JP2011185841A

JP2011185841A - Particle analyzer and particle analysis method

Info

Publication number: JP2011185841A
Application number: JP2010053213A
Authority: JP
Inventors: Takashi Adachi; 貴志足立; Nobuhiro Ota; 信廣太田
Original assignee: Hokkaido University NUC; Fujifilm Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; Fujifilm Corp
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2011-09-22

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To enable the analysis based on the internal structure of particles to be inspected with high precision without being affected the intensity of exciting light or the concentration of a fluorescent substance and peripheral environment in a particle analyzer. SOLUTION: This particle analyzer 1 is equipped with: an exciting light generation means 10 for generating pulse exciting light L1, an exciting light irradiation means 20 for irradiating a flow F, which contains a liquid 71 containing particles D to be detected, with pulse exciting light L1; a light receiving means 30 for receiving the fluorescence Lf emitted from the particles D to be detected by the irradiation with the pulse exciting light L1; a time resolving means 40 for timewise resolving the fluorescence Lf in synchronous relation to irradiation with the pulse exciting light L1; a detection means 50 for detecting the timewise resolved fluorescence Lf; and an analyzing means 60 for calculating the fluorescence life Tf of the fluorescence Lf from the intensity of the fluorescence Lf detected by the detection means 50 and analyzing the particles D to be inspected on the basis of the fluorescence life Tf. COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、フローサイトメータ等の粒子分析装置および粒子分析方法に関する。 The present invention relates to a particle analyzer such as a flow cytometer and a particle analysis method.

細胞等の粒子を分析する装置として、フローサイトメトリーの手法を用いた装置（フローサイトメータ）が用いられている。従来知られているフローサイトメータでは、通常、サンプルから採取された大量の細胞をシース液で包み込んだシース流とすることにより一列に整列させて流し、シース流中の各細胞にレーザ光等の光を照射し、細胞から発せられた蛍光や散乱光を細胞ごとに検出することにより、個々の細胞の同定や、正常・異常等の判別を行う。フローサイトメータには、細胞を分類して回収する分取機能を有するソータータイプのもの（一般にセルソーターと呼ばれる）と、分析機能のみを有し分取機能を有しないアナライザタイプのものがある。フローサイトメータを用いることにより、大量の細胞を高速に分析することが可能になり、統計的な情報を短時間で得ることが可能になる。 An apparatus (flow cytometer) using a flow cytometry technique is used as an apparatus for analyzing particles such as cells. In conventional flow cytometers, a large number of cells collected from a sample are usually flowed in a line by making the sheath flow wrapped with a sheath liquid, and each cell in the sheath flow is subjected to laser light or the like. By irradiating light and detecting fluorescence or scattered light emitted from the cells for each cell, individual cells are identified and normal / abnormal are discriminated. There are two types of flow cytometers: a sorter type having a sorting function for classifying and collecting cells (generally called a cell sorter), and an analyzer type having only an analysis function and no sorting function. By using a flow cytometer, a large amount of cells can be analyzed at high speed, and statistical information can be obtained in a short time.

フローサイトメータにおいて、散乱光による分析では細胞の大きさに関する情報しか得ることができないことから、細胞の同定や正常・異常等の判別を行うためには内部構造の情報を得ることができる蛍光強度による分析が主に行われている。 In the flow cytometer, only the information on the cell size can be obtained by analysis with scattered light, so the fluorescence intensity can be obtained for internal structure information for cell identification and normal / abnormal discrimination. The analysis by is mainly performed.

特許文献１及び特許文献２では、蛍光を分光して得られた蛍光スペクトルにより粒子分析を行っている。例えば、特許文献１では。被検粒子からの蛍光を分光手段により波長毎に分離してそれぞれの強度をイメージセンサで測定している。この方法によれば、個々の粒子に対して同時に複数の蛍光強度を測定することができる。 In Patent Document 1 and Patent Document 2, particle analysis is performed using a fluorescence spectrum obtained by spectroscopic fluorescence. For example, in Patent Document 1. The fluorescence from the test particles is separated for each wavelength by a spectroscopic means, and the intensity of each is measured by an image sensor. According to this method, a plurality of fluorescence intensities can be simultaneously measured for individual particles.

また、特許文献３には、共焦点光学系を有するフローサイトメータにおいて、細胞から２光子励起により発せられる蛍光を検出することにより、微小サイズの細胞を分析する方法が記載されている。 Patent Document 3 describes a method of analyzing a micro-sized cell by detecting fluorescence emitted from a cell by two-photon excitation in a flow cytometer having a confocal optical system.

特開平６−０４３０９０号公報JP-A-6-043090 特開平２−０２４５３５号公報JP-A-2-024535 特開２００４−３４７６０８号公報JP 2004-347608 A

しかしながら、蛍光強度や蛍光スペクトルは、励起光波長や強度、蛍光物質の濃度や退色等の影響を受けて変化するうえ、粒子に含まれる複数物質からの蛍光や周囲からの蛍光の影響も分析結果に反映されることから精度の高い粒子分析をすることが難しい。 However, the fluorescence intensity and fluorescence spectrum change due to the influence of the excitation light wavelength and intensity, the concentration and fading of the fluorescent substance, and the analysis results also show the influence of fluorescence from multiple substances contained in the particles and fluorescence from the surroundings. It is difficult to conduct highly accurate particle analysis.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、励起光波長や強度、蛍光物質の濃度や退色、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に被検粒子の内部構造に基づく分析が可能な粒子分析装置および粒子分析方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and the internal structure of a test particle with high accuracy without being affected by the wavelength and intensity of excitation light, the concentration and discoloration of a fluorescent substance, and the fluorescence of an unnecessary substance. An object of the present invention is to provide a particle analysis apparatus and a particle analysis method capable of analysis based on the above.

本発明の粒子分析装置は、パルス励起光を発生する励起光発生手段と、被検粒子を含む液体の流れに前記パルス励起光を照射する励起光照射手段と、前記パルス励起光が照射されることにより前記被検粒子から生じる蛍光を含む光を受光する受光手段と、前記パルス励起光の照射と同期して前記蛍光を時間分解する時間分解手段と、該時間分解された前記蛍光を検出する検出手段と、該検出手段により検出された前記蛍光から該蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命に基づいて前記被検粒子を分析する分析手段とを備えたことを特徴とするものである。 The particle analyzer of the present invention is irradiated with excitation light generating means for generating pulsed excitation light, excitation light irradiating means for irradiating the flow of liquid containing the test particles with the pulsed excitation light, and the pulsed excitation light. A light receiving means for receiving light containing fluorescence generated from the test particles, a time resolving means for time-resolving the fluorescence in synchronization with irradiation of the pulse excitation light, and detecting the time-resolved fluorescence It is characterized by comprising detection means and analysis means for calculating the fluorescence lifetime of the fluorescence from the fluorescence detected by the detection means and analyzing the test particles based on the fluorescence lifetime. .

また、本発明の粒子分析方法は、被検粒子を含む液体の流れにパルス励起光を照射し、該パルス励起光が照射されることにより前記被検粒子から生じる蛍光を受光し、前記パルス励起光の照射と同期して前記蛍光を時間分解し、該時間分解された前記蛍光から蛍光強度時間分布を検出し、該蛍光強度時間分布を解析して蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命に基づいて前記被検粒子を分析するものである。 Further, the particle analysis method of the present invention is configured to irradiate a flow of a liquid containing a test particle with pulse excitation light, receive fluorescence generated from the test particle when the pulse excitation light is irradiated, and perform the pulse excitation. The fluorescence is time-resolved in synchronization with light irradiation, a fluorescence intensity time distribution is detected from the time-resolved fluorescence, the fluorescence intensity time distribution is analyzed to calculate a fluorescence lifetime, and based on the fluorescence lifetime Thus, the test particles are analyzed.

ここで、「分析」とは、被検粒子の同定及び正常・異常の判別を意味する。また、「液体の流れ」とは、生体内に流れる血液やリンパ液等の体液や、流路内を流れる液体試料等を意味する。流れの種類としては特に制限されず、層流や乱流などを含むものとする。 Here, “analysis” means identification of test particles and discrimination between normal and abnormal. In addition, “liquid flow” means body fluid such as blood and lymph fluid flowing in a living body, a liquid sample flowing in a flow path, and the like. The type of flow is not particularly limited, and includes laminar flow and turbulent flow.

ここで、「被検粒子」は、前記パルス励起光照射により蛍光が励起されるものであれば特に限定されず、蛍光標識にて標識された粒子であってもよいし、粒子内部に蛍光物質が含有されるものであってもよい。また、「被検粒子」は、医療・生物分野だけでなく工業分野におけるものでもよいが、生体物質である場合に好ましく適用することができる。 Here, the “test particle” is not particularly limited as long as fluorescence is excited by the pulsed excitation light irradiation, and may be a particle labeled with a fluorescent label, or a fluorescent substance inside the particle. May be contained. Further, the “test particles” may be not only in the medical / biological field but also in the industrial field, but can be preferably applied in the case of a biological material.

