JP6196448B2 - 低温糊化変異米の選抜方法及び低温糊化変異米の生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、低温糊化変異米の生産方法、米加工品、及び食品に関する。

日本人が常食としている米は、わが国では数少ない国内自給率の非常に高い穀物である。わが国の食糧自給率向上の観点から、国の施策として、米の消費拡大が推進されている。

消費者のライフスタイルの変化により、コンビニエンスストア、スーパーマーケット等で購入した食品を持ち帰り、家庭の食卓で食べる食事の形態、いわゆる「中食」が定着しつつある。一般的な中食としては、弁当、おにぎり、寿司等が挙げられ、それらには、炊飯米が用いられる。

近年、小麦アレルギーの問題が顕在化し、それを回避するために、小麦の代わりに米粉を用いたパン（以下、米粉パンという）が普及しつつある。米は栄養価が高くかつ小麦と比較してカロリーが低いという点からも、米粉パンは注目されている。

前述のような炊飯米を用いた弁当等は、冷蔵状態で配送されて店内に陳列されるため、配送及び陳列中に炊飯米が硬くなりやすく、また、米粉パンは、焼成後に硬くなりやすいという問題が存在していた。また、糯米を用いた餅製品についても、搗いて成型した後、経時的に硬くなるため、食感が損なわれるという問題が存在していた。米に含まれるデンプンは、炊飯及び加熱加工によって糊化し、その後冷却されると老化するからである。このような問題を解決する方法がいくつか見出され、報告されている。

米の炊飯時に、トレハロースといった保水性の高い糖類（特許文献１）、酵素（アミラーゼ及びパパイン）（特許文献２）、ジグリセリン脂肪酸エステル（特許文献３）、又は食用油脂を主成分とする添加剤（特許文献４）を加えることにより、炊飯米が硬くなることを抑制する方法が報告されている。また、アミラーゼを添加することにより、硬くなりにくい米粉パンを製造する方法が報告されている（特許文献５）。さらに、アミロース含量１５％以下の粘りの強い低アミロース米を使用することにより、低温保存中の食感劣化が少ない炊飯米を得る方法が報告されている（特許文献６）。加えて、糊化開始温度の低い米の品種として旱不知Ｄが知られている（非特許文献１）。また、餅製品については、天然多糖類のプルラン、二糖類、乳化剤を餅類の硬化防止剤として用いることが報告されている（特許文献７）。

特開平７−１４７９１６号公報 特開平７−３１３９６号公報 特開平７−３９３２５号公報 特開平４−１４１０５２号公報 特開２０１０−１８７５５９号公報 特開平９−３２２７２５号公報 特開平５−８４０４６号公報

岡本和之 他，育種学研究，６（別２），ｐ３１６，２００４

しかしながら、特許文献１〜５、７に記載の方法では、多糖類、酵素等を添加するため、製造コスト及び作業手順が増えるという難点が存在するばかりでなく、食品添加物の低減を望む消費者ニーズに逆行していた。また、特許文献６に記載の方法では、粘りの強い低アミロース米を用いるため、炊飯米の中食用容器へのパッキングラインにおいて、機械に炊飯米が付着することで製造効率が低下するという課題を残していた。さらに、非特許文献１に記載の旱不知Ｄは、消費者のニーズに合致する炊飯米及び米粉パンという観点においては、糊化特性に関して課題を残していた。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、柔らかさが維持される米加工品及び食品、並びに糊化しやすく老化しにくい低温糊化変異米の生産方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る低温糊化変異米の生産方法は、
旱不知Ｄを突然変異させる工程と、
尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程と、
を含む、
ことを特徴とする。

前記低温糊化変異米の生産方法は、
前記低温糊化変異米を選抜する工程に次いで、
前記低温糊化変異米と、糯性イネと、を交配させる工程と、
前記交配後代のＦ_２世代の個体から糯性個体を選抜する工程と、
前記糯性個体由来の試料に含まれる第６染色体のデンプン枝付け酵素Ｉ遺伝子のコアプロモーター領域における変異を検出することで糊化易性個体を選抜する工程と、
を含んでいてもよい。

前記低温糊化変異米の生産方法は、
前記糯性個体由来の試料中のＤＮＡを鋳型として、ＨｖＳＳＲ１１−２７マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号３、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号４）及びＨｖＳＳＲ１１−２８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号６）のうち少なくとも１つ、並びにＨｖＳＳＲ１１−４８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８）及びＨｖＳＳＲ１１−５０マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号９、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０）のうち少なくとも１つ、を用いて糊化易性個体を選抜する工程をさらに含んでいてもよい。

本発明の第２の観点に係る米加工品は、本発明の第１の観点に係る低温糊化変異米の生産方法で得られた低温糊化変異米からなる。

本発明の第３の観点に係る食品は、本発明の第２の観点に係る米加工品を含む。

本発明の第４の観点に係る米加工品は、旱不知Ｄを突然変異させることで得られた低温糊化変異米からなる。

前記低温糊化変異米のアミロペクチン短鎖指標値は、旱不知Ｄのアミロペクチン短鎖指標値の１１０％以上であってもよい。

前記低温糊化変異米の糊化温度は、旱不知Ｄの糊化温度よりも２℃以上低くてもよい。

前記低温糊化変異米は、低温糊化変異米と糯性イネとを交配することで得られた糯性低温糊化変異米であってもよい。

本発明の第５の観点に係る食品は、本発明の第４の観点に係る米加工品を含む。

本発明によれば、柔らかさが維持される米加工品及び食品、並びに糊化しやすく老化しにくい低温糊化変異米の生産方法を提供することができる。

尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程で使用されたマイクロプレートのひとつを示す図である。 各米品種のアミロペクチン鎖長分布及びＤＰ９／ＤＰ１７を示す図である。 各米品種の炊飯米の硬さを示す図である。 各米品種のグルテン添加米粉パンの焼成後の硬さを示す図である。 新規糊化易性遺伝子のマッピングを示す図である。 本実施例による糯性低温糊化変異米による餅の硬さを示す図である。（ａ）は、札幌材料の結果の図であり、（ｂ）は、福山材料の結果の図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

（１．低温糊化変異米）
本発明による米加工品に用いられる低温糊化変異米について、以下に詳細に説明する。

本発明による低温糊化変異米は、陸稲品種である旱不知Ｄを突然変異させることで得られる。本明細書において低温糊化変異米とは、旱不知Ｄよりも糊化しやすく老化しにくい特徴を有する突然変異米をいう。突然変異処理の方法については、後に詳述する。

本発明による低温糊化変異米のアミロペクチン短鎖指標値は、例えば、旱不知Ｄのそれの１１０％以上である。本明細書においてアミロペクチン短鎖指標値とは、以下のように算出される。米デンプンのアミロペクチン側鎖のグルコース重合度（以下、ＤＰという）５からＤＰ３５までの総検出モル数を算出し、総検出モル数に対するＤＰ９の側鎖が占めるモル比率（Ａ）、及び総検出モル数に対するＤＰ１７の側鎖が占めるモル比率（Ｂ）を求める。ＡをＢで除した数値を、アミロペクチン短鎖指標値（以下、ＤＰ９／ＤＰ１７という）とする。ＤＰ９／ＤＰ１７の値が高いほど、米におけるアミロペクチン短鎖含有量が高くなる。

上記のＤＰ９／ＤＰ１７測定に供される米の試料は、例えば、米から冷アルカリ浸漬法（山本ら，澱粉科学，２０，ｐ９９−１０４，１９７３）を参考に精製デンプンを調製し、精製デンプンを糊化させ、イソアミラーゼによりアミロペクチンを限定分解し、側鎖を直鎖成分とする方法により事前調製される。該試料は、例えば、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（８−ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＡＴＰＳ）で蛍光ラベルされ、キャピラリー電気泳動装置（機種名：Ｐ／ＡＣＥ ｓｙｓｔｅｍ ＭＤＱ、ベックマンコールター社）により直鎖検出に供される。

本発明による低温糊化変異米のＤＰ９／ＤＰ１７は、前述の通り、旱不知Ｄのそれの１１０％以上であり、好ましくは１１１％以上である。したがって、本発明による低温糊化変異米のアミロペクチン短鎖含有量は、旱不知Ｄに比して高い。本発明による低温糊化変異米のＤＰ９／ＤＰ１７は、例えば、１．４５以上であり、好ましくは１．５０以上、より好ましくは１．５５以上である。なお、いわゆる低アミロース米では、アミロース含量を低下させることで低温保存中の食感劣化が抑制される一方で、本発明による低温糊化変異米は、アミロペクチン短鎖含有量が高く、糊化しやすく老化しにくい特性を有する。

