JP6207276B2 - Fish egg discrimination method and fish egg sorting apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、魚卵の良否を判別する技術に関し、特に、魚卵の受精の有無及び受精卵の孵化可能性を判別する技術に関する。 The present invention relates to a technique for discriminating the quality of fish eggs, and in particular, to a technique for discriminating the presence or absence of fertilization of fish eggs and the possibility of hatching of fertilized eggs.
水産養殖業において、孵化率の高い卵の安定的な入手は重要な課題である。特に、親魚の入手自体が困難な希少種や、養殖状態での安定的な産卵誘発技術が確立途上である種では、その重要性は増大する。 In the aquaculture industry, stable acquisition of eggs with a high hatching rate is an important issue. In particular, the importance of rare species for which it is difficult to obtain parent fish and species for which stable spawning induction technology in the state of cultivation is being established is increasing.
特に、海魚は、卵を育てるための最適条件を作り出すことが難しいため、養殖における孵化率が低い。例えば、養殖が盛んで商業的に重要なオヒョウは、孵化率は１％以下である。ヨーロピアンシーバスの孵化率は１０〜１５％であり、受精卵を育てる方法が確立されているサケでさえ、孵化率は５０％である。 In particular, sea fish have a low hatching rate in aquaculture because it is difficult to create optimal conditions for raising eggs. For example, halibut, which is well-cultured and commercially important, has a hatching rate of 1% or less. The hatching rate of European seabass is 10-15%, and even the salmon for which fertilized eggs are cultivated has a hatching rate of 50%.
海魚孵化場では、海水に対して卵が浮くか否かによって、卵の良否を判別する方法が一般的である。さらに、特許文献１及び２には、生きている良卵がほぼ透明であり、死んでいる不良卵が白濁していることに着目して、魚卵からの反射光の強度に基づいて、魚卵の良否を判別する方法が開示されている。当該方法により、魚卵を破壊することなく、魚卵の良否を判別することができる。 In a sea fish hatchery, a method of determining whether an egg is good or not is common depending on whether the egg floats against seawater. Furthermore, Patent Documents 1 and 2 focus on the fact that live good eggs are almost transparent and dead bad eggs are clouded, and based on the intensity of reflected light from fish eggs, A method for determining the quality of an egg is disclosed. By this method, it is possible to determine the quality of the fish egg without destroying the fish egg.
オヒョウなどでは、卵の質は、卵割の早い段階における細胞の対象性により評価する必要がある。そのため、魚卵が海水に対して浮くか否かに基づく判別方法は適用できない。また、産卵（あるいは受精）直後の段階では、良卵と不良卵とで光の透過率は変わらないので、特許文献１及び２に記載の判別方法も適用できない。さらに 、産卵（あるいは受精）直後から魚卵の形態的な変化が起こるまでの期間に、魚卵の孵化可能性を効率よく判別する方法は知られていない。 In halibut, etc., the egg quality needs to be evaluated by the target of the cells at an early stage of cleavage. Therefore, a discrimination method based on whether or not a fish egg floats against seawater cannot be applied. Further, at the stage immediately after egg laying (or fertilization), the light transmittance does not change between a good egg and a bad egg, so the discrimination methods described in Patent Documents 1 and 2 cannot be applied. Furthermore, there is no known method for efficiently discriminating the possibility of hatching of a fish egg during a period immediately after egg laying (or fertilization) until a morphological change of the fish egg occurs.
本発明は、上記問題を解決するためになされたものであって、魚卵の良否を産卵（あるいは受精）直後の段階で判別可能な魚卵判別方法および魚卵選別装置の提供を目的とする。 The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a fish egg discrimination method and a fish egg sorting apparatus that can judge the quality of a fish egg immediately after laying (or fertilization). .
本発明に係る魚卵判別方法は、上記課題を解決するためになされたものであり、レーザー光を魚卵に照射する照射ステップと、前記魚卵の反射光からラマン散乱光を検出し、検出されたラマン散乱光に基づいて、魚卵の良否を判別する判別ステップと、を有することを特徴とする。 The fish egg discriminating method according to the present invention is made to solve the above-mentioned problem, and detects the Raman scattered light from the irradiation step of irradiating the fish egg with laser light and the reflected light of the fish egg, And a discrimination step for discriminating the quality of the fish egg based on the Raman scattered light.
このような構成によれば、魚卵にレーザー光を照射し、その反射光のラマン散乱光に基づき、魚卵の良否を判別する。産卵（あるいは受精）直後の受精卵と無精卵とでは、見た目には大差はないが、受精卵では、液胞から卵中へのエネルギー供給が行われているため、液胞成分が染み出している。そのため、ラマン散乱光からラマンスペクトルを解析して、脂肪滴成分（中性脂肪）の組成を検出することにより、受精の有無を予見することができる。よって、魚卵の良否を産卵（あるいは受精）直後の段階で判別することができる。 According to such a configuration, the fish egg is irradiated with laser light, and the quality of the fish egg is determined based on the Raman scattered light of the reflected light. There is not much difference in appearance between fertilized eggs immediately after egg laying (or fertilization) and non-fertilized eggs, but in fertilized eggs, vacuolar components are exuded because energy is supplied from the vacuole into the egg. . Therefore, the presence or absence of fertilization can be predicted by analyzing the Raman spectrum from the Raman scattered light and detecting the composition of the lipid droplet component (neutral fat). Therefore, the quality of fish eggs can be determined immediately after egg laying (or fertilization).