本発明の粒子分析装置において、前記励起光照射手段に、前記流れに対して略垂直方向に前記被検粒子上で前記励起光を走査させる走査光学系を含むことが好ましい。更に、前記受光手段により受光した前記蛍光を分光して前記時間分解手段に前記蛍光の蛍光スペクトルを出力する分光手段を備えた構成では、前記時間分解手段により、前記蛍光スペクトルから所定の波長の前記蛍光を時間分解することができる。 In the particle analyzer according to the aspect of the invention, it is preferable that the excitation light irradiation unit includes a scanning optical system that scans the excitation light on the test particle in a direction substantially perpendicular to the flow. Furthermore, in a configuration including a spectroscopic unit that splits the fluorescence received by the light receiving unit and outputs the fluorescence spectrum of the fluorescence to the time resolving unit, the time resolving unit causes the fluorescence spectrum to have the predetermined wavelength. Fluorescence can be time resolved.

被検粒子が生体物質である場合は、前記蛍光が前記被検粒子の自家蛍光であることが好ましい。かかる構成では、前記被検粒子をin vivoにて分析することができる。従って、前記液体が生体内の血管中を流れる血液中の粒子分析にも適用することができるので、眼部血管中の細胞の診断等に好ましく適用することができる。 When the test particle is a biological material, the fluorescence is preferably autofluorescence of the test particle. With such a configuration, the test particles can be analyzed in vivo. Therefore, since the liquid can be applied to particle analysis in blood flowing in blood vessels in a living body, it can be preferably applied to diagnosis of cells in ocular blood vessels.

また、血液中の粒子分析においては、前記液体の流れが、前記血管から外部に取り出された血液であり、該血液を外部に取り出す第1の流路と、該第1の流路から前記血液を受け入れて前記流れを形成するフローセルと、該フローセルから前記分析後の前記血液を受け入れて該血液を前記血管に戻す第２の流路とを備えた構成としてもよい。 Further, in the particle analysis in blood, the flow of the liquid is blood taken out from the blood vessel, the first flow path for taking out the blood to the outside, and the blood from the first flow path It is good also as a structure provided with the 2nd flow path which receives the said blood after the said analysis from the said flow cell, and returns this blood to the said blood vessel.

また、本発明の粒子分析装置は、前記層流が前記液体をシース液で包んで流したシースフローであり、前記液体を受け入れて前記シースフローを形成するフローセルを更に備えた構成としてもよい。かかる構成では、前記分析手段で得られた分析結果に基づいて、前記被検粒子を分離する粒子分離部を更に備えた構成としてもよい。 Further, the particle analyzer of the present invention may be configured to further include a flow cell in which the laminar flow is a sheath flow in which the liquid is wrapped with a sheath liquid and the liquid is received to form the sheath flow. In such a configuration, a particle separation unit that separates the test particles based on the analysis result obtained by the analysis unit may be further provided.

ここで、「シースフロー」とは、被検粒子を液の流れの略中央部に精度良く一列に整列させて通過させるために、被検粒子を含む試料液の周囲を層流のシース液（電解液）で被覆した流れを意味する。通常、「シース液」としては、試料液の希釈液等を用いることができる。 Here, the term “sheath flow” refers to a laminar flow sheath liquid (a laminar flow sheath liquid around the sample liquid containing the test particles) in order to allow the test particles to pass through the liquid flow in a substantially central portion with high accuracy. It means a flow covered with an electrolyte. Usually, as the “sheath solution”, a diluted solution of a sample solution or the like can be used.

前記蛍光は、多光子励起により励起されるものであってもよい。 The fluorescence may be excited by multiphoton excitation.

本発明の粒子分析装置および粒子分析方法は、蛍光寿命により被検粒子を分析するものである。蛍光寿命は、物質固有の値を持ち、励起光の波長や強度、蛍光物質の濃度や退色等に影響されることなく、周囲の環境によって変化するため、高精度に被検粒子の同定や正常・異常の判断等の内部性質に基づく分析が可能となる。 The particle analysis apparatus and particle analysis method of the present invention analyze test particles based on fluorescence lifetime. The fluorescence lifetime has a value specific to the substance, and does not affect the wavelength and intensity of the excitation light, the concentration or fading of the fluorescent substance, and changes depending on the surrounding environment.・ Analysis based on internal characteristics such as judgment of abnormality is possible.

また、被検粒子から種々の物質の蛍光が発せられる場合にも、各物質の蛍光を高精度に分離することができるので、所望の物質からの蛍光を高精度に分析することができる。特に、蛍光スペクトルの時間分解測定を行って蛍光寿命を測定することで、より高精度に各物質の蛍光の分離を行うことができる。 Further, even when fluorescence of various substances is emitted from the test particle, the fluorescence of each substance can be separated with high accuracy, so that fluorescence from a desired substance can be analyzed with high accuracy. In particular, the fluorescence of each substance can be separated with higher accuracy by performing time-resolved measurement of the fluorescence spectrum and measuring the fluorescence lifetime.

また、生体物質の粒子分析の際に、本発明の粒子分析装置および粒子分析方法では、物質固有の値である蛍光寿命により粒子分析を行うため、蛍光強度による粒子分析では、その蛍光強度の弱さから分離が難しく精度の点で分析には不向きとされていた自家蛍光による粒子分析が可能である。自家蛍光により分析では、被検粒子を蛍光色素による染色する必要がないため、染色によるダメージを与えることなく粒子分析をすることができる。従って、分析後の粒子の再利用やin vivoにおける分析を可能とすることができる。 In addition, in the particle analysis of biological materials, the particle analysis apparatus and the particle analysis method of the present invention perform particle analysis based on the fluorescence lifetime that is a value inherent to the substance. Thus, particle analysis by autofluorescence, which is difficult to separate and unsuitable for analysis in terms of accuracy, is possible. In the analysis by autofluorescence, since it is not necessary to stain the test particles with a fluorescent dye, particle analysis can be performed without causing damage due to staining. Therefore, it is possible to reuse the particles after analysis or to perform in vivo analysis.

本発明の第１の実施形態による粒子分析装置の概略構成図1 is a schematic configuration diagram of a particle analyzer according to a first embodiment of the present invention. 生物物質中に含まれる主な自家蛍光発光物質の励起光吸収特性を示す図Diagram showing excitation light absorption characteristics of main autofluorescent materials contained in biological materials 図２Ａに示される自家蛍光発光物質の蛍光スペクトルを示す図The figure which shows the fluorescence spectrum of the autofluorescent substance shown by FIG. 2A 時間分解による蛍光寿命の算出方法を示す図Diagram showing how to calculate fluorescence lifetime by time resolution 本発明の第１の実施形態による粒子分析装置に走査光学系を備えた構成を示す概略構成図1 is a schematic configuration diagram showing a configuration in which a particle analyzing apparatus according to a first embodiment of the present invention includes a scanning optical system. 図４に示される粒子分析装置に更に分光手段を備えた構成を示す概略構成図4 is a schematic configuration diagram showing a configuration in which the particle analyzing apparatus shown in FIG. 本発明の第２の実施形態による粒子分析装置の概略構成図Schematic configuration diagram of a particle analyzer according to a second embodiment of the present invention. 本発明の第２の実施形態による粒子分析装置に流路及びフローセルを備えた構成を示す概略構成図The schematic block diagram which shows the structure provided with the flow path and the flow cell in the particle analyzer by the 2nd Embodiment of this invention.

「粒子分析装置の第1実施形態（フローサイトメータ）」
以下、図面を参照して本発明にかかる第1実施形態の粒子分析装置および粒子分析方法について説明する。図１は、本実施形態の粒子分析装置１の概略構成図である。視認しやすくするため、各部の縮尺は適宜変更して示してある。 "First embodiment of particle analyzer (flow cytometer)"
Hereinafter, a particle analysis apparatus and a particle analysis method according to a first embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a particle analyzer 1 of the present embodiment. In order to facilitate visual recognition, the scale of each part is appropriately changed and shown.

図１に示されるように、粒子分析装置１は、被検粒子Ｄを含む試料液（液体）７１を含む層流（流れ）Ｆにパルス励起光Ｌ１（以下、励起光Ｌ１とする）を励起光照射手段２０により照射し、励起光Ｌ１が照射されることにより被検粒子Ｄから生じる蛍光を受光手段３０により受光し、所定の蛍光Ｌｆを時間分解手段４０により時間分解し、時間分解された蛍光Ｌｆを検出手段５０により検出し、検出された蛍光Ｌｆの強度から分析手段６０により蛍光強度時間分布を得て蛍光寿命Ｔｆを算出し、蛍光寿命Ｔｆに基づいて被検粒子Ｄを分析するフローサイトメータである。 As shown in FIG. 1, the particle analyzer 1 excites pulse excitation light L1 (hereinafter referred to as excitation light L1) in a laminar flow (flow) F including a sample liquid (liquid) 71 including a test particle D. Irradiated by the light irradiating means 20 and irradiated with the excitation light L1, the fluorescence generated from the test particle D is received by the light receiving means 30, and the predetermined fluorescence Lf is time resolved by the time resolving means 40 and time resolved. Flow in which the fluorescence Lf is detected by the detection means 50, the fluorescence intensity time distribution is obtained from the intensity of the detected fluorescence Lf by the analysis means 60, the fluorescence lifetime Tf is calculated, and the test particle D is analyzed based on the fluorescence lifetime Tf It is a cytometer.