本発明による低温糊化変異米の糊化温度は、旱不知Ｄのそれよりも低く、例えば、２℃以上低い。本明細書において糊化温度とは、示差走査熱量計（例えば、機種名：ＤＳＣ６１００（セイコーインスツル社製））を用いて２５℃から１３０℃まで２℃／ｍｉｎの昇温速度を測定した値より算出される。具体的には、示差走査熱量計で糊化吸熱ピークを測定し、この糊化吸熱ピークが頂点を示した時点での温度を糊化温度とする。

上記の糊化温度測定に供される米の試料は、例えば、前述と同様の冷アルカリ浸漬法を参考に米から調製された精製デンプンを用いることができる。

本発明による低温糊化変異米の糊化温度は、前述の通り、旱不知Ｄのそれよりも低く、例えば、２℃以上、好ましくは２．２℃以上低い。したがって、本発明による低温糊化変異米は、旱不知Ｄに比して糊化しやすく老化しにくい特徴を有する。本発明による低温糊化変異米の糊化温度は、例えば、６６℃以下、好ましくは６５℃以下、より好ましくは６４．５℃以下である。

（２．低温糊化変異米の生産方法）
本発明による低温糊化変異米の生産方法は、旱不知Ｄを突然変異させる工程と、尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程と、を含む。

旱不知Ｄを突然変異させる工程において、突然変異処理は、例えば、旱不知Ｄの種子を、アジ化ナトリウム、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロピル）ニトロソアミン（ＤＨＰＮ）等を含む溶液に浸漬することで行われる。例えば、コバルト６０等の放射線による突然変異処理の方法を用いてもよい。本発明の効果を奏する突然変異処理の方法であれば適宜選択され得る。

尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程について、以下に説明する。低温で糊化しやすいデンプンは、低濃度の尿素溶液に溶解する性質を有する。低温でより糊化しやすい低温糊化変異米を得るためには、まず、旱不知Ｄの玄米を様々な濃度の尿素溶液に浸して、旱不知Ｄの玄米が溶解しない尿素限界濃度を設定する。例えば、２．５Ｍ尿素溶液では溶解せず、２．６Ｍ尿素溶液でも溶解せず、２．７Ｍ尿素溶液では溶解した場合、尿素限界濃度は「２．６Ｍ」となる。次に、設定された尿素限界濃度の尿素溶液に、旱不知Ｄを突然変異させて得られた変異米の玄米を浸す（例えば、２０℃で１８時間浸す）。この尿素限界濃度の尿素溶液に溶解する変異米は、旱不知Ｄよりも糊化しやすい低温糊化変異米の候補となり得る。なお、変異米が尿素溶液に溶解したことは、例えば、変異米を浸した尿素溶液にヨウ素溶液を加え、ヨウ素デンプン反応により赤褐色や青紫色に染まるのを目視することで確認することができる。このような工程を世代毎に繰り返して行うことにより、低温糊化性が遺伝かつ固定した個体を低温糊化変異米として選別することができる。

尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程の具体例について、以下に説明する。前述の通り突然変異処理した旱不知Ｄ種子を育苗後、水田にて栽培し、稲一個体毎に種子を収穫する。得られた種子の玄米を、片刃カミソリを用いて、胚芽を有する半粒と、胚芽を有しない半粒と、に二分する。２．６Ｍ（尿素限界濃度）尿素水溶液に胚芽を有しない半粒を浸し、２．６Ｍ尿素水溶液に溶解した半粒の種子を低温糊化変異米の候補として選抜する。選抜された種子の玄米の胚芽を有する半粒を播種、栽培し、次世代の種子を収穫する。前述と同様に、尿素溶液による低温糊化変異米の候補の選抜を世代毎に繰り返し、低温糊化性が遺伝かつ固定した個体を低温糊化変異米とすることができる。

尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程では、特殊な試薬、装置及び手法を用いること無く簡便に行うことができ、かつ確実に低温糊化変異米を選別することができる。

（３．低温糊化変異米からなる米加工品及び食品）
本発明による低温糊化変異米からなる米加工品としては、例えば、米粉、炊飯米、加工米飯等が例示される。

本発明による米粉は、例えば、前述の低温糊化変異米を粉砕することにより得られる。例えば、前述の低温糊化変異米を白米又は玄米とし、気流粉砕機、杵、スタンプミル、ロール製粉機、石臼（乾式製粉又は湿式製粉）、ハンマーミル（乾式製粉又は湿式製粉）等の製粉装置を用いて、例えば、中央値２００μｍ以下、中央値１００μｍ以下、又は中央値５０μｍ以下程度の粒度に粉砕することで得られる。異なる製粉装置により得られた米粉を混合してもよい。製粉装置による粉砕前には洗米を行ってもよく、洗米した場合には製粉装置で粉砕する前又は後に米を乾燥させてもよい。また、製粉装置による粉砕前に、ペクチナーゼ等を含む酵素液で米を処理してもよい。さらに、製粉装置により得られた米粉を篩にかけてもよい。本発明の効果を奏する米粉の調製方法であれば、適宜選択され得る。

本発明による米粉は、製粉装置により得られた米粉をさらに精製デンプンとしたものも含む。精製デンプンの調製を、例えば、冷アルカリ浸漬法（山本ら，澱粉科学，２０，ｐ９９−１０４，１９７３）により行う場合、前述の低温糊化変異米を、例えば０．５ｍｍ以下程度の粒度に粉砕した後に精製を行ってもよい。本発明の効果を奏する精製デンプンの調製方法であれば、適宜選択され得る。

本発明による米粉には、米粉の製品に通常用いられる保存剤、賦形剤等を適宜含有させてもよい。

本発明による低温糊化変異米は、糊化しやすく老化しにくい特徴を有するため、この低温糊化変異米を含む米粉を用いたパン等の食品は、加熱加工後でも硬くなりにくく、柔らかさが維持される。

本発明による炊飯米は、例えば、前述の低温糊化変異米を公知の炊飯器で炊飯することで得られる。前述の通り、本発明による低温糊化変異米は、糊化しやすく老化しにくい特徴を有するため、この低温糊化変異米による炊飯米は、炊飯及び冷蔵後でも硬くなりにくく、柔らかさが維持される。

本明細書において炊飯米の硬さは、硬さ・粘り計（例えば、製品名：ＲＨＳ１Ａ（サタケ社製））を用いて測定され得る。本発明による炊飯米の炊飯放熱後の硬さに対する４℃で２４時間冷蔵後の硬さの増加率は、旱不知Ｄのそれよりも小さく、例えば、５０％未満、好ましくは４５％以下、より好ましくは４３％以下である。

本発明による炊飯米は、炊飯及び冷蔵後でも柔らかさが維持されるため、中食用の弁当、おにぎり等に好適に用いられ得る。また、添加剤を用いることなく炊飯及び冷蔵後でも柔らかさが維持されるため、弁当、おにぎり等の製造コスト及び作業手順を低減することができる。さらに、低アミロース米を用いることなく炊飯及び冷蔵後でも柔らかさが維持されるため、弁当、おにぎり等の容器へのパッキングラインにおいて、機械への炊飯米の付着が低減され、製造効率を向上させることができる。

本発明による加工米飯は、例えば、本発明による炊飯米をレトルトパウチ、トレイ等に無菌的に充填したものである。本発明による炊飯米は、前述の通り、炊飯及び冷蔵後でも柔らかさが維持されるため、加工米飯に好適に用いられ得る。また、前述と同様に、加工米飯の製造コスト及び作業手順を低減することができ、製造効率を向上させることができる。

なお、本発明の効果を奏する米加工品であれば、米粉、炊飯米及び加工米飯以外にも適宜選択され得る。

次に、本発明による食品は、前述の米加工品を含む。食品としては、例えば、グルテン添加米粉パン、米粉ブレンドパン等が例示される。

本発明によるグルテン添加米粉パンは、例えば、本発明による米粉に小麦活性グルテンを配合させて作られる。配合比は、例えば、米粉８０％：小麦活性グルテン２０％である。前述の低温糊化変異米は、糊化しやすく老化しにくい特徴を有するため、この低温糊化変異米による米粉を用いたグルテン添加米粉パンは、焼成後でも硬くなりにくく、柔らかさが維持される。