また、上記魚卵判別方法において、前記レーザー光の波長は７２０〜８６０ｎｍであることが好ましい。 Moreover, in the said fish egg discrimination | determination method, it is preferable that the wavelength of the said laser beam is 720-860 nm.
また、上記魚卵判別方法において、前記レーザー光の波長は７８５ｎｍであることがさらに好ましい。 In the fish egg discrimination method, the wavelength of the laser beam is more preferably 785 nm.
また、上記魚卵判別方法において、前記照射ステップでは、前記レーザー光を前記魚卵の脂肪滴および卵黄部分の少なくともいずれかに照射することが好ましい。 In the fish egg discrimination method, it is preferable that in the irradiation step, the laser light is irradiated to at least one of the fat droplets and the yolk portion of the fish egg.
また、上記魚卵判別方法において、前記判別ステップでは、脂質のバンドを用いて線形判別分析を行うことが好ましい。 In the fish egg discrimination method, the discrimination step preferably performs linear discrimination analysis using a lipid band.
また、上記魚卵判別方法において、前記判別ステップでは、さらにタンパク質のバンドを用いて線形判別分析を行うことが好ましい。 In the fish egg discrimination method, the discrimination step preferably further performs linear discrimination analysis using a protein band.
また、上記魚卵判別方法において、前記判別ステップでは、さらにカロテノイドのバンドを用いて線形判別分析を行うことが好ましい。 In the fish egg discrimination method, it is preferable that in the discrimination step, linear discriminant analysis is further performed using a carotenoid band.
魚卵の早い発生段階のラマン散乱光において、タンパク質・カロテノイドの生成を検出することにより、孵化の可否を予見することができる。 Whether or not hatching is possible can be predicted by detecting the production of proteins and carotenoids in the Raman scattered light at the early development stage of fish eggs.
また、本発明に係る魚卵選別装置は、上記課題を解決するためになされたものであり、魚卵が投入される投入部と、前記魚卵の良否を判別する判別部と、前記判別部の判別結果に基づいて良卵と不良卵とを仕分ける仕分部と、を備えた魚卵選別装置であって、前記判別部は、レーザー光を魚卵に照射する照射手段と、前記魚卵の反射光からラマン散乱光を検出し、検出されたラマン散乱光に基づいて、魚卵の良否を判別する解析手段と、を備えることを特徴とする。 Further, the fish egg sorting apparatus according to the present invention is made to solve the above-described problem, and includes an input unit into which a fish egg is inserted, a determination unit that determines the quality of the fish egg, and the determination unit. And a sorting unit that sorts good and bad eggs based on the discrimination result of the step, wherein the discrimination unit includes irradiation means for irradiating the fish eggs with laser light, and Analyzing means for detecting Raman scattered light from the reflected light and discriminating the quality of the fish egg based on the detected Raman scattered light.
このような構成によれば、照射手段が魚卵にレーザー光を照射し、解析手段が反射光のラマン散乱光に基づき、魚卵の良否を判別する。したがって、魚卵選別装置は、産卵（あるいは受精）直後の段階で良卵と不良卵とを選別することができる。 According to such a configuration, the irradiating means irradiates the fish eggs with laser light, and the analyzing means determines the quality of the fish eggs based on the Raman scattered light of the reflected light. Therefore, the fish egg sorting apparatus can sort good and bad eggs immediately after egg laying (or fertilization).
また、上記魚卵選別装置において、前記照射手段は、前記レーザー光の照射位置を、前記魚卵に追随させる追随手段を備えることが好ましい。これにより、レーザー光を照射する際に、魚卵の移動を停止させる必要がない。よって、判別に要する時間を短くすることができ、魚卵を損傷するリスクを減らすことができる。 In the fish egg sorting apparatus, it is preferable that the irradiation unit includes a tracking unit that causes the irradiation position of the laser light to follow the fish egg. Thereby, when irradiating a laser beam, it is not necessary to stop the movement of a fish egg. Therefore, the time required for discrimination can be shortened, and the risk of damaging fish eggs can be reduced.
また、上記魚卵選別装置において、前記追随手段は、前記レーザー光を偏向するポリゴンミラーであってもよい。 In the fish egg sorting apparatus, the following means may be a polygon mirror that deflects the laser light.
また、上記魚卵選別装置において、前記追随手段は、前記レーザー光を伝播させ、先端が前記魚卵の進路に沿って移動可能な光ファイバーであってもよい。 In the fish egg sorting apparatus, the following means may be an optical fiber that propagates the laser light and whose tip is movable along the course of the fish egg.
また、上記魚卵選別装置において、前記レーザー光の波長は７２０〜８６０ｎｍであることが好ましい。 In the fish egg sorting apparatus, the wavelength of the laser beam is preferably 720 to 860 nm.
また、上記魚卵選別装置において、前記レーザー光の波長は７８５ｎｍであることがさらに好ましい。 In the fish egg sorting apparatus, the wavelength of the laser beam is more preferably 785 nm.