蛍光寿命の測定方法は、時間領域測定法と周波数領域測定法に大別され、本実施形態においては時間領域測定法を採用する。時間領域測定法には、ストリークカメラ法、時間相関単一光子計数法、時間ゲート法等があるが、本実施形態では、時間ゲート法により蛍光寿命の測定を行う例について説明する。 The fluorescence lifetime measurement method is roughly classified into a time domain measurement method and a frequency domain measurement method, and in this embodiment, the time domain measurement method is adopted. Examples of the time domain measurement method include a streak camera method, a time correlation single photon counting method, a time gate method, and the like. In this embodiment, an example in which fluorescence lifetime is measured by the time gate method will be described.

時間ゲート法は、パルス励起光の照射と同期して、発光した蛍光をある時間領域で区切り、その範囲の蛍光強度積分値をＣＣＤ等の固体検出器で検出して時間領域を変えて測定することで近似的に蛍光減衰曲線を求めて蛍光強度時間分布を得る方法である。本実施形態では、ビームスプリッタ２５により励起光Ｌ１から分けられた信号光Ｌ２がフォトダイオード４４により検出されると、同期制御装置４３によりゲートコントローラ４２に対して同期信号Ｓ１が送られる。ゲートコントローラ４２は、同期信号Ｓ１を受けて予め設定された所定の時間領域にゲート信号Ｓ２を発信し、ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１を駆動する。ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１に入力された蛍光像Ｌｆは、ゲート信号Ｓ２に応じた時間領域において増強されて、検出手段５０により、蛍光Ｌｆの蛍光強度の積分値（蛍光信号）Ｌｔを検出される。この工程をゲート信号Ｓ２に応じて繰り返し、分析手段６０により単一指数関数による解析を行って蛍光寿命Ｔｆを算出する。 In the time gate method, in synchronization with the irradiation of pulsed excitation light, the emitted fluorescence is separated in a certain time domain, and the fluorescence intensity integrated value in that range is detected by a solid-state detector such as a CCD, and the time domain is changed and measured. In this way, a fluorescence decay curve is approximately obtained to obtain a fluorescence intensity time distribution. In the present embodiment, when the signal light L 2 separated from the excitation light L 1 by the beam splitter 25 is detected by the photodiode 44, the synchronization signal S 1 is sent to the gate controller 42 by the synchronization control device 43. The gate controller 42 receives the synchronization signal S1 and transmits a gate signal S2 in a predetermined time region set in advance to drive the image intensifier 41 with a gate function. The fluorescence image Lf input to the image intensifier 41 with the gate function is enhanced in the time domain according to the gate signal S2, and the detection means 50 detects the integrated value (fluorescence signal) Lt of the fluorescence intensity of the fluorescence Lf. Is done. This process is repeated according to the gate signal S2, and the analysis means 60 performs analysis with a single exponential function to calculate the fluorescence lifetime Tf.

蛍光寿命Ｔｆは物質固有の値であり、例えば、細胞に異常があった場合は正常な細胞と値が異なる。例えば、がん細胞は正常細胞と化学的性質が異なるため、蛍光寿命Ｔｆが変化する。更に、蛍光寿命は励起光強度や周辺に存在する別の蛍光により影響を受けないため、精度のよい物質の同定を行うことができる。蛍光寿命測定による物質同定については、例えば特開２００２−０３９９４３等に記載されている。 The fluorescence lifetime Tf is a value unique to a substance. For example, when a cell is abnormal, the value is different from that of a normal cell. For example, the fluorescence lifetime Tf changes because cancer cells have different chemical properties from normal cells. Furthermore, since the fluorescence lifetime is not affected by the excitation light intensity or other fluorescence existing in the vicinity, the substance can be identified with high accuracy. About substance identification by fluorescence lifetime measurement, it describes in Unexamined-Japanese-Patent No. 2002-039943 etc., for example.

粒子分析装置１はフローサイトメータであるので、被検粒子Ｄは、シース液７３に包まれたシースフロー（層流）Ｆ中で一列に整列し、ほぼ等間隔フローセル７５内を流れている。シースフローＦを形成するフロー部７０は、被検粒子Ｄを含有する試料液（液体）７１を供給する試料液供給部７２と、試料液供給部７２の周囲に設けられてシース液７３を供給するシース液供給部７４と、試料液７１とシース液７３の合流地点に連結された細い管状のフローセル７５とを有する。試料液供給部７２から試料液７１を流すと同時に、試料液７１の周囲にシース液供給部７４からシース液７３を流す。このとき、試料液供給部７２にかける圧力をシース液供給部７４にかける圧力より若干低く設定することにより、流体力学的な絞り込みが生じ、シース液７３に包まれた試料液７１の流径が非常に細くなり、試料液７１に含まれる被検粒子Ｄをフローセル７５内で一列に整列させてほぼ等間隔で流すことが可能になる。一例として、フローセル７５を流れる試料液流の速度は数〜２０ｍ／秒、フローセル７５の幅は５〜４０μｍにすることができる。 Since the particle analyzer 1 is a flow cytometer, the test particles D are aligned in a line in the sheath flow (laminar flow) F wrapped in the sheath liquid 73 and flow in the flow cell 75 at approximately equal intervals. The flow unit 70 that forms the sheath flow F is provided around the sample liquid supply unit 72 and the sample liquid supply unit 72 that supplies the sample liquid (liquid) 71 containing the test particles D, and supplies the sheath liquid 73. And a thin tubular flow cell 75 connected to the joining point of the sample liquid 71 and the sheath liquid 73. At the same time as the sample solution 71 is supplied from the sample solution supply unit 72, the sheath solution 73 is supplied from the sheath solution supply unit 74 around the sample solution 71. At this time, by setting the pressure applied to the sample liquid supply part 72 slightly lower than the pressure applied to the sheath liquid supply part 74, hydrodynamic narrowing occurs, and the flow diameter of the sample liquid 71 wrapped in the sheath liquid 73 is reduced. It becomes very thin, and the test particles D contained in the sample liquid 71 can be arranged in a line in the flow cell 75 and flow at substantially equal intervals. As an example, the speed of the sample liquid flowing through the flow cell 75 can be several to 20 m / second, and the width of the flow cell 75 can be 5 to 40 μm.

フローセル７５の下流側の端部は開口しており、この端部から被検粒子Ｄを１つずつ含有する液滴５７が吐出される。粒子分析装置１はセルソーター型の構成を採用しており、フロー部７は、被検粒子Ｄを分取するための分取制御手段７６、およびフローセル７５の下流側に配置された偏向板（分取手段）７７ａ、７７ｂを有している。 An end portion on the downstream side of the flow cell 75 is opened, and a droplet 57 containing the test particles D one by one is discharged from this end portion. The particle analyzer 1 adopts a cell sorter type configuration, and the flow unit 7 includes a sorting control means 76 for sorting the test particles D, and a deflection plate (sorting unit) arranged on the downstream side of the flow cell 75. Taking means) 77a, 77b.

粒子分析装置１において、励起光発生手段１０は、測定する蛍光の励起波長を発振可能なパルスレーザ１１と、パルスレーザ１１より発振されたパルスを、所定の間隔にて出射させるように間引くパルスピッカー１２とを含む。パルスレーザ１１は、特に制限されないが、超短パルス光を発振できるレーザであることが好ましく、数十フェムト秒〜数十ピコ秒の時間範囲内でパルス発振可能なレーザであることがより好ましい。パルスレーザ１１としては、例えば、発振波長７４０ｎｍのチタンサファイアレーザの第２次高調波（ＳＨＧ）である波長３７０ｎｍ、パルス幅３ｐｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー８ｋＷ、平均パワー２Ｗ等を用いることができる。また、励起光発生手段１０には、第３次高調波（ＴＨＧ）や光パラメトリック発信器（Optical Parametric Oscillator:OPO）等の波長変換素子を備えた構成としてもよい。 In the particle analyzer 1, the excitation light generation means 10 includes a pulse laser 11 that can oscillate the excitation wavelength of the fluorescence to be measured, and a pulse picker that thins out the pulses oscillated from the pulse laser 11 so as to be emitted at a predetermined interval. 12 and so on. The pulse laser 11 is not particularly limited, but is preferably a laser capable of oscillating ultrashort pulsed light, and more preferably a laser capable of pulse oscillation within a time range of several tens of femtoseconds to several tens of picoseconds. As the pulse laser 11, for example, a second harmonic (SHG) wavelength of 370 nm of a titanium sapphire laser with an oscillation wavelength of 740 nm, a pulse width of 3 ps, a repetition frequency of 80 MHz, a peak power of 8 kW, an average power of 2 W, and the like can be used. . The excitation light generating means 10 may be configured to include a wavelength conversion element such as a third harmonic (THG) or an optical parametric oscillator (OPO).

また、被検粒子Ｄ内において励起される蛍光Ｌｆは多光子励起によるものでもよい。その場合は、多光子励起可能な波長及びパルス幅の励起光Ｌ１として、発振波長７４０ｎｍのチタンサファイアレーザ、パルス幅２００ｆｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー３０ｋＷ、平均パワー０．５Ｗ等を用いる。多光子励起では、所望の箇所だけ励起が可能なので、周辺部の蛍光低減ができより低雑音化ができ、また観察箇所より前の部分での吸収減衰を低減できるので効率よく観察箇所に励起光Ｌ１を照射することができる。また、高い空間分解能で分析もできる。 Further, the fluorescence Lf excited in the test particle D may be due to multiphoton excitation. In that case, a titanium sapphire laser with an oscillation wavelength of 740 nm, a pulse width of 200 fs, a repetition frequency of 80 MHz, a peak power of 30 kW, an average power of 0.5 W, or the like is used as the excitation light L1 having a wavelength and pulse width capable of multiphoton excitation. In multi-photon excitation, only the desired location can be excited, so the fluorescence at the periphery can be reduced, noise can be reduced, and the absorption attenuation at the location before the observation location can be reduced, so that the excitation light can be efficiently applied to the observation location. L1 can be irradiated. Analysis can also be performed with high spatial resolution.