本明細書において、グルテン添加米粉パン（配合比＝米粉８０％：小麦活性グルテン２０％）の硬さは、１．４ｃｍの厚さにスライスしたパンを、直径３．６ｃｍのプランジャーで厚さの２５％押し込み、その際の応力をテクスチャーアナライザー（例えば、機種名：ＴＡ．ＸＴｐｌｕｓ（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍ社製））を用いて測定した値（ｇ）で表される。本発明によるグルテン添加米粉パンの焼成後３日目の硬さの値は、例えば、旱不知Ｄの米粉を用いた同様のグルテン添加米粉パンよりも顕著に低く、例えば、２００ｇ以下である。本発明によるグルテン添加米粉パンの、焼成後１日目の硬さに対する焼成後３日目のそれの増加率は、例えば、３０％以下、好ましくは２６％以下である。このように、本発明によるグルテン添加米粉パンは、他の添加剤を用いることなく、焼成後においても柔らかさが維持される。

本発明による米粉ブレンドパンは、例えば、本発明による米粉に超強力小麦品種「ゆめちから」の小麦粉を配合させて作られる。配合比は、例えば、米粉２０％：ゆめちから８０％である。前述の低温糊化変異米は、糊化しやすく老化しにくい特徴を有するため、この低温糊化変異米による米粉を用いた米粉ブレンドパンは、焼成後でも硬くなりにくく、柔らかさが維持される。

本明細書において、米粉ブレンドパン（配合比＝米粉２０％：ゆめちから８０％）の硬さは、室温まで放冷したパンをポリエチレン製の袋に入れて密封し、３日間室温状態で保管し、その後、パンを２ｃｍの厚さにスライスし、各スライスの中央部から３ｃｍ×３ｃｍの正方形のサンプルを切り出し、該サンプルをレオメーター（例えば、機種名：ｍｏｄｅｌ ＲＥ３３００５（山電社製））を用いて、１ｃｍまで圧縮した際の応力（Ｎ／ｍ^２）として表され得る。焼成３日後の本発明による米粉ブレンドパンの硬さは、旱不知Ｄのそれに比して低く、例えば、４６００Ｎ／ｍ^２以下、好ましくは４５００Ｎ／ｍ^２以下である。このように、本発明による米粉ブレンドパンは、添加剤を用いることなく、焼成後においても柔らかさが維持される。

本発明による食品として、上記のグルテン添加米粉パン及び米粉ブレンドパンの他に、菓子、麺、餃子の皮、ライスペーパー、離乳食（レトルト）等が例示される。前述の低温糊化変異米は、糊化しやすく老化しにくい特徴を有するため、本発明による菓子、麺等は、加工後においても硬くなりにくく、柔らかさが維持される。なお、本発明の効果を奏する食品であれば、適宜選択され得る。

（４．糯性低温糊化変異米）
本発明による低温糊化変異米は、低温糊化変異米（粳性）と糯性イネとを交配して得られた糯性低温糊化変異米であってもよい。本発明による糯性低温糊化変異米について、以下に詳細に説明する。

本発明による糯性低温糊化変異米は、前述の低温糊化変異米（粳性）と糯性イネとを交配し、交配後代のＦ_２世代の個体から糯性かつ糊化易性個体を選抜することで得られる。その方法については、後に詳述する。

本発明による糯性低温糊化変異米を搗いて餅にすると、その餅は、硬化が遅い（つまり、柔らかさが維持される）特性を有する。具体的には、本発明による糯性低温糊化変異米を搗いて餅にした場合では、交配する糯性イネ由来の米を搗いて餅にした場合、又は前述の低温糊化変異米と糯性イネとを交配して低温糊化変異米のデンプン特性（後述）を受け継がなかったイネ個体の米を搗いて餅にした場合と比較して、硬化が遅くなる（つまり、柔らかさが維持される）。餅の硬さは、例えば、搗いてから２４時間５℃に置いた後、テクスチャーアナライザーで測定され得る。

（５．糯性低温糊化変異米の生産方法）
本発明による糯性低温糊化変異米の生産方法は、旱不知Ｄを突然変異させる工程と、尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程と、その後の、低温糊化変異米（粳性）と糯性イネとを交配させる工程と、交配後代のＦ_２世代の個体から糯性個体を選抜する工程と、糯性個体由来の試料に含まれる第６染色体のデンプン枝付け酵素Ｉ遺伝子のコアプロモーター領域における変異を検出することで糊化易性個体を選抜する工程と、を含む。旱不知Ｄを突然変異させる工程と、尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程と、については、前述同様である。

低温糊化変異米（粳性）と糯性イネを交配させる工程において、糯性イネとして、例えば、きたゆきもち、こがねもち、ヒヨクモチ、はくちょうもち、ヒメノモチ、マンゲツモチ、新羽二重糯、カグラモチ、喜寿糯、モチミノリ、クレナイモチ、ヒデコモチ、もちひかり、峰の雪もち等の品種を用いることができる。餅品質の良さの観点から、きたゆきもちを好適に用いることができる。本発明の効果を奏する糯性イネであれば適宜選択され得る。

交配後代のＦ_２世代の個体から糯性個体を選抜する工程において、糯性イネを選抜する方法としては、例えば、玄米の外観から糯性と判断できるものを選抜してもよいし、イネの葉からＤＮＡを抽出し、糯性を選抜し得る既知のＤＮＡマーカー（例えば、Ｗａｎｃｈａｎａ 他，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６５，ｐ１１９３−１１９９，２００３に記載のマーカー）を用いてＰＣＲ法により糯性個体を選抜してもよい。本発明の効果を奏する糯性個体の選抜方法であれば適宜選択され得る。

糯性個体由来の試料に含まれる第６染色体のデンプン枝付け酵素Ｉ遺伝子（Ｓｂｅ１遺伝子）のコアプロモーター領域における変異を検出することで糊化易性個体を選抜する工程において、「糯性個体由来の試料」とは、例えば、糯性と判断されたイネ（例えばイネの葉）から抽出したＤＮＡ試料をいう。また、この変異の検出方法としては、例えば、糯性個体由来の試料中のＤＮＡを鋳型として、Ｓｂｅ１遺伝子のコアプロモーター領域にある挿入・欠失に基づくマーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号２）（以下、本明細書において「Ｓｂｅ１マーカー」という）を用いてＰＣＲ法により増幅させ、ＰＣＲ産物をアガロースゲルによる電気泳動により分離し、バンドの位置により変異を検出する方法が挙げられる。低温糊化変異米の原品種である旱不知Ｄが持つアミロペクチン短鎖比率が高いというデンプン特性は、１つの遺伝子で決まっていると判断され、その座乗染色体領域は、第６染色体のＳｂｅ１遺伝子座近傍であることが報告されている（梅本ら、日本作物学会紀事、第７７巻、別号１、２００８、ｐ２８４−２８５）。したがって、Ｓｂｅ１マーカーによりＳｂｅ１遺伝子のコアプロモーター領域における変異（挿入・欠失）を検出することで、旱不知Ｄ由来の糊化易性のデンプン特性（アミロペクチン短鎖比率が高い）を受け継いだイネ個体と、受け継がなかったイネ個体と、を明確に区別することができ、糊化易性のデンプン特性を受け継いだイネ個体（糊化易性個体）を確実に選抜することができる。

本発明による糯性低温糊化変異米の生産方法においては、糯性個体由来の試料中のＤＮＡを鋳型として、ＨｖＳＳＲ１１−２７マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号３、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号４）（表１）及びＨｖＳＳＲ１１−２８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号６）（表１）のうち少なくとも１つ、並びにＨｖＳＳＲ１１−４８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８）（表１）及びＨｖＳＳＲ１１−５０マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号９、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０）（表１）のうち少なくとも１つ、の計２つ以上を用いて糊化易性個体を選抜する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、糯性個体由来の試料中のＤＮＡを鋳型として、上記マーカーを用いてＰＣＲ法により増幅させ、ＰＣＲ産物を、例えばアガロースゲルによる電気泳動により分離し、バンドの位置により塩基配列の多型を検出する。本発明者らは、鋭意検討した結果、ＨｖＳＳＲ１１−２７マーカーで増幅される領域とＨｖＳＳＲ１１−５０マーカーで増幅される領域との間に、新規糊化易性遺伝子が座乗することを見出した（以下、この新規糊化易性遺伝子座を「Ｌｇｔ（ｔ）座」という）。その結果、Ｓｂｅ１マーカーに加えてこのようなマーカーを用いることで、より糊化易性に優れたデンプン特性を受け継いだイネ個体（糊化易性個体）を選抜できることがわかった。