また、上記魚卵選別装置において、前記照射手段は、前記レーザー光を前記魚卵の脂肪滴および卵黄部分の少なくともいずれかに照射することが好ましい。 In the fish egg sorting apparatus, it is preferable that the irradiation unit irradiates at least one of the fat droplets and the yolk portion of the fish egg with the laser light.
また、上記魚卵選別装置において、前記解析手段は、脂質のバンドを用いて線形判別分析を行うことが好ましい。 In the fish egg sorting apparatus, the analyzing means preferably performs linear discriminant analysis using a lipid band.
また、上記魚卵選別装置において、前記解析手段は、さらにタンパク質のバンドを用いて線形判別分析を行うことが好ましい。 In the fish egg sorting apparatus, it is preferable that the analysis means further performs linear discriminant analysis using a protein band.
また、上記魚卵選別装置において、前記解析手段は、さらにカロテノイドのバンドを用いて線形判別分析を行うことが好ましい。 In the fish egg sorting apparatus, it is preferable that the analysis means further performs linear discriminant analysis using a carotenoid band.
本発明によれば、魚卵の良否を産卵（あるいは受精）直後の段階で判別することができる。 According to the present invention, the quality of a fish egg can be determined at a stage immediately after egg laying (or fertilization).
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings.
（魚卵選別装置）
図１は、本発明の一実施形態に係る魚卵選別装置１の概略構成を示すブロック図である。魚卵選別装置１は、魚卵が投入される投入部２、投入された魚卵を一列に整列する整列部３、魚卵の良否を判別する判別部４、および、判別部４の判別結果に基づいて良卵と不良卵とを仕分ける仕分部５を備えている。投入部２には、産卵された直後の魚卵が投入される。投入部２に投入された魚卵は、整列部３によって所定の間隔で一列に整列される。投入部２および整列部３は、詳細な構成は特に限定されず、公知のものを用いることができる。整列された魚卵は、水で満たされた水路を通って判別部４に到達する。
(Fish egg sorting device)
FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a fish egg sorting apparatus 1 according to an embodiment of the present invention. The fish egg sorting apparatus 1 includes an input unit 2 into which fish eggs are input, an alignment unit 3 that aligns the input fish eggs in a line, a determination unit 4 that determines whether the fish eggs are good, and a determination result of the determination unit 4 The sorting unit 5 for sorting the good eggs and the bad eggs based on the above is provided. The throwing egg 2 immediately after being laid is put into the loading unit 2. The fish eggs thrown into the throwing section 2 are aligned in a line at a predetermined interval by the aligning section 3. The detailed configuration of the input unit 2 and the alignment unit 3 is not particularly limited, and known ones can be used. The aligned fish eggs reach the determination unit 4 through a water channel filled with water.
（判別部）
図２は、判別部４の一構成例を示す図である。判別部４は、魚卵の良否、すなわち、受精卵であるか無精卵（未受精卵）であるかを判別するものであり、ラマン分光法によって判別することを特徴としている。判別部４は、水路４１、石英ガラス４２、シリンドリカルレンズ４３、レーザー光源４４（照射手段）、ビームスプリッター４５、ポリゴンミラー４６（追随手段）、ロングパスフィルター４７、分光器４８およびラマンスペクトル解析器４９（解析手段）を備えている。
(Determination part)
FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration example of the determination unit 4. The discriminating unit 4 discriminates whether the fish egg is good, that is, whether it is a fertilized egg or an unfertilized egg (unfertilized egg), and is characterized by discriminating by Raman spectroscopy. The discriminating unit 4 includes a water channel 41, a quartz glass 42, a cylindrical lens 43, a laser light source 44 (irradiation means), a beam splitter 45, a polygon mirror 46 (following means), a long pass filter 47, a spectroscope 48, and a Raman spectrum analyzer 49 ( Analysis means).
水路４１は、断面が半円形のチューブ状に形成されている。水路４１の上部は板状の石英ガラス４２が設けられており、水路４１と石英ガラス４２との間は、新鮮な水流で常に満たされている。これにより、水面が石英ガラス４２の窓で覆われる。整列部３で整列された魚卵Ｅは、水路４１中を図中右方向に移動する。水の温度は、魚卵Ｅの品質に影響を与えないように管理されている。なお、石英ガラス４２の代わりに、サファイアガラスを使用してもよい。 The water channel 41 is formed in a tube shape with a semicircular cross section. An upper portion of the water channel 41 is provided with a plate-like quartz glass 42, and a space between the water channel 41 and the quartz glass 42 is always filled with a fresh water flow. Thereby, the water surface is covered with the window of the quartz glass 42. The fish eggs E aligned in the alignment unit 3 move in the water channel 41 in the right direction in the figure. The temperature of the water is controlled so as not to affect the quality of the fish egg E. Note that sapphire glass may be used instead of the quartz glass 42.
