｉ／μｇの^６４Ｃｕを含む０．１ＭのＨＣｌをプラスチックバイアルに用意する。

実施例５：脂質成分
本明細書に記載のリポソームは、種々の脂質成分を用いて形成することができる。代表的な脂質の構造を図８に示す。脂質の選択は、限定的であることを意図するものではない。

表４は、リポソーム賦形剤の組成および最終容器の１０ｍＬ溶液における賦形剤リポソームの組成（図３の賦形剤リポソーム）を示す。

表５は、リポソーム賦形剤の各成分の機能を示す。

^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入のため、様々な脂質成分および導入勾配からなる他の賦形剤リポソーム製剤を調製した。４℃（表６）と４℃、３０℃および３７℃（表７）とで貯蔵したサンプルのリポソーム組成および導入効率を下記に列挙する。

実施例６：非標的化リポソーム造影剤における^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの使用
本明細書に記載するように、一実施形態では、リポソーム造影剤は、内包されたキレート剤（４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ）および^６４Ｃｕキレート化錯体（^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ）（以下、「リポソームＡ」）を含む非標的化リポソームである。４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣは、２つのジエチルアミノ（プロピル）基を加えることによりＡＴＳＭ構造から誘導される（図１および図２の構造を比較）。^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ（図２の構造を参照）は現在、癌患者のＰＥＴ造影剤として臨床試験されている。４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣは、ＡＴＳＭの^６４Ｃｕキレート化活性を保持するという点でＡＴＳＭに類似している。しかしながら、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣは意外にも、化学的勾配を有するＰＥＧ化リポソームに速やかに内包されることで、上記のようなリポソーム造影剤を生じるという特性を有する。

実施例７：腫瘍付着に対するリポソーム標的化の影響
前臨床試験により、総腫瘍付着に対するリポソーム標的化の影響が検査されてきた。これらの試験から、腫瘍のＨＥＲ２受容体へのＰＥＧ化リポソームの標的化が、非標的化リポソームと比較してその薬物動態または全体的な腫瘍付着に影響を与えなかったことが示されている。Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌは、リポソームを^６７Ｇａで標識し、ＨＥＲ２標的化リポソームおよび対応する非標的化リポソームの腫瘍付着の％投与量／ｇ組織（％ｉ．ｄ．／ｇ）が類似していることを示した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（６６）６７３２（２００６）。ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＲＬ−５８２２（商標））胃癌マウス異種移植モデル、およびＢＴ４７４−Ｍ３乳癌マウス異種移植モデルを用いた、ＨＥＲ２標的化リポソームＢおよび非標的化リポソーム（同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６４４９６号パンフレットに開示されている）による腫瘍付着を比較しても、同様の結果が得られ、この２種のリポソーム製剤は、腫瘍細胞取り込み（図２５挿入図）のみに相違があるものの、腫瘍における総リポソーム付着に大きな相違は、検出されなかった（図２５）。図２６はさらに、様々なＨＥＲ２発現量を有する腫瘍におけるリポソームＢの腫瘍付着の間に相関関係が確認できないため、リポソーム標的化が腫瘍付着に何ら明らかな影響を与えないことを図示する。同様に、ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍モデル（ＨＥＲ２過剰発現腫瘍）でも、ＨＥＲ２標的化リポソームＢは、非標的化リポソームＡと同様の腫瘍付着を有することが示された。

腫瘍への薬剤の総送達量を決定付ける際のリポソーム付着の重要性はまた、動態計算モデリングの結果によっても裏付けられる。本発明者らは、文献データに基づき腫瘍へのリポソーム送達に関する生理学的薬物動態モデルを開発した。このモデルは、リポソームおよび遊離型薬剤の薬物動態のほか、血管、間質および細胞の空間を捕捉する生理学的腫瘍コンパートメントを含む。

本モデルは文献データで訓練した。図９に示すように、モデルの感度解析から、リポソーム付着に関する因子、たとえば、血管表面積およびリポソームに対する血管系の透過性が腫瘍細胞への薬剤の総送達量の最も重要な決定因子であることが示された。