本発明による糯性低温糊化変異米の生産方法の具体例について、以下に説明する。前述の通り得られた低温糊化変異米（粳性）と糯性イネの品種である「きたゆきもち」を交配し、その後代Ｆ_２種子を得る。Ｆ_２種子を玄米にし、外観から糯性と判断できる個体を選抜する。この個体を育苗し、葉からＤＮＡを抽出する。このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により、Ｓｂｅ１マーカー、ＨｖＳＳＲ１１−２７マーカー及びＨｖＳＳＲ１１−２８マーカーのうち少なくとも１つ、並びにＨｖＳＳＲ１１−４８マーカー及びＨｖＳＳＲ１１−５０マーカーのうち少なくとも１つを用いて（例えば、Ｓｂｅ１マーカーと、ＨｖＳＳＲ１１−２８マーカーと、ＨｖＳＳＲ１１−４８マーカーと、を用いて）、Ｓｂｅ１座が低温糊化変異米（変異系統）と同じ遺伝子型（ｓｂｅ１）である個体、Ｌｇｔ（ｔ）座が低温糊化変異米（変異系統）と同じ遺伝子型（ｌｇｔ）である個体、及びＳｂｅ１座、Ｌｇｔ（ｔ）座ともに低温糊化変異米（変異系統）と同じ遺伝子型（ｓｂｅ１／ｌｇｔ）である個体を選別する。このようにして得られた糯性イネ（糯性低温糊化変異米）は、糊化易性の特性を有し、搗いた餅は柔らかさが維持される。なお、Ｓｂｅ１座、Ｌｇｔ（ｔ）座ともに低温糊化変異米（変異系統）と同じ遺伝子型（ｓｂｅ１／ｌｇｔ）の個体では、Ｓｂｅ１座又はＬｇｔ（ｔ）座のいずれか一方が低温糊化変異米（変異系統）と同じ遺伝子型である個体に比べて、搗いた餅がより柔らかくなる。

（６．糯性低温糊化変異米からなる米加工品及び食品）
本発明による糯性低温糊化変異米からなる米加工品としては、例えば、糯米、糯米粉（白玉粉等）、餅製品（例えば、搗いた餅、切り餅）等が例示される。例えば、糯米は、本発明による糯性低温糊化変異米を精米することで得られ、餅粉は、本発明による糯性低温糊化変異米を（例えば精米後に）粉砕することで得られ、餅製品は、前述の糯米を蒸して餅搗き器等で搗いて成型することで得られる。このようにして得られた餅製品は、硬化が遅い特性を有する糯性低温糊化変異米を用いているため、搗いてから一定時間経過後でも硬くなりにくく、糖類等の添加剤（硬化防止剤）を加えることなく、柔らかさが維持される。

上述の米加工品を含む食品としては、大福餅などの生菓子、白玉団子、米粉ブレンドパン等が例示される。このような食品は、硬化が遅い特性を有する糯性低温糊化変異米を用いているため、加工後一定時間経過後でも硬くなりにくく、柔らかさが維持される。このため、大福餅などの生菓子では糖類等の添加剤（硬化防止剤）を加えることなく柔らかさが維持され、白玉団子では冷やしても硬くなりにくく、米粉ブレンドパンでは焼成後においても柔らかさが維持され得る。

これらの米加工品には、通常用いられる保存剤、賦形剤等を適宜含有させてもよい。なお、本発明の効果を奏する米加工品及び食品であれば、適宜選択され得る。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
（突然変異処理及び低温糊化変異米の選抜）
陸稲品種「旱不知Ｄ」の種子（茨城県農業総合センター生物工学研究所より分譲）４０ｇを、１ｍＭアジ化ナトリウム溶液（アジ化ナトリウム（製品名：アジ化ナトリウム、和光純薬工業社）の水溶液（１００ｍＭ）を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で希釈）４００ｍＬに２５℃で６時間浸漬し、突然変異処理を行った。突然変異処理後の種子を、４００ｍＬの蒸留水で２回洗浄した後、常温で乾燥させた（突然変異処理の詳細については、Ｈａｓｅｇａｗａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ３０，ｐ３０１−３０８，１９８０を参照）。

前述の通り突然変異処理した種子を育苗後、水田にて栽培し、稲一個体毎に種子を収穫した。得られた種子を、籾殻を除去して玄米とした。稲一個体につき１６粒の玄米を、片刃カミソリを用いて、胚芽を有する半粒と、胚芽を有しない半粒と、に二分した。胚芽を有する半粒と、胚芽を有しない半粒と、を各々異なる９６穴のマイクロプレートの対応する位置の穴に入れた。胚芽を有しない半粒を入れたマイクロプレートの各穴に、２．６Ｍ（尿素限界濃度）尿素水溶液（ｐＨ７．０）（尿素（製品名：尿素、和光純薬工業社製）を水溶液としたもの）２００μＬ加え、２０℃で１８時間静置した。その後、尿素水溶液を加えた各穴に、さらにヨウ素溶液（０．１％ヨウ素（製品名：よう素、和光純薬工業社製）／１％ヨウ化カリウム（製品名：よう化カリウム、ナカライテスク社製）水溶液）を２０μＬ滴下し、玄米の尿素水溶液への溶解性を確認した。該ヨウ素溶液によって赤褐色又は青紫色に染まった玄米（図１の低温糊化変異米候補のカラム）を、低温糊化変異米の候補として選抜した。

前述の通り低温糊化変異米の候補として選抜された玄米の、胚芽を有する半粒を播種、栽培し、次世代の種子を収穫した。尿素水溶液を用いた前述の方法により低温糊化変異米の候補の選抜を世代毎に繰り返し、最終的に、低温糊化変異米としてＭ５世代の種子を得た。得られた低温糊化変異米を「変異系統２０２」と名付けた。

〔実施例２〕
（ＤＰ９／ＤＰ１７の測定）
上述の通り得られた変異系統２０２のアミロペクチン短鎖比率を評価するために、ＤＰ９／ＤＰ１７を測定した。比較として、原品種である旱不知Ｄ及び基準品種であるコシヒカリのＤＰ９／ＤＰ１７も併せて測定した。

変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリを精米し、白米をとした。該白米を、サンプルミル（ＣＹＣＬＯＴＥＣ １０９３、ＦＯＳＳ ＴＥＣＡＴＯＲ社製）を用いて０．５ｍｍ以下の粒度に粉砕し、白米粉を得た。この白米粉を用いて、冷アルカリ浸漬法（山本ら，澱粉科学，２０，ｐ９９−１０４，１９７３）を参考に、以下の方法で精製デンプンを調製した。該白米粉２００ｇに、４℃に冷却した０．１％水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム（製品名：水酸化ナトリウム、ナカライテスク社製）を水溶液としたもの）１，６００ｍＬを加えて、４℃で３時間攪拌し、その後４℃で１５時間静置した。上清の水酸化ナトリウム水溶液を廃棄後、沈殿物を蒸留水に懸濁し、洗浄した。該懸濁液を、１５０μｍの篩にかけた。篩通過物を、２，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物に、４℃に冷却した０．１％水酸化ナトリウム水溶液（上記と同様）１，６００ｍＬを加えて懸濁し、再度上述の通り４℃での攪拌及び静置を行った。その後、蒸留水を用いた沈殿物の洗浄を、上清がｐＨ７となるまで繰り返した。懸濁液を１００μｍ、引き続き７５μｍの篩にかけ、篩通過物を２５℃で通風乾燥させた。乾燥後の篩通過物を乳鉢及び乳棒を用いて粉末化し、これを精製デンプンとした。

上述の通り調製した変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリの精製デンプンのアミロペクチン側鎖の鎖長分布を測定した。測定は、既報（Ｏ’Ｓｈｅａ ａｎｄ Ｍｏｒｅｌｌ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０７，ｐ１−１２，１９９８、及びＦｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ；Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６０，ｐ５９５−６０２，２００１）を参考に、以下の方法で行った。

各精製デンプン１ｍｇをマイクロチューブに秤量し、脱イオン蒸留水２８５μＬを加え攪拌後、１５μＬの５規定 水酸化ナトリウムを加え再度攪拌した。このマイクロチューブを５分間沸騰水中に置き、デンプンを糊化させた。放冷後、１００％酢酸９．６μＬを加えて中和し、６００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）５０μＬ、２％アジ化ナトリウム１０μＬ、及び脱イオン蒸留水６９０．４μＬを加え混和した。その後、イソアミラーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａの培養液から得られたイソアミラーゼ、林原生化学研究所）５μＬ（約７００ｕｎｉｔ）を反応させ、アミロペクチンを限定分解し、側鎖を直鎖成分とした。これに８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（８−ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＡＴＰＳ）（製品名：Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｄｙｅ（ＡＴＰＳ）、ベックマンコールター社製）を反応させ、蛍光ラベルした。ラベルした直鎖の検出は、キャピラリー電気泳動装置（機種名：Ｐ／ＡＣＥ ｓｙｓｔｅｍ ＭＤＱ、ベックマンコールター社）を用いて行った。各精製デンプンのＤＰ５からＤＰ３５までの総検出モル数を算出し、総検出モル数に対するＤＰ９の側鎖が占めるモル比率（Ａ）、及び総検出モル数に対するＤＰ１７の側鎖が占めるモル比率（Ｂ）を求め、ＡをＢで除した数値（ＤＰ９／ＤＰ１７）を算出した。