シリンドリカルレンズ４３は、石英ガラス４２の上側の水路４１と対向する位置に設けられている。レーザー光源４４から出射されたレーザー光は、ビームスプリッター４５を通過してポリゴンミラー４６の側面に反射され、シリンドリカルレンズ４３によって魚卵Ｅの中心付近に収束するように照射される（照射ステップ）。ポリゴンミラー４６は、レーザー光の照射位置が魚卵Ｅに追随するようにレーザー光を偏向する。これにより、水路４１中を移動する魚卵Ｅに１〜５秒間レーザー光を連続的に照射することができる。 The cylindrical lens 43 is provided at a position facing the water channel 41 on the upper side of the quartz glass 42. The laser light emitted from the laser light source 44 passes through the beam splitter 45, is reflected on the side surface of the polygon mirror 46, and is irradiated so as to converge near the center of the fish egg E by the cylindrical lens 43 (irradiation step). The polygon mirror 46 deflects the laser light so that the irradiation position of the laser light follows the fish egg E. Thereby, the laser beam can be continuously irradiated to the fish eggs E moving in the water channel 41 for 1 to 5 seconds.
魚卵Ｅからの反射光は、ポリゴンミラー４６、ビームスプリッター４５に反射され、ロングパスフィルター４７を通過する。その際、反射光からレイリー散乱光が除去され、ラマン散乱光のみが分光器４８に入射する。分光器４８は、ラマン散乱光を分光する。ラマンスペクトル解析器４９は、分光されたラマン散乱光を波長毎に検出し、ラマンシフト値に変換してラマンスペクトルを測定する（検出ステップ）。これにより、ラマンスペクトル解析器４９は、魚卵Ｅの良否、すなわち、魚卵Ｅが孵化する受精卵であるか、孵化しない無精卵であるかを判別する（判別ステップ）。判別結果は、仕分部５に送信される。なお、判別方法の具体的な内容は、後述の実施例で説明する。 The reflected light from the fish egg E is reflected by the polygon mirror 46 and the beam splitter 45 and passes through the long pass filter 47. At that time, the Rayleigh scattered light is removed from the reflected light, and only the Raman scattered light enters the spectroscope 48. The spectroscope 48 separates the Raman scattered light. The Raman spectrum analyzer 49 detects the scattered Raman scattered light for each wavelength, converts it into a Raman shift value, and measures the Raman spectrum (detection step). Thereby, the Raman spectrum analyzer 49 determines whether the fish egg E is good, that is, whether the fish egg E is a fertilized egg that hatches or an infertile egg that does not hatch (determination step). The determination result is transmitted to the sorting unit 5. The specific contents of the determination method will be described in the examples described later.
レーザー光の波長は、特に制限されないが、７２０〜８６０ｎｍが好ましく、特に７８５ｎｍが好ましい。なお、短波長のレーザー光は、魚卵Ｅに毒性があるため、好ましくない。また、１０００ｎｍを超える波長のレーザー光を用いると、ラマンスペクトル解析器４９として、高価な装置を用いる必要がある。 The wavelength of the laser beam is not particularly limited, but is preferably 720 to 860 nm, and particularly preferably 785 nm. Note that short-wavelength laser light is not preferable because the fish egg E is toxic. If laser light having a wavelength exceeding 1000 nm is used, it is necessary to use an expensive device as the Raman spectrum analyzer 49.
（仕分部）
図３は、仕分部５の一構成例を示す図である。仕分部５は、判別部４の下流に設けられており、水路５１、シャッター５２、シャッター制御装置５３を備えている。水路５１は、図２に示す水路４１と連続しており、判別部４において良否を判別された魚卵Ｅが水路５１を図中左側からシャッター５２の方向へ移動する。水路５１は、シャッター５２が設けられている位置で２つの水路５１ａ・５１ｂに分岐している。
(Sorting department)
FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration example of the sorting unit 5. The sorting unit 5 is provided downstream of the determination unit 4 and includes a water channel 51, a shutter 52, and a shutter control device 53. The water channel 51 is continuous with the water channel 41 shown in FIG. 2, and the fish egg E determined to be good or bad by the determination unit 4 moves through the water channel 51 from the left side in the drawing toward the shutter 52. The water channel 51 branches into two water channels 51a and 51b at a position where the shutter 52 is provided.
シャッター５２は、シャッター制御装置５３の制御によって、水路５１の水流を水路５１ａ・５１ｂのいずれに流すかを切り替える。シャッター制御装置５３は、判別部４から送信される判別結果に基づき、受精卵であると判別された魚卵Ｅを水路５１ａに流し、無精卵であると判別された魚卵Ｅを水路５１ｂに流すように、シャッター５２を制御する。これにより、魚卵選別装置１は、受精卵と無精卵とを選別することができる。 Under the control of the shutter control device 53, the shutter 52 switches whether the water flow of the water channel 51 flows to the water channel 51a or 51b. The shutter control device 53 causes the fish egg E determined to be a fertilized egg to flow in the water channel 51a based on the determination result transmitted from the determination unit 4, and flows the fish egg E determined to be an infertile egg to the water channel 51b. Thus, the shutter 52 is controlled. Thereby, the fish egg sorting device 1 can sort a fertilized egg and an infertile egg.
さらに、魚卵Ｅが接水によって付活しない魚卵（メダカ等）であれば、無精卵であると判別された魚卵Ｅを、精子が混入した塩類溶液に移して、人工受精させることができる。これにより、受精率を向上させ、孵化率の高い卵をより安定的に得ることができる。 Furthermore, if the fish egg E is a fish egg that is not activated by water contact (medaka etc.), the fish egg E determined to be an infertile egg can be transferred to a salt solution mixed with sperm and artificially fertilized. . Thereby, a fertilization rate can be improved and an egg with a high hatching rate can be obtained more stably.