励起光発生手段１０から出射された励起光Ｌ１は、励起光照射手段２０に入射され、励起光照射手段２０により被検粒子Ｄを含む試料液７１を含む層流Ｆに照射される。励起光照射手段２０の構成は特に制限されないが、本実施形態では、励起光Ｌ１の照射と被検粒子Ｄから発生した蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３の受光を同一の対物レンズ２１（３１）で行う構成としている。従って、励起光照射手段２０には、フローセル７５内のシースフローＦの所定位置に励起光Ｌ１を照射し、且つ、光Ｌ３を受光できるように配された対物レンズ２１及び、励起光Ｌ１を対物レンズ２１に入射させ、且つ、光Ｌ３を時間分解手段４０に導くダイクロイックミラー２２（３２）を備えている。対物レンズ２１としては、励起光Ｌ１及び蛍光の透過率が高く、レンズ素材による蛍光の発生の少ないものが好ましい。 The excitation light L1 emitted from the excitation light generation unit 10 is incident on the excitation light irradiation unit 20 and is irradiated by the excitation light irradiation unit 20 onto the laminar flow F including the sample liquid 71 including the test particle D. Although the configuration of the excitation light irradiation means 20 is not particularly limited, in the present embodiment, the same objective lens 21 (31) performs irradiation of the excitation light L1 and reception of the light L3 including the fluorescence Lf generated from the test particle D. It is configured. Therefore, the excitation light irradiating means 20 irradiates the excitation light L1 to a predetermined position of the sheath flow F in the flow cell 75 and receives the light L3 and the excitation light L1 as an objective. A dichroic mirror 22 (32) that is incident on the lens 21 and guides the light L 3 to the time resolving means 40 is provided. The objective lens 21 is preferably a lens that has high transmittances for the excitation light L1 and fluorescence and generates little fluorescence due to the lens material.

また、本実施形態では、励起光Ｌ１の照射と時間分解手段４０を同期して駆動させるため、励起光照射手段２０に同期信号Ｓ１を発信させる信号光Ｌ２を励起光Ｌ１から分割させるビームスプリッタ２５を、そして、励起光Ｌ１を検出する蛍光の励起波長の光に絞り込む励起フィルター２３を備えている。励起光照射手段２０には、必要に応じて励起光Ｌ１を導光するミラー（２４，２６）やレンズ等（図示略）を備えてよい。 In the present embodiment, in order to drive the excitation light L1 and the time resolving means 40 in synchronization, the beam splitter 25 that splits the signal light L2 that causes the excitation light irradiation means 20 to transmit the synchronization signal S1 from the excitation light L1. And an excitation filter 23 that narrows down the light to the excitation wavelength of the fluorescence that detects the excitation light L1. The excitation light irradiation means 20 may be provided with mirrors (24, 26) and lenses (not shown) for guiding the excitation light L1 as necessary.

受光手段３０は、励起光Ｌ１の照射により被検粒子Ｄにおいて生じた光Ｌ３を受光して時間分解手段４０に目的とする蛍光Ｌｆを出力できれば特に制限されないが、本実施形態では、被検粒子Ｄから発生した光Ｌ３を受光する対物レンズ３１（２１）と、光Ｌ３を時間分解手段４０に導くダイクロイックミラー３２（２２）と、光Ｌ３から励起光Ｌ１の散乱光等のノイズ光を除去するフィルター３３とを備えている。 The light receiving means 30 is not particularly limited as long as it can receive the light L3 generated in the test particle D by the irradiation of the excitation light L1 and output the target fluorescence Lf to the time resolving means 40, but in this embodiment, the test particle is not limited. An objective lens 31 (21) that receives the light L3 generated from D, a dichroic mirror 32 (22) that guides the light L3 to the time resolving means 40, and noise light such as scattered light of the excitation light L1 is removed from the light L3. And a filter 33.

対物レンズ３１及びダイクロイックミラー３２については上述の通りである。フィルター３４は、検出する蛍光Ｌｆの波長に応じて、バンドパスフィルタやショートパスフィルタ等適宜選択して用いればよい。複数種類の蛍光を観測するときは、異なる透過波長帯域を有する複数のバンドパスフィルタを用いたり、あるいは透過波長帯域が可変のものを用いるようにしてもよい。 The objective lens 31 and the dichroic mirror 32 are as described above. The filter 34 may be appropriately selected and used, such as a band pass filter or a short pass filter, according to the wavelength of the fluorescence Lf to be detected. When observing a plurality of types of fluorescence, a plurality of bandpass filters having different transmission wavelength bands or a variable transmission wavelength band may be used.

検出する蛍光Ｌｆは、被検粒子Ｄに予め標識された蛍光色素からの蛍光であってもよいし、被検粒子Ｄ自身が有する物質固有の自家蛍光であってもよい。有機系蛍光色素及び無機系蛍光色素を用いた検出は、その蛍光強度の強さから感度のよい検出を行うことができるが、生体に対して毒性を有するものが多く、場合によっては被検粒子を死に至らしめることもあるため、被検粒子Ｄが生物物質である場合は好ましくない。特に、後記する、第２実施形態のように、直接生体内の被検粒子を測定対象とする場合は、有害物質により標識して分析を行うことは難しい。そのため、生物物質を被検粒子とする場合は、自家蛍光を用いた分析が好ましい。 The fluorescence Lf to be detected may be fluorescence from a fluorescent dye that is pre-labeled on the test particle D, or autofluorescence specific to the substance that the test particle D itself has. Detection using organic fluorescent dyes and inorganic fluorescent dyes can be carried out with high sensitivity due to the intensity of the fluorescence intensity, but many of them are toxic to living organisms. In some cases, the test particle D is not a biological substance. In particular, as in the second embodiment, which will be described later, when a test particle directly in a living body is a measurement target, it is difficult to perform analysis by labeling with a harmful substance. Therefore, when a biological substance is used as a test particle, analysis using autofluorescence is preferable.

自家蛍光は、その蛍光強度が弱いため、蛍光強度の評価では周辺物質の蛍光等による影響により感度の良い検出を行うことが難しいとされているが、本実施形態の粒子分析装置１では、蛍光の絶対強度での分析ではなく、蛍光寿命により物質の分析を行っている。既に述べたように、蛍光寿命は、蛍光強度の絶対値と異なり、物質固有の値であることから、近い波長で発光される周辺物質の蛍光等により影響されることがない。従って、本実施形態の粒子分析装置１では、精度の高い検出を、自家蛍光により実施することができる。より精度の高い検出を行うためには、蛍光寿命が４．９ｎｓ以上の物質の自家蛍光を測定対象とすることが好ましい。 Since autofluorescence has low fluorescence intensity, it is difficult to perform sensitive detection due to the influence of fluorescence of surrounding substances in the evaluation of fluorescence intensity, but in the particle analyzer 1 of this embodiment, fluorescence is difficult. Analyzes of substances based on fluorescence lifetime rather than analysis of absolute intensity. As already described, the fluorescence lifetime is different from the absolute value of the fluorescence intensity and is a value inherent to the substance, so that it is not affected by the fluorescence of the peripheral substance that emits light at a near wavelength. Therefore, in the particle analyzer 1 of the present embodiment, highly accurate detection can be performed by autofluorescence. In order to perform detection with higher accuracy, it is preferable to measure autofluorescence of a substance having a fluorescence lifetime of 4.9 ns or more.

表１に、主な自家蛍光物質と、時間相関単一光子計数法（ＴＣＳＰＣ）により本発明者が測定した各自家蛍光物質の蛍光寿命値を示す。表１の蛍光寿命は、プロテインと結合していないフリー状態にある蛍光物質の蛍光寿命値である。 Table 1 shows the main autofluorescent materials and the fluorescence lifetime values of the respective autofluorescent materials measured by the present inventor by the time correlated single photon counting method (TCSPC). The fluorescence lifetime in Table 1 is a fluorescence lifetime value of a fluorescent substance in a free state not bound to protein.

また、図２Ａ，Ｂに、主な生物物質中の自家蛍光を発する物質の励起光吸収特性及び蛍光スペクトルを示す。

2A and 2B show excitation light absorption characteristics and fluorescence spectra of substances that emit autofluorescence in main biological substances.

受光手段３０により得られた蛍光Ｌｆは、時間分解手段４０に入力される。時間分解手段４０は、蛍光Ｌｆの、所定の時間領域の蛍光信号Ｌｔを取り出して検出手段５０に出力するものである。蛍光の時間分解は、励起光Ｌ１の照射に対する最初の同期信号Ｓ１の受信時ｔ０から開始する。同期信号Ｓ１は、励起光Ｌ１からビームスプリッタ２５により分けられた信号光Ｌ２が、光検出器４４で電気信号に変換されて同期制御装置４３から、ゲートコントローラ４２に送られる。
The fluorescence Lf obtained by the light receiving means 30 is input to the time resolving means 40. The time resolving means 40 extracts the fluorescence signal Lt of the fluorescence Lf in a predetermined time region and outputs it to the detection means 50. The time resolution of the fluorescence starts from the time t0 when the first synchronization signal S1 is received for the excitation light L1. In the synchronization signal S1, the signal light L2 separated from the excitation light L1 by the beam splitter 25 is converted into an electric signal by the photodetector 44 and sent from the synchronization control device 43 to the gate controller 42.