結果を図２に示す。図中、モル比率の差分は、変異系統２０２又は旱不知Ｄの各アミロペクチン側鎖のモル比率から、対応するコシヒカリの各アミロペクチン側鎖のモル比率を減じて算出した値を表す。旱不知Ｄ及び変異系統２０２はコシヒカリに比してアミロペクチン短鎖モル比率が高かったが、変異系統２０２ではさらに旱不知Ｄに比してもアミロペクチン短鎖モル比率が高かった。ＤＰ９／ＤＰ１７は、変異系統２０２ではコシヒカリに対して１４３％、旱不知Ｄに対して１１１％であった。

以上より、変異系統２０２のアミロペクチン短鎖比率は、旱不知Ｄのアミロペクチン短鎖比率に比して高いことが示された。

〔実施例３〕
（糊化温度の測定）
上述の通り得られた変異系統２０２の糊化温度を測定した。比較として、原品種である旱不知Ｄ及び基準品種であるコシヒカリの糊化温度も併せて測定した。

糊化温度の測定は、示差走査熱量計（機種名：ＤＳＣ６１００、セイコーインスツル社製）を用いて行った。変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリから、実施例２と同様に精製デンプンを調製した。各々の精製デンプン１０ｍｇを、７０μＬ容量の密封試料容器（銀製）（商品コード：５６０−００３、ＤＳＣ１００系用、エポリードサービス社）に秤量し、蒸留水を加えて、デンプン濃度３０％（ｗ／ｗ）（乾物重換算）とした。密封試料容器を密閉後、蒸留水のみを入れた密封試料容器をブランクとして、２５℃から１３０℃まで２℃／ｍｉｎの昇温速度で糊化温度を測定した。得られたデータを上記示差走査熱量計に付属のソフトウェアで解析し、糊化温度を算出した。具体的には、上記示差走査熱量計で糊化吸熱ピークを測定し、この糊化吸熱ピークが頂点を示した時点での温度を糊化温度とした。

結果を表２に示す。変異系統２０２の糊化温度は、コシヒカリのそれより６．１℃、及び旱不知Ｄのそれより２．２℃低かった。

以上より、変異系統２０２の糊化温度は、旱不知Ｄ及びコシヒカリの糊化温度よりも低いことが示された。したがって、変異系統２０２は、旱不知Ｄよりも糊化しやすく老化しにくいことが明らかとなった。

〔実施例４〕
（炊飯米の評価）
変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリの炊飯米の硬さを、以下の通り測定した。

変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリを精米して白米とし、電気炊飯器（品番：ＳＲ−Ｗ１８０、ナショナル社製）で炊飯した。炊飯米の硬さの測定は、硬さ・粘り計（機種名：ＲＨＳ１Ａ、サタケ社製）を用いて、既報（越智ら，美味技術研究会，６，ｐ１６−１９，２００５）の方法に準じて行った。炊飯米８．０ｇを秤量し、上記硬さ・粘り計付属の試料用リングに詰めて整形後、硬さ測定に供した。上記硬さ・粘り計に付属のプログラムを用いて、硬さの解析を行った。炊飯米の硬さの測定は、炊飯放熱後及び４℃で２４時間冷蔵後に行った。

結果を図３に示す。炊飯放熱後において、変異系統２０２の炊飯米は、旱不知Ｄと同程度の硬さであり、コシヒカリよりも硬い傾向にあった。しかし、４℃で２４時間冷蔵後では、変異系統２０２の炊飯米は、旱不知Ｄに比して柔らかく、さらにコシヒカリに比して顕著に柔らかかった。４℃で２４時間冷蔵後の硬さの増加率は、コシヒカリ１３７％及び旱不知Ｄ５０％に比して、変異系統２０２では４２％であり、変異系統２０２の硬さの増加率は、コシヒカリ及び旱不知Ｄに比して小さいことが示された。

以上より、変異系統２０２の炊飯米は、冷蔵後においても、旱不知Ｄのそれに比して硬くなりにくく柔らかさが維持されることが示された。

〔実施例５〕
（グルテン添加米粉パンの評価）
米粉に加工された変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリを用いて、グルテン添加米粉パンを作り、焼成後の硬さ及び食味を評価した。

まず、変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリから、以下の通り米粉を調製した。酵素処理を加えた湿式の気流粉砕法により、以下のように米粉を調製した。各品種の米を精米して白米サンプルとした。各白米サンプル１７００ｇを水道水で４回洗浄し、その後、米の温度を上げて添加される酵素（後述）の作用を良くするために、４０℃前後の湯で１回洗浄した。水を切った後、クエン酸三ナトリウム二水和物（製品名：くえん酸三ナトリウム二水和物、ナカライテスク社製）（０．３％）及びペクチナーゼ（製品名：ペクチナーゼＧ「アマノ」、天野エンザイム社製）（０．０５％）を含む酵素液（約４０℃）５Ｌに白米サンプルを漬け、４５℃の培養器内に１時間静置した。処理後、白米サンプルを水道水で洗浄し、脱水後、ジェットミル（機種名：ＳＰＭ−Ｒ２９０、西村製作所製）を用いて粉砕した。粉砕機の回転数の設定は５０Ｈｚとした。

次に、前述にて得られた各米品種の米粉を用い、ノータイム法（Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．１０，ｐ２４７−２５３，２００４）に準じて、以下の通り製パンを行った（配合比＝米粉８０％：小麦活性グルテン２０％）。配合は水分含量を１４％換算とした重量比で、各米粉８０％、活性グルテン（製品名：エマソフトＥＸ−１００、理研ビタミン社製）１５％、及びグルテン製剤（製品名：ドウマスターＦＲ、理研ビタミン社製）５％とした。以上を１００％として、これに対し、砂糖７％、脱脂粉乳３％、食塩１．５％、ショートニング８％、ドライイースト１．５％の比率で混合した。加水量は、米粉、活性グルテン、及びグルテン製剤の重量に対し７５％とし、１４％の水分補正についても加水量を調節することで行った。以上の割合に基づき、加水後の重量が１２５０ｇとなるように上記各材料の使用量を調節して混合した。パン生地はカントーミキサー（機種名：ＨＰｉ−２０Ｍ、関東混合機工業社製）を用いて捏ね、４００ｇのパン生地をフッ素樹脂加工のパン型（スルトン食パン型、１斤用、長さ１９０ｍｍ、幅９０ｍｍ、高さ９０ｍｍ）に入れ、３８℃、湿度８０％で生地の高さが型の上端に届くまで（約１時間）発酵させた。引き続き１８５℃に予熱したガスオーブンにパン生地の入った型を入れ、２８分間焼いた。焼成後のパンを型から取り出し、室温まで冷やした。

焼成後のパンを厚さ１．４ｃｍにスライスし、パンの中心部を直径３．６ｃｍのプランジャーで厚さの２５％押し込み、その際の応力をテクスチャーアナライザー（機種名：ＴＡ．ＸＴｐｌｕｓ、Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて測定し、その測定値をパンの硬さとした。パンの硬さの測定は、焼成後１日目、２日目、及び３日目に行った。

結果を図４に示す（図中、エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）である）。変異系統２０２のパンの硬さは３日目においても２００ｇ以下であり、コシヒカリ及び旱不知Ｄに比して顕著に柔らかかった。また、焼成後１日目のパンの硬さに対する焼成後３日目のそれの増加率は、コシヒカリ１１９％に対し、変異系統２０２で２６％、旱不知Ｄで２１％であった。このように、焼成後の変異系統２０２の硬さ増加率は、コシヒカリのそれよりも顕著に低く、旱不知Ｄのそれと同程度であった。

グルテン添加米粉パンの食味評価を以下の方法で行った。市販の米粉（製品名：薄力米粉、波里社製）を用いたパンを基準として、変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリのパンを評価した。評価項目は、「外観」、「香り」、「柔らかさ」、「しっとり感」、及び「総合評価」の５項目であった。市販の米粉のパンと比較して、非常に優れる「３」、優れる「２」、やや優れる「１」、差がない「０」、やや劣る「−１」、劣る「−２」、又は非常に劣る「−３」の７段階で評価した。パンの食味評価は、焼成約２４時間後に行った。評価者数は、２０名であった。