なお、仕分部５の具体的な構成は、図３に示すものに限定されず、公知のあらゆる装置を適用することができる。 In addition, the specific structure of the sorting part 5 is not limited to what is shown in FIG. 3, All the well-known apparatuses are applicable.
（ラマン分光法による魚卵の良否の判別）
上述のように、判別部４は、ラマン分光法によって魚卵の良否を判別することを特徴としている。具体的には、魚卵Ｅの液胞（脂肪滴）および／または卵黄の部分にレーザー光を照射し、その反射光のラマン散乱光に基づき、魚卵の良否を判別する。産卵（あるいは受精）直後の受精卵と無精卵とでは、見た目には大差はないが、受精卵では、液胞から卵中へのエネルギー供給が行われているため、液胞成分が染み出している。そのため、ラマン散乱光からラマンスペクトルを解析して、脂肪滴成分（中性脂肪）の組成を検出することにより、受精の有無を予見することができる。さらに、魚卵の早い発生段階のラマン散乱光において、タンパク質・カロテノイドの生成を検出することにより、孵化の可否を予見することができる。よって、装置上の自由度を確保することができ、実用化が容易な装置とすることができる。
(Rate determination of fish eggs by Raman spectroscopy)
As described above, the discriminating unit 4 is characterized by discriminating the quality of fish eggs by Raman spectroscopy. Specifically, the vacuole (fat droplet) and / or egg yolk portion of the fish egg E is irradiated with laser light, and the quality of the fish egg is determined based on the Raman scattered light of the reflected light. There is no difference in appearance between a fertilized egg immediately after egg laying (or fertilization) and an unfertilized egg. However, in fertilized eggs, the vacuole component oozes because energy is supplied from the vacuole into the egg. . Therefore, the presence or absence of fertilization can be predicted by analyzing the Raman spectrum from the Raman scattered light and detecting the composition of the lipid droplet component (neutral fat). Furthermore, the possibility of hatching can be predicted by detecting the production of proteins and carotenoids in Raman scattered light at an early stage of fish egg development. Therefore, the degree of freedom on the device can be ensured and the device can be easily put into practical use.
また、液胞のラマンスペクトルは他の部位に比較して非常に強い（約１００倍）ラマン散乱光を与えるため、スペクトルからも液胞と他の部位を識別することも可能である。従って、レーザー光の焦点の位置制御精度や空間分解能が低くても、高いＳ／Ｎ比でラマンスペクトルを得ることができる。 In addition, the Raman spectrum of the vacuole gives a very strong (about 100 times) Raman scattered light as compared with other sites, so that the vacuole and other sites can also be distinguished from the spectrum. Therefore, a Raman spectrum can be obtained with a high S / N ratio even if the position control accuracy and spatial resolution of the focal point of the laser beam are low.
（仕分部の変形例）
図２に示す仕分部４では、ポリゴンミラーを用いることにより、移動する魚卵に連続的にレーザー光を照射していたが、本発明はこれに限定されない。以下では、光ファイバー（中空ファイバー）を用いて、移動する魚卵に連続的にレーザー光を照射する構成について説明する。
(Modification of sorting section)
In the sorting unit 4 shown in FIG. 2, the moving fish eggs are continuously irradiated with laser light by using a polygon mirror, but the present invention is not limited to this. Below, the structure which irradiates a moving fish egg with a laser beam continuously using an optical fiber (hollow fiber) is demonstrated.
図４は、図２に示す判別部４の変形例に係る判別部４’の構成を示す図である。判別部４’は、水路４１、石英ガラス４２、レーザー光源４４、分光器４８、ラマンスペクトル解析器４９および光ファイバーＦ（追随手段）を備えている。レーザー光源４４、分光器４８および光ファイバーＦは、同数ずつ設けられている。 FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration of a determination unit 4 ′ according to a modification of the determination unit 4 illustrated in FIG. 2. The determination unit 4 ′ includes a water channel 41, quartz glass 42, a laser light source 44, a spectroscope 48, a Raman spectrum analyzer 49, and an optical fiber F (following means). The same number of laser light sources 44, spectroscopes 48, and optical fibers F are provided.
光ファイバーＦは、励起集光ファイバーと信号収集ファイバーとから構成されている。励起集光ファイバーの一端にレーザー光源４４が接続され、励起集光ファイバーの他端は、魚卵Ｅの進路に沿って移動可能となっている。これにより、光ファイバーＦの先端は、水路４１を移動する魚卵Ｅに追随することができる。信号収集ファイバーは分光器４８に接続されている。判別部４’の他の構成は、図２に示す判別部４と同様である。 The optical fiber F is composed of an excitation collecting optical fiber and a signal collecting fiber. A laser light source 44 is connected to one end of the excitation collecting optical fiber, and the other end of the excitation collecting optical fiber is movable along the course of the fish egg E. Thereby, the tip of the optical fiber F can follow the fish egg E moving in the water channel 41. The signal collection fiber is connected to the spectrometer 48. The other configuration of the determination unit 4 'is the same as that of the determination unit 4 shown in FIG.