この動態モデルを適合させて、腫瘍におけるリポソームＡ付着のモデルを作成した。図１０に示すように、本モデルは、血漿、腫瘍血管系および腫瘍間質におけるリポソームＡ濃度のプロファイルをシミュレートした。このモデルにより、付着した（間質）リポソームと腫瘍血管空間内のリポソームとから発生したと予想される全腫瘍シグナルの割合を推定することができた。さらに、このモデルにより、シグナルに対する^６４Ｃｕ崩壊の作用（図１０Ｂ）のほか、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）Ｆｅｂ；７（２）：２４３−５４からの患者データに基づき、患者において予測されるばらつき（図１０Ｃ）のシミュレーションも可能になった。腫瘍付着のばらつきは、リポソームＢ（図２６）のほか、他の^６４Ｃｕ導入リポソームを用いた複数の前臨床異種移植モデルにおいても観察された。

実施例８：ヒト血漿中の^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソーム（リポソームＡ）のインビトロ安定性
^６４Ｃｕは、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソーム（リポソームＡ）のヒト血漿中での４８時間のインキュベーション後、リポソームに効率的に保持されることが示された（図１１）。リポソームのインビトロ安定性は、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームをヒト血漿と３７℃でインキュベートすることにより検査した。指定のインキュベーション時間（最大４８時間）で、封入された（リポソームの）放射能は、サイズ排除クロマトグラフィー（リポソーム画分、タンパク質画分および^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ／錯体を形成していない^６４Ｃｕ画分を分離できるＣＬ４Ｂカラム）を用いて放出／未封入放射能から分離した。データから、リポソームＡは、生理的温度のヒト血漿中で高度に安定で、４８時間までに検出される未封入^６４Ｃｕは、＜５％であることが示される。

実施例９：^６４Ｃｕ導入リポソームＢのインビボイメージング
図１２は、ＣＴ画像とＰＥＴ画像との位置合わせを行ってＰＥＴ−ＣＴ融合画像を得るプロセスを示す。^６４Ｃｕ導入リポソームのイメージングが可能であることは、^６４Ｃｕ導入リポソームＢを用いて示した。ＰＥＴ／ＣＴのイメージングは、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを導入したリポソームＢを静脈内注射したＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍（乳腺脂肪織に接種）を有するマウスを対象に行った。図１３に示すように、^６４Ｃｕ導入リポソームＢは、主に肝臓および脾臓のほか、リポソームの長時間循環する特性のため循環系に蓄積した。^６４Ｃｕ導入リポソームＢの顕著な蓄積は、注射から１０時間後および２４時間後の腫瘍部位でも検出された。

実施例１０：リポソームＡの薬物動態および体内分布
リポソームＡの薬物動態および体内分布は、腫瘍を有さないＣＤ−１（登録商標）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）を用いて評価した。マウスに２つのバッチのリポソームＡ（１００〜２００μＣｉ／マウス、２０μｍｏｌリン脂質／ｋｇ）の１つを注射した。表記の時点に伏在静脈から血液サンプルを採取した。γカウンターを用いて^６４Ｃｕの血漿中濃度を測定した（図１４Ａ）。データには比較のため、ＣＤ−１マウスにおける^６４Ｃｕ導入リポソームＢ（^６４Ｃｕ放射能およびドキソルビシン量の定量）のほか、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＢＴ４７４−Ｍ３マウス異種移植モデルに投与されたリポソームＢ（ドキソルビシン量の定量）を用いた薬物動態試験からのデータも含まれる。リポソームＡの薬物動態は、異なるバッチ間で再現性が高いことが示され、かつ類似の製剤特性を有するリポソームＢの血漿クリアランスプロファイルと整合していた。リポソームＡの体内分布は、γカウンターを用いて様々な臓器の^６４Ｃｕの量を定量することにより研究した。肝臓、脾臓および腎臓は、リポソームＡの有意な蓄積を示すことが明らかになった（図１４Ｂ）。