結果を表３に示す。表３に示す値は、各評点と評価者数との積の合計を総評価者数で割った平均値である。変異系統２０２のパンでは、「柔らかさ」、「しっとり感」及び「総合評価」において、旱不知Ｄ及びコシヒカリのパンよりも優れていた。

以上より、変異系統２０２を用いたグルテン添加米粉パンは、旱不知Ｄ及びコシヒカリを用いたそれに比して、焼成の１日後でも柔らかさが維持され、また食味においても優れることが示された。

〔実施例６〕
（米粉ブレンドパンの評価）
米粉に加工された変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリを用いて、超強力小麦粉と混合させた米粉ブレンドパンを作り、焼成後のふくらみ及び硬さ、並びに食味を評価した。

まず、変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリから、実施例２と同様に精製デンプンを調製した。ブレンド適性の高い超強力小麦品種「ゆめちから」（江別製粉社より入手（小麦産年：２０１０年））の小麦粉１６０ｇ、前述にて得られた各米品種の精製デンプン４０ｇ、グラニュー糖１０ｇ、ショートニング１０ｇ、食塩４ｇ、ドライイースト４ｇ、１００ｐｐｍアスコルビン酸１ｍＬを混合し、以下の通り製パンした（配合比＝米粉２０％：ゆめちから８０％）。加水量は、１３３ｍＬであった。ミキサー（２００ｇ用ピンミキサー、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＭＦＧ社製）のモーターにかかる負荷をモニタリングしながらパン生地を捏ね、負荷がピークになってから約１０秒後にミキサーを止めた。パン生地は１００ｇずつに分割し、３０℃で２０分間発酵器に置いた後、３８℃、湿度８５％で７０分間発酵させた。その後、パン型（長さ１２３ｍｍ、幅７０ｍｍ、高さ５０ｍｍ）を用いて、２００℃に予熱したオーブンで２５分間焼いた。また、米粉を使用せず「ゆめちから」の小麦粉２００ｇを用いて上記同様に製パン及び焼成したものを、比較用パン（配合比＝米粉０％：ゆめちから１００％）とした。

パンのふくらみを、比容積により評価した。比容積は、焼成後のパンを１時間室温で冷ました後、パンの体積及び重量を測定し、体積を重量で除して算出した。

パンの硬さの測定は、既報（山内ら，日本食品科学工学会誌；４６，ｐ２１２−２１９，１９９９）の方法に準じて行った。室温まで放冷したパンをポリエチレン製の袋に入れて密封し、３日間室温状態で保管した。その後、パンを２ｃｍの厚さにスライスし、各スライスの中央部から３ｃｍ×３ｃｍの正方形のサンプルを切り出した。切り出したサンプルをレオメーター（機種名：ｍｏｄｅｌ ＲＥ３３００５、山電社製）を用いて、１ｃｍまで圧縮した際の応力をパンの硬さとした。パンの硬さの測定は、焼成３日後に行った。

結果を表４に示す。表中、同じアルファベットの数値間にはＴｕｒｋｅｙの検定による有意差が無いことを示す（ｐ＜０．０５）。また、括弧内は、比較用パン（配合比＝米粉０：ゆめちから１００）を１００とした場合の比率を表す。パンのふくらみ（比容積）において、旱不知Ｄとコシヒカリとの間で差が見られなかったが、変異系統２０２では旱不知Ｄ及びコシヒカリに比して高かった。特に、変異系統２０２での比容積は、コシヒカリでのそれに比して有意に高く、目視でも変異系統２０２のパンの膨らみの良さが確認された。また、パンの硬さについては、変異系統２０２のパンでは旱不知Ｄ及びコシヒカリのそれに比して柔らかく、特に、コシヒカリのそれに対しては有意に柔らかいことが示された。

米粉ブレンドパンの食味評価は以下の方法で行われた。比較用パン（配合比＝米粉０％：ゆめちから１００％）を基準として、変異系統２０２、旱不知Ｄ、及びコシヒカリの米粉ブレンドパンを評価した。評価項目は「焼き色」（評点：１〜１０）、「形均整」（評点：１〜５）、「皮質（焼き色のついた部分にブツブツが見られないか、ひび割れが見られないか等を評価）」（評点：１〜５）、「すだち」（評点：１〜１０）、「色相」（評点：１〜５）、「触感」（評点：１〜５）、「香り」（評点：１〜１５）、「味」（評点：１〜１５）、及び「総合評価」（最高評点：７０）の９項目であった。各項目において、比較用パンの評点を満点の８割とし、それを基準に各米粉ブレンドパンを評価した。食味評価は、焼成後１日後及び３日後に実施した。評価者数は、焼成１日後で２名、焼成３日後で２名であった。

結果を表５に示す。表５に示す値は、各評点と評価者数との積の合計を総評価者数で割った平均値である。旱不知Ｄでは、コシヒカリよりも劣る評価項目があったのに対して、変異系統２０２の焼成３日後の「香り」以外では、コシヒカリと差が無い、又はコシヒカリに比較して優れていた。また、変異系統２０２では、「皮質」、「触感」、「香り」（焼成１日後）、「味」（焼成３日後）、及び「総合評価」において、旱不知Ｄよりも優れていた。特に、「触感」において、旱不知Ｄでは焼成１日後「３．７５」に対して３日後では「３．５」に低下したが、変異系統２０２では焼成１日後「４．２５」であり、３日後でも「４」に維持されていた。さらに、「味」において、旱不知Ｄでも変異系統２０２でも焼成１日後「１１．７５」であったが、旱不知Ｄでは３日後に「９」に低下したのに対して、変異系統２０２では３日後でも「９．２５」に維持されていた。

以上より、変異系統２０２を用いた米粉ブレンドパンは、旱不知Ｄを用いたそれに比して、焼成時のふくらみが良好であり、焼成後でも柔らかさが維持され、また食味においても優れることが示された。

〔実施例７〕
（変異系統２０２と糯性品種との交配）
糊化易性の糯性イネ（糯性低温糊化変異米）を得るために、変異系統２０２と糯米品種「きたゆきもち」（北海道立総合研究機構農業研究本部・上川農業試験場より分譲）とを交配し、その交配後代のＦ_２世代個体の種子を確保した。

（新規低温糊化変異遺伝子座の決定）
前述のＦ_２世代個体の中から、糊化易性の個体を選抜するために、まず、以下の通り、新規低温糊化変異遺伝子座を決定した。

新規低温糊化変異遺伝子座を決定するために、材料として変異系統２０２とコシヒカリとを交配した後代のＦ_２世代２００個体を用いた。このＦ_２世代２００個体について、変異系統２０２が持つ既知の糊化易性遺伝子（デンプン枝付け酵素１、Ｓｂｅ１）の遺伝子型を調べ、変異系統２０２ホモ型、又はコシヒカリホモ型に固定されたものを選んだ。方法は以下の通りである。

まず、変異系統２０２とコシヒカリとを交配した後代のＦ_２世代の個体を慣行法により栽培し、成葉１〜２枚を５０℃で一晩乾燥した。乾燥した葉（約５ｃｍ）を解剖用ハサミで裁断し、ガラスビーズとともに２ｍＬのマイクロチューブに入れ、フタを開けた状態で５０℃、一晩乾燥した。乾燥サンプルを粉砕機（シェークマスター、バイオメディカルサイエンス）に２分間かけることで、粉末状に粉砕した。

次に、Ｆ_２世代の個体からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出には、ＣＴＡＢ（Cetyl trimethyl ammonium bromide）法をスケールダウンした方法を用いた。前述の粉末状の乾燥サンプルをマイクロチューブに入れ、１．５倍濃度のＣＴＡＢ溶液（１．５％ ＣＴＡＢ、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１．０５Ｍ ＮａＣｌ）８００μＬを加え、よく攪拌した後、５６℃の恒温水槽に３０分間置いた。その後、クロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ）５００μＬを加え、マイクロチューブを寝かせた状態で、７５ストローク／分の速度で２０分間振とうした。その後、１０，０００ｇで５分間遠心し、上清７００μＬを別の２ｍＬマイクロチューブに移し、クロロホルム・イソアミルアルコール５００μＬを加えて７５ストローク／分の速度で２０分間振とうした。遠心（１０，０００ｇ×５分間）後、上清６５０μＬを別の２ｍＬマイクロチューブに移し、ＣＴＡＢ沈殿バッファー（１％ ＣＴＡＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））６５０μＬを加えて混和し、ＤＮＡを析出させた。析出したＤＮＡを遠心（１０，０００ｇ×５分）することでペレットにし、上清を捨てた。ペレットを９９．５％の氷冷エタノール、引き続き７０％の氷冷エタノールで各１回洗浄した後、６０℃で約２０分、ＤＮＡを乾燥させた。その後、ＤＮＡに１／１０濃度のＴＥ溶液を１００μＬ加えて穏やかに攪拌することでＤＮＡを溶かした。ＤＮＡの濃度を測定し、１／１０濃度のＴＥ溶液を用いて２０ｎｇ／μＬに希釈した。