上記の構成により、判別部４’では、レーザー光源４４から出射されたレーザー光は、光ファイバーＦの励起集光ファイバーを伝播して、魚卵Ｅに照射される。上記のように光ファイバーＦの先端は魚卵Ｅに追随することができるため、移動する魚卵Ｅにレーザー光を連続的に照射することができる。 With the above configuration, in the determination unit 4 ′, the laser light emitted from the laser light source 44 propagates through the excitation-collecting optical fiber of the optical fiber F and is irradiated onto the fish egg E. Since the tip of the optical fiber F can follow the fish egg E as described above, the moving fish egg E can be continuously irradiated with laser light.
魚卵Ｅからの反射光は、光ファイバーＦの信号収集ファイバーを通り、レイリー散乱光が除去されて、分光器４８に入射する。分光器４８はラマン散乱光を分光する。ラマンスペクトル解析器４９は、分光されたラマン散乱光を波長毎に検出し、ラマンシフト値に変換してラマンスペクトルを測定する。これにより、ラマンスペクトル解析器４９は、魚卵Ｅの良否を判別する。 The reflected light from the fish egg E passes through the signal collection fiber of the optical fiber F, and the Rayleigh scattered light is removed and enters the spectroscope 48. The spectroscope 48 separates the Raman scattered light. The Raman spectrum analyzer 49 detects the Raman scattered light separated for each wavelength, converts it into a Raman shift value, and measures the Raman spectrum. Thereby, the Raman spectrum analyzer 49 determines the quality of the fish egg E.
このように、本変形例では、光ファイバーを用いて、移動する魚卵に連続的にレーザー光を照射することができる。 Thus, in this modification, a moving fish egg can be continuously irradiated with a laser beam using an optical fiber.
（付記事項）
なお、上記の実施形態では、レーザー光の照射位置を魚卵に追随させる追随手段として、ポリゴンミラーまたは光ファイバーを用いたが、移動する魚卵にレーザー光を連続的に照射可能なものであれば、追随手段はこれらに限定されない。また、上記追随手段は必須ではなく、魚卵が生息できる状況下でラマン分光法による測定が可能であれば、魚卵の移動を一旦停止させた状態で、所定時間レーザー光を照射する構成としてもよい。当該構成では、判別に要する時間が長くなるが、固定された照射装置を用いることができる。
(Additional notes)
In the above embodiment, the polygon mirror or the optical fiber is used as the tracking means for following the irradiation position of the laser light to the fish egg. However, as long as the moving fish egg can be continuously irradiated with the laser light. The following means is not limited to these. In addition, the following means is not indispensable, and if measurement by Raman spectroscopy is possible under conditions where fish eggs can inhabit, the movement of fish eggs is temporarily stopped and laser light is irradiated for a predetermined time. Also good. In this configuration, the time required for the determination becomes long, but a fixed irradiation device can be used.
本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、実施形態に開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる形態も本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications are possible within the scope of the claims, and a form obtained by appropriately combining technical means disclosed in the embodiment is also included in the present invention. Included in the technical scope.
本実施例では、ラマン分光法を用いた魚卵判別方法によって、受精の有無が判別可能であることを検証するための実験を行った。なお、各実施例における数値（レーザー光の波長、解析に用いるバンド等）はあくまで一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、バンドの数値は、装置の精度・性能によって、多少変動してもよい。 In this example, an experiment was conducted to verify that the presence or absence of fertilization can be discriminated by the fish egg discrimination method using Raman spectroscopy. In addition, the numerical value (the wavelength of a laser beam, the band used for an analysis, etc.) in each Example is an example to the last, and this invention is not limited to this. For example, the numerical value of the band may vary somewhat depending on the accuracy and performance of the apparatus.
（実施例１）
実施例１では、総数約１２０個のメダカの卵を用意し、顕微ラマン装置（レーザー光の波長：７８５ｎｍ、試料点での出力：６０ ｍＷ）を用いて、卵中の卵黄部分を測定し、ラマンスペクトルの分析を行った。測定データは試料の無い状態で測定したバックグランドを引き、５次関数によるベースライン補正を実施して、背景ノイズ光（蛍光、ダークノイズ等）を除去した。１００３ｃｍ−１付近に観測されるフェニルアラニンのバンド強度を用いてスペクトル強度を規格化し、サビツキーゴーレイ法でスムージングを施した。
Example 1
In Example 1, a total of about 120 medaka eggs were prepared, and the yolk portion in the egg was measured using a microscopic Raman apparatus (wavelength of laser light: 785 nm, output at the sample point: 60 mW). The Raman spectrum was analyzed. The measurement data was obtained by subtracting the background measured in the absence of the sample and performing baseline correction by a quintic function to remove background noise light (fluorescence, dark noise, etc.). Spectral intensity was normalized using the band intensity of phenylalanine observed in the vicinity of 1003 cm −1 , and smoothed by the Savitzky Golay method.