実施例１１：錯体を形成していない^６４Ｃｕおよび^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体と比較したリポソームＡのインビボでのＰＫおよび体内分布
ＣＤ−１マウスに錯体を形成していない^６４Ｃｕまたは^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体Ａ（１００〜２００μＣｉ／マウス）を静脈内注射した。図１５Ａに示すように、錯体を形成していない^６４Ｃｕおよび^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体の血漿クリアランスはリポソームＡより有意に大きかったことから、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体が賦形剤リポソームに安定に封入されていることが示唆される。リポソームＡの体内分布も、前の実施例と同じ方法を用いて評価した。心臓 肝臓、脾臓および腎臓は、リポソームＡの有意な蓄積を示すことが明らかになった（図１５Ｂ）。

実施例１２：他のリポソーム製剤と比較したリポソームＡのインビボでのＰＫおよび体内分布
リポソームＡに記載したのと同じプロトコルを使用して、Ｈｅｒ２標的化リポソームドキソルビシン、リポソームＢに^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体を導入した。意外にも、ドキソルビシンの導入後のリポソームにおける残留ｐＨ勾配は、リポソーム内の^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体の安定な内包を誘導するのに十分であることが明らかになった。^６４Ｃｕ導入リポソームＢの薬物動態は、^６４Ｃｕおよびドキソルビシンの両方の血漿レベルを、それぞれγカウンターおよびＨＰＬＣを用いて定量することにより研究した。図１６Ａに示すように、^６４Ｃｕおよびドキソルビシンの血漿クリアランスの間に有意差がなかったことから、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体は、インビボでリポソームに安定に内包されていることが示される。さらに、^６４Ｃｕ導入リポソームＢの血漿クリアランスは、腫瘍を有するマウスにおけるリポソームＢの血漿クリアランスとも同様であった。重要なのは、リポソームＡの薬物動態が^６４Ｃｕ導入リポソームＢのそれと類似していることである。リポソームＡの体内分布も、ＣＤ−１マウスの^６４Ｃｕ導入リポソームＢのそれに類似していた（図１６Ｂ）。重要なのは、これらの結果から、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ錯体がリポソーム内で高度に安定であり、かつリポソームのインビボでの分布を反映することが示唆されることである。

ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍（乳腺脂肪織に接種）を有するマウスにリポソームＡまたは^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを導入したリポソームＢを静脈内投与した。注射から４８時間後、^６４Ｃｕ導入リポソームＢおよびリポソームＡの腫瘍蓄積は、約４％投与量／ｇ組織（ｉ．ｄ．／ｇ）であり、Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．により以前報告されたもののほか、ＢＴ４７４−Ｍ３乳癌およびＮＣＩ−Ｎ８７胃癌マウス異種移植腫瘍モデルを対象にリポソームＢを用いて得られたデータにも類似していることが明らかになった。これらの結果から、^６４Ｃｕが少なくとも４８時間リポソームに安定に結合した状態が続くことが示される（図１６Ｃ）。このことから、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣがリポソームを放射能標識するのに効果的な手段となり、かつリポソーム造影剤の腫瘍付着を追跡するためのＰＥＴ薬として好適であることが示唆される。

実施例１３：^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの毒性推定および用量レベル
ヒト血液中の銅（Ｃｕ）の基準範囲は７０〜１５０μｇ／ｄＬである（ＡＴＳＤＲ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｆｏｒ Ｃｏｐｐｅｒ，２００４）。毒性用量レベルは、数週間にわたり＞１０ｍｇ／人／日（約１５４μｇ／ｋｇ；６５ｋｇ成人）であると推定される。リポソームＡは０．２μｇ／患者（約０．００３μｇ／ｋｇ）で投与され、これは銅の毒性と考えられる反復投与範囲より約５１，０００倍低い。加えて、リポソームＡに関連する銅は、投与前にキレート化され、封入される。