光検出器４４としては特に制限されず、一般的に用いられているフォトダイオード等を用いることができる。 The photodetector 44 is not particularly limited, and a generally used photodiode or the like can be used.

同期制御装置４３は、光検出器４４から出力された信号を受けてゲートコントローラ４２に同期信号Ｓ１を出力できれば特に制限なく、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）等を用いることができる。ゲートコントローラ４２は、同期信号Ｓ１を受けて予め設定された所定の時間領域にゲート信号Ｓ２を発信し、ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１のゲートの開閉を指示する。ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１には、ＣＣＤカメラ等の検出手段５０が接続されており、ゲート信号Ｓ２に基づいてゲートを開閉し、ゲートが開いているときに受光した蛍光Ｌｆを増幅させ、コントラストの向上した蛍光信号ＬｔをＣＣＤ等の検出手段５０により受光して電気信号として蓄積し、検出する。例えば、ゲートコントローラ４２が同期信号Ｓ１を最初に受けた時刻を基準時刻ｔ０として、時間Δｔの間だけゲート機能付きイメージインテンシファイア４１のゲートを開くように指示するゲート信号Ｓ２を出力すると、ゲート機能付きイメージインテンシファイア４１により、ｔ０〜Δｔの間の蛍光Ｌｆを増幅させて蛍光信号Ｌｔを検出手段５０に出力し、検出手段５０は、その時間範囲の蛍光信号Ｌｔを検出して、その蛍光強度の積分値Ｓ３を分析手段６０に出力する。この蛍光強度Ｓ３の検出工程を、ゲート信号に応じて繰り返すことにより、時間分解された蛍光強度を分析手段に出力する。 The synchronization controller 43 can use a personal computer (PC) or the like without particular limitation as long as it can receive the signal output from the photodetector 44 and output the synchronization signal S1 to the gate controller 42. The gate controller 42 receives the synchronization signal S1 and transmits a gate signal S2 in a predetermined time region set in advance to instruct opening / closing of the gate of the image intensifier 41 with a gate function. Detection means 50 such as a CCD camera is connected to the image intensifier 41 with a gate function, and the gate is opened and closed based on the gate signal S2, and the received fluorescence Lf is amplified when the gate is opened. The fluorescence signal Lt with improved contrast is received by the detection means 50 such as a CCD, and is accumulated and detected as an electrical signal. For example, when the gate controller 42 outputs the gate signal S2 for instructing to open the gate of the image intensifier 41 with the gate function only during the time Δt, with the time when the gate controller 42 first receives the synchronization signal S1 as the reference time t0, The function image intensifier 41 amplifies the fluorescence Lf between t0 and Δt and outputs the fluorescence signal Lt to the detection means 50. The detection means 50 detects the fluorescence signal Lt in the time range, The integrated value S3 of the fluorescence intensity is output to the analysis means 60. By repeating this detection step of the fluorescence intensity S3 according to the gate signal, the time-resolved fluorescence intensity is output to the analysis means.

分析手段６０としては特に制限ないが、ＰＣ等のコンピュータシステムを用いることが簡易であり好ましい。分析手段６０は、同期制御装置４３とを同じ装置により兼ねてもよい。分析手段６０は、時間分解された蛍光強度Ｓ３から蛍光減衰曲線を求めて蛍光強度時間分布を得る。この蛍光減衰曲線において、蛍光強度が1/eになった時間ｔｍａｘと発光の開始時ｔ０との差を蛍光寿命Ｔｆとして算出する。図３に、時間分解された蛍光強度から得られた蛍光強度時間分布及び蛍光減衰曲線から求められた蛍光寿命Ｔｆを示す。図３において、ｔ０からの経過時間ｔにおける蛍光強度Ｉとt０における蛍光強度Ｉ_０とは、下記式の関係で表される。分析手段６０では、Ｓ３がある時間ｔにおける蛍光強度Ｉとなる。 The analyzing means 60 is not particularly limited, but it is simple and preferable to use a computer system such as a PC. The analysis unit 60 may also serve as the synchronization control device 43 by the same device. The analysis means 60 obtains a fluorescence decay curve from the time-resolved fluorescence intensity S3 to obtain a fluorescence intensity time distribution. In this fluorescence decay curve, the difference between the time tmax when the fluorescence intensity becomes 1 / e and the light emission start time t0 is calculated as the fluorescence lifetime Tf. FIG. 3 shows the fluorescence lifetime Tf obtained from the fluorescence intensity time distribution and fluorescence decay curve obtained from the time-resolved fluorescence intensity. In FIG. 3, the fluorescence intensity I at the elapsed time t from t0 and the fluorescence intensity I _{0 at} t0 are represented by the relationship of the following equation. In the analysis means 60, S3 becomes the fluorescence intensity I at a certain time t.

Ｉ＝Ｉ_０ｅ^−ｔ／Tf
次に、分析手段６０は得られた蛍光寿命に基づいて、被検粒子Ｄ内部の分子を同定し、被検粒子Ｄの内部性質の情報を取得し、被検粒子Ｄを分析する。ここで、細胞の内部性質とは、細胞を構成する成分（例えばタンパク質や脂質、無機質等）、各成分の分布、各成分の割合、化学的性質等である。分析手段６０は、分析の目的に応じ、内部性質や機能の情報を用いて細胞を分析することができる。例えば、ある細胞が正常な細胞であるか癌化した細胞であるか等を蛍光寿命Ｔｆにより分析して判別することが可能である。 I = I ₀ e ^{−t / Tf}
Next, the analyzing means 60 identifies the molecules inside the test particle D based on the obtained fluorescence lifetime, acquires information on the internal properties of the test particle D, and analyzes the test particle D. Here, the internal properties of the cells are components (for example, proteins, lipids, minerals, etc.) constituting the cells, the distribution of each component, the ratio of each component, chemical properties, and the like. The analysis means 60 can analyze cells using information on internal properties and functions according to the purpose of analysis. For example, it is possible to determine whether a certain cell is a normal cell or a cancerous cell by analyzing the fluorescence lifetime Tf.

表示部８０は、分析手段６０の分析結果を表示するものであり、例えばモニタ装置等により構成することができる。 The display part 80 displays the analysis result of the analysis means 60, and can be comprised by a monitor apparatus etc., for example.

分取制御手段７６は、分析手段６０と接続され、分析手段６０からの情報に基づき、吐出された液滴７８に正または負の電荷を選択的に帯電させる。液滴７８の進行方向の両側にはそれぞれ正、負の所定電圧が印加され、分取用の異なるラインに接続された偏向板７７ａ、７７ｂが配設されている。帯電した液滴７８が偏向板７７ａ、７７ｂの間を通過するときに、帯電の正負に応じて電場の力を受けて偏向板７７ａあるいは偏向板７７ｂの方向へ偏向されることにより、所望の細胞を分取することができる。分取用のラインとは、例えば、培養実験用に被検粒子Ｄを回収するライン、分析後の細胞を廃棄するためのライン等である。 The sorting control unit 76 is connected to the analysis unit 60 and selectively charges positive or negative charges on the discharged droplet 78 based on information from the analysis unit 60. Predetermined positive and negative voltages are applied to both sides of the droplet 78 in the traveling direction, and deflecting plates 77a and 77b connected to different lines for sorting are disposed. When the charged droplet 78 passes between the deflecting plates 77a and 77b, it is deflected in the direction of the deflecting plate 77a or the deflecting plate 77b by receiving the force of the electric field in accordance with the positive / negative of the electrification. Can be sorted. The sorting line is, for example, a line for collecting the test particles D for a culture experiment, a line for discarding cells after analysis, or the like.

なお、図１では、偏向板７７ａ、７７ｂの２方向へ分取する粒子分析装置１００を図示しているが、正にも負にも帯電されない液滴を分取するためのラインをさらに設け、計３つのラインを備えた構成としてもよい。 In FIG. 1, the particle analyzer 100 for sorting in two directions of the deflecting plates 77a and 77b is shown, but a line for sorting droplets that are not charged positively or negatively is further provided. It is good also as a structure provided with a total of three lines.

次に、上記構成を有する粒子分析装置１の動作例について説明する。まず、フロー部７において、被検粒子Ｄを含有する試料液７１がシース液７３に包まれてフローセル７５内を流れるシースフローＦを形成する。シースフローＦにおいて、被検粒子Ｄはフローセル７５内を一列に整列した状態で流れていく。 Next, an operation example of the particle analyzer 1 having the above configuration will be described. First, in the flow unit 7, the sample liquid 71 containing the test particle D is wrapped in the sheath liquid 73 to form a sheath flow F that flows in the flow cell 75. In the sheath flow F, the test particles D flow in the flow cell 75 in a state of being aligned in a line.