次に、ＤＮＡマーカーを用いて、ＰＣＲによりＳｂｅ１座遺伝子型を判定した。ＤＮＡマーカーには、Ｓｂｅ１遺伝子のコアプロモーター領域にある挿入・欠失変異に基づいたマーカー（挿入・欠失マーカー）であるプライマー対、Ｓｂｅ１＿５ｅｎｄ＿１２Ｉ／Ｄ＿Ｕ（配列番号１）及びＳｂｅ１＿５ｅｎｄ＿１２Ｉ／Ｄ＿Ｌ（配列番号２）を用いた（梅本ら作成（２００８年））。

ＰＣＲ反応液（１０μＬ）の組成は、以下の通りである。
ＧｏＴａｑ ｍｉｘ（プロメガ社） ５．０μＬ
滅菌水 ４．０μＬ
鋳型ＤＮＡ（２０ｎｇ／μＬ） ０．８μＬ
プライマー混合液（２０μＭ） ０．２μＬ

ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
１．ＤＮＡ変性：９５℃、２分間
２．ＤＮＡ変性：９４℃、３０秒間
３．アニーリング：６０℃、３０秒間
４．伸長反応：７２℃、３０秒間
（上記２〜４を３５サイクル）
５．伸長反応：７２℃、５分間

増幅したＰＣＲ産物を、３％アガロースゲル用いた電気泳動によって分離し、バンドの位置により、変異系統２０２とコシヒカリとの交配後代Ｆ_２世代２００個体について、Ｓｂｅ１座の遺伝子型（変異系統２０２ホモ型、コシヒカリホモ型、又はヘテロ型）を判定した。このＦ_２世代の個体から、変異系統２０２が持つ新規糊化易性の遺伝解析を容易にするために、ヘテロ型については棄却し、変異系統２０２ホモ型及びコシヒカリホモ型のみを選抜した。

上記の通り選抜した各々のＦ_２個体に実ったＦ_３種子２４粒を用いて、実施例１と同様の尿素水溶液を用いた方法により、Ｆ_２個体の新規糊化易性の遺伝子型を調べた。尿素水溶液を用いた方法により糊化性の結果が曖昧な個体については、遺伝解析の対象とはしなかった。その上で、Ｓｂｅ１座がコシヒカリホモ型５個体、変異系統２０２ホモ型１２個体、及びヘテロ型１６個体の計３３個体のＦ_２個体を、遺伝解析の対象とした。

前述の３３個体のＦ_２個体について、ＤＮＡマーカーを用いて新規糊化易性遺伝子の予備的なマッピングを行った。このＤＮＡマーカーとしては、ＨｖＳＳＲマーカー（Ｓｉｎｇｈ 他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２５，ｐ３５９−３６４，２０１０）のうち、遺伝解析集団の両親である変異系統２０２とコシヒカリとの間で明瞭な多型が確認できた４６マーカー（表６）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲの条件、及び増幅産物の解析については、上記と同様である。増幅したＰＣＲ産物を、３％アガロースゲル用いた電気泳動によって分離し、バンドの位置により、遺伝子型を判定した。

解析に用いたＦ_２世代３３個体の遺伝子型のマッピングデータを図５に示す。新規糊化易性遺伝子の座乗染色体領域では、糊化易性の遺伝子型とＤＮＡマーカーの遺伝子型との一致率が高くなる。解析の結果、第１１番染色体のＨｖＳＳＲ１１−２７で増幅される領域とＨｖＳＳＲ１１−５０で増幅される領域との間に新規糊化易遺伝子の存在が示唆された。そこで、この２つのマーカー間に位置するＳＳＲマーカー２０２−９（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号９９、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１００）及び２０２−１６（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０１、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０２）（表７）を追加して解析を実施した結果、さらに一致率が高くなった。このことからＨｖＳＳＲ１１−２７で増幅される領域とＨｖＳＳＲ１１−５０で増幅される領域との間に新規糊化易性遺伝子が座乗することがほぼ確定された。したがって、変異系統２０２が持つ新規糊化易性のＤＮＡマーカー選抜は、ＨｖＳＳＲ１１−２７で増幅される領域とＨｖＳＳＲ１１−５０で増幅される領域との間に位置する塩基配列の多型に基づくＤＮＡマーカーを用いることで実施可能であることがわかった。

（糊化易性の糯性イネ個体の選抜）
前述の通り変異系統２０２と糯米品種「きたゆきもち」とを交配して得たＦ_２世代個体の材料を２集団に分け、その後の栽培を北海道札幌市と広島県福山市とで別個に行った（以下、各々、「札幌材料」又は「福山材料」という）。

（札幌材料の栽培及び選抜）
上記の交配後代のＦ_２世代１１０９個体（種子）を玄米にし、外観から糯性と判断できる２４０個体を選抜した。これらを慣行法により育苗し、北海道農業研究センター（北海道札幌市）の水田圃場に植え、その葉からＤＮＡを簡易調整した。ＤＮＡの簡易調整法は以下の通りである。イネの成葉１〜２枚を５０℃で一晩乾燥した。乾燥した葉（約２ｃｍ）を解剖用ハサミで裁断し、ガラスビーズとともに２ｍＬのマイクロチューブに入れ、フタを開けた状態で５０℃、一晩乾燥した。乾燥サンプルを粉砕機（シェークマスター、バイオメディカルサイエンス）に２分間かけることで粉末状に粉砕した。サンプル粉末の入ったマイクロチューブに４００μＬの抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ）を加え、激しく攪拌した後、１０，０００ｇで１０分間遠心し、上清３５０μＬを新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。そこにイソプロパノールを３５０μＬ加えて良く反転混和し、１０，０００ｇで１０分間遠心してＤＮＡを沈殿させた。上清を捨てた後、マイクロチューブのフタを開けたままにして、１時間ほど室温でペレットを乾燥させた。その後、３０μＬの１／１０ＴＥ溶液にペレットを溶かした。この溶液０．８μＬをＰＣＲ反応に用いた。

この調整されたＤＮＡを鋳型に用いて、既知の糊化易性遺伝子座であるＳｂｅ１座及び前述の新規糊化易性遺伝子座の遺伝子型を調べた。ＤＮＡマーカーとして、Ｓｂｅ１遺伝子のコアプロモーター領域にある挿入・欠失変異に基づくマーカー（挿入・欠失マーカー）であるプライマー対、Ｓｂｅ１＿５ｅｎｄ＿１２Ｉ／Ｄ＿Ｕ（配列番号１）及びＳｂｅ１＿５ｅｎｄ＿１２Ｉ／Ｄ＿Ｌ（配列番号２）、ＨｖＳＳＲ１１−２８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号６）、並びにＨｖＳＳＲ１１−４８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８）を用いた。ＤＮＡマーカー解析のためのＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ条件、増幅産物の解析は上記と同様である。増幅したＰＣＲ産物を、３％アガロースゲル用いた電気泳動によって分離し、バンドの位置により、遺伝子型を判定した。

このＤＮＡマーカー選抜によって、Ｆ_２集団の中からＳｂｅ１座及び新規糊化易性遺伝子座（Ｌｇｔ（ｔ）座）の遺伝子型がともに糯性親品種「きたゆきもち」ホモ型の個体（遺伝子型：ＳＢＥ１／ＬＧＴ）、Ｓｂｅ１座が変異系統２０２ホモ型でＬｇｔ（ｔ）座が「きたゆきもち」ホモ型（遺伝子型：ｓｂｅ１／ＬＧＴ）、Ｓｂｅ１座が「きたゆきもち」ホモ型でＬｇｔ（ｔ）座が変異系統２０２ホモ型（遺伝子型：ＳＢＥ１／ｌｇｔ）、両方の遺伝子座が変異系統２０２ホモ型（遺伝子型：ｓｂｅ１／ｌｇｔ）を選抜した。これらの遺伝子型について、下記の表にまとめた。

これらの選抜個体を収穫し白米を調整したところ、餅の硬化性試験に必要な８ｇの白米を得られた個体は、ＳＢＥ１／ＬＧＴが６個体、ｓｂｅ１／ＬＧＴが４個体、ＳＢＥ１／ｌｇｔが５個体、ｓｂｅ１／ｌｇｔが５個体であった。