実施例１４：リポソーム体内分布を正確に測定するための定量可能なＰＥＴ薬としてのリポソームＡのバリデーション
腫瘍を有するマウスにおけるリポソームＡの臓器取り込みを、ＰＥＴ画像の関心体積（ＶＯＩ）に基づく解析のほか、切除臓器のγ−カウンティング（すなわち伝統的な体内分布試験）を用いて定量した。マウスのイメージングは、リポソームＡを用いた注射から４８時間後に行った。イメージングの直後に臓器採取のためマウスを屠殺した。次いで個々の臓器をγ−カウンティングに供して放射能（すなわち^６４Ｃｕ）の量を定量した。ＰＥＴ画像のＶＯＩ解析は、ＰＥＴ画像に位置合わせしたＣＴ画像に基づき臓器の輪郭線を配置することにより行った。図１７に示すように、ＰＥＴ画像を用いて臓器ごとに測定された放射能は、対応する臓器のγ−カウンティングにより測定された放射能とよく相関する。注射から１８時間後に得た一連のＰＥＴ画像を用いて同様の研究を行った。得られた結果は、注射から４８時間後の前述のデータセットと一致した。これにより、リポソームＡの体内分布がリポソームＡを注射した被検体のＰＥＴスキャンにより調査できることが立証される。

実施例１５：リポソーム薬剤の腫瘍付着を測定するためのツールとしてのリポソームＡ
リポソームＡが腫瘍におけるリポソーム薬剤のばらつきを測定するためのツールとして使用できることを立証するため、２つの異なる種類の腫瘍を有する異種移植を用いてＰＥＴ−ＣＴイメージングを行った。Ｈ５２０（ＮＳＣＬＣモデル細胞株ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ−１８２（商標））細胞およびＢＴ４７４−Ｍ３（乳癌モデル細胞株、（Ｎｏｂｌｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９ ６４：７４１−５１を参照）細胞をそれぞれ左側腹部および右側腹部に接種したマウスにリポソームＡを注射した。注射から１０分後、６時間後および２０時間後にＰＥＴ−ＣＴイメージングを行った。図１８に示すように、注射から１０分後、リポソームＡは主に循環血中に見られ、これは長時間循環するリポソームの特徴であることが知られている。注射から６時間後、リポソームＡの蓄積は、Ｈ５２０腫瘍における著しい付着と共に脾臓および肝臓で明確に視認できる。注射から２０時間後、ＰＥＴ画像のＶＯＩ解析によりＨ５２０腫瘍およびＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍におけるリポソームＡの蓄積は、２３％ｉ．ｄ．／ｇおよび３％ｉ．ｄ．／ｇに達したことから、腫瘍におけるリポソーム付着のばらつきは、リポソームＡおよびＰＥＴイメージングを用いて測定できることが立証された。２つの腫瘍におけるリポソームＡの腫瘍付着量は、臓器切除およびγ−シンチレーション測定によっても確認された。

実施例１６：薬剤を含むリポソーム（リポソームＢ、リポソームＣ）への^６４Ｃｕ導入
リポソームＡに関する上記と同様の導入手順を用いて、化学療法剤を含む他のリポソーム製剤に残留化学的勾配により^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを導入することにも成功している。こうしたリポソーム製剤の例として、ＨＥＲ２標的化ドキソルビシン導入リポソームＢ、イリノテカン導入リポソームＣのほか、市販されているドキソルビシン導入Ｄｏｘｉｌ（登録商標）が挙げられる。キレート化効率が＞９０％の^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを種々の量のリポソームＢ、リポソームＣまたはＤｏｘｉｌ（登録商標）と混合した。次いで混合物を６５℃の水浴で１０分間インキュベートし、その後導入手順を氷水浴クエンチした。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、９０％超の^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣをリポソームＢ（下記表８）、リポソームＣ（下記表９）およびＤｏｘｉｌ（登録商標）（下記表１０）に導入できることが判定された。

実施例１７：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤の貯蔵安定性
様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤（下記表１０を参照）を様々な条件下で貯蔵した。指定の時点で、サンプルを集めて、その貯蔵安定性を機能表示値により評価した。