励起光発生手段１０からは励起光Ｌ１が出射されて、励起光照射手段２０に入射する。励起光照射手段２０に入射された励起光Ｌ１は、ビームスプリッタ２５により同期用信号光Ｌ２を分離した後、に対物レンズ２１により集光されて、フローセル７５内の試料液７１の流れに照射され、各被検粒子Ｄに照射される。この照射により、被検粒子Ｄからは蛍光Ｌｆが発せられる。受光手段３０の対物レンズ３１は、被検粒子Ｄから発せられた光Ｌ３を受光する。光Ｌ３には、蛍光Ｌｆ以外のノイズ光も含まれているが、フィルタ３３を通過することにより、蛍光Ｌｆ以外の光がほぼ排除される。 Excitation light L 1 is emitted from the excitation light generation means 10 and enters the excitation light irradiation means 20. The excitation light L1 incident on the excitation light irradiation means 20 is condensed by the objective lens 21 after being separated from the synchronizing signal light L2 by the beam splitter 25, and irradiated to the flow of the sample liquid 71 in the flow cell 75. The test particles D are irradiated. By this irradiation, fluorescence Lf is emitted from the test particle D. The objective lens 31 of the light receiving means 30 receives the light L3 emitted from the test particle D. Although the light L3 includes noise light other than the fluorescence Lf, light other than the fluorescence Lf is almost eliminated by passing through the filter 33.

蛍光Ｌｆは、ミラー３４により光路を曲げられて時間分解手段４０に入射され、時間分解された蛍光信号Ｌｔとして検出手段５０に出力される。検出手段５０は、検出された蛍光信号Ｌｔを、各時間においてΔｔの時間範囲の積分値である蛍光強度Ｓ３を検出し、電気信号として分析手段６０に出力される。分析手段６０は、時間分解された蛍光強度Ｓ３から蛍光強度−時間曲線を得、この曲線において、蛍光強度が1/eになった時間ｔｍａｘとｔ０との差を蛍光寿命Ｔｆとして算出し、蛍光寿命Ｔｆに基づいて、被検粒子Ｄの内部構造の情報を取得し、被検粒子Ｄを分析する。これにより、被検粒子Ｄに含まれる分子が同定され、被検粒子Ｄの内部性質の情報が取得され、被検粒子Ｄの同定や正常・異常等の判別が行われる。分析手段６０から分取制御手段７６へ分取を指示する信号が送信され、分取制御手段７６は分取指示の出された被検粒子Ｄを含む液滴７８に正あるいは負の電荷を帯電させて、分取を行う。本実施形態では分析結果に応じて被検粒子Ｄの分取を行ったが、分取は行わなくてもよい。 The fluorescence Lf is bent in the optical path by the mirror 34, is incident on the time resolving means 40, and is output to the detecting means 50 as a time-resolved fluorescence signal Lt. The detection means 50 detects the fluorescence intensity S3 that is an integral value of the time range of Δt at each time from the detected fluorescence signal Lt, and outputs it to the analysis means 60 as an electrical signal. The analysis means 60 obtains a fluorescence intensity-time curve from the time-resolved fluorescence intensity S3, and calculates the difference between the time tmax and the time t0 when the fluorescence intensity becomes 1 / e in this curve as the fluorescence lifetime Tf. Based on the lifetime Tf, information on the internal structure of the test particle D is acquired, and the test particle D is analyzed. As a result, the molecules contained in the test particle D are identified, information on the internal properties of the test particle D is acquired, and the test particle D is identified and determined as normal / abnormal. A signal instructing sorting is transmitted from the analyzing means 60 to the sorting control means 76, and the sorting control means 76 charges positive or negative charges on the droplet 78 containing the test particle D for which the sorting instruction has been issued. And sort. In the present embodiment, the test particles D are sorted according to the analysis result, but the sorting may not be performed.

上記のように、粒子分析装置１は、蛍光寿命Ｔｆにより被検粒子Ｄを分析するものである。蛍光寿命Ｔｆは、物質固有の値を持ち、励起光Ｌ１の波長や強度、蛍光物質の濃度や退色等に影響されることなく、周囲の環境によって変化するため、高精度に被検粒子Ｄの同定や正常・異常の判断等の内部性質に基づく分析が可能となる。 As described above, the particle analyzer 1 analyzes the test particle D based on the fluorescence lifetime Tf. The fluorescence lifetime Tf has a value specific to the substance and changes depending on the surrounding environment without being influenced by the wavelength and intensity of the excitation light L1, the concentration and fading of the fluorescent substance, etc. Analysis based on internal properties such as identification and judgment of normality / abnormality becomes possible.

また、被検粒子Ｄから種々の物質の蛍光が発せられる場合にも、各物質の蛍光を高精度に分離することができるので、所望の物質からの蛍光Ｌｆを高精度に分析することができる。 Further, even when fluorescence of various substances is emitted from the test particle D, the fluorescence of each substance can be separated with high accuracy, so that the fluorescence Lf from a desired substance can be analyzed with high accuracy. .

また、物質固有の値である蛍光寿命により粒子分析を行うため、蛍光強度による粒子分析では、その蛍光強度の弱さから分離が難しく精度の点で分析には不向きとされていた自家蛍光による粒子分析が可能である。自家蛍光により分析では、被検粒子を蛍光色素による染色する必要がないため、染色によるダメージを与えることなく粒子分析をすることができる。従って、分析後の粒子の再利用やin vivoにおける分析を可能とすることができる。 In addition, since particle analysis is performed based on the fluorescence lifetime, which is a value unique to the substance, particle analysis based on fluorescence intensity makes it difficult to separate due to the weak fluorescence intensity, and particles due to autofluorescence that were not suitable for analysis in terms of accuracy. Analysis is possible. In the analysis by autofluorescence, since it is not necessary to stain the test particles with a fluorescent dye, particle analysis can be performed without causing damage due to staining. Therefore, it is possible to reuse the particles after analysis or to perform in vivo analysis.

上記実施形態では、照射する励起光Ｌ１のビーム径に応じた領域の分析を行う形態について説明した。励起光強度が不足し、十分な蛍光強度が得られない場合や、被検粒子Ｄの粒径が励起光Ｌ１のビーム径に比して大きく、ビーム径に応じた領域だけの分析では不十分な場合や、被検粒子Ｄの粒径が流路径よりもかなり小さく、流れの垂直方向全体の分析ができない場合は、図４に示される粒子分析装置２のように、ビーム径を小さく集光するなどして、励起光照射手段２０に、層流Ｆに対して略垂直方向に被検粒子Ｄ上で励起光Ｌ１を走査させる走査光学系２７を備えた構成とすることにより、被検粒子Ｄについて２次元の分析を行うことができる。走査光学系を用いない場合として、流れの垂直方向に長いラインビーム集光により励起光Ｌ１を照射する構成としてもよい。共焦点系の光学系を構成し、光軸方向への走査手段を備えれば、３次元の分析も行うことができる。 In the above-described embodiment, the mode in which the region is analyzed according to the beam diameter of the excitation light L1 to be irradiated is described. When the excitation light intensity is insufficient and sufficient fluorescence intensity cannot be obtained, or the particle diameter of the test particle D is larger than the beam diameter of the excitation light L1, and it is not sufficient to analyze only the region corresponding to the beam diameter. If the particle diameter of the test particle D is much smaller than the flow path diameter and the entire flow cannot be analyzed in the vertical direction, the beam diameter is reduced and condensed as in the particle analyzer 2 shown in FIG. As a result, the excitation light irradiating means 20 includes the scanning optical system 27 that scans the excitation light L1 on the test particle D in a direction substantially perpendicular to the laminar flow F. A two-dimensional analysis can be performed on D. As a case where the scanning optical system is not used, the excitation light L1 may be irradiated by condensing the line beam long in the vertical direction of the flow. If a confocal optical system is configured and scanning means in the optical axis direction is provided, three-dimensional analysis can also be performed.

かかる構成とする場合は、励起光Ｌ１により励起される蛍光の種類が複数になる可能性が高いため、図５に示される粒子分析装置３ように、受光手段３０により受光した蛍光Ｌｆを分光して時間分解手段４０に蛍光Ｌｆの蛍光スペクトルＬｓを出力する分光手段３５を備えた構成とすることが好ましい。蛍光Ｌｆを分光して蛍光スペクトルＬｓを時間分解することにより、より高精度に複数の蛍光を分離して所定の波長の蛍光の蛍光寿命を測定することができる。 In the case of such a configuration, since there is a high possibility that there are a plurality of types of fluorescence excited by the excitation light L1, the fluorescence Lf received by the light receiving means 30 is dispersed as in the particle analyzer 3 shown in FIG. The time resolving means 40 is preferably provided with a spectroscopic means 35 for outputting the fluorescence spectrum Ls of the fluorescence Lf. By splitting the fluorescence Lf and time-resolving the fluorescence spectrum Ls, it is possible to separate a plurality of fluorescences with higher accuracy and measure the fluorescence lifetime of fluorescence having a predetermined wavelength.

図４又は図５に示される走査光学系を備えた構成は、局所的な励起を行う多光子励起の場合等に、特に好ましく用いることができる。 The configuration provided with the scanning optical system shown in FIG. 4 or 5 can be used particularly preferably in the case of multiphoton excitation in which local excitation is performed.