図５は、無精卵と受精直後の受精卵の卵黄のラマンスペクトルの第１主成分（ＰＣ１）のローディングプロット例を示している。次に波数領域（１８００〜６００ｃｍ−１）のデータを用いて、主成分分析（ＰＣＡ）を行った結果の無精卵と受精卵のスコアプロットを図６に示した。各プロットが卵毎の測定データを表しており、受精卵のプロットは円形で示され、無精卵のプロットは矩形で示されている。無精卵のプロットと受精卵のプロットとは、異なる領域に分布していることから、プロット中に境界線を引くことにより、受精の有無のグループが区分可能であることが分かる。なお、実際の受精の有無は、顕微鏡によって卵割が発生しているか否かに基づいて確認した。 FIG. 5 shows an example of a loading plot of the first principal component (PC1) of the yolk Raman spectrum of an infertile egg and a fertilized egg immediately after fertilization. Next, FIG. 6 shows score plots of an unfertilized egg and a fertilized egg as a result of principal component analysis (PCA) using data in the wavenumber region (1800 to 600 cm −1 ). Each plot represents the measured data for each egg, the fertilized egg plot is shown as a circle and the infertile egg plot is shown as a rectangle. Since the plot of the infertile egg and the plot of the fertilized egg are distributed in different regions, it can be seen that the group with or without fertilization can be distinguished by drawing a boundary line in the plot. In addition, the presence or absence of actual fertilization was confirmed based on whether or not cleavage occurred with a microscope.
主成分のローディングプロットから、無精卵と受精卵とを判別するために、脂質成分の組成が大きく貢献しており、液胞からのエネルギー供給が行われているかどうかで受精の有無を識別できることを示している。ＰＣＡの解析結果より、液胞成分のバンド（１２６５，１３００，１４３８，１６５６，１７４５ｃｍ−１）を用いて線形判別分析（ＬＤＡ）を行った。無精卵（１７個）、受精直後（６個）のデータから１つのデータを除き、残りの２２個のデータでモデルを作成し、初めに除いたデータをモデルに当てはめ、無精卵・受精直後の判別を行った。この作業を２３個全てのデータについて繰り返した結果、９５．７％の精度で（正答：２２, 誤答：１）無精卵・受精直後を正しく判別できた。 It shows that the composition of the lipid component contributes greatly to distinguish between infertile and fertilized eggs from the loading plot of the main component, and whether fertilization is possible or not can be discriminated based on whether energy is supplied from the vacuole. ing. From the PCA analysis results, linear discriminant analysis (LDA) was performed using the vacuole component bands (1265, 1300, 1438, 1656, 1745 cm −1 ). Remove one data from the data of fertilized eggs (17) and immediately after fertilization (6), create a model with the remaining 22 data, apply the data removed first to the model, and discriminate immediately after fertilized eggs and fertilization went. As a result of repeating this operation for all 23 data, it was possible to correctly discriminate between immature eggs and immediately after fertilization with an accuracy of 95.7% (correct answer: 22, incorrect answer: 1).
（実施例２）
本実施例では、ラマン分光法を用いた魚卵判別方法によって、受精卵が孵化するか否かを判別可能であることを検証するための実験を行った。実験に用いる装置および測定条件は、実施例１と同一である。
(Example 2)
In this example, an experiment was conducted to verify that it is possible to determine whether or not a fertilized egg will hatch by a fish egg determination method using Raman spectroscopy. The apparatus and measurement conditions used in the experiment are the same as in Example 1.
孵化しない卵（無精卵・変な分割卵・冷凍卵）と孵化する卵（受精直後・２−８細胞期・多細胞期・かなり進んだ多細胞期）の計７種類の卵のラマンスペクトルについて解析を行った。図７は、孵化する卵と孵化しない卵の卵黄のラマンスペクトルのローディングプロット例を示している。次に、波数領域（１８００〜６００ｃｍ−１）のデータを用いて、孵化する卵と孵化しない卵の間で主成分分析（ＰＣＡ）を行った結果のスコアプロットを図８に示した。孵化する卵のプロットは円形で示され、孵化しない卵のプロットは矩形で示されている。孵化する卵であるか否かの区別は、後日、プロットに対応する卵が実際に孵化したか否かに基づいて行った。 Analysis of the Raman spectra of seven types of eggs: eggs that do not hatch (fertilized eggs, strange divided eggs, frozen eggs) and eggs that hatch (immediately after fertilization, 2-8 cell stage, multicellular stage, considerably advanced multicellular stage) Went. FIG. 7 shows an example of a loading plot of Raman spectra of eggs that hatch and eggs that do not hatch. Next, FIG. 8 shows a score plot as a result of performing principal component analysis (PCA) between eggs that hatch and eggs that do not hatch using the data in the wavenumber region (1800 to 600 cm −1 ). The plot of eggs that hatch is shown as a circle, and the plot of eggs that do not hatch is shown as a rectangle. The distinction as to whether or not the egg hatched was made at a later date based on whether or not the egg corresponding to the plot actually hatched.
続いて、図８のプロットを、２グループに分けて解析を実施した。両グループ間の分離率が最も高くなるように、分析波数領域を決定した。分析波数領域は以下のように設定した。 Subsequently, the plot of FIG. 8 was divided into two groups for analysis. The analysis wavenumber region was determined so that the separation rate between the two groups was the highest. The analysis wavenumber region was set as follows.