貯蔵ｐＨの影響
４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを一定範囲のｐＨ（ｐＨ４〜７）でクエン酸塩緩衝液を用いて製剤化した。図１９Ａに見られるように、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの分解量は、製剤における貯蔵ｐＨが上昇するにつれて減少する。ｐＨ６〜７では、分解率が非常に小さく、−２０℃または４℃で貯蔵した場合、４ヶ月の期間にわたり観察された分解は１５％未満であった。

貯蔵温度の影響
クエン酸塩緩衝液を用いて製剤化した４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを４つの異なる温度（−２０℃、４℃、３０℃および３７℃）で製剤化した。図１９Ｂに見られるように、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤を３０℃および３７℃で１ヶ月の期間にわたり貯蔵した場合、有意な分解が観察された（＞６０％）。一方、−２０℃および４℃で貯蔵した４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤は安定に保存することができ、４ヶ月の期間にわたり検出された分解は１５％未満である。

凍結乾燥製剤
様々な４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤を凍結乾燥させ、様々な条件下で貯蔵してその貯蔵安定性に対する凍結乾燥の影響を研究した。図１９Ｃは、凍結乾燥が４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの分解を阻害し、前述のような任意の温度関連の分解プロセスを除去するのに効果的な方法であることを図示する。さらに、凍結乾燥の充填剤として働くマンニトールを製剤に加えた。図１９Ｄに示すように、マンニトールは、４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの貯蔵安定性に影響を与えなかった。

不活性ガス雰囲気下の貯蔵
液体製剤の貯蔵安定性を高める代替手段として、一連の４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ製剤をアルゴンで満たした。図１９Ｅは、不活性ガス雰囲気が４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ液体製剤の貯蔵安定性を高めなかったことを図示する。高温（３０℃および３７℃）で貯蔵された製剤では、著しい分解が依然として検出された。加えて、不活性ガスで満たした凍結乾燥製剤の貯蔵安定性も、空気で満たした凍結乾燥製剤と同様であった（図１９Ｆ）。

実施例１８：様々な組成の賦形剤リポソームの貯蔵安定性
様々な賦形剤リポソーム製剤（下記表１２および１３を参照）を様々な条件下で貯蔵した。指定の時点で、サンプルを集めて、その貯蔵安定性を機能表示値（^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入率および^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームのインビボ安定性）のほか、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ（高速液体クロマトグラフィー／蒸発光散乱検出器）により判定した脂質成分の分解により評価した。

様々な脂質組成を用いた賦形剤リポソーム
上記リストのリポソーム製剤はすべて、本試験の開始時点で許容可能な^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入率（＞９５％）が得られることが示された。ＨＳＰＣ−硫酸アンモニウム製剤は、室温（室温は、２２〜２５℃の間で変動する温度と定義される）で貯蔵した際に６ヶ月の貯蔵期間にわたり、および４℃で貯蔵した際に少なくとも１５ヶ月間、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入能力を保持することが立証された。１ヶ月の時点で、ＤＳＰＣ−硫酸アンモニウム製剤は、許容可能なレベルの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入（許容可能なレベルの導入は＞９０％と定義される）を保持しなかった（図２０Ａ）。スフィンゴミエリン製剤はすべて、全貯蔵温度で少なくとも４ヶ月間^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入能力を保持した。トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルフェート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）を封入しているＤＳＰＣ製剤は、４℃で貯蔵すると^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入能力を少なくとも４ヶ月間維持した。

ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤの結果は、上記の観察結果を裏付けており、硫酸アンモニウムを封入しているＨＳＰＣ製剤およびＤＳＰＣ製剤の両方で相当量の脂質分解が検出された（図２０Ｂ）。スフィンゴミエリン製剤における脂質分解は軽微であり、リポソームの内膜にあるＰＥＧ−ＤＳＰＥの分解に起因する可能性がある少量のステアリン酸が２ヶ月以降に検出された。同様に、ＴＥＡ−ＳＯＳを封入しているＤＳＰＣ製剤の脂質分解は３０℃貯蔵で２ヶ月の期間にわたり軽微であり、４℃貯蔵では５ヶ月にわたり脂質分解が検出されなかった（図２０Ｂ）。