「粒子分析装置の第２実施形態（in vivo測定・眼底カメラ）」
次に、本発明の別の実施形態にかかる粒子分析装置について説明する。第１実施形態の粒子分析装置１は、フローサイトメータであったが、本実施形態の粒子分析装置４は、in vivoにて粒子分析を行う粒子分析装置である点で第1実施形態と異なっている。なお、以降の実施形態の説明および図面においては、前述の実施形態の構成要素と実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。 "Second embodiment of particle analyzer (in vivo measurement, fundus camera)"
Next, a particle analyzer according to another embodiment of the present invention will be described. The particle analyzer 1 of the first embodiment is a flow cytometer, but the particle analyzer 4 of the present embodiment is different from the first embodiment in that it is a particle analyzer that performs particle analysis in vivo. ing. In the following description and drawings of the embodiments, components having substantially the same functional configuration as those of the above-described embodiment will be denoted by the same reference numerals, and redundant description will be omitted.

図６に示されるように、粒子分析装置４は、生体内の血管（脈管）９０内の細胞（被検粒子）Ｄを分析するものである。本実施形態において血管９０内を流れる血液（液体）７１が血流（流れ）Ｆとなる。 As shown in FIG. 6, the particle analyzer 4 analyzes a cell (test particle) D in a blood vessel (vessel) 90 in a living body. In the present embodiment, blood (liquid) 71 flowing in the blood vessel 90 becomes blood flow (flow) F.

粒子分析装置４は、測定する被検粒子Ｄが生体内の血管９０中の細胞であるため、分取等を行わない点を除けば第1実施形態と同様の構成としている。 The particle analysis device 4 has the same configuration as that of the first embodiment except that the sample particle D to be measured is a cell in the blood vessel 90 in the living body, and that the sorting is not performed.

粒子分析装置４は、眼底の血管構造中における異常の有無等の診断に好ましく用いることができる。眼底の血管の診断に用いる場合は、励起光Ｌ１の波長等は、眼底に使用可能で、眼組織を過度に損傷させることなく、且つ、診断する脈管に到達可能なものを選択する必要がある。眼底部では、動脈（通常は皮膚の奥にある）、静脈、毛細血管の全ての血管が表層近くにあり、皮膚などでは困難な動脈を流れる血液の検出も容易となる。 The particle analyzer 4 can be preferably used for diagnosis of the presence or absence of abnormality in the blood vessel structure of the fundus. When used for diagnosing blood vessels in the fundus, it is necessary to select the wavelength of the excitation light L1 that can be used for the fundus, can reach the vascular to be diagnosed without excessively damaging the ocular tissue. is there. At the fundus, all blood vessels such as arteries (usually in the back of the skin), veins, and capillaries are close to the surface layer, making it easy to detect blood that flows through arteries that are difficult on the skin.

眼底部の粒子分析においても、第１実施形態において示した光源を用いた分析を行うことができるが、近赤外光を良く透過するので、発振波長８００ｎｍのチタンサファイアレーザを利用した多光子励起による分析を行うことが好ましい。この場合、励起光Ｌ１のパルス幅は１０ピコ秒以下であることが好ましい。第１実施形態において述べたように、多光子励起では、所望の箇所だけ励起が可能なので、周辺部の蛍光低減ができより低雑音化ができ、また観察箇所より前の部分での吸収減衰を低減できるので効率よく観察箇所に励起光を運ぶことができるため、眼部分析等においては特に有効である。また、高い空間分解能での分析も可能となる。 In the fundus particle analysis, the analysis using the light source shown in the first embodiment can be performed. However, since the near-infrared light is transmitted well, multiphoton excitation using a titanium sapphire laser with an oscillation wavelength of 800 nm is possible. It is preferable to perform an analysis according to. In this case, the pulse width of the excitation light L1 is preferably 10 picoseconds or less. As described in the first embodiment, in multi-photon excitation, excitation can be performed only at a desired location, so that fluorescence at the peripheral portion can be reduced, noise can be reduced, and absorption attenuation can be achieved at a portion before the observation location. Since it can be reduced, the excitation light can be efficiently transported to the observation location, which is particularly effective in eye analysis and the like. In addition, analysis with high spatial resolution is possible.

また、上記のように、直接血管９０中の血流Ｆの被検粒子Ｄを分析する以外に、図７に示されるように、被検粒子Ｄを含む血液７１をいったん外部に取り出して粒子分析を行った後に、分析後の血液７１をまた生体内に戻す構成としてもよい。例えば、図７に示される粒子分析装置５のように、生体内の血管９０に、血管９０内を流れる血液７１を外部に取り出す第１の流路１０１と、第１の流路１０１から血液７１を受け入れて血流Ｆを形成するフローセル７５と、フローセル７５から分析後の血液７１を受け入れて血液７１を血管９０に戻す第２の流路１０２を備えた構成とすればよい。実際には、流路１０１に血液７１を取り出すためのポンプや、分析時の血液の凝固等を抑制する抗凝固薬の注入手段等が必要になるが、図７においては記載を省略する。 In addition to directly analyzing the test particle D of the blood flow F in the blood vessel 90 as described above, as shown in FIG. 7, the blood 71 including the test particle D is once taken out to the particle analysis. It is good also as a structure which returns the blood 71 after analysis to a living body again after performing. For example, as in the particle analyzer 5 shown in FIG. 7, a first flow channel 101 for taking out blood 71 flowing in the blood vessel 90 to the blood vessel 90 in the living body, and the blood 71 from the first flow channel 101. And a second flow channel 102 that receives blood 71 after analysis from the flow cell 75 and returns the blood 71 to the blood vessel 90. Actually, a pump for taking out the blood 71 to the flow path 101 and an anticoagulant injection means for suppressing blood coagulation during analysis are required, but the description is omitted in FIG.

上記したように、上記第１及び第２実施形態の粒子分析装置は、例えば、組織に含まれる正常細胞と癌細胞を分離する際に使用可能である。医療現場等においては、癌細胞が含まれると思われる組織をその周辺領域とともに摘出し、細胞分離試薬により組織から単体の細胞に分離することが行われている。分離された細胞群には正常細胞と癌細胞の両方が存在する。正常細胞と癌細胞では、上述したように蛍光寿命が異なり、蛍光寿命であれば蛍光強度の小さい自家蛍光を利用して、非染色で正常細胞と癌細胞を分離することができる。従来の蛍光強度を用いた分析装置に比べて細胞へのダメージは軽減されるため、分取した癌細胞を培養して株化細胞の作製や、抗癌剤の効果検証等の実験、そして、ｉｎｖｉｖｏでの分析に用いることができる。例えば、培養した細胞を分析して、細胞の大きさや構造に関する情報を得ることにより、細胞の周期を測定することができる。 As described above, the particle analyzers of the first and second embodiments can be used, for example, when separating normal cells and cancer cells contained in a tissue. In the medical field or the like, a tissue that seems to contain cancer cells is removed together with its peripheral region, and separated from the tissue into single cells using a cell separation reagent. The separated cell group includes both normal cells and cancer cells. As described above, normal cells and cancer cells have different fluorescence lifetimes, and if they are fluorescence lifetimes, normal cells and cancer cells can be separated without staining using autofluorescence with low fluorescence intensity. Since damage to cells is reduced as compared with conventional analyzers using fluorescence intensity, experiments such as production of cell lines by culturing sorted cancer cells, verification of the effects of anticancer agents, and in vivo It can be used for analysis. For example, the cell cycle can be measured by analyzing cultured cells and obtaining information on the size and structure of the cells.

一方、自家蛍光による分析では、様々な物質の蛍光が発せられる可能性が高いが、様々な物質の蛍光が存在しても、上記したように、蛍光スペクトルを時間分解する等の方法を用いて高精度に分離して、所定の波長の蛍光寿命に基づいて分析を行うことができる。 On the other hand, in the analysis by autofluorescence, there is a high possibility that fluorescence of various substances is emitted, but even if there is fluorescence of various substances, using a method such as time-resolving the fluorescence spectrum as described above. The analysis can be performed based on the fluorescence lifetime of a predetermined wavelength by separating with high accuracy.

また、上記実施形態の粒子分析装置は、癌腫瘍を摘出する際の判断材料を提供することも可能である。癌腫瘍の摘出手術では、癌細胞が患者の身体に残存すると再発の可能性が高まり好ましくないが、再発を恐れるあまり、過剰に組織を切除するのも患者の身体の負担が増大し好ましくない。そこで、摘出腫瘍が接していた領域の組織を微少量切り取り、細胞分離試薬により単体の細胞に分離した後、本発明の粒子分析装置を用いて、癌細胞の有無を調べる。癌細胞が検出された場合はさらなる切除が必要と判断し、癌細胞が検出されなかった場合は摘出が十分であったと判断することができる。 In addition, the particle analyzer of the above-described embodiment can also provide a determination material for removing a cancer tumor. In surgery to remove cancerous tumors, if cancer cells remain in the patient's body, the possibility of recurrence increases, which is not preferable. However, excessive fear of recurrence increases the burden on the patient's body and is not preferable. Therefore, a small amount of tissue in the area where the excised tumor is in contact is cut out and separated into single cells using a cell separation reagent, and then the presence or absence of cancer cells is examined using the particle analyzer of the present invention. When cancer cells are detected, it can be determined that further excision is necessary, and when cancer cells are not detected, it can be determined that extraction has been sufficient.