ＰＣＡ解析結果より、判別に貢献していると考えられる１２７０，１３００，１４４０，１６６０，１７４５ｃｍ−１の脂質・タンパク質のバンドを用いて線形判別分析を行った。１２２個のデータを２つに分け、一方のデータ（６１個）に対して上記の脂質・タンパク質のバンドを用いて線形判別モデルを作成した。次に他方のデータ（６１個）をモデルに当てはめて判別の正確性を検証した結果、正答率７０．５％を得た。 From the PCA analysis results, linear discriminant analysis was performed using lipid and protein bands of 1270, 1300, 1440, 1660, and 1745 cm −1 which are considered to contribute to discrimination. 122 pieces of data were divided into two, and a linear discriminant model was created using the above-mentioned lipid / protein bands for one piece of data (61 pieces). Next, the accuracy of discrimination was verified by applying the other data (61 items) to the model, and as a result, a correct answer rate of 70.5% was obtained.
さらに、脂質・タンパク質のバンドにカロテノイドのバンド（１１５８，１５２１ｃｍ−１）を加えて、同様の解析を行った結果、８０．３％の正答率を得た。 Furthermore, a carotenoid band (1158, 1521 cm −1 ) was added to the lipid / protein band and the same analysis was performed. As a result, a correct answer rate of 80.3% was obtained.
以上のように、ラマン分光法を用いて、孵化する卵と孵化しない卵とを識別することができる結果を得た。 As mentioned above, the result which can distinguish the egg which hatches from the egg which does not hatch was obtained using the Raman spectroscopy.
１ 魚卵選別装置
２ 投入部
３ 整列部
４ 判別部
４’ 判別部
５ 仕分部
４１ 水路
４２ 石英ガラス
４３ シリンドリカルレンズ
４４ レーザー光源（照射手段）
４５ ビームスプリッター
４６ ポリゴンミラー（追随手段）
４７ ロングパスフィルター
４８ 分光器
４９ ラマンスペクトル解析器（解析手段）
５１ 水路
５１ａ 水路
５１ｂ 水路
５２ シャッター
５３ シャッター制御装置
Ｅ 魚卵
Ｆ 光ファイバー（追随手段）
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Fish egg sorting apparatus 2 Input part 3 Alignment part 4 Discrimination part 4 'Discrimination part 5 Sorting part 41 Water channel 42 Quartz glass 43 Cylindrical lens 44 Laser light source (irradiation means)
45 Beam splitter 46 Polygon mirror (Following means)
47 Long pass filter 48 Spectrometer 49 Raman spectrum analyzer (analysis means)
51 Water channel 51a Water channel 51b Water channel 52 Shutter 53 Shutter control device E Fish egg F Optical fiber (Following means)
Claims (17)
前記魚卵の反射光からラマン散乱光を検出し、検出されたラマン散乱光に基づいて、前記魚卵が受精卵であるか無精卵であるか、または前記魚卵が孵化する受精卵であるか孵化しない受精卵であるかを判別する判別ステップと、を有することを特徴とする魚卵判別方法。 An irradiation step of irradiating the fish egg with laser light;
Whether the fish egg is a fertilized egg or an unfertilized egg, or whether the fish egg is a fertilized egg that hatches based on the detected Raman scattered light, detecting Raman scattered light from the reflected light of the fish egg And a discrimination step for discriminating whether the fertilized egg is not hatched .
前記魚卵の良否を判別する判別部と、
前記判別部の判別結果に基づいて良卵と不良卵とを仕分ける仕分部と、を備えた魚卵選別装置であって、
前記判別部は、
レーザー光を魚卵に照射する照射手段と、
前記魚卵の反射光からラマン散乱光を検出し、検出されたラマン散乱光に基づいて、前記魚卵が受精卵であるか無精卵であるか、または前記魚卵が孵化する受精卵であるか孵化しない受精卵であるかを判別する解析手段と、を備えることを特徴とする魚卵選別装置。 An input section into which fish eggs are input;
A discriminating unit for discriminating the quality of the fish egg;
A fish egg sorting apparatus comprising: a sorting unit that sorts good and bad eggs based on the discrimination result of the discrimination unit;
The discrimination unit
Irradiation means for irradiating fish eggs with laser light;
Whether the fish egg is a fertilized egg or an unfertilized egg, or whether the fish egg is a fertilized egg that hatches based on the detected Raman scattered light, detecting Raman scattered light from the reflected light of the fish egg A fish egg sorting apparatus comprising: an analyzing means for discriminating whether a fertilized egg does not hatch .
前記レーザー光の照射位置を、前記魚卵に追随させる追随手段を備えることを特徴とする請求項８に記載の魚卵選別装置。 The irradiation means includes
9. The fish egg sorting apparatus according to claim 8, further comprising a follower that causes the irradiation position of the laser light to follow the fish egg.
前記レーザー光を偏向するポリゴンミラーであることを特徴とする請求項９に記載の魚卵選別装置。 The following means is
The fish egg sorting apparatus according to claim 9, wherein the fish egg sorting device is a polygon mirror that deflects the laser beam.
前記レーザー光を伝播させ、先端が前記魚卵の進路に沿って移動可能な光ファイバーであることを特徴とする請求項９に記載の魚卵選別装置。 The following means is
The fish egg sorting apparatus according to claim 9, wherein the laser light is propagated and a tip is an optical fiber capable of moving along a course of the fish egg.
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