実施例１０に記載されているようにインビボ安定性試験を行い、前述の条件下で貯蔵されたリポソーム製剤の薬物動態プロファイルを調査した。ＨＳＰＣ製剤では相当量の脂質が分解したものの、^６４Ｃｕ−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入ＨＳＰＣリポソームは室温で６ヶ月の貯蔵後、依然としてインビボで安定に効果を発揮した（図２０Ｃ）。スフィンゴミエリン製剤でも、高温（図２０Ｄ（４℃）、図２０Ｅ（３０℃）および図２０Ｆ（３７℃））で３ヶ月の貯蔵期間にわたり同様の結果が得られた。

ＰＥＧ−脂質の種類および量を変えて別の製剤について研究した。スフィンゴミエリンは加水分解の影響を受けにくかったため、スフィンゴミエリン製剤のＰＥＧ−ＤＳＰＥは、リポソーム内の低ｐＨ（導入勾配として硫酸アンモニウムが存在）により誘導される脂質分解の対象のままである。ＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質の代わりに、ＰＥＧ−ＤＳＧＥ、ＰＥＧ−ＤＳＧまたは予め形成したリポソームへの（減少量）ＰＥＧ−ＤＳＰＥの後挿入製剤などスフィンゴミエリン製剤の変形を研究した。これらの製剤はすべて、高温で４ヶ月の貯蔵後に優れた^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入率（＞９０％）が得られることが示された（図２０Ｇ）。

実施例１９：様々な導入勾配強度を有する賦形剤リポソームの貯蔵安定性
２０ｍＭ、５０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む様々な強度の導入勾配を有するリポソーム製剤を調製した。^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの導入および貯蔵安定性に対する導入勾配強度の影響を検査した。図２１Ａは、様々な条件下で貯蔵したＨＳＰＣリポソームの^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入効率に対する導入勾配強度の影響を図示する。リポソームの２０ｍＭ製剤は、５０ｍＭ製剤より早く導入性基準を達成しなくなることが示された。これは、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤデータにより示唆されるようにＨＳＰＣ製剤の脂質二重層が分解して、導入勾配の散逸を引き起こしたことに起因する可能性がある。高温度で長期の貯蔵時間において、２０ｍＭ製剤は、^６４Ｃｕ−４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣの満足のいく導入を可能にするのに十分なリポソーム内硫酸アンモニウムを保持できなかったと考えられる。

５０ｍＭ、１２５ｍＭまたは２５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含むＤＳＰＣリポソームを貯蔵安定性試験に含め、ＤＳＰＣリポソーム製剤を用いて同様の研究を行った（図２１Ｂ）。１ヶ月の貯蔵期間後、高温で貯蔵したリポソームはやはり＜９０％の^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入率を示した。これも、ＤＳＰＣ成分の顕著な分解により、勾配の散逸を引き起こしたことに起因する。

一方、スフィンゴミエリン製剤は、高温での４ヶ月の貯蔵において安定であることが明らかになった（図２１Ｃ）。上記のように、スフィンゴミエリン製剤における脂質分解は少ないことから、製剤の貯蔵安定性の増強が示された。このことはさらに、スフィンゴミエリン製剤で検出されたＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質のわずかな分解はその貯蔵安定性を機能的に損なわなかったことも示す。

実施例２０：様々な貯蔵ｐＨで製剤化された賦形剤リポソームの貯蔵安定性
スフィンゴミエリンリポソームの貯蔵安定性に対する貯蔵ｐＨの影響を図２２に図示する。１２ヶ月の貯蔵において２〜８℃で冷蔵貯蔵すると、リポソームは６．５〜７．４の貯蔵ｐＨで導入性を保持する。同様の結果は、上記表に示した他のｐＨ６．５およびｐＨ７．４の製剤でも得られた。ｐＨ６．５で高い温度（３０℃）にて貯蔵すると、リポソームは^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入率が９０％未満に低下し始める。