（福山材料の栽培及び選抜）
上記の交配後代のＦ_２世代７８０個体（種子）を近畿中国四国農業研究センター（広島県福山市）の水田圃場に慣行栽培し、その葉からＤＮＡを簡易調整した（ＤＮＡの簡易調整法は上記と同様）。糯性個体の選抜は、玄米外観による判定ではなく、Ｗａｎｃｈａｎａ 他，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６５，ｐ１１９３−１１９９，２００３に記載のＤＮＡマーカーを用いる方法で行った。Ｓｂｅ１座およびＬｇｔ（ｔ）座の選抜は、ＨｖＳＳＲ１１−４８マーカーの代わりにＨｖＳＳＲ１１−５０マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号９、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０）を用いた以外、上記の札幌材料の場合と同様に行った。

これらの選抜個体を収穫し白米を調整したところ、餅の硬化性試験に必要な白米８ｇを調整できた個体は、ＳＢＥ１／ＬＧＴが２個体、ｓｂｅ１／ＬＧＴが３個体、ＳＢＥ１／ｌｇｔが２個体、ｓｂｅ１／ｌｇｔが３個体であった。

（餅の硬化性測定）
札幌材料及び福山材料の各サンプルの白米８ｇを吸水させ、蒸した後、試験用小型餅つき器「ミニうさぎ」（応用栄養学食品研究所）で餅に搗き上げ、餅生地を厚さ７ｍｍに成形した。２４時間５℃に置いた後、テクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍ社製、ＴＡ−ＸＴ２ｉ）に直径２ｍｍの円筒形プローブを装着し、２ｍｍ／秒の速さで３ｍｍ貫入した際の正の最大荷重（ｇ）を硬さとして測定した。なお、札幌材料、福山材料とも同様の方法で硬化性測定を行った。なお、札幌材料の解析には、同様に札幌で栽培した糯性親品種「きたゆきもち」のサンプルも加えた上で行った（５反復測定）（福山市では「きたゆきもち」の成熟が極端に早くなるため、「きたゆきもち」の栽培を行わなかった）。

（札幌材料の結果）
札幌材料の結果を図６（ａ）に示す。硬さ測定の結果、「きたゆきもち」の餅の硬さと、ＳＢＥ１／ＬＧＴ（Ｓｂｅ１座とＬｇｔ（ｔ）座がともに「きたゆきもち」遺伝子型）の餅の硬さと、の間で有意な差は認められなかった。一方、ＳＢＥ１／ｌｇｔ及びｓｂｅ１／ＬＧＴ（Ｓｂｅ１座又はＬｇｔ（ｔ）座が変異系統２０２遺伝子型）の餅では、「きたゆきもち」の餅に比して、柔らかい傾向にあった。また、ｓｂｅ１／ｌｇｔ（Ｓｂｅ１座及びＬｇｔ（ｔ）座がともに変異系統２０２遺伝子型）では、ＳＢＥ１／ｌｇｔ及びｓｂｅ１／ＬＧＴの餅よりも柔らかい傾向にあり、さらには「きたゆきもち」の餅及びＳＢＥ１／ＬＧＴの餅よりも有意に柔らかい結果となった。

（福山材料の結果）
福山材料の結果を図６（ｂ）に示す。札幌材料の結果と同様に、ＳＢＥ１／ｌｇｔ及びｓｂｅ１／ＬＧＴの餅では、ＳＢＥ１／ＬＧＴの餅に比して柔らかい傾向にあり、ｓｂｅ１／ｌｇｔの餅ではさらに柔らかい傾向にあった。

これらのことから、Ｓｂｅ１座に加えて新規糊化易性遺伝子座（Ｌｇｔ（ｔ）座）が変異系統２０２遺伝子型となった個体を選抜することで、硬化しにくい糯性個体を確実に選抜できることが明らかとなったとともに、本実施例により得られた糯性低温糊化変異米による餅は、搗いた後一定時間が経過した後でも、硬くなりにくく、柔らかさが保たれることが示された。

以上説明したように、本発明により、柔らかさ及び食味が維持される米加工品及び食品、並びに糊化しやすく老化しにくい低温糊化変異米の生産方法が提供される。

本発明による低温糊化変異米を用いて、例えば、炊飯米、加工米飯、グルテン添加米粉パン、米粉ブレンドパン、菓子、麺、餃子の皮、ライスペーパー、離乳食（レトルト）等の、加工後においても硬くなりにくく、柔らかさが維持される食品を製造することができる。また、本発明による糯性低温糊化変異米を用いて、例えば、餅製品、大福餅などの生菓子、白玉団子、米粉ブレンドパン等の、加工後一定時間経過後でも硬くなりにくく、柔らかさが維持される食品を製造することができる。本発明により、これらの食品の食味向上、品質保持等がはかられるため、消費者にとってメリットがあるだけでなく、製造業者や販売業者にとっても食品のシェルフライフが長くなる等の利点がある。

Claims (5)

1. （ａ）旱不知Ｄを突然変異させる工程と、
   （ｂ）旱不知Ｄの玄米が溶解しない尿素限界濃度の尿素溶液に、前記工程（ａ）において旱不知Ｄを突然変異させて得られた変異米の玄米の胚芽を有しない半粒を浸す工程と、
   （ｃ）前記工程（ｂ）において前記尿素溶液に溶解した前記変異米の玄米の胚芽を有する半粒を播種及び栽培し、種子を収穫する工程と、
   （ｄ）前記尿素溶液に、前工程において収穫された種子の玄米の胚芽を有しない半粒を浸す工程と、
   （ｅ）前記工程（ｄ）において前記尿素溶液に溶解した種子の玄米の胚芽を有する半粒を播種及び栽培し、種子を収穫する工程と、
   を含み、
   工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）及び工程（ｅ）をこの順に行い、
   前記工程（ｅ）の後、工程（ｄ）及び工程（ｅ）をこの順に繰り返して行うことで、アミロペクチン短鎖指標値が旱不知Ｄのアミロペクチン短鎖指標値の１１０％以上であり、糊化温度が旱不知Ｄの糊化温度よりも２℃以上低い低温糊化変異米を選抜する工程を含む、
   ことを特徴とする糊化温度が旱不知Ｄの糊化温度よりも２℃以上低い低温糊化変異米の選抜方法。
2. 前記低温糊化変異米を選抜した後に、
   前記低温糊化変異米と、糯性イネと、を交配させる工程と、
   前記交配後代のＦ_２世代の個体から糯性個体を得る工程と、
   前記糯性個体由来の試料に含まれる第６染色体のデンプン枝付け酵素Ｉ遺伝子のコアプロモーター領域における変異を検出することで糊化易性個体を得る工程と、
   を含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の低温糊化変異米の選抜方法。
3. 前記糯性個体由来の試料中のＤＮＡを鋳型として、ＨｖＳＳＲ１１−２７マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号３、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号４）及びＨｖＳＳＲ１１−２８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号６）のうち少なくとも１つ、並びにＨｖＳＳＲ１１−４８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８）及びＨｖＳＳＲ１１−５０マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号９、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０）のうち少なくとも１つ、を用いて糊化易性個体を得る工程をさらに含む、
   ことを特徴とする請求項２に記載の低温糊化変異米の選抜方法。
4. 旱不知Ｄを突然変異させる工程と、
   尿素溶液を用いて低温糊化変異米を選抜する工程と、
   を含み、
   前記低温糊化変異米を選抜する工程に次いで、
   前記低温糊化変異米と、糯性イネと、を交配させる工程と、
   前記交配後代のＦ_２世代の個体から糯性個体を選抜する工程と、
   前記糯性個体由来の試料に含まれる第６染色体のデンプン枝付け酵素Ｉ遺伝子のコアプロモーター領域における変異を検出することで糊化易性個体を選抜する工程と、
   を含む、
   ことを特徴とする糊化温度が旱不知Ｄの糊化温度よりも２℃以上低い低温糊化変異米の生産方法。
5. 前記糯性個体由来の試料中のＤＮＡを鋳型として、ＨｖＳＳＲ１１−２７マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号３、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号４）及びＨｖＳＳＲ１１−２８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号６）のうち少なくとも１つ、並びにＨｖＳＳＲ１１−４８マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８）及びＨｖＳＳＲ１１−５０マーカー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号９、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０）のうち少なくとも１つ、を用いて糊化易性個体を選抜する工程をさらに含む、
   ことを特徴とする請求項４に記載の低温糊化変異米の生産方法。