上記の株化細胞の作製や、抗癌剤の効果検証は、細胞が新鮮なうちに培養を始める必要がある。また、上記の癌腫瘍の摘出の判断は手術中に短時間で行う必要がある。すなわち、大量の細胞の分析や分取を短時間で行う必要があり、スループットが高い粒子分析装置は有用である。 Preparation of the above-mentioned cell line and verification of the effect of the anticancer agent require culturing while the cells are fresh. In addition, it is necessary to determine the removal of the cancer tumor in a short time during the operation. That is, it is necessary to analyze and sort a large amount of cells in a short time, and a particle analyzer with high throughput is useful.

また、上記第２実施形態の粒子分析装置では、血管中の癌細胞の流れ、及びその機能を検出することができるので、癌の転移メカニズムの解明やその診断などにも有用である。 In addition, since the particle analyzer of the second embodiment can detect the flow of cancer cells in blood vessels and the function thereof, it is useful for elucidating the mechanism of cancer metastasis and diagnosing it.

また、上述した実施形態の粒子分析装置の用途としては、赤血球、白血球等の血球細胞の分類にも用いることができる。その際には、赤血球に含まれるヘモグロビン量の分析や、５種類の白血球（好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球）の分類を行うことができる。この５種類の白血球は、形状が異なるだけでなく、独自の機能を有し、病気により増減する種類が違うため、各種類の増減数を調べて診断材料とすることができる。 Moreover, as a use of the particle | grain analyzer of embodiment mentioned above, it can be used also for classification | category of blood cells, such as a red blood cell and a white blood cell. In that case, it is possible to analyze the amount of hemoglobin contained in red blood cells and classify five types of white blood cells (neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, lymphocytes). These five types of white blood cells not only have different shapes but also have unique functions, and the types of increase / decrease are different depending on the disease. Therefore, the number of increase / decrease of each type can be examined to make a diagnostic material.

「設計変更」
以上、本発明による粒子分析装置および方法の好ましい実施の形態について説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない限りにおいて、種々変更することが可能である。 "Design changes"
The preferred embodiments of the particle analysis apparatus and method according to the present invention have been described above. However, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made without changing the gist of the invention. It is.

例えば、上記実施形態では、測定対象を分取するセルソーター型のフローサイトメータを例にとり説明したが、本発明は分取機能を持たないアナライザ型のフローサイトメータにも適用可能である。また、上記実施形態では、フローセル内を流れる被検粒子に光を照射して分析する例について説明したが、フローセルで覆われてない試料液流中の被検粒子に光を照射して分析するジェット・イン・エア方式のフローサイトメータにも適用可能である。 For example, in the above-described embodiment, a cell sorter type flow cytometer that sorts a measurement target has been described as an example. However, the present invention can also be applied to an analyzer type flow cytometer that does not have a sorting function. Moreover, although the said embodiment demonstrated the example which irradiates and analyzes the test particle which flows in the flow cell, it irradiates and analyzes the test particle in the sample liquid flow which is not covered with the flow cell It is also applicable to jet-in-air flow cytometers.

また、上記実施形態では、励起光照射手段２０と受光手段３０とを同一の対物レンズ等を用いた形態について示したが、受光手段３０は、励起光照射手段２０と流れＦに対して反対側に配置した構成としてもよい。 In the above embodiment, the excitation light irradiating unit 20 and the light receiving unit 30 are shown as using the same objective lens. However, the light receiving unit 30 is opposite to the excitation light irradiating unit 20 and the flow F. It is good also as a structure arrange | positioned.

本発明の粒子分析装置及び粒子分析方法は、正常細胞と異常細胞（癌細胞等）の診断及び分離に好ましく用いることができる。 The particle analysis apparatus and particle analysis method of the present invention can be preferably used for diagnosis and separation of normal cells and abnormal cells (cancer cells and the like).

１，２，３，４，５粒子分析装置
１０励起光発生手段
１１レーザ（光源）
２０励起光照射手段
２７走査光学系
３０受光手段
３５分光手段
４０時間分解手段
５０検出手段
６０分析手段
７０フロー部
７１試料液（液体、血液）
７２試料液供給部
７３シース液
７４シース液供給部
７５フローセル
７６分取制御手段
７７ａ、７７ｂ偏向板
７８液滴
８０表示部
９０血管（脈管）
１０１第１の流路
１０２第２の流路
Ｌ１パルス励起光
Ｌｓ蛍光スペクトル
Ｌｆ蛍光
Ｌｔ蛍光信号（蛍光の強度）
Ｔｆ蛍光寿命
Ｄ被検粒子
Ｆ層流（シースフロー、流れ） 1, 2, 3, 4, 5 Particle analyzer 10 Excitation light generation means 11 Laser (light source)
20 Excitation light irradiation means 27 Scanning optical system 30 Light receiving means 35 Spectroscopic means 40 Time resolving means 50 Detection means 60 Analysis means 70 Flow section 71 Sample liquid (liquid, blood)
72 Sample liquid supply part 73 Sheath liquid 74 Sheath liquid supply part 75 Flow cell 76 Sorting control means 77a, 77b Deflection plate 78 Droplet 80 Display part 90 Blood vessel (vascular)
101 First channel 102 Second channel L1 Pulse excitation light Ls Fluorescence spectrum Lf Fluorescence Lt Fluorescence signal (fluorescence intensity)
Tf fluorescence lifetime D test particle F laminar flow (sheath flow, flow)

Claims

Excitation light generating means for generating pulsed excitation light;
Excitation light irradiation means for irradiating the flow of liquid containing the test particles with the pulsed excitation light;
A light receiving means for receiving light including fluorescence generated from the test particles by irradiation with the pulse excitation light;
Time-resolving means for time-resolving the fluorescence in synchronization with the irradiation of the pulsed excitation light;
Detecting means for detecting the time-resolved fluorescence;
A particle analysis apparatus comprising: an analysis unit that calculates a fluorescence lifetime of the fluorescence from the fluorescence detected by the detection unit and analyzes the test particle based on the fluorescence lifetime.

A spectroscopic unit that splits the fluorescence received by the light receiving unit and outputs the fluorescence spectrum of the fluorescence to the time resolution unit;
2. The particle analyzer according to claim 1, wherein the time-resolving means time-resolves the fluorescence having a predetermined wavelength from the fluorescence spectrum in synchronization with the irradiation of the pulse excitation light.

The particle analyzing apparatus according to claim 1, wherein the excitation light irradiation unit includes a scanning optical system that scans the excitation light in a direction substantially perpendicular to the flow.

The particle analyzer according to claim 1, wherein the test particle is a biological material.

The particle analyzer according to claim 4, wherein the fluorescence is autofluorescence of the test particles.

The particle analyzer according to claim 4 or 5, wherein the test particles are analyzed in vivo.

The particle analyzer according to claim 6, wherein the flow of the liquid is blood flowing in a blood vessel in a living body.

The particle analyzer according to claim 7, wherein the blood vessel is an ocular blood vessel.

The flow of the liquid is blood taken out from the blood vessel to the outside, a first flow path for taking out the blood to the outside, and a flow cell for receiving the blood from the first flow path and forming the flow The particle analyzer according to claim 7, further comprising a second flow path that receives the analyzed blood from the flow cell and returns the blood to the blood vessel.

6. The flow according to claim 1, further comprising a flow cell that receives the liquid and forms the sheath flow, wherein the flow is a sheath flow in which the liquid is wrapped with a sheath liquid. Particle analyzer.

Based on the analysis result obtained by the analyzing means, the apparatus further comprises a sorting control means for labeling the test particles and a sorting means for sorting the labeled test particles according to the label. The particle analyzer according to claim 10.

The particle analyzer according to claim 1, wherein the fluorescence is excited by multiphoton excitation.

Irradiate the liquid flow containing the test particles with pulsed excitation light,
Receiving fluorescence generated from the test particles by irradiation with the pulsed excitation light;
Time-resolved the fluorescence in synchronization with irradiation of the pulsed excitation light,
A fluorescence intensity time distribution is detected from the time-resolved fluorescence,
Analyzing the fluorescence intensity time distribution to calculate the fluorescence lifetime,
A particle analysis method comprising analyzing the test particles based on the fluorescence lifetime.

Spectroscopy the fluorescence to obtain a fluorescence spectrum including the fluorescence,
14. The particle analysis method according to claim 13, wherein fluorescence having a predetermined wavelength is time-resolved from the fluorescence spectrum in synchronization with the irradiation of the pulsed excitation light.

Scanning the irradiation position in a direction substantially perpendicular to the flow, irradiating the pulsed excitation light to a plurality of the liquid flow,
The particle analysis method according to claim 13 or 14, wherein fluorescence generated from a plurality of locations of the test particle is received by irradiation with the pulse excitation light.

The particle analysis method according to claim 13, wherein the fluorescence is autofluorescence.

The particle analysis method according to claim 16, wherein the flow of the liquid is blood flowing in a blood vessel in a living body.

The particle analysis method according to claim 17, wherein the blood vessel is an ocular blood vessel.

The liquid flow is blood that is taken out from a blood vessel in a living body through a flow path and flows in a flow cell, and the blood is returned to the blood vessel through another flow path after the analysis. The particle analysis method according to claim 17.

The particle analysis method according to claim 13, wherein the fluorescence is excited by multiphoton excitation.