実施例２１：リポソーム治療剤に対する患者の処置反応を予測するためのイメージングマーカーとしてのリポソームＡ
リポソームＢ処置の２４時間前、ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍（乳腺脂肪織および皮下に接種）を有するマウスにリポソームＡを静脈内注射した。リポソームＡ注射から１６時間後、ＰＥＴ／ＣＴイメージングを行い、関心体積（ＶＯＩ）（すなわち腫瘍領域）の放射能を測定することによりリポソームＡの腫瘍取り込み率（％ｉ．ｄ．／ｇ）をＰＥＴデータセットから判定した。次いでマウスをリポソームＢ（ｑ７ｄ）により３ｍｇ／ｋｇで３週間処置した。ＭＲＩおよびノギス測定により２ヶ月の期間にわたり測定された腫瘍容積の変化として、リポソームＢ処置に対する反応を定量した。

リポソームＡの腫瘍付着は、３〜６％ｉ．ｄ．／ｇの範囲にあることが明らかになったが、これは、リポソームＢの腫瘍取り込みレベルと同程度である。図２３に示すように、リポソームＡの腫瘍付着は、リポソームＢに対する処置反応と相関する（スピアマン相関係数−０．８９１およびｐ値０．０００４）。具体的には、腫瘍におけるリポソームＡの蓄積が増加すると、リポソームＢによる処置後の腫瘍増殖阻害の改善が予測された。

実施例２２：処置後の腫瘍付着の変化をモニタリングするためのイメージングマーカーとしてのリポソームＡ
３週間のリポソームＢ処置の２４時間前に、ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍（乳腺脂肪織および皮下に接種）を有するマウスにリポソームＡを静脈内注射した（リポソームＡの３回の投与およびリポソームＢの３回の投与）。リポソームＡの投与ごとに、ＰＥＴ／ＣＴイメージングを注射から１６時間後に行い、ＶＯＩ解析を用いてＰＥＴデータセットからリポソームＡの腫瘍取り込み率（％ｉ．ｄ．／ｇ）を判定した。

図２４に示すように、リポソームＡの腫瘍付着の変化は、ベースライン取り込み（２２日目、「Ｄ２２」）と比較したリポソームＢの連続投与後のＰＥＴデータセットから乳腺脂肪織腫瘍（図２４Ａ）および皮下腫瘍（図２４Ｂ）において検出することができる。リポソームＡの投与３（Ｄ３６）の腫瘍付着を投与１（Ｄ２２）と比較したところ、皮下腫瘍および乳腺脂肪織腫瘍の両方の２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）（ｐ＝０．０００３）により、リポソームの腫瘍取り込みの増加が観察された（図２４Ｃ）。

実施例２３：６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームのインビボ安定性
６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームＡ（図２７Ａ）、リポソームＢ（図２７Ｂ）およびリポソームＣ（図２７Ｃ）のインビボ安定性もＣＤ−１マウスを用いて注射から２４時間後まで検査した。ＣＤ−１未処置マウスに^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームＡ、^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームＢおよび^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ導入リポソームＣを尾静脈注射（１００〜２００μＣｉ／マウス、２０μｍｏｌリン脂質／ｋｇ）により注射した。注射から５分後および２４時間後に、心臓穿刺により血液を採取し、続いて血漿採取のため遠心した。血漿中の封入された（リポソームの）放射能は、実施例８に記載した方法と同様にサイズ排除カラム（リポソーム画分、タンパク質画分および^６４Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣ／錯体を形成していない^６４Ｃｕ画分を分離することができるＣＬ４Ｂカラム）を用いて放出／未封入放射能から分離した。このデータから、リポソームＡおよびリポソームＢは、インビボで高度に安定であり、注射から２４時間後までに検出された未封入６４Ｃｕが＜６％であることが示される。リポソームＣの場合、注射から５分後および２４時間後に、リポソーム画分で検出された血漿中の^６４Ｃｕは７４％および２２％のみであった。

等価物
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、本明細書に記載した具体的な実施形態に対する等価物を数多く認識するか、あるいは確認することができるであろう。こうした等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図している。従属請求項に開示された実施形態のどのような組み合わせも、本発明の範囲内であることを意図している。

文献の引用
本明細書に言及した、ありとあらゆる発行された特許、特許出願および刊行物は、その全体を本明細書に援用する。

Claims (18)

1. （ａ）薬学的に許容される媒体中のリポソームであって、各々が内部空間および前記内部を前記媒体から隔てる膜を有し、前記膜が、１種または複数種の脂質を含むリポソームと、
   （ｂ）キレート化された金属イオン、Ｍ、を含む下記式ＩＩの化合物であって、
   

   

   （式中、Ｍはリポソーム造影剤内に検出可能な銅のカチオンである）
   上記（ａ）のリポソームの少なくとも１つのリポソームに内包された化合物と、
   を含むことを特徴とするリポソーム造影剤組成物。
2. 請求項１に記載の組成物において、前記銅のカチオンが、Ｃｕ ^２＋ であることを特徴とする組成物。
3. 請求項１または２に記載の組成物において、Ｍは前記銅のカチオンの放射性同位元素であることを特徴とする組成物。
4. 請求項３に記載の組成物において、前記銅のカチオンの放射性同位元素が、 ^６４ Ｃｕまたは ^６７ Ｃｕであることを特徴とする組成物。
5. 請求項１乃至４の何れか１項に記載の組成物において、薬学的に許容される媒体中のリポソームであって、各々が内部空間および前記内部を前記媒体から隔てる膜を有し、前記膜が、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むリポソームを含むことを特徴とする組成物。
6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載の組成物において、前記リポソームの膜が、重量比３：１：１でＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むことを特徴とする組成物。
7. リポソーム膜を有するリポソームに内包された検出可能な ^６４ Ｃｕ：４−ＤＥＡＰ−ＡＴＳＣを含むリポソーム造影剤において、前記リポソーム膜が、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むことを特徴とするリポソーム造影剤。
8. 請求項７に記載のリポソーム造影剤であって、５〜８の外部ｐＨを有することを特徴とするリポソーム造影剤。
9. 請求項７に記載のリポソーム造影剤であって、約７．４の外部ｐＨを有することを特徴とするリポソーム造影剤。
10. 請求項７乃至９のいずれか１項に記載のリポソーム造影剤であって、前記リポソームに内包された非ポリマーアニオン捕獲剤を更に含むことを特徴とするリポソーム造影剤。
11. 請求項７乃至９のいずれか１項に記載のリポソーム造影剤であって、前記リポソームに内包されたスクロースオクタスルフェートを更に含むことを特徴とするリポソーム造影剤。
12. 請求項７乃至１１のいずれか１項に記載のリポソーム造影剤において、前記リポソーム膜が、重量比３：１：１でＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むことを特徴とするリポソーム造影剤。
13. 請求項７乃至１２のいずれか１項に記載のリポソーム造影剤であって、患者内において検出可能な放射能を提供する量でＣｕ ^２＋ を含むことを特徴とするリポソーム造影剤。
14. 患者内において検出可能な放射能を提供する量でリポソームに内包された下記式ＩＩの化合物を含む造影剤であって、この式ＩＩの化合物のＭはＣｕ ^２＋ の放射性同位元素である造影剤において、
    

    

    前記リポソームがリポソーム膜を有することを特徴とする造影剤。
15. 請求項１４に記載の造影剤において、前記リポソーム膜が、ＰＥＧ化脂質を含むことを特徴とする造影剤。
16. 請求項１４又は１５に記載の造影剤において、前記リポソーム膜が、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むことを特徴とする造影剤。
17. 請求項１６に記載の造影剤であって、リポソーム内において式ＩＩの化合物で内包されたスクロースオクタスルフェートを更に含み、５〜８の外部ｐＨを有することを特徴とする造影剤。
18. 請求項１７に記載の造影剤であって、約７．４の外部ｐＨを有することを特徴とする造影剤